מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות להעניק 1K22AI097291-01 ועל ידי המרכז הלאומי לקידום מדעי Translational של המכון הלאומי לבריאות בפרס מספר UL1TR000433. אנחנו גם מכירים פרופ &#39;אירווין דארל ב- MIT ופרופ&#39; מתיאס סטפן בפרד האצ&#39;ינסון מרכז הסרטן על תרומתם בעבודה הראשונית על חלקיקי החיסון ועכברים הטרנסגניים OT-I / לוק.

כל הניסויים שתוארו בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת האוניברסיטה על שימוש וטיפול של בעלי חיים (UCUCA) באוניברסיטת מישיגן ומבוצעים על פי המדיניות והנחיות שנקבעה. 1. סינתזה ואפיון של ICMVs Co-עמוס חלבון Antigen וAdjuvant מולקולות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב 1: 1 יחס טוחנת של 1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (dOPC) ו1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [4 (-maleimidophenyl p) butyramide] (MPB) בכלורופורם, שמירה על סך סכום שומנים ב1.26 μmol ליצווה (כלומר, 500 מיקרוגרם של dOPC ו 630 מיקרוגרם של MPB) בבקבוקון 20 מיליליטר זכוכית (קוטר = 28 מ&quot;מ וגובה = 61 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תרופות lipophilic, כגון השומנים monophosphoryl (MPLA) או צבעי lipophilic (למשל, האם), לפתרון השומנים בריכוז רצוי. ביסודיות להסיר את הממס האורגני על ידי טיהור עם nitroge יבש נוסףn גז והצבת הדגימות תחת ואקום O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מימה סרט השומנים על ידי הוספת 200 μl 10 פרופאן מ&quot;מ BIS-טריס (BTP, pH 7.0) המכיל תרופות מסיסים במים (לדוגמא, אנטיגנים חלבון). וורטקס במשך 10 שניות כל 10 דקות במשך שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התוכן מזכוכית בקבוקון לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר, דגימות מקום באמבט קרח-מים, וsonicate ברציפות במשך 5 דקות באמצעות עצמת 40% הגדרה בsonicator בדיקה-קצה / 20 kHz 125 W. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 μl של 150 מ&quot;מ dithiothreitol (DTT) לכל מנה (עובד ריכוז 2.4 מ&quot;מ), מערבולת, ו צנטריפוגות בקצרה באמצעות microcentrifuge שולחן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של 200 מ&quot;מ CaCl 2 ולערבב עם פיפטה (עובד ריכוז 33 מ&quot;מ). דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי לאפשר crosslinking של MPB המכיל שכבות שומנים עם DTT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות 20,000 XG במשך 15 דקות, להסיר את supernatant, וגלול ב200 μl של ddiH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.7 ו צנטריפוגות שוב לאחר שטיפת O השנייה ddiH 2 כדי להסיר CaCl 2, DTT unreacted, וחומרי מטען unencapsulated מsupernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ג / מיליליטר של 2 kDa פוליאתילן גליקול-תיאול (PEG-SH) בddiH 2 O. Resuspend כל דגימת ICMV בפתרון של PEG-SH 100 μl ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שני 2 O שוטף ddiH (שלב 1.7) וresuspend גלולה הסופי ICMV בPBS ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. לפני השימוש, לערבב את ההשעיה ICMV, כמו חלקיקים עשויים ליישב לתחתית לאחר אחסון ממושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיון של חלקיקים, להסיר aliquot קטן (~ 10%) של ICMVs מכל אצווה ולדלל באופן אינדיבידואלי בנפח כולל של 1 מיליליטר של ddiH 2 O. הנח מדגם יחיד בגודל Zetasizer חלקיקי תא ומידה, מדד polydispersity, ופוטנציאל זטה של ​​הדגימות באמצעות מערכת zeta פוטנציאל מדידה (על פי הפרוטוקול של היצרן) DLS ו. </li></ol> 2. בחינת לימפה צומת הניקוז של הקרינה מתויגות ICMVs עם מיקרוסקופיה confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת ICMVs עמוסה אנטיגן fluorophore מתויג וצבע ניאון lipophilic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חלבון מתויג fluorophore, כגון ovalbumin הגיב באסתר 555-succinimidyl אלקסה פלואוריד, על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין ICMVs מתויג עם fluorophore במעטפת השומנית, להוסיף צבע lipophilic ניאון, (למשל, 1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3 &#39;, 3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, (לא)) שלב במהלך הכנת סרט השומנים ( 1.2) בשעה 0.05% כמות שומנים טוחנות. ללחות שומנים סרט (שלב 1.3), המכיל מאגר השימוש אנטיגן fluorophore מתויג, וסינתזת ICMV מלאה כפי שמתואר בשלבים 1.4-1.11. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממשל תת עורית של חלקיקים בבסיס זנב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר באמצעות זרימה מאדה מבוקרת מצוידים בתא אינדוקציה utilizing 3% isoflurane ו -1.5 ליטר / דקת זרימת חמצן על פי IACUC אישר פרוטוקול בעלי חיים. ברגע שהעכבר הוא מחוסר הכרה, בצע את השלבים הבאים במהירות לפני ההרדמה מתפוגג כדי לאפשר גישה אופטימלית לאתר של ההזרקה ולמזער אי נוחות לבעלי החיים. לחלופין, להשתמש בחרטום הולם נכון כדי לשמור על הרדמה. אם עכברים מורדמים למשך זמן ארוך יותר מ -5 דקות, להחיל סיכה העין דרושה כדי למזער גירוי לאחר ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסס את בסיס הזנב עם אתנול 70% כדי לטהר ולהרטיב את חלק הפרווה השיער הרטוב לחשוף תיקון קטן של עור גלוי, אשר יכול לשמש כדי לחזות את המחט מתחת לעור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו השעיה הזרקת חלקיקים המכילה כמות רצויה של אנטיגן ומשלים לשל מינון חיסון 100 μl בPBS (למשל, 10 מיקרוגרם OVA ו0.3 מיקרוגרם לMPLA של מינון הזרקה 100 μl נעשו שימוש ב6,9 העבר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את int ההשעיה חלקיקיםמזרק OA עם מחט G 27-29 ולהכניס את המחט בבסיס הזנב (~ 5 מ&quot;מ מקו השיער) עם השיפוע כלפי מעלה ולהזריק 50 μl של ההשעיה חלקיק 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן מספר שניות ללחץ להשוות כדי למנוע חזרה זרימה מוגזמת ולמשוך את המחט. חזור על ההזרקה בצד השני של בסיס הזנב האחר למקד שני LNs מפשעתי הניקוז. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת cryosections בלוטה לימפה ובדיקה עם מיקרוסקופ confocal. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם CO 2 מחנק, ואחריו pneumothorax המושרה על פי IACUC אישר פרוטוקול בעלי חיים. לחלץ LNs מפשעתי על פי פרוטוקול הפגין בבדויה 23 ולשטוף את הדם על ידי הצבת הרקמות ב 1 מיליליטר של 4 מעלות צלזיוס PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוג PBS מהרקמות עם רקמות ולמקם את הרקמה בcryomolds רקמה (10 x 10 x 5 מ&quot;מ 3) מראש מלא לראש עם אוקטובר הקפאת 24 בינוניים. Snap להקפיא את TISלתבוע בלוק בחנקן נוזלי למשך 30 שניות. לחלופין, למקם את בלוק רקמה על קרח יבש למשך 30 דקות. אחסן רקמה קפוא במקפיא -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך קטעי רקמה 5-10 מיקרומטר עבים בcryostat להגדיר ב -20 ° C. 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת צורך, לבצע תיוג immunofluorescence, ולבחון את הרקמה עם מיקרוסקופיה confocal כפי שהודגמה בעבר 24. </li></ol></li></ol> 3. הרחבת ניטור של אנטיגן ספציפי, לוציפראז להביע תאי CD8 + T לאחר Nanoparticle חיסון עם כל חיה הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של OVA -specific 257-264, תאי CD8 + T-לבטא לוציפראז מעכברים מהונדסים OT-I / לוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר מהונדס OT-I / לוק עם CO 2 מחנק ולגרום pneumothorax לפי IACUC אישר פרוטוקול בעלי חיים. לקצור את הטחול באופן סטרילי על ידי הגישה חלל הצפק ובזהירות ניתוק הרקמה מהלבלב 23, ומקום 5 מיליליטר של 4 מעלות צלזיוס PBS + 2% FBS להעברה למכסת מנוע בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הטחול במסננת ניילון 70 מיקרומטר על שפופרת 50 מיליליטר חרוטי צנטריפוגות (עד 3 טחולים בכל פעם). באמצעות בוכנה של מזרק 3 מיליליטר, לטחון את התאים דרך המסננת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הבוכנה ואת המסננת עם PBS + 2% FBS וזורקים. תביא את הנפח הכולל עד 10 מיליליטר / טחול בשפופרת 50 מיליליטר, לקחת דגימה קטנה של ההשעיה התא לספור עם hemocytometer, וצנטריפוגות במשך 10 דקות ב 300 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות ערכת בחירה זמינה מסחרי מגנטית שלילית, לבודד את אוכלוסיית תאי CD8 + T על ידי ביצוע הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפת תאים עם PBS, לספור את מספר תאי CD8 + T מבודדים. כדי להעריך טוהר של תאי CD8 + T המבודדים, דגירה ~ 20,000-30,000 תאים ב -20 μl של CD16 עכבר / 32 נוגדן (0.025 מ&quot;ג / מיליליטר) במשך 10 דקות, ולאחר מכן להוסיף 20 μl של נוגדן αCD8-APC (0.005 מ&quot;ג / מיליליטר) דגירה במשך 30 דקות. פrform כל incubations על 4 מעלות צלזיוס בPBS + 1% w / v BSA. ביצוע ניתוח cytometric זרימה 25. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מאמצת של תאי CD8 + T מבודדים ויזואליזציה של פוסט הרחבת החיסון שלהם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע העברת מאמצת של תאים המבודד OT-I / לוק CD8 + T לC57BL / 6 עכברים נאיביים על ידי מתן 1-10 × 10 5 תאים בנפח 200 μl של PBS באמצעות הזרקה לוריד זנב וריד 22 (יום -1). בהתחשב בכך שתיקוני הפרווה ועור שחור בעכברי C57BL / 6 עלול להפריע לאות bioluminescent, לבקן המגולח עכברי C57BL / 6 הם אידיאליים עבור מחקרים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר יום אחד (יום 0), לנהל את החיסון כפי שתואר לעיל (סעיף 2.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נהל 150 מ&quot;ג של luciferin למשקל גוף עכבר קילוגרם intraperitoneally ב300 μl נפח של PBS. לאחר 10 דקות, להרדים את העכברים עם isoflurane (כמו בשלב 2.2.1) ולדמיין תאי OT-I / לוק CD8 + T על ידי רכישת אות פליטת אור למשך 5-10 דקות wה- i מערכת הדמיה חיה שלמה (IVIS; מתייחס לווילסון 26 להדרכה מפורטת). חזור על פי צורך למחקרים ארוכי טווח. </li></ol></li></ol> תאי CD8 + T 4. פפטיד-MHC tetramer הכתמה של PBMCs לניתוח של אנטיגן ספציפי הערה: הליך הפרוטוקול הבא יכול להתבצע באמצעות או / 6 עכברים C57BL הועברו adoptively עם תאי OT-I / לוק CD8 + T או C57BL עכברים / 6 ללא העברת המאמצת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודת זמן רצויה לאחר חיסון, לאסוף כ -100 μl דם (4-6 טיפות) מעכברים באמצעות טכניקת דימום submandibular 27 לתוך צינור מצופה K 2 EDTA ולהפוך כמה פעמים כדי למנוע קרישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את דם 100 μl לצינור microcentrifuge, להוסיף 1 מיליליטר של חיץ תמוגה, ודגירה של 2 עד 3 דקות כדי להסיר תאי דם אדומים (RBCs). צנטריפוגה דגימות במשך 5 דקות ב 1500 XG ולהסיר את supernatant. אם גלולה עדייןppears האדום (המצביע על ההסרה חלקית של תאי דם אדום), לחזור על שלב תמוגה עם דגירה קצרה (&lt;1 דקות) של מאגר תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את PBMCs נותר עם 1 מיליליטר של חיץ FACS (PBS + 1% w / v BSA) וצנטריפוגות ב 1500 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ו resuspend המדגם ב -20 μl של CD16 / 32 נוגדן עכבר (0.025 מ&quot;ג / מיליליטר) כדי לחסום נוגדן ספציפי ותיווך FCR מחייב. דגירה של 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התאים מצינורות microcentrifuge ל 4 מיליליטר צינורות FACS סיבוב תחתון. הוסף 20 μl של H-2K ב פתרון OVA tetramer-SIINFEKL-PE לפי המפרט של היצרן לכל דגימה ודגירה במשך 30 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הקוקטייל של הנוגדנים (למשל, נוגדני αCD8-APC, αCD44-FITC, וαCD62L-PECy7 (0.005, 0.005, 0.002 ומ&quot;ג / מיליליטר ריכוז, בהתאמה)). הוסף 20 μl לכל דגימת ניסוי, ודגירה של 20 דקות על קרח. הכן בקרות fluorophore יחידים על ידי להbeling תאים עם כל tetramer מתויג fluorophore או נוגדן בריכוז שצוין לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2 פעמים עם חיץ FACS וresuspend גלולה הסופי במאגר FACS המכיל 2 מיקרוגרם / מיליליטר של DAPI. התאים מוכנים כעת לcytometry זרימה (ניתן למצוא את פרטים ודוגמאות בScheffold 25) ניתוח. </li></ol>

פרקין אלמר סיפק את עלות הייצור שנגרם במהלך הפרסום של מאמר זה.

הפרוטוקול האמור במאמר זה מתאר את הסינתזה ואפיון של מערכת ננו-חלקיקים המבוססים על שומנים חדשה, המכונה ICMVs, ומספק את התהליך של אימות אפקטיבי של ניסוחים חיסון המבוסס על ננו-חלקיקים לגרום לתגובות תא אנטיגן הספציפי CD8 + T. סינתזת ICMV תושלם בכל המצב המימי, וזה יתרון גדול לעומת ...

פיתוח חיסון מסורתי בעיקר העסיק את הגישה האמפירית של ניסוי וטעייה. עם זאת, עם ההתפתחות האחרונה של מגוון רחב של ביו-חומרים וגילוי של גורמים מולקולריים של הפעלה חיסונית, ניתן כיום לעצב באופן רציונלי ניסוחים חיסון עם רמזי biophysical וביוכימיים הנגזרים מגורמי המחלה 1,2. בפרט, פלטפורמות משלוח הסמים חלקיקים שונות נבדקו כנישאי חיסון כפי שהם יכולים להיות שותף מלא באנטיגנים מקטע וסוכני immunostimulatory, להגן על רכיבי חיסון משפלה, ולשפר את שיתוף מסירתם לאנטיגן תאי מציגים (נגמ&quot;שים) המתגוררים בהלימפה בלוטות (LNs), ובכך למקסם את הגירוי וההפעלה 3-5 חיסוניים. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים את הסינתזה של מערכת &quot;מחקה לפתוגן&quot; ננו-חלקיקים, המכונה שלפוחית ​​interbilayer-crosslinked multilamellar (ICMVs), שכבר הוכיח בעבר כplatfor חיסון חזקמ &#39;לדיבוב של הלימפוציטים חזקים T ציטוטוקסי (CTL) ותגובות חיסוניות הלחות בשני תאי רקמה מערכתיים ורירית 6-9. בפרט, חיסון עם ICMVs הושג משופר באופן משמעותי את רמות נוגדנים בסרום נגד אנטיגן מלריה, בהשוואה לחיסון עם adjuvants הקונבנציונלי (לדוגמא, אלום וMontanide) 7 וגם עורר תגובות CTL חזקות נגד תאים סרטניים ודגמי אתגר נגיפיים בעכברים 9. כאן, באמצעות ICMVs כמערכת חיסון ננו-חלקיקי מודל, אנו מתארים שיטות לאפיון של ננו-ניסוחים חיסון, כולל גודל חלקיקים ומדידות פוטנציאל זטה ומעקב של סחר בחלקיקים לLNs ניקוז (dLNs) ניצול ההדמיה confocal של רקמות cryosectioned 7. בנוסף, אנו מציגים שיטה של ניתוח הרחבת תגובות CTL בעכברים לאחר העברת מאמצת של תאי CD8 + T אנטיגן הספציפי להביע לוציפראז 9,10 מבוססת הדמיה כל-חיה. לבסוף, אנו דהצביעת tetramer סופר של תאים ההיקפיים mononuclear הדם (PBMCs) לכימות אורך של תגובות תא T אנדוגני בעכברים שחוסנו בחלקיקים 6,9. ICMVs הוא ניסוח ננו-חלקיקים המבוססים על שומנים מסונתזים על ידי היתוך מבוקר של יפוזומים פשוטים למבני multilamellar, אשר לאחר מכן התייצבו כימי על ידי קבוצות ראש פוספוליפידים cross-linking פונקציונליות maleimide בתוך שכבות שומנים עם dithiol crosslinkers 6. ברגע שICMVs מסונתזים, חלק קטן של חלקיקים יכול לשמש כדי לקבוע את גודל חלקיקים ופוטנציאל זטה (כלומר, תשלום פני השטח של חלקיקים) עם פיזור אור דינמי מערכת (DLS) ומנתח פוטנציאל זטה. DLS אמצעי שינויים בפיזור אור בהשעיות חלקיקים, המאפשרים קביעת מקדם הדיפוזיה והגודל הידרודינמית של חלקיקים 11. השגת גודל חלקיקים עקבי מיצווה לסינתזה אצווה היא קריטיתמאז גודל חלקיקים הוא אחד הגורמים העיקריים המשפיעים על הניקוז לימפטי של חלקיקי חיסון לdLNs וספיגה סלולרית לאחר מכן על ידי נגמ&quot;שים 12,13. בנוסף, ניתן להשיג פוטנציאל זטה על ידי מדידת המהירות של החלקיקים כאשר זרם חשמלי מוחל, המאפשרת קביעת ניידות electrophoretic של חלקיקים וחלקיקי משטח תשלום 11. הבטחת ערכי פוטנציאל זטה עקבית של חלקיקים היא חשובה שכן תשלום של חלקיקי משטח קובע יציבות colloidal, שבה יש השפעה ישירה על פיזור חלקיקים במהלך אחסון ולאחר in vivo ממשל 14,15. על מנת לעקוב אחר חלקיק הלוקליזציה לdLNs, יכול להיות מתויג ICMVs עם fluorophores הרצויה כולל צבעי lipophilic ואנטיגנים קוולנטית מתוייגים. בעקבות חיסון, יכולים להיות מורדמים עכברים בנקודות זמן שונים, dLNs כריתה, cryosectioned, וניתחו עם מיקרוסקופיה confocal. טכניקה זו מאפשרת הדמיה של דראי הלימפהנינג של שני נשאי חיסון ננו-חלקיקים ואנטיגן לdLNs. בנוסף יכולים להיות מוכתמים סעיפי הרקמות עם נוגדנים שכותרתו fluorescently ומנוצל כדי לקבל מידע נוסף, כגון סוגים של תאים הקשורים לאנטיגן והיווצרות מרכזים נבטי כפי שהראינו בעבר 7. ברגע שסינתזת החלקיקים היא מותאמת והסחר לdLNs הוא אישר, חשוב לאמת דיבוב של in vivo הרחבת CTL. על מנת לנתח את הדיבוב של תאי CD8 + T אנטיגן הספציפי בתגובה לחיסון ננו-חלקיקים, שנוצלנו אנטיגן מודל, ovalbumin (OVA), עם OVA 257-264 פפטיד (SIINFEKL) epitope תא CD8 + T immunodominant, המאפשר ניתוח מפורט חיסוני של תגובות תא T אנטיגן הספציפי ל16,17 פיתוח חיסון ראשוני. בפרט, לחקור את הדינמיקה של התרחבות ונדידה של תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי, יש לנו שנוצרומודל עכבר כפול מהונדס על ידי חציית הגחלילית בלוציפראז להביע עכברים הטרנסגניים (לוק) עם עכברים הטרנסגניים OT-לי שיש תאי CD8 + T עם T-cell קולט (TCR) ספציפי לSIINFEKL (בשיתוף עם H-2K ב). מעכברי OT-I / לוק אלה, להביע לוציפראז, יכולים להיות מבודדים תאי OT-אני CD8 + T ומוכנה להעברת מאמצת לעכברי C57BL / 6 נאיביים. ברגע שהזרע, חיסון מוצלח עם חלקיקים המכיל OVA יגרום הרחבת תאי T הועברו, אשר יכול להיות במעקב על ידי ניטור אות פליטת אור עם 9,10 מערכת הדמיה חיה שלמה. טכניקת הדמיה זה לא פולשנית כל הגוף כבר בשימוש עם אנטיגנים נגיפיים או גידול אחרים ב18-20 העבר, חושפת תהליכים מעורבים בהרחבת T תא ברקמות הלימפה והפצה לרקמות היקפית באופן אורך. משלים לניתוח adoptively תאי CD8 + T אנטיגן הספציפי הועברו, endogenoתגובות תא T לפרסם חיסון ניתן לבדוק עם מורכב פפטיד-גדול histocompatibility (MHC) assay tetramer 21, שבו מורכב tetramer פפטיד-MHC, מורכב מארבע כיתת MHC-מתויג fluorophore אני מולקולות עמוסות epitopes פפטיד, מועסק כדי לאגד TCR ותווית תאי CD8 + T באופן אנטיגן ספציפי. Assay tetramer פפטיד-MHC יכול להתבצע גם במחקרי נתיחה לאחר מות מסוף לזהות תאי CD8 + T אנטיגן הספציפי בהלימפה ורקמות היקפית או במחקרים ארוכי טווח עם תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) המתקבלים מהדם סידורי מושך. לאחר מכתים ימפוציטים עם tetramer פפטיד-MHC, cytometry זרימת הניתוח מבוצע ניתוחים מפורטים על הפנוטיפ של תאי-ההרג או כימות של התדר שלהם בין תאי CD8 + T.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>870012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD&#8482;) (MPLA)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>699800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass vials</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>0334125D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Symphny Vacuum Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin (OVA)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>3054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris Propane (BTP)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator (125W/20kHz)</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SH-2000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer Cuvettes</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A37571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT freezing medium&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cryomolds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albino C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-1 C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>003831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep&#8482; Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS&#174; whole animal imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2EDTA tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10492-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD16/32 Fc Block</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>14-0161-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-2Kb OVA Tetramer</td>
			<td>MBL</td>
			<td>TS-5001-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8-APC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44-FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD62L-PECy7</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>25-0621-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8417-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyAn Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-animal imaging and flow cytometric techniques for analysis of antigen-specific cd8+ t cell responses after nanoparticle vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

הצעדים מעורבים בסינתזה של ICMVs הם באיור 1 6. בקצרה, סרט שומנים המכילים כל תרופות lipophilic או צבעי ניאון הוא התייבשות בנוכחות תרופות הידרופילי. קטיונים דו ערכיים, כגון Ca 2 +, מתווספים לנהוג היתוך של יפוזומים אניוני לתוך שלפוחית ​​multilamellar. Dithiol crosslinker, כגו?...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination at JoVE.com

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

טכניקות הדמיה כל-החיה והזרימה Cytometric לתגובות ניתוח של אנטיגן ספציפי CD8 + T תא לאחר Nanoparticle חיסון

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

whole-animal-imaging-flow-cytometric-techniques-for-analysis-antigen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.1K Views.  University of Michigan. We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Video: Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

ניתוח בידוד תזרים Cytometric של האדם תאים האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in B-cell and plasma-cell production of antibodies, and detecting and eliminating cancer cells. The development of MHC-tetramer staining of antigen-specific T cells analyzed by flow cytometry has revolutionized our ability to study and understand the immunobiology of T cells. While extremely useful for determining the quantity and phenotype of antigen-specific T cells, flow cytometry cannot determine the spatial localization of antigen-specific T cells to other cells and structures in tissues, and current disaggregation techniques to extract the T cells needed for flow cytometry have limited effectiveness in non-lymphoid tissues. In situ MHC-tetramer staining (IST) is a technique to visualize T cells that are specific for antigens of interest in tissues. In combination with immunohistochemistry (IHC), IST can determine the abundance, location, and phenotype of antigen-specific CD8 and CD4 T cells in tissues. Here, we describe a protocol to stain and enumerate antigen-specific CD8 T cells, with specific phenotypes located within specific tissue compartments. These procedures are the same that we used in our recent publication by Li et al., entitled &#34;Simian Immunodeficiency Virus-Producing Cells in Follicles Are Partially Suppressed by CD8+ Cells In Vivo.&#34; The methods described are broadly applicable because they can be used to localize, phenotype, and quantify essentially any antigen-specific CD8 T cell for which MHC tetramers are available, in any tissue.

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Here, we describe a method that combines in situ MHC-tetramer staining with immunohistochemistry to determine localization, phenotype, and quantity of antigen-specific T cells in tissues. This protocol is used to determine the spatial and phenotypic characteristics of antigen-specific CD8 T cells relative to other cell type and structures in tissues.

בחיי עיר MHC-tetramer מכתים וניתוח כמותי כדי לקבוע את מיקום שפע, ותפקיד של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים ברקמות

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

אופטימיזציה אינטרפרון-גמא ELISpot Assay מידה תגובות תא T במודל שפן לאחר החיסון

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of pathogens. Therefore, the frequency of antigen-specific CTLs is indicative of the strength of the T cell response against a specific antigen. Such analysis is important in basic immunology, vaccine development, cancer immunobiology and the adaptive immunology. In the vaccine field, the CTL response directed against components of a viral vector co-determines how effective the generation of antigen-specific cells against the antigen of interest (i.e., transgene) is. Antigen-specific CTLs can either be detected by stimulation with specific peptides followed by intracellular cytokine staining or by the direct staining of antigen-specific T cell receptors (TCRs) and analysis by flow cytometry. The first method is rather time-consuming since it requires sacrificing of animals to isolate cells from organs. Also, it requires isolation of blood from small animals which is difficult to perform. The latter method is rather fast, can be easily done with small amounts of blood and is not dependent on specific effector functions, such as cytolytic activity. MHC tetramers are an ideal tool to detect antigen-specific TCRs.
Here, we describe a protocol to simultaneously detect antigen-specific CTLs for the immunodominant peptides of the viral vector VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) and transgenes (OVA, HPV 16 E7, eGFP) by MHC I tetramer staining and flow cytometry. Staining is possible either directly from blood or from single cell suspensions of organs, such as spleen. Blood or single cell suspensions of organs are incubated with tetramers. After staining with antibodies against CD3 and CD8, antigen-specific CTLs are quantified by flow cytometry. Optionally, antibodies against CD43, CD44, CD62L or others can be included to determine the activation status of antigen-specific CD8+T cells and to discriminate between na&#239;ve and effector cells.

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Here, we present a protocol for the ex vivo qualitative detection of antigen-specific CD8+ T cells. Analysis is possible with single cell suspensions from organs or from small amounts of blood. A broad range of studies require the analysis of cytotoxic T cell responses (vaccination and cancer immunotherapy studies).

כימות סימולטני של CD8 וקטור נגד ו- Anti-transgene-ספציפי+ T תאים דרך MHC אני Tetramer מכתים לאחר החיסון עם וקטור ויראלי

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

תפירה Vivo ציטורעילות Assays ללמוד אימונומימינינס ב-CD8 התגובות הספציפיות לגידול של תאים

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

בידוד של עכבר כליות תושב CD8+ תאי T לניתוח ציטומטריה זרימה

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine (BrdU) marks cells that are in or recently completed S-phase, and carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) detects daughter cells after division. However, these dyes do not allow identification of the cell cycle phase at the time of analysis. An alternative approach is to exploit Ki67, a marker that is highly expressed by cells in all phases of the cell cycle except the quiescent phase G0. Unfortunately, Ki67 does not allow further differentiation as it does not separate cells in S-phase that are committed to mitosis from those in G1 that can remain in this phase, proceed into cycling, or move into G0.
Here, we describe a flow cytometric method for capturing a &#34;snapshot&#34; of T cells in different cell cycle phases in mouse secondary lymphoid organs. The method combines Ki67 and DNA staining with major histocompatibility complex (MHC)-peptide-multimer staining and an innovative gating strategy, allowing us to successfully differentiate between antigen-specific CD8 T cells in G0, in G1 and in S-G2/M phases of the cell cycle in the spleen&#160;and draining lymph nodes of mice after vaccination with viral vectors carrying the model antigen gag of human immunodeficiency virus (HIV)-1.
Critical steps of the method were the choice of the DNA dye and the gating strategy to increase the assay sensitivity and to include highly activated/proliferating antigen-specific T cells that would have been missed by current criteria of analysis. The DNA dye, Hoechst 33342, enabled us to obtain a high-quality discrimination&#160;of the G0/G1 and G2/M DNA peaks, while preserving membrane and intracellular staining. The method has great potential to increase knowledge about T cell response in vivo and to improve immuno-monitoring analysis.

Clonal expansion is a key feature of antigen-specific T cell response. However, the cell cycle of antigen-responding T cells has been poorly investigated, partly because of technical limitations. We describe a flow cytometric method to analyze clonally expanding antigen-specific CD8 T cells in spleen and lymph nodes of vaccinated mice.

בדיקת ציטומטריית זרימה מבוססת DNA/Ki67 לניתוח מחזור תאים של תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן בעכברים מחוסנים

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...