אנו מודים לד&quot;ר ויליאם Cashdollar, ומרכז קרן ההדמיה נורת&#39;ווסטרן ההדדית בדם מכון המחקר של ויסקונסין לעזרה עם בדיקות ההדמיה. כמו כן, אנו מודים לד&quot;ר דריה Ilatovskaya לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה ודיון מועיל. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומי לבריאות מענקי HL108880 (לAS) וDP2-OD008396 (לAMG).

הפרוצדורות המתוארות להלן אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) בבית הספר לרפואה של ויסקונסין והיו בהתאם למכונים הלאומי לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה. 1. בידוד של אב העורקים העכברוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חולדות עם isoflurane (אינדוקציה 5%, 1.5 עד 2.5% אחזקה) או אחר IACUC אושר שיטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החולדה במצב שכיבה. על מנת לחשוף את אברי הבטן, לעשות חתך קו האמצע הגחון קטן דרך העור והרקמה התת עורית הבטן. פדה גזת שימוש בעדינות להסיט את המעיים לחשוף את הווריד נבוב אב העורקים וכפי שמוצג באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, בוטה לנתח את אב העורקים מרקמת חיבור ומהווריד הנבוב. באמצעות תפר, לקשור את אב העורקים הקרובים ככל האפשר לכליות. לנתח על 1 - 2 סנטימטר של אב העורקים ולמקם אותו בחרוטי 15 מיליליטר ט&quot;ולהיות מכילים פיזיולוגית נורמלי תמיסת מלח (PSS; מ&quot;מ: 140 NaCl, 1.2 MgCl 2, 2 CaCl 2, 4.5 KCl, 6 גלוקוז, 10 HEPES) על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהאב העורקים מבודדים, להרדימו על פי פרוטוקולי IACUC אושרו. בסיום כל הלא-הישרדות נהלים להרדים בעלי חיים עמוקים מורדמים על ידי פתיחת בית החזה וגורם pneumothorax כדי להבטיח את מותו האנושי של בעלי החיים. 3 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה, הטה בסדר-מלקחיים, וmicroscissors לנתח את השומן ורקמת חיבור משל אב העורקים. ברגע שהאב העורקים הוא נקי, לחתוך את אב העורקים longitudinally ולמקם אותו בPSS על קרח לשימוש מאוחר יותר. </li></ol> 2. טעינת צבע ודגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 7 μl של 1 מ&quot;מ צבע AM Fluo-4, אשר מסופק בפתרון המבוסס על DMSO, לתוך צינורות בודדים μl 500 שכבר מכוסים בנייר אלומיניום. אחסן במקפיא ב -20 מעלות כדי לשמר את מאפייני הצבע לאורך זמן. הערה: אלה aliquoted כךlutions צריך להיות יציב במשך לפחות שישה חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש, מאפשר פתרונות הצבע להתחמם לRT לפני הפתיחה. הכן את הפתרונות לעבוד מייד לפני השימוש. אין לאחסן מגיב המדולל לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 7 μl של Fluo-4 צבע מוכן 1 מ&quot;מ AM המומס בתמיסת DMSO 450 ul של PSS המכיל סידן לא. הוסף 40 μl של 10% פתרון pluronic חומצה שאינה מבוסס DMSO לקוקטייל הטעינה כדי לעזור לפזר את acetoxymethyl אסטרים (בבוקר) ולשפר את הטעינה של צבע סידן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את aortas גזור לתוך 500 צינורות μl מכילים קוקטייל הטעינה (כמתואר ב2.3) עבור h 1. לכסות את כל הצינורות בנייר כסף ומניחים על שייקר מסתובב בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח על ייצור NO בכלי הדם, להשתמש צבע diacetate DAF-FM. דגירה אב העורקים בתמיסה המכילה 450 PSS μl, חומצת pluronic 40 μl ו -5 μl של 10 מ&quot;מ diacetate DAF-FM. בדומה לפרוטוקול הדגירה סידן (שתואר ב2.3), למקם את אב העורקיםבצינור 500 μl מכיל את פתרון NO-הצבע מכוסה בנייר הכסף ומניחים על שייקר מסתובב במשך 30 דקות ב 4 C ואחרי 30 דקות הבאות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אין ייצור נמדד, להשתמש באנדותל אין חוסם synthase, L-שם, כדי לחסום ייצור NO כשליטה כפי שמוצג באיור 4. להליך זה, להוסיף לקוקטייל (כפי שתואר על 2.5) L-שם 100 ננומטר במשך 30 דקות האחרונות של דגירה (ב RT). </li></ol> 3. פרוטוקול מיקרוסקופית פוטון סריקת לייזר שני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 1 שעות, לשטוף את אב העורקים 2 - 3 פעמים בPSS הנקי כדי להסיר צבע תאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את אב העורקים לצלחת מצופה סיליקון המכילה גם PSS הרגיל או 2 + חיץ Ca -חינם (תלוי בפרוטוקול הניסוי). הצמד את אב העורקים מטה אל ציפוי סיליקון עם adventitia במגע עם סיליקון (כלומר, לומן האנדותל נחשף לפתיחת המנה) באמצעות סיכות בצורת μ. לחלופין, להשתמש בעוגן Sliceרשת או דבק כדי לתקן את הרקמה. הערה: כדי להפחית את הלחץ וחפצים מכאניים אפשריים, העברה ולתקן אב העורקים בCa 2 + -חינם פתרון ולחכות 5-10 דקות לפני תחילת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר משאבת peristaltic או מזרק לצלחת מצופה סיליקון ליישום אוטומטי או ידני של תרופות או לשינוי הפתרון תאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת מתחת לפיסת מיקרוסקופ שני הפוטונים הזקוף האף, ולהתקין ולמקם 25 × (NA 1.05 ומרחק 2 מ&quot;מ עובד) עדשה אובייקטיבית מים טבילה מעל הדגימה. הערה: אם עדשה ספציפית זה אינה זמינה, להשתמש אובייקטיבי במיוחד מיוצר עבור שתי הדמיה פוטון, כי זה יכול להגדיל באופן דרמטי את הרזולוציה אות לעומת אובייקטיבי רגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את לייזר שני פוטונים באמצעות התוכנה (הלייזר מתחיל לשאוב ולהדליק). מנגינת עירור הלייזר 820 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות epifluorescence, לאתר את אב העורקים ולהתמקד במטרה במשטח האנדותל באמצעות התאמה גסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור מיקרוסקופ למצב סריקת לייזר שני פוטונים, על מנת להבטיח כי לייזר עירור מצב נעול, הגלאים-descanned אינם עוסקים ומסנני הפליטה מתאימים לספקטרום הפליטה הצפוי מותקנים. שים לב: כאן, FV10-MRL / R (495-540 ננומטר) היו בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל סריקה חי באמצעות כ 5% כוח לייזר ודק למקד את המטרה כדי להמחיש את תאי האנדותל. הערה: תאי האנדותל יציגו אות ניאון חזקה כאשר מודגרות בPSS הנורמלי. זה יהיה ניכר חלש כאשר כלי מודגרת במאגר ללא סידן. תאי האנדותל יהיו נוכחים בחלק העליון של אב העורקים נפתחו וניתן לראות את תאי שריר חלק, ממש מתחת לתאי האנדותל (ראה איור 2). בגלל כלי דם הם לא חלקים ואפילו לא, יהיו מקומות שבם שני תאי שריר חלק ותאי האנדותל קיימים. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתאים הם בפוקוס, תכנית תוכנת מיקרוסקופ כדי לאסוף תמונות רציפות במצב סריקה מהיר (סריקת סריקה, 512 x 512 פיקסלים עם חלון תדירות אוסף מסגרת של 1.1 ים). במקביל לFluo-4 הקרינה בבוקר, לאסוף מועבר תמונות אור כדי לזהות שינויים בהתכווצות כלי דם וטוב יותר לחזות את תנאי הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי האוסף של תמונות אות בסיסיות, לשנות את ריכוז יון Ca 2 + בפתרון החיצוני או לאט תחול סוכני גירוי תרופתיים באמצעות משאבת peristaltic תוך הדמיה. שים לב לעליית אות הניאון בתוך התאים הטעונים. הערה: תאי האנדותל להגיב לשינויים בזרימה, ובכך מומלץ להשתמש ביישומים למינרית נמוכים ובדיקת רכב לפני היישום של מפעילים תרופתיים של Ca 2 + או אין איתות. כדי לחשב מחדש סידן תוך תאי לערכי ריכוז ננומטר בכלי עמוסים Fluo-4 (קבוע דיסוציאציה לFluo-4 אנישל 345 ננומטר), עוצמת הקרינה יכולה להיות מוקלטת בתחילת מחקר ולאחר תוספת של ionomycin וMnCl 2. 4 </li></ol> 4. עיבוד תמונה וחישובים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוריד ולהתקין את חבילת פיג&#39;י עיבוד תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ התמונה בפיג&#39;י. על יבוא הקובץ, לפצל את הערוצים (אור מועבר ואות ניאון) כאשר תתבקשו לעשות זאת. השתמש באות הניאון רק לניתוח נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במסגרת תכנית פיג&#39;י, לחץ על הכרטיסייה לנתח ולגלול למטה לאפשרות הכלים. תחת אפשרות הכלים, למצוא את הכרטיסייה שאומרת מנהל החזר על השקעה ולחץ עליו; חלון חדש יופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי זה, לחץ על מדידות סט תחת הלשונית לנתח. בחר את המדידות הספציפיות של עניין. למדידות חולפות סידן, להשתמש באפשרות הערך האפור הממוצעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם כלי העקבות המעגלי, מתחיל לעקוב אחר האזורים של עניין (ROI) ולחץ על &quot;הוסף&quot; על מסך מנהל החזר על השקעה עבור כל ROI. ברגע שכל התאים של עניין כבר איתרו, בחלון מנהל ROI, בחר מדוד רב תחת הלשונית &quot;יותר&quot;. זכור גם לשמור את המדידות ישירות או להעתיק ולהדביק את כל מדידות אלה לגיליון אלקטרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> * להרחיב קובץ txt או גיליון אלקטרוני Excel מפיג&#39;י ולהעביר את המספרים לגיליון מקור חדש. הערה: לחלופין, להשתמש בכל תכנית כמו מגרש סיגמא או פריזמה לניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במסגרת תכנית מקור, השתמש מגרש → תפריט הקו + סמל להתבונן סקירה של כל התגובות חולפות. בטל את התאים מגיבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב מחדש מספר עקבות להיקף זמן (ציר X), להשתמש בערכי עמודת טור → הגדר ולהכפיל את מספר עמודת עקבות לתדר אוסף תמונה (במקרה שלנו 1.1s). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סטטיסטיקת → ניתוח בשורות לכל הקלטות שנבחרו לחישוב ממוצע (ציר Y) ועקבות שגיאת תקן. מגרש גרף סופי לקבוצה הנוכחית של תאי מגרש → קו + הסמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאהn חישוב חולף סידן מתואר כאחריו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרור סידן הכולל בתוך תכנית מקור, לחץ על גרף, ולאחר מכן להשתמש בתפריט ניתוח → חדו&quot;א → שלב. נפרד כולל של אזור תחת עקומה מופיע בתוצאה התחבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקינטיקה החולפת, לחץ על גרף, ולאחר מכן להשתמש בתפריט: Curve ניתוח → ללא יניארי Fit → בחר נתונים סט (לבחור ציר X נע בין מקסימום לסוף תגובת מעבר). התחל התאמת → בחר פונקצית → מעריכי Decay 1 → בוצע. הערה: מתאים מעריכי מופיע בחלון גרף ותוצאה התחבר. הנתונים שהתקבלו (ערכים) מייצגים סכום כולל של סידן שוחרר, וקינטיקה של ערוצי תיווך תגובת המעבר. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+2-photon+microscopy+to+understand+albuminuria.">Using 2-photon microscopy to understand albuminuria.</a> Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).</li><li>Burford, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+podocyte+calcium+in+glomerular+injury+and+disease.">Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease.</a> J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).</li><li>Palygin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+electrochemical+detection+of+ATP+and+H(2)O(2)+release+in+freshly+isolated+kidneys.">Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).</li><li>Ilatovskaya, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+analysis+and+calcium+imaging+in+the+podocytes+of+the+freshly+isolated.">Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated.</a> J Vis. Exp. In Press, (2015).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+superoxide+and+angiotensin+II+suppression+in+salt-induced+changes+in+endothelial+Ca2++signaling+and+NO+production+in+rat+aorta.">Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).</li><li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Plekha7+attenuates+salt-sensitive+hypertension+in+the+rat.">Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).</li><li>Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+gradients+in+single+smooth+muscle+cells+revealed+by+the+digital+imaging+microscope+using+Fura-2.">Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2.</a> Nature. 318, 558-561 (1985).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elastin+network:+its+relationship+with+collagen+and+cells+in+articular+cartilage+as+visualized+by+multiphoton+microscopy.">The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy.</a> J. Anat. 215, 682-691 (2009).</li><li>Sathanoori, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+modulates+endothelial+KLF2+through+activation+of+P2X4.">Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4.</a> Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).</li><li>Hall, A. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Multiphoton+Microscopy:+Focusing+Light+on+Acute+Kidney+Injury.">Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury.</a> Physiology. 29, 334-342 (2014).</li><li>Campese, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+sensitivity+in+hypertension.+Renal+and+cardiovascular+implications.">Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications.</a> Hypertension. 23, 531-550 (1994).</li><li>Cowley, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+nongenetic+determinants+of+salt+sensitivity+and+blood+pressure.">Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure.</a> Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).</li><li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hypertension+susceptibility+loci+on+rat+chromosome+12.">Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12.</a> Hypertension. 60, 942-948 (2012).</li><li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+multiple+causative+genes+at+a+single+GWAS+locus.">Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus.</a> Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).</li><li>Mattson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mutation+of+recombination+activating+gene+1+in+Dahl+salt-sensitive+rats+attenuates+hypertension+and+renal+damage.">Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).</li><li>Rudemiller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD247+modulates+blood+pressure+by+altering+T-lymphocyte+infiltration+in+the+kidney.">CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney.</a> Hypertension. 63, 559-564 (2014).</li><li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXM+-+a+new+tool+for+mapping+breast+cancer+risk+in+the+tumor+microenvironment.">CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment.</a> Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הסקירה ניסיונית. כדי להבין טובה יותר את התרומה של סידן ולא לפיזיולוגיה של כלי דם, שיטה חדשה שפותחה למדידה [Ca 2 +] אני ולא בתוך שריר חלק ותאי האנדותל של aortas שלם המבודד. יחד, פרוטוקול זה מורכב משלבים הבאים קריטיים: 1) בידוד והכנה מכאני (עיכול לא האנזימטית) של...

סידן הוא שליח שני יסודי בתוך תאי כלי דם כגון אנדותל ותאי שריר חלק. זה הגירוי העיקרי להתכווצות כלי דם ומשחק תפקיד מרכזי בהתרחבות כלי דם, כולל ההשפעות שלה שלא בדור בתוך האנדותל. בשל מגבלות של טכנולוגיות הדמיה, זה כבר כמעט בלתי אפשרי להתבונן טיפול סידן בתוך הכלי שלם. הפיתוח של שתי מערכות הדמיה פוטון ויצירת סידן חדש או NO צבעי תיוג, מאפשר תמונה בעומק ורזולוציה מספיק כדי להתחיל להבין את דינמיקת סידן וייצור NO בתוך כלי הדם. לאחרונה מיקרוסקופ שני פוטונים יושם ברקמות, איברים ומחקרים בבעלי חיים גם כל בגלל היכולת מעולה שלו לחדור לעומק רקמות עם הקרינה רקע נמוכה ורגישות גבוהה אות. 1,2 הספקטרום הצר של שני עירור הפוטון בIlluminatמוקד היון והשימוש בגלאים-descanned הלא הם הסיבות מדוע שתי מיקרוסקופיה הפוטון היא מעולה למיקרוסקופיה confocal המסורתית. מיקרוסקופיה confocal לא יכולה לייצר תמונות באיכות גבוהה בעומק הרקמה ההכרחי בשל אוטומטי הקרינה והפיזור של אור מחוץ למוקד לחריר confocal. כתוצאה מכך, פיתחנו שיטה באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים למדוד [Ca 2 +] אני איתות וייצור NO בתאים שלמים, פרט כלי דם עם רזולוציה גבוהה ויחס אות לרעש נמוך.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DAF-FM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-23842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo 4 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F14217</td>
			<td>500&#181;l in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68 solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Name</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>0665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Fluoview FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai HP DeepSee-OL&#160;</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td>Ti:sapphire laser 690nm &#8212; 1040nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV10-MRL/R&#160;</td>
			<td>495 to 540 nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25&#215; water-immersion objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPL25XWMP</td>
			<td>N.A. 1.05 and working distance 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Anchor grid&#160;</td>
			<td>Warner Instrument&#160;</td>
			<td>SHD-27LH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other basic reagents&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon imaging of intracellular ca2+ handling and nitric oxide production in endothelial and smooth muscle cells of an isolated rat aorta

סידן הוא רגולטור חשוב מאוד של תהליכים פיסיולוגיים רבים ברקמות כלי דם. רוב פונקציות אנדותל ושריר החלק תלויות במידה רבה בשינויים בסידן תוך תאי ([Ca 2 +] i) ותחמוצת חנקן (NO). על מנת להבין כיצד [Ca 2 +] אני, לא ומולקולות במורד הזרם מטופלות על ידי כלי דם בתגובה לvasoconstrictors ומרחיבי כלי דם, שפיתחנו שיטה חדשנית שחלה בסידן תיוג (או אי-תיוג) צובע עם שתי מיקרוסקופיה הפוטון כדי למדוד טיפול סידן (או ייצור NO) בכלי דם בודדים. שתואר כאן הוא הליך צעד-אחר-צעד מפורט המדגים איך לבודד את אב העורקים מעכברוש, סידן תווית או NO בתאי האנדותל או שריר חלק, וסידן תמונה ארעיים (או ייצור NO) באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים הבאים פיסיולוגי או גירויים תרופתיים. היתרונות של שימוש בשיטה הנן רב-פי: 1) זה אפשרי בו זמניתly למדוד ארעיים סידן בשני תאים אנדותל ותאי שריר חלק בתגובה לגירויים שונים; 2) זה מאפשר לתאי האנדותל תמונה ותאי שריר חלק בהגדרה האם שלהם; 3) בשיטה זו היא רגישה מאוד לסידן תוך תאי או ללא שינויים ומייצר תמונות ברזולוציה גבוהות למדידות מדויקות; ו -4 גישה מתוארת) יכולה להיות מיושמת למדידה של מולקולות אחרות, כגון מיני חמצן תגובתי. לסיכום, יישום של מיקרוסקופיה פליטת לייזר שני פוטונים כדי לפקח ארעיים סידן ואין ייצור בתאי האנדותל ושריר החלק של כלי דם בודדים סיפק נתונים כמותיים באיכות גבוהה וקידם את ההבנה של מנגנוני ויסות תפקוד כלי דם שלנו.

על מנת להעריך את התרומה של סידן לפיזיולוגיה של כלי דם (התרחבות והתכווצות כלי דם) בצורה מדויקת, פרוטוקול נועד לטעון צבעי סידן לשני תאי האנדותל ותאי שריר חלק בaortae שלם המבודד. הניסיוני הכללי להגדיר מתואר באיור 1, מציג את האסטרטגיה הבסיסית לבידוד והכנה של כלי השי?...

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta at JoVE.com

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

הדמיה שני פוטונים של תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; תאי טיפול ותחמוצת חנקן ייצור בהאנדותל ושריר חלק של עכברוש אב העורקים מבודדים

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

two-photon-imaging-intracellular-ca2-handling-nitric-oxide-production

Research

JoVE Journal

Biology

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

11.2K Views.  Medical College of Wisconsin. Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta. 

Video: Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

מיקוד Ca 2 + איתור חלוף של שריר חלק

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

בידוד של האדם עורקי טבורי תאים שרירים חלקים (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

מדידה של תפקוד של שריר חלק ברקמות מבודדות אמבט-היישומים למחקר פרמקולוגיה

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

צמודים זיהוי פנים של Nitric Oxide ו Superoxide ב שכבת האנדותל של העורקים Intact

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

מדידת תנודות סידן בתוך הרטיקולום sarcoplasmic של בתאי שריר חלק בתרבית באמצעות מבוססי סריג הדמיה Confocal

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

פיתוח ואפיון של<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; וייצור Nitric Oxide

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

Murine אבי העורקים למחוץ פגיעה: יעיל<em&gt; בויבו</em&gt; מודל של תאים שרירים חלקה תפוצת ו אנדותל פונקציה

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...