Bu çalışma CBER / FDA NIAID / NIH Kurumlararası Anlaşma YI-AI-6153-01, FDA / CBER içi fonlar ve FDA Tıbbi Önlemler Girişimi tarafından desteklenmiştir. TCT, MNB, VPM, LMS ve KDK ABD Enerji Departmen ve ABD arasında bir Kurumlararası anlaşma yoluyla Fen Eğitimi için, Oak Ridge Enstitüsü tarafından uygulanan Biyolojik Değerlendirme ve Araştırma Merkezi&#39;nde araştırma Katılım Programı için randevu tarafından desteklenen Gıda ve İlaç İdaresi.

Standart seri seyreltme hazırlanması 1. (Şekil 3A) NOT: Pr / Pb grubu tarafından hedef sekansları ihtiva eden doğrusallaştırılmış plazmidin seri seyreltme serisi QRT-PCR deneyi için sayısal standartlar olarak kullanılmıştır. IFN alt tipleri için her standart seri seyreltme seti 90 deney plakaları çalıştırmak için yeterli hacim içerir. Deney için kullanılan standart seyreltme eğrisi dört noktanın 20-32 (Tablo 3), bir dizi Ct değerleri kapsayacak şekilde seçilir. <ol><li> Çözülme, girdap ve kısa bir süre için standart (50 pM) ve somon sperm DNA (ssDNA, 10 mg / ml) stok çözelti santrifüj. </li><li> Su 20.3 ml ssDNA&#39;nın 51 ul karıştırarak 17 standart seyreltme setleri için ssDNA / su karışımı hazırlayın. </li><li> Standart seyreltme kümesi için bir 8-tüp PCR şerit etiketleyin. NOT: stok çözümleri standart seri dilüsyonları hazırlanması 2-3 saat sürer. </li><li> F ssDNA / su karışımı 190 ul dağıtınirst şerit boru ve beş kalan tüplere ssDNA / su karışımı 180 ul. </li><li> , Mix ssDNA&#39;nın / su 190 ul tüp 50 pM standart stoktan 10 ul aktararak bir 1:20 seyreltme gerçekleştirin; hızla girdap ve PCR şeridi santrifüj. </li><li> Serinin bir sonraki tüp en son seyreltilmiş tüp 20 ul aktararak 1:10 seyreltme gerçekleştirin; hızla girdap ve PCR şeridi santrifüj. </li><li> Seyreltme serisinin son tüp kadar adımı yineleyin 1.6 standardını aldı. </li><li> Tekrarlayın, her standart için 1,3-1,7 adımları. </li></ol> Aşağıda Tablo 3 görün Primer / prob (Pr / Pb) ile Şablonsuz Kontrol 2. Hazırlık (NTC) işleme stok karışımlar (Şekil 3B) NOT: Her 1.7 ml Pr / Pb stok ve 30 tahlil plakaları yapacak stok karışımı çalışma 128.6 ul yok Şablon Kontrolü (NTC) çalışan set. <ol><li> Pr / Pb çalışma stok karışımları set hazırlayın. DEĞİLE: Pr / Pb seti hazırlanması ve NTC çalışma stok 2-3 saat sürer stok çözümleri karıştırır. <ol><li> Stok çözeltilerin hazırlanması için, ultra-saf su ile 100 uM primer ve problar yeniden süspanse edin. </li><li> Onyedi 2 ml tüpler kadar Etiket; Deneyde yer alan her Pr / Pb kümesi için bir. </li><li> Çözülme, girdap ve kısa bir süre için primerler (100 uM), sondalar (100 uM) ve ssDNA (10 mg / ml) stok çözelti santrifüj. </li><li> 12.5 ul elektronik çok kanallı pipet kullanarak her bir tüpe ssDNA&#39;nın 2 ul ekleyin. Uygun ileri primer ekle ters primer ve her Pr / Pb stok tüp çalışma ayarlayın soruşturma. Rhesus makak Pr / Pb setleri için insan IFN alt tiplerini ve Tablo 2 hedefleme Pr / Pb setleri için Tablo 1&#39;e bakınız. Her Pr hacmi getirmek için su ekleyin / Pb 200 ul stok tüp çalışan set. Not: ekleme primerleri, prob hacmi ve su Pr / Pb gerekli nihai reaksiyon konsantrasyonuna bağlıdırset. </li></ol></li><li> NTC çalışma stok karışımları hazırlayın. <ol><li> NTC çalışma hisse senetleri için Etiket iki adet 5-tüp PCR şeritler karıştırır. </li><li> Her Pr / Pb 14.3 ul uygun NTC çalışma stok karışımı tüp set aktarın. NTC kuyuları için Pr / Pb seti kombinasyonları için Tablo 4&#39;e bakın. NTC çalışma Stokta her su ekleyin 128.6 ul son hacim getirmek karıştırır. </li><li> Girdap, kısa bir süre için santrifüj ve ardından buz üzerine ya da uzun süreli depolama için -20 ° C&#39;de karanlıkta tüpleri. </li></ol></li></ol> Aşağıda Tablo 4 &#39;e bakınız <ol start="3"><li> Pr / Pb çalışma stokları set sulandırmak. <ol><li> Her Pr / Pb son hacim su 1.5 ml ekleyin NTC çalışma stoğu karışımı için gereklidir, Pr / Pb setleri bir kısım maddelerin ayrılmasından sonra 1.7 ml stok tüp olarak ayarlayın. </li><li> Girdap, kısa bir süre için santrifüj ve ardından buz üzerine ya da daha uzun süreli depolama için -20 ° C&#39;de karanlıkta tüpleri. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Çok kanallı otomatik pipet kullanarak 384 oyuklu deney plakaları hazırlanması <ol><li> 384 oyuklu deney plakalarına aliquoting Pr / Pb setleri ve NTC karışımları, 96 oyuklu bir kaynak plaka hazırlanması. NOT: Pr / Pb çalışmaları stok karışımları kaynak plakasının hazırlanması az 1 saat sürer. Her 96 oyuklu bir kaynak plaka altı 384 oyuklu deney plakaları (Şekil 3C) için yeterlidir. <ol><li> Kısaca girdap ve Pr / Pb çalışma stokları ve NTC çalışma stok karışımları set santrifüj. </li><li> Soğutulmuş bir 96-çukurlu soğutma bloğu yeni 96-yuvalı plakayı, her Pr / Pb seti için kuyu tayin veya NTC kuyuları (bakınız Şekil 2) alan karıştırın. </li><li> 250 ul bir elektronik çok kanallı pipet kullanılarak 96 oyuklu plakaya su ekleyin: Her Pr su 66 ul koyun / Pb (hedef 17 için 4 gözlük hariç) de ayarlanır. 4 Hedef 17 kuyu suyu 82.5 ul koyun. De her NTC karışımı su 27.5 ul koyun. </li&gt; <li> Doğru Pr / Pb 96-plaka belirlenen kuyu stok çalışan set ekleyin: Doğru Pr / Pb 54 ul (Hedef 17 için 4 kuyular hariç) belirlenen Pr / Pb seti kuyu stok çalışan set dağıtın. Hedef 17 Pr / Pb 67.5 ul dağıtın belirlenen Hedef 17 Pr / Pb seti kuyu stok çalışan set. Belirlenen kuyulara doğru NTC çalışma stok karışımı 22.5 ul ekleyin. </li><li> Içeriği kuyu altındaki sağlamak için 700 x g, 1 dakika için bir yapışkan levha contası ve santrifüj ile 96 oyuklu plaka kapatın. </li><li> 96 oyuklu bir plaka adaptörü kullanılarak vorteks karıştırıcıda 96 oyuklu plaka koyun ve 1000 rpm&#39;de 1 dakika için karıştırın. Santrifüj 700 x g&#39;de 5 dakika boyunca 96 gözlü plaka. </li><li> Aynı gün içinde kullanılması durumunda, aksi kullanılana kadar -20 ° C&#39;de saklayın, 4 ° C&#39;de karanlıkta, 96 oyuklu bir kaynak plaka saklayın. </li></ol></li><li> Çok kanallı otomatik pipet kullanarak setleri Pr / Pb eklenerek 384 oyuklu deney plakaları hazırlayın. NOT: 96-kuyu kaynak plaka altı tahlil plakaları hazırlanması 3-4 saat sürer. <ol><li> Plakaları yapmadan önce, 4 ° C&#39;ye kadar soğutulduktan yuva ön soğuk ve dakika başına 20-25 litre (LPM) arasındaki üfleme hava akımı ile 80 ° C ila 125 ° C arasında levha buharlaştırıcı ve alt ısıtma bloğu önceden ısıtın. </li><li> Otomatik çok kanallı pipet açın ve çift yazılım simgesini tıklatarak IFN tahlil plakaları yapmak için protokol açın. </li><li> Platformu kurulumu için, platform konumuna 1 tamamen dolu pipet ucu kutusu yerleştirmek, pozisyon 4 96-kuyu, kaynak plaka ve pozisyon 6&#39;da yeni bir 384-plaka play butonuna basarak koşmak başlayın. Not: bir çalışma tamamlandıktan sonra, her bir göze, Pr / Pb karışımı 5 ul ihtiva edecektir. Not: ssDNA son miktarı 384 oyuklu deney plakasının her çukuruna ilave 0.025 mcg&#39;dır. </li><li> Yavaşça kuyu altındaki olan sıvıları sağlamak için düz bir yüzeye 384 oyuklu tahlil plaka dokunun ve bir yapıştırıcı uygulanırplaka mühür. </li><li> Santrifüj 700 x g, 1 dakika için levha. Plaka kurutma makinesi içine 384-iyi tahlil plaka koyun, yapışkan plaka mühür çıkarın ve kuyuların üstünde doğrudan 384-kuyu manifoldu yerleştirin. </li><li> 384 oyuklu deney levhanın içeriği kuru, yeni bir yapışkan levha conta geçerli olduğunda, kullanılana kadar 4 ° C&#39;de karanlıkta folyo, etiket ve mağaza sarın. Not: Plakalar en az 6 ay için 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Adımları tekrarlayın 3.2.3-3.2.6 6 x kadar 384-iyi tahlil plakalar hazırlanır veya 96-kuyu, kaynak plaka sıvı tükenmiş. </li><li> Soğutma yuva kapatın yazılımı kapatın ve otomatik çok kanallı pipet kapatın. Plaka kurutma kapatın. </li></ol></li></ol> 4. Yükleme ve 384 deney plakası çalıştırma <ol><li> Iyi bir HKG, ssDNA, PCR ana karışımı, su ve Pr / Pb grubu oluşur karışımları, iki temizlik gen (HKG) hazırlanması (a kurutuldu 384 oyuklu deney plakası eklenecek <strong&gt; Şekil 3D). NOT: karışımlarının hazırlanması ve tahlil plaka yükleme 1-2 saat sürer. Tahlil plakasını Koşu az 2 saat sürecektir. <ol><li> Her HKG karışımı için 1.5 ml tüp etiketleyin. </li><li> 84.9 ul su ile ssDNA (10 mg / ml), 2 ul seyreltin. Seyreltilmiş ssDNA 2 ul, su içinde 11.8 ul, ana karışımı 23 ul ve HKG Pr / Pr, her tüp, girdap ve kısa bir süre için santrifüj ayarlı doğru 20x 9.2 ul ekleyin. </li><li> İnsan tahlil için hkg olarak gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) ve ubikuitin C (UBC) kullanın (Malzeme Tablo). Rhesus deneyi için hkg olarak GAPDH ve 18S ribozomal RNA kullanın. Not: deneyi gerçekleştirmek için kullanılan HKG esnektir ve bir hücre tipi için uygun genler yansıtmalıdır test edilen GAPDH, UBC ve 18S yaygın olarak kullanılan hkg örnektir;. Diğer HKG daha uygun olabilir. </li></ol></li><li> Örnek ve positi hazırlanmasıde numune veya pozitif kontrol cDNA ana karışımı, su ve oluşan karışımları, kontrol ettik, kurutulmuş bir 384-oyuklu bir deney plakasına eklendi edilmesi. Örnek hazırlayın ve yeterli miktarda pozitif kontrol karışımları 21 plakalı kuyuları (Şekil 3D) dağıtmak için. <ol><li> CDNA sentezi önce, bir DNaz sindirim adım ile RNA örnekleri hazırlamak için üreticinin talimatlarını izleyin. </li><li> Üreticinin talimatlarını takip RNaz H (her bir örnek için, 24 ul nihai hacim) ile işlenerek ve ardından RNA&#39;nın en az 500 ng cDNA sentezi, önceden örnekleri ve pozitif kontrol hazırlayın. Kullanılana kadar -20 ° C &#39;de hazırlanmış cDNA saklayın. Çözülme, girdap, kısaca örnek cDNA santrifüj. </li><li> Ana karışımı 78.8 ul ve her 24 ul numune ve pozitif kontrol tüpüne su 54.8 ul ekleyin. </li><li> Kısaca girdap ve tüpler santrifüj. </li></ol></li><li> Standartları hazırlayın ve NTC iyi con karıştırırana karışımı su ve aşağıdakilerden oluşan bir kuru 384 oyuklu bir deney plakası (Şekil 3D) eklenmesi. Standartlar iyice karıştırın için, 1.5 ml tüp master karışımı 275 ul su 165 ul ekleyin. NTC iyice karıştırın için, 1.5 ml tüp master karışımı 52.5 ul su 52.5 ul ekleyin. Kısaca girdap ve tüpler santrifüj. </li><li> Karışımları ve numune yükleme için bir kuru 384 oyuklu deney plakası hazırlayın. <ol><li> 700 x g, 1 dakika için kurutulmuştur 384 oyuklu deney 4 ° C plaka ve santrifüj çıkarın. </li><li> , Soğutulmuş 384 soğutma bloğuna plaka koyun yapışkan plaka mühür kaldırmak ve çeşitli karışımlar ve örnekler (Şekil 1) pipetle nereye belirtmek için plaka kuyu özetlemektedir. </li></ol></li><li> Standart iyi karışımı, standartlara 384-iyi tahlil plaka yükleyin, NTC iyi örnekleri, pozitif kontrol ve HKG karışımı (Şekil 3E) karıştırın. Vortex ve kısaca santrifüj tüm çözümler plaka dağıtım önce. <ol><li> Standartların 6 ul iyi 30 ul elektronik çok kanallı pipet ile her bir standart kuyusuna karıştırın dağıtın. 12.5 ul elektronik çok kanallı pipet ile iyi belirlenmiş doğru standart seri seyreltme 1.5 ul koyun. </li><li> NTC 7.5 ul iyi 30 ul elektronik çok kanallı pipet ile de her NTC karıştırmak dağıtın. 30 ul bir elektronik çok kanallı pipet ile belirlenmiş oyuklara örnek 7.5 ul koyun. 12.5 ul elektronik çok kanallı pipet ile belirlenen kuyu karıştırır HKG Pr / Pb 2.5 ul koyun. </li><li> 30 ul elektronik çok kanallı pipet ile artık su ve usta karışımı karışımı 7.5 ul ile herhangi bir boş kuyu doldurun; Su 7,5 ul yalnız de çalışacaktır. </li><li> 700 x g, 1 dakika için bir optik yapıştırıcı film ve santrifüj ile 384 oyuklu tahlil plaka kapatın. 2600 rpm&#39;de 2 dakika boyunca vorteks karıştırıcıda mühürlü 384 oyuklu plaka vorteksve x, g 700 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj. </li><li> , Mah-PCR makinesinde mühürlü 384-kuyu tahlil plaka koyun tahlil düzeni için şablonu açın ve çalıştırın başlar. NOT: Sonuçlar bir tablo olarak ya da analiz için bir metin dosyası olarak ihraç edilebilir. </li><li> Deney için, aşağıdaki en iyi termal döngü reaksiyon koşulları kullanarak, i) 50 ° C sıcaklıkta 2 dk, ii) 95 ° C sıcaklıkta 10 dakika süre ile, iii) 25 s için 95 ° C, iv) ile, 1 dakika için 59 ° C. Tekrar 40 döngü için iii ve iv adımları. </li><li> Bir elektronik tablo uygulaması yazılımı içine Mah-PCR platformu ham veri verir. Lineer gözlemlemek için bir standart eğri olarak belirlenen her 4 nokta standardı çizilir. ΔCq hesaplayarak veya dört nokta standart eğrileri 27 dayalı kopya sayısına göre analizi yapın. </li></ol></li></ol> Aşağıda Şekil 3 görün

<ol>
	<li>Yan, N., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+antiviral+immunity.">Intrinsic antiviral immunity.</a> Nature. 13, 214-222 (2012).</li><li>Pestka, S., Krause, C. D., Walter, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferons,+interferon-like+cytokines,+and+their+receptors.">Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors.</a> Immunological reviews. 202, 8-32 (2004).</li><li>Baum, A., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+type+I+interferon+by+RNA+viruses:+cellular+receptors+and+their+substrates.">Induction of type I interferon by RNA viruses: cellular receptors and their substrates.</a> Amino acids. 38, 1283-1299 (2010).</li><li>Kotenko, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-lambdas+mediate+antiviral+protection+through+a+distinct+class+II+cytokine+receptor+complex.">IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex.</a> Nature. 4, 69-77 (2003).</li><li>Hardy, M. P., Owczarek, C. M., Jermiin, L. S., Ejdeback, M., Hertzog, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+type+I+interferon+locus+and+identification+of+novel+genes.">Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes.</a> Genomics. 84, 331-345 (2004).</li><li>Cheon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNbeta-dependent+increases+in+STAT1,+STAT2,+and+IRF9+mediate+resistance+to+viruses+and+DNA+damage.">IFNbeta-dependent increases in STAT1, STAT2, and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage.</a> The EMBO journal. 32, 2751-2763 (2013).</li><li>Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-stimulated+genes:+a+complex+web+of+host+defenses.">Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses.</a> Annual review of immunology. 32, 513-545 (2014).</li><li>Hiscott, J., Nguyen, T. L., Arguello, M., Nakhaei, P., Paz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+the+nuclear+factor-kappaB+pathway+and+the+innate+immune+response+by+viruses.">Manipulation of the nuclear factor-kappaB pathway and the innate immune response by viruses.</a> Oncogene. 25, 6844-6867 (2006).</li><li>Alcami, A., Symons, J. A., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vaccinia+virus+soluble+alpha/beta+interferon+(IFN)+receptor+binds+to+the+cell+surface+and+protects+cells+from+the+antiviral+effects+of+IFN.">The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN.</a> Journal of virology. 74, 11230-11239 (2000).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+type+I+and+type+III+interferons+by+a+secreted+glycoprotein+from+Yaba-like+disease+virus.">Inhibition of type I and type III interferons by a secreted glycoprotein from Yaba-like disease virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9822-9827 (2007).</li><li>Bidwell, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Irf7+pathways+in+breast+cancer+cells+promotes+bone+metastasis+through+immune+escape.">Silencing of Irf7 pathways in breast cancer cells promotes bone metastasis through immune escape.</a> Nature medicine. 18, 1224-1231 (2012).</li><li>Di Domizio, J., Cao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fueling+autoimmunity:+type+I+interferon+in+autoimmune+diseases.">Fueling autoimmunity: type I interferon in autoimmune diseases.</a> Expert review of clinical immunology. 9, 201-210 (2013).</li><li>Crow, Y. J., Casanova, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STING-Associated+Vasculopathy+with+Onset+in+Infancy+-+A+New+Interferonopathy.">STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy - A New Interferonopathy.</a> The New England journal of medicine. , (2014).</li><li>Bermel, R. A., Rudick, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-beta+treatment+for+multiple+sclerosis.">Interferon-beta treatment for multiple sclerosis.</a> Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 4, 633-646 (2007).</li><li>Kingham, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+HBsAg-positive+chronic+active+hepatitis+with+human+fibroblast+interferon.">Treatment of HBsAg-positive chronic active hepatitis with human fibroblast interferon.</a> Gut. 19, 91-94 (1978).</li><li>Heathcote, J., Main, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+hepatitis+C.">Treatment of hepatitis C.</a> Journal of viral hepatitis. 12, 223-235 (2005).</li><li>Donnelly, R. P., Dickensheets, H., O'Brien, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-lambda+and+therapy+for+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis C virus infection.</a> Trends in immunology. 32, 443-450 (2011).</li><li>Castaigne, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+alpha+in+the+treatment+of+hairy+cell+leukemia.">Interferon alpha in the treatment of hairy cell leukemia.</a> Cancer. 57, 1681-1684 (1986).</li><li>Kumar, L., Basade, M., Gulati, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+interferon-alpha+in+chronic+myeloid+leukemia.">Role of interferon-alpha in chronic myeloid leukemia.</a> The Journal of the Association of Physicians of India. 3, 26-32 (1995).</li><li>Dai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+alpha+on+NZM2328.Lc1R27:+Enhancing+autoimmunity+and+immune+complex-mediated+glomerulonephritis+without+end+stage+renal+failure.">Interferon alpha on NZM2328.Lc1R27: Enhancing autoimmunity and immune complex-mediated glomerulonephritis without end stage renal failure.</a> Clinical immunology (Orlando, Fla.). 154, 66-71 (2014).</li><li>Maeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-alpha+Acts+on+the+S/G2/M+Phases+to+Induce+Apoptosis+in+the+G1+Phase+of+an+IFNAR2-Expressing+Hepatocellular+Carcinoma+Cell+Line.">Interferon-alpha Acts on the S/G2/M Phases to Induce Apoptosis in the G1 Phase of an IFNAR2-Expressing Hepatocellular Carcinoma Cell Line.</a> The Journal of biological chemistry. , (2014).</li><li>Xia, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+IFN-alpha-Producing+Plasmacytoid+Dendritic+Cells+(pDCs)+in+Human+Th1-Mediated+Type+1+Diabetes:+pDCs+Augment+Th1+Responses+through+IFN-alpha+Production.">Increased IFN-alpha-Producing Plasmacytoid Dendritic Cells (pDCs) in Human Th1-Mediated Type 1 Diabetes: pDCs Augment Th1 Responses through IFN-alpha Production.</a> Journal of immunology. 193, 1024-1034 (2014).</li><li>Hervas-Stubbs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+but+not+plasmacytoid+dendritic+cells+foster+the+systemic+virus-induced+type+I+IFN+response+needed+for+efficient+CD8+T+cell+priming.">Conventional but not plasmacytoid dendritic cells foster the systemic virus-induced type I IFN response needed for efficient CD8 T cell priming.</a> Journal of immunology. 193, 1151-1161 (2014).</li><li>Manry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+genetic+dissection+of+human+interferons.">Evolutionary genetic dissection of human interferons.</a> The Journal of experimental medicine. 208, 2747-2759 (2011).</li><li>Chen, J., Baig, E., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+relatedness+among+the+type+I+interferons.">Diversity and relatedness among the type I interferons.</a> Journal of interferon &amp; cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 24, 687-698 (2004).</li><li>Fox, B. A., Sheppard, P. O., O'Hara, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+genomic+data+in+the+discovery,+annotation+and+evolutionary+interpretation+of+the+interferon-lambda+family.">The role of genomic data in the discovery, annotation and evolutionary interpretation of the interferon-lambda family.</a> PloS one. 4, e4933 (2009).</li><li>Hillyer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiles+of+human+interferon-alpha+and+interferon-lambda+subtypes+are+ligand-+and+cell-dependent.">Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent.</a> Immunology and cell biology. 90, 774-783 (2012).</li><li>Schramm, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+array+for+absolute+and+relative+quantification+of+rhesus+macaque+types+I,+II,+and+III+interferon+and+their+subtypes.">High-throughput quantitative real-time polymerase chain reaction array for absolute and relative quantification of rhesus macaque types I, II, and III interferon and their subtypes.</a> Journal of interferon &amp; cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 32, 407-415 (2012).</li><li>Wang, Q., Chen, L., Long, Y., Tian, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons+of+xeno-nucleic+acid+for+detecting+nucleic+acid.">Molecular beacons of xeno-nucleic acid for detecting nucleic acid.</a> Theranostics. 3, 395-408 (2013).</li><li>Little, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification-refractory+mutation+system+(ARMS)+analysis+of+point+mutations.">Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations.</a> Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines ... [et al.]. 9 (Unit 9 8), (2001).</li></ol>

VPM and RLR are co-inventors of the technology to measure expression of IFN- and IFN- subtypes and derive royalty income from it. The remaining authors declare no conflict of interest.

Bu rapor, tasarım, toplu üretim ve bir araştırma laboratuar ortamında yüksek olarak benzer genlerin bir dizi transkripsiyonunu ölçmek için bir deney analizinin doğru bir yaklaşımı tarif eder. Burada bildirilen yüksek verimli QRT-PCR testi IFN ve ölçer - yüksek özgüllük ile λ alt tipleri. Bu yöntem iki temel yönlerini, bir homolog gen ailesinin üyeleri ve Pr / Pb setleri ile önceden yüklenmiş, güvenilir ve tutarlı 384 tahlil plakaları oluşturulması için bir üretim platformu gelişimi arasında ayrım Pr / Pb setleri tasarımı içerir. Mah-PCR probları kendi özgünlüklerini 29 artırılmasına yönelik yapısal (MB) veya kimyasal (LNA) yaklaşımı içermektedir. Rhesus tahlilinde (Tablo 2) astar setlerinin ikisi için, amplifikasyon refraktör mutasyon sistem (ARMS) daha fazla özgüllük, 30 geliştirmek için primer diziler dahil edilmiştir. Bu Enha için ekson-ekson bağlantı yerleri hedef, genel olarak en iyi ikentip I genler intronlan eksikliği IFN çünkü Mah-PCR reaksiyonunun nce özgüllüğü, bu mümkün değildi. Bu nedenle, genomik DNA, PCR reaksiyonunda amplifiye edilecek ve RNA ekstraksiyonu sonra DNase muamelesi ile bozulmuş olması gerekir. Pr / Pb kümeleri için, hedef bölge, her bir IFN için olgun peptide ait kodlama bölgeleri ile sınırlandırılmıştır. IFN-α alt türlerine, özellikle olgun peptid bölgesi arasında yüksek dizi benzerliği nedeniyle, özgüllük sağlamak için duyarlılık uzlaşma bazen gerekli oldu. Bu özellikle diğer IFN-α alt tiplerine karşı karşılaştırıldığında olgun peptid transkript sadece dört benzersiz üsleri olan IFN-α17, böyleydi. Hedefleme, IFN-α17 sondasına özgüllük sınırlayan çok sayıda alt-tiplerinin transkript bağlanan primerler gerekmez. Bunun bir sonucu olarak, PCR reaksiyonu, böylece, PCR reaktifleri ve loweri önemli bir yüzdesini alıcı IFN-α17 başka alt tipi artıracaktırIFN-α17 için spesifik sonda floresan sinyalinin genliği ng. Böyle IFN gibi son derece benzer genler için duyarlı ve özgül Pr / Pb setleri tasarımı yönelik ek bir zorluk Gen bankasındaki açıklamalı dizileri tasarım sırasında tam veya kapsamlı olmayabilir olasılığıdır. Yine, bu yeni açıklamalı dizileri mükemmel tasarımı sırasında veritabanında dizisinin sürümü ile aynı hizaya etmeyen IFN-α17 için bir meydan okuma oldu. Pr tasarlarken Bu nedenle, / Pb yoğun çalışma yapılmamıştır genler için ayarlar, periyodik bir hedef genin son açıklamalı dizisini kontrol etmek akıllıca olacaktır. Son olarak, Pr / Pb setleri Kopyası çıkarılan ancak çevrilmeyen edilebilir pseudogenleri amplifiye emin olmak için gereklidir. Pr / Pb setleri tasarladıktan sonra, bir sonraki zorluk yedi farklı Pr / Pb PCR koşulları optimize ediyor, bir 384-plaka üzerinde ayarlar. Transkript standartları impor olanBir Pr / Pb kümesi özgünlüğünü test ve çok sayıda farklı PCR reaksiyonlarının Mah-PCR koşulları uyumlaştırılması için gerekli hale de tant. Transkript standartlarına karşı Pr / Pb seti test verimliliği ve hassasiyetini kurar; yüksek oranda benzer pseudogenleri ifade plazmidleri Pr / Pb seçici olarak işlevsel bir genin transkripsiyonunu ölçer sağlamak için gerekli olabilir. transkript standartları da bir ev bakıcısı geni (ΔCq) yarı-nicel analiz nisbetle ek olarak, analiz, bir sayısal aracı (transkript sayısı) bulunur. Birden fazla 384 oyuklu deney plakaları bir 96-çukurlu bir kaynak plaka Robotik çok kanallı pipet hassas ve inter-plak sonuçları tutarlılığını arttırır. Yapar plaka içine tevzi reaktif kurutma gibi somon sperm DNA (ssDNA), stabilize eder ve uzun süreli depolama için Pr / Pb setleri koruyan bir taşıyıcı madde olarak kullanılır. Plakaları Kurutma de reaksiyon hacmi azaltırda değerli örnekleri korur ve pahalı reaktiflerin kullanımını azaltır tekrarlanabilir sonuçlar için gerekli. Bu adımlarda, plakaların toplu fazla altı ay için hassasiyet ve tutarlılık sağlamak monte edilir. Plaka hazırlığı takiben, kalite kontrol önlemleri plakaların bir toplu tutarlılığını kontrol etmek önemlidir. Bu amaçla, standart bir ek dört set bir plaka üzerinde çalışır. &quot;5x standart&quot; plaka performansını izler ve bireysel levhanın standartları karşılaştırıldığında hangi bir veri kümesi oluşturur. Her bir standardın on 10-kat seyreltme deney tasarımı sırasında kullanılır, alan hususlar dört nokta, her bir deney plakası üzerindeki standart eğri için kullanılır ve 5x standart levha olduğu gerektirir. Buna ek olarak, bir pozitif kontrol plakası geçerliliğini sağlamak için her bir plaka üzerine dahil edilmelidir. Tipik olarak, Pr / Pb s birinden altı tahlil plakaları hazırlamak için 3-4 saat sürerource plaka; Bir araştırma laboratuvarında tek bir gün içinde on iki tabak hazırlamak için mümkündür. Her insan IFN alt tipi tahlil plakası onyedi Pr / Pb setleri inceler ve on beş deneysel örnekleri ağırlayacak beri, montaj bir gün 3,060 deneysel veri noktalarına kadar üretmek için kapasiteye sahip plakaların bir toplu üretir. Mah-PCR platformu Ham veri işlenir ve otomatik olarak önceden tasarlanmış bir analiz şablonu doldurmak için bir elektronik tablo uygulaması yazılımı programlama komut dosyalarını kullanarak monte edilebilir. Bu yöntem eller veri girişi, böylece önlenmesi kopyalama hatalarını en aza indirir ve araştırmacı veri analizi ziyade veri derleme odaklanmasını sağlar. Burada tarif edildiği gibi, bu, yüksek verimli QRT-PCR deneyi, insan ya da resus makak örneklerde interferon alt tiplerinin ekspresyonunu ölçmek için uygulanabilir ve diğer türler ya da homolog gen kümeleri için kullanmak üzere adapte edilebilir. plaka düzeni esnekliği kullanıcı astar değiştirmenize olanak sağlar / sonda genlerini terzi setleribelirli bir hücre tipi veya model sistem doğru faiz. Bu deney, bağışıklık tepkisi önemli olan sinyal mekanizmaları aydınlatmak için patojenler okuyan hücre kültürü modelleri ya da hastalık modelleri bağlamında, hasta numunelerinde IFN sentezleme imza ölçülmesi için tatbik edilebilir.

Tip I ve III &#39;interferonlar (IFN) tüm omurgalıların 1 virüs ve diğer patojenik uyarıcılara, mevcut immün yanıt olarak büyük önem taşımaktadır. Bağışıklık ve olmayan bağışıklık hücreleri cevap için, IFN 2 yanı sıra, ifade ve salgılarlar. Gibi paralı-benzeri reseptörler (TLR), SOKMASI ve Rig-I gibi doğuştan gelen bağışıklık sensörler, patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMP) 3,4 tespiti üzerine tip I ve III IFN ifadesini neden. İnsanlarda, bir IFN tipi 2,5 kompleks IFNAR 1 / IFNAR2 reseptörü, IFN-β, -ω, -κ ve IFN-α 12 alt tipleri ve bağlama yer alır. Tip III, IFN, IFN-λ1, -λ2 ve -λ3 dahildir ve IL10RB / IL28RA reseptör kompleksi 2 bağlanır. Klasik, tip I ve III IFN ardından STAT1 / STAT2 heterodimerlerini işe ve interferon uyarılmış genlerin (ISG) 6 transkripsiyonunu başlatmak kendi reseptör kompleksleri bağlama. İSG, antiviral ve anti-dan, fonksiyonları çok çeşitli katılanAdaptif immün yanıtı 7 aktivasyonuna çoğalma etkinliği. patojenler kaçmasına altüst ve IFN sinyal yolunun elemanları kaçırma geliştiğini çok sayıda mekanizma, doğuştan gelen bağışıklık tepkisi 8 IFN&#39;nin önemini göstermektedir. Örneğin, aşı virüsü, bir Yaba-benzeri hastalığı virüsü I ve III IFN proteini 10 yazın önleyen bir glikoprotein salgılar ederken 9 IFN yazın tecrit IFNAR1 homoloji ile bir tuzak reseptörü ifade eder. Ev sahibi savunma rollerine ilave olarak, IFN aynı zamanda, kanser gözetim ve oto-enflamatuar hastalıkların bir dizi implike edilmiştir: göğüs kanseri hücrelerinin IFN ifade susturma immün 11 sınırlayan IFN-α aşırı üretimi sistemik gelişiminde bir mekanizmadır lupus eritematozus 12, ve SOKMASI ve hatalı aktivasyon STING ilişkili vaskülopatisi IFN aşırı miktarda neden sistemik inflamasyona yol açar13. Terapötik olarak IFN multipl skleroz 14 tedavi etmek için kullanılır, örneğin tüylü hücre lösemisi 18 ve kronik miyelojenik lösemi 19 gibi HBV 15 ve HCV 16,17 ve kanser gibi kronik viral enfeksiyonlar. Belirli bir fizyolojik süreç içinde IFN alaka ile ilgili sorular sürekli bu sitokin ailesinin her yerde doğasını ortaya koyuyor. Özellikle IFN-α alt tipleri, genellikle bir varlık olarak 20-23 yerine bir yakından ilişkili grup, ancak farklı, proteinler olarak kabul edilir Ben IFN, yazın. Omurgalı evrim 24 boyunca varlığı ve IFN-α alt tipleri de dahil olmak üzere birden fazla IFN türlerine sürmesi, bu alt türlerin en azından bir alt kümesi, belirli veya benzersiz bir işleve sahip olduğunu göstermektedir. Bu, IFN ifade tanımlayan desen çözer ve alt tiplerinin 17 arasında bir veya daha fazla özel fonksiyonları karakterize etmeye yardımcı olması mümkündür. t okuyan meydanonların, paylaşılan bu sekans kimliğine dayalı olan I ve III, IFN alt tiplerini yazın: on iki IFN-α alt tipleri&gt; 50% 25 paylaşan ve IFN-λ alt tipleri, amino asit dizileri arasında 81-96% 26 paylaşır. Tarif Mah-PCR deneyinde, moleküler işaret (MB) ve kilitli nükleik asit (LNA) floresan sondalar çok benzer IFN alt tipi dizileri arasında tek baz çifti farklılıkları ayırt ve IFN ifade imza karakterizasyonu için izin verir. Testi Yeni 384 kuyucuklu plak format sırasıyla transkript kopya sayısına ve ΔCq ile analiz için izin kantitatif (transkript standartları) ve yarı-kantitatif (temizlik genler (HKG)) önlemleri içerir. Astar / sonda (Pr / Pb) kurutulması ile mümkün otomatik çok kanallı pipetle ve uzun süreli depolama, kolaylaştırdı Toplu montaj, testin tekrarlanabilirliği, programı, ve pratiklik geliştirmek, plakalar üzerinde ayarlar. Bu protokol işlemi tarif384 gözlü QRT-PCR testi plakaları insan IFN alt tiplerini (Tablo 1) hedefleme için on yedi farklı Pr / Pb setleri ile (Şekil 1) üretimi için. Pr / Pb hazır kaynak plakaları (Şekil 2), bir robot çok kanallı pipet kullanılarak, otomatik bir işlemde, birden çok 384 oyuklu deney plakaları hazırlamak için kullanılan olarak ayarlayın. Ilk odak insan IFN ifade imzaları çalışmak için bir protokol oluşturmaya ilişkin iken, bu yöntem, aynı zamanda, rhesus macaques uygulanmıştır. Levha düzenleri biraz farklıdır ve Pr / Pb setleri (Tablo 2) belirgin olmasına rağmen, insan ve resus plakalar oluşturmak için genel hazırlama yöntemi aynıdır. Protokolün en az modifikasyon ile, yöntem yakından ilişkili genlerin diğer grupları çalışma testlerin geliştirilmesi için izin vermek için yürütülebilir. Bkz Şekil 1 ve 2 Aşağıda Tablo 1 ve 2 Bel görow

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1824">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;"></td>
			<td style="width:668px;"></td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:531px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2mL PCR Tube Strips&#160;</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>E0030 124 286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-139</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-137</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel Electronic Pipette, 5-250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td style="width:141px;">14-387-118</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile</td>
			<td>Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA)</td>
			<td>229446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-115</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Reagent Reservoirs&#160;</td>
			<td>VWR International (Radnor, PA, USA)</td>
			<td>89094-668</td>
			<td>25mL reservoirs with 2 dividers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E-Centrifuge</td>
			<td>Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA)</td>
			<td>1090003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eukaryotic 18S rRNA (18S)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Hs99999901_s1</td>
			<td>Rhesus HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fixed Speed Mini Vortexer</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gas Permeable Adhesive Plate Seal</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB-0580</td>
			<td>Disposable plate seal used during the plate preparation process&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Human HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Rh02621745_g1</td>
			<td>Rhesus HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hudson Solo automated multichannel pipettor&#160;</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>800200</td>
			<td>Modified with a 384-well cooling nest</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Linearized plasmids (IFN genes)</td>
			<td>Aldevron (Fargo, ND, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Item 3000, 3580; used for assay standards&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LNA inhibitors</td>
			<td>Exiqon (Woburn, MA, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Item 500100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LNA Probes</td>
			<td>Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Material number VC00023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4309849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microsoft Excel 2010 Spreadsheet</td>
			<td>Microsoft (Redmond, WA, USA)&#160;</td>
			<td>Office 2010</td>
			<td>Visual Basic programming language&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MixMate Vortex Mixer</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>5353 000.014</td>
			<td>2 dimensional plate vortex apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Molecular Beacon Probes</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>Z606634-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plate Dryer (manifold)</td>
			<td>Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primer sets</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pUC57 plasmid DNA</td>
			<td>Genescript (Piscataway, NJ, USA)</td>
			<td>SD1176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes</td>
			<td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-free DNase Set (50)</td>
			<td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase H</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA)</td>
			<td>M0297L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNeasy Mini Kit (250)</td>
			<td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips)</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>800350-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Salmon Sperm DNA Solution</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SoftLinx Version V</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Software for programming pipetting steps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG</td>
			<td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>4352042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ABgene Adhesive Plate Seals&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Ubiquitin C (UBC)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Hs01871556_s1</td>
			<td>Human HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Verso cDNA synthesis Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB1453B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ViiA 7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4453536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water-Ultra Pure</td>
			<td>Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA)</td>
			<td>351-029-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zipvap 384 (plate dryer heating element)</td>
			<td>Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA)</td>
			<td>384-109A</td>
			<td>Plate Dryer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput quantitative real-time rt-pcr assay for determining expression profiles of types i and iii interferon subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

QRT-PCR deneyi, hücre tipleri ve çeşitli bağlamlarda da tip I ve III, IFN salgılanma modellerini analiz etmek için uygulanabilir tarif. Örneğin, insan tip I ve III, IFN ekspresyon profili 6 donör Toll benzeri reseptör ligandları ile uyarılan periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC) analiz edilmiştir; poli I: C (25 ug / ml) LPS (10 ng / ml), imikimod (10 uM) ve CpG oligonükleotitleri (1 uM) (Şekil 4). Veriler elektronik tablo uygulama yazılımı kullanılarak analiz ve protein dizisinin 27 filogenetik ağacın göre saat yönünde düzenlenmiş IFN-α alt tipleri ile radar grafikleri olarak sunuldu. insan IFN ifade radar çizelgeleri tahlil tasarımına dahil analiz iki farklı yöntem kullanılarak hesaplanan bir günlük ölçekte sunulmuştur: HKG (ΔCq) normalize mutlak Cq değeri, toplam RNA mikrogram (mcg) başına şablon kopya sayısı . Kopya sayısı değerleri sonuçları o hesaplanır<html> fa transkript standart eğri. Eldeki TLR agonistleri tarafından ortaya çıkarılan insan IFN ekspresyon profili bağ spesifik olduğunu gösterir. Aşağıda Şekil 4 görün Insan IFN ifade imzalar için gösterildiği gibi, türleri ifade imzaları, rhesus makak I ve III IFN ayrıca belirli TLR ligandı vardı. 3 saat (Şekil 5) C (50 ug / ml) LPS (10 ug / ml), Imiquimod (10 ug / ml): 3 vericiden elde edilen PBMC, poli I ile uyarıldı. Başlangıçta uyarılmamış hücrelerde IFN alt tipi ifadesi düşük oldu. C: IFN-y alt tiplerinin sınırlı sayıda LPS ve poli I yanıt olarak ifade edildi. Bunun aksine, imikuimod yanıt olarak IFN ifade yüksek ve alt tip ifade genişti. Üç TLR agonistleri 28 IFN-β ve IFN-λ1 ifadesi geliştirilmiştir. Aşağıda Şekil 5&#39;e bakınız her zaman &quot;&gt; <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52650/52650fig1.jpg" /> Şekil 1:. Yedi Pr / Pb setleri ile 384 deney plakası için düzeni hedef numarası, Pr / Pb işaret eder. dört nokta standart eğrileri (koyu gri üçgen) sütunlar 1-5 eklenir. HKG Pr / Pb setleri (Beyaz arka plan), sütunlar 6 ve 7 geri kalan sütun 8-24 ilave yedi Pr / Pb kümelerinin biri için spesifiktirler. Örnekler sütun, 6-24 (siyah oklar), satırlar AP eklenir. sütunun 5 altındaki iki kuyu (O5, P5) sadece su ve ana karışımı alırsınız. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52650/52650fig2.jpg" /> Şekil 2:. Onyedi Pr / Pb setleri ile 96 kuyu kaynak plaka için düzeni Hedef numarası Pr / Pb anlamına gelirset. Bir Pr / Pb seti birden kuyulara ilave edildiğinde siyah oklar temsil eder. NTC karışımlar belirlenen kuyuları (koyu gri arka plan) eklenir. diyagonal çizgiler ile iki kuyu (F3, G3) kullanılmamaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52650/52650fig3.jpg" /> Şekil 3: Mah-PCR testi protokolü belirli adımların şematik diyagramı AE protokolü bölümlerini seçin.. (A) Aşama 1: Standart seri seyreltileri hazırlanması. (B) 2. Adım: Pr / Pb ve NTC çalışma stok karışımlarının hazırlanması. (C) Aşama 3.1: Hi / Pb setleri ve NTC karışımları, 96 oyuklu bir çalışma stokları plakasının hazırlanması. (D) Kademe 4,1-3: 384 oyuklu tahlil plaka yüklenmesi için karışımların hazırlanması. (Avustralya, Brezilya Ve Kuzey Amerika Ülkelerinin Kullandığı Saat Uygulamasıep 4.5: 384 oyuklu tahlil plaka yükleme. Diyagramları sağ alt köşesine sol üst okunur. Interferon (IFN) tahlil için Reaktifler -20 o C&#39;de saklanır ve sol sütunda listelenen; protokol çizgiler ayrı eylemler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52650/52650fig4.jpg" /> Şekil 4:. Periferal kan tek-çekirdekli hücrelerinde insan IFN ifade imza (PBMC), Toll benzeri reseptör ligandları ile uyarıldı ve RNA QRT-PCR analizi için hasat edildi stimülasyon PBMC için kullanılan Toll benzeri reseptör ligandlarına karşılık olarak değişmektedir. Tepe cevapları geometrik ortalamaları I poli: C (25 ug / ml) ile 8 saat (kırmızı kareler), LPS (10 ng / ml), 4 saat (yeşil üçgenler), imikimod (10 uM), 16 saatte ( mor elmaslar) CpG (1 uM)16 saat (siyah daireler) ve 16 saat sonra uyarılmamış kontrol (mavi daireler) 6 vericiden (solda) HKG UBC ΔCq ifadesi bir fonksiyonu olarak günlük 10 cetvelinde gösterilir, ya da RNA ug başına kopya sayısı olarak (sağ) . IFN-α alt türleri, amino asit dizi benzerliği olan filogenetik arsa göre sıralanır. Bu rakam aslında İmmünoloji ve Hücre Biyolojisi 27 yayımlanmıştır. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52650/52650fig5.jpg" /> Şekil 5:. Periferal kan tek-çekirdekli hücrelerinde Rhesus macaque IFN ifade imza (PBMC) (kare, baklava ve üçgeni tarafından belirlenmiş), üç resus makakların uyarım PBMC için kullanılan Toll benzeri reseptör ligandlarına tepki olarak farklı bütün kandan izole edildi ve C (50 ug / ml) ya da imikuimod (10 ug / ml) lipopolisakkarit (LPS) (10 ug / ml), poli I ile uyarılır. Hücreler ope (0 saat sonra hasat edildin şekiller) veya IFN ifade ölçümü için TLR stimülasyonu (kapalı şekillerin 3 saat sonra). Tip I, II ve III &#39;IFN transkript seviyeleri (solda) HKG GAPDH ΔCq ifadesi bir fonksiyonu olarak ya da kopya sayısı / ug RNA (sağ) olarak günlük 10 ölçekte gösterilir. Bu rakam aslında İnterferon Dergisi ve Sitokin Araştırma 28 yayımlanmıştır. <img alt="Tablo 1" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" width="700" /> Tablo 1:. İnsan IFN astar / prob seti dizileri ve reaksiyon bilgileri <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" target="_blank">bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Tablo 2" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" width="700" /> Tablo 2:. Rhesus makak IFN astar / prob seti dizileri ve reaksiyon bilgileri <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" target="_blank">bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Plazmid konsantrasyonu (FM) </td></tr><tr><td></td><td> Bir </td><td> B </td><td> C </td><td> D </td></tr><tr><td> IFN-α1 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α2 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α4 </td><td> 2500 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> IFN-α5 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α6 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td>0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α7 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α8 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α10 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α14 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α16 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α17 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α21 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ1 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ2 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ3 </td><td>250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-β </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-ω </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr></tbody></table> Tablo 3: Standart seyreltme seti konsantrasyon bilgileri. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> IFN Pr / Pb Setleri eklendi </td><td> Su hacmi ilave (mi) </td></tr><tr><td> NTC 1 </td><td> IFN-β, -ω, -λ3 </td><td> 85.7 </td></tr><tr><td> NTC 2 </td><td> IFN-α1, -α5 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 3 </td><td> IFN-α2 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 4 </td><td> IFN-α4 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 5 </td><td> IFN-α7 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td>NTC 6 </td><td> IFN-α6, -α8, -α10 </td><td> 85.7 </td></tr><tr><td> NTC 7 </td><td> IFN-α14, -α16 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 8 </td><td> IFN-α17 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 9 </td><td> IFN-α21, -λ1 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 10 </td><td> IFN-λ2 </td><td> 114.3 </td></tr></tbody></table> Tablo 4: NTC çalışma stok bilgileri karıştırır.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes at JoVE.com

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Yüksek verim Kantitatif Gerçek zamanlı RT-PCR Testi Türleri I ve III İnterferon Alttipleriyle İfadesi Profilleri belirlenmesi için

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

high-throughput-quantitative-real-time-rt-pcr-assay-for-determining

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.2K Görüntüleme.  US Food and Drug Administration. This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible. 

Video: High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

İnsan İmmün Yetmezlik Virüs çoğaltma Fitness belirlenmesi için İkili Büyüme Rekabet Analizi

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and protection to the underlying cells. Analysis of tears is an emerging area for the identification of biomarkers for the prediction, diagnosis, and prognosis of various ocular diseases. Tears are easily accessible and their collection is non-invasive. Therefore, advancing technologies are gaining prominence for identification of multiple analytes in tears to study changes in protein or metabolite composition and its association with pathological conditions. Tear cytokines are ideal biomarkers for studying the health of the ocular surface and also help in understanding the mechanisms of different ocular surface disorders like dry eye disease and vernal conjunctivitis. Bead based multiplex assays have the capability of detecting multiple analytes in a small amount of sample with a higher sensitivity. Here we describe a standardized protocol of tear sample collection, extraction and analysis of cytokine profiling using a bead based multiplex assay.

Analysis of tear film cytokines helps in studying various ocular diseases. Bead based multiplex assays are simple and sensitive and enable the testing of multiple targets in samples with small volumes. Here we describe a protocol for tear film cytokine profiling a using bead based multiplex assay.

Boncuk Multiplex tahlil için gözyaşı sitokin profilleri analizi dayalı

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification of lymphocyte subtypes is important for the study of immunology as well as diagnosis and treatment of various diseases. Currently, standard methods for classifying lymphocyte types rely on labeling specific membrane proteins via antigen-antibody reactions. However, these labeling techniques carry the potential risks of altering cellular functions. The protocol described here overcomes these challenges by exploiting intrinsic optical contrasts measured by 3D quantitative phase imaging and a machine learning algorithm. Measurement of 3D refractive index (RI) tomograms of lymphocytes provides quantitative information about 3D morphology and phenotypes of individual cells. The biophysical parameters extracted from the measured 3D RI tomograms are then quantitatively analyzed with a machine learning algorithm, enabling label-free identification of lymphocyte types at a single-cell level. We measure the 3D RI tomograms of B, CD4+ T, and CD8+ T lymphocytes and identified their cell types with over 80% accuracy. In this protocol, we describe the detailed steps for lymphocyte isolation, 3D quantitative phase imaging, and machine learning for identifying lymphocyte types.

We describe a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and a machine learning algorithm. Measurements of 3D refractive index tomograms of lymphocytes present 3D morphological and biochemical information for individual cells, which is then analyzed with a machine-learning algorithm for identification of cell types.

Etiket içermeyen lenfosit alt türlerinden üç boyutlu nicel faz Imaging'i kullanma tanımlaması ve öğrenme makine

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Bir yüksek-den geçerek Shigella-belirli bakterisidal tahlil

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to confirm rabies diagnosis but have only recently been accepted by the OIE (World Organisation for Animal Health) as a primary method to detect rabies infection. Real-time RT-PCR assays provide real-time data, and are closed-tube systems, minimizing the risk of contamination during setup. DNA intercalating fluorochrome real-time RT-PCR assays do not require expensive probes, minimizing the cost per sample, and when the primers are designed in conserved regions, assays that are specific across virus genera rather than specific to just one virus species are possible. Here we describe a pan-lyssavirus SYBR real-time RT-PCR assay that detects lyssaviruses across the Lyssavirus genus, including the most divergent viruses IKOV, WCBV and LLEBV. In conjunction with dissociation curve analysis, this assay is sensitive and specific, with the advantage of detecting all lyssavirus species. The assay has been adopted in many diagnostic laboratories with quality assured environments, enabling robust, rapid, sensitive diagnosis of animal and human rabies cases.

This real-time RT-PCR using dsDNA intercalating dye is suitable to diagnose lyssavirus infections. The method begins with RNA extracted from rabies suspected ante-mortem or post-mortem samples, detailing master mix preparation, RNA addition, setup of the real-time machine and correct interpretation of results.

Pan-Lyssavirus gerçek zamanlı RT-PCR Rabies tanı için

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.

Mikrobiyal Etkileşimlerin İncelemi için Yüksek İş-İş Ortağı Tahlilleri

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

Konak-Patojen Etkileşimlerini Araştırmak için Yüksek Verimli Transkriptom Analizi

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...