עבודה זו נתמכה על ידי Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia. המחברים רוצים להכיר Miltenyi יוטכנולוגיים GmbH (ברגיש גלאדבך, גרמניה) עבור החסות של כתב היד הזה, ד&quot;ר פאולו פטרוצ&#39;יאני (המחלקה להמטולוגיה החיסונית ועירוי שירות, בית החולים לוטי Pontedera, פיזה, איטליה) לאספקת מעילים באפי אדם ו פרופ &#39;מאסימו Pasqualetti (מחלקה לביולוגיה - יחידה נייד וביולוגיה התפתחותית, האוניברסיטה של ​​פיזה, פיזה, איטליה) לדיור המושבה העכבר.

מסר של אתיקה דגימות אדם ובעלי החיים עובדו פועלות בהתאם להנחיות של משרד בריאות האיטלקי, החוק 116/92 והוראת מועצת הקהילות האירופית 86/609/EEC. 1. תא תרבויות מונוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תרבות אנושיים THP-1 בT-75 צלוחיות המכילות מדיום RPMI-1640 תוספת 10% בסרום אנושי, 50 / ml פניצילין U ו50 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין, 0.05 מ&quot;מ β-mercaptoethanol על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות פיצול כאשר מחוברות (כל 3-5 ימים). </li></ol> 2. בידוד של תאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMCs) מאפי מעילים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחיל פרוטוקול הבידוד, להכין תמיסה של מי מלח pH פוספט (PBS) 7.2, חומצת ethylenediaminetetraacetic 2 מ&quot;מ (EDTA), 0.5% אלבומין בסרום שור (BSA), והוסיף 5 מיליליטר BSA מלאי פתרון ל95 מיליליטר שטיפת חיץ (1: 20 דילול). דגה החיץ ולשמור אותו קר (2-8מעלות צלזיוס). חשוב: אי דגה החיץ עלול לגרום לתוצאות פחות אופטימלי בגלל בועות עלולות לחסום את עמודת הבידוד (ראה שלב 3.2). הערה: נוסחה נוגדת קרישת ציטראט דקסטרוז (ACD-) או דקסטרוז פוספט ציטרט (CPD) יכול לשמש לחלופין. לעומת זאת, חלבונים אחרים אלבומין או סרה ממינים אחרים יכולים להחליף את ארגון ה-BSA. אל תשתמשו במאגרים המכילים Ca 2 + או Mg 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג מעילי אפים מתורמים בריאים (בגילי 20-60 שנים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 צינורות חרוטי מיליליטר לצנטריפוגה שיפוע צפיפות. לקבוע את מספר הצינורות הנדרשים לעיבוד הדם (צינור אחד יכול לעבד 35 מיליליטר של דם מדולל) ולהוסיף 15 מיליליטר של Ficoll-Paque על צינור אחד ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 8 מיליליטר של דם עם 24 מיליליטר של PBS / BSA פתרון / EDTA (1:4 דילול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבה בזהירות את הפתרון בדילול מלא על גבי Ficoll-Paque (צפיפות = 1.077 גר &#39;/ מיליליטר) בכל אחד מ50 מיליליטר צינורות חרוטי. אל תערבבוהדם וFicoll-Paque. חשוב: כדי להימנע מערבוב של הדם וFicoll-Paque, להחזיק את הצינור בזווית של ° 45 ושכבת תערובת הדם באיטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 400 ל30 דקות ב 4 ° C. תאי mononuclear (MNC) יישארו בממשק הפלזמה Ficoll-Paque, ואילו גרנולוציטים ואריתרוציטים משקעים בשל צפיפות גבוהה יותר בלחץ האוסמוטי של Ficoll-Paque. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי ביניים (תאים היקפיים mononuclear הדם, PBMCs) לצינור מיליליטר חדש 50 מלא PBS / BSA / EDTA ו צנטריפוגות XG 300 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכדור פעמיים עם PBS / BSA / EDTA כדי להסיר טסיות דם. ספין ב XG 200 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאי RPMI-1640 להשלים עם 10% בסרום ואנטיביוטיקה אנושיים או להמשיך לטיהור מונוציטים. </li></ol> 3. טיהור הראשונית מונוציטים מPBMCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד מונוציטים מPBMCs ידי הפרדת חרוז מגנטית באמצעות Humערכת בידוד מונוציטים פאן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובר תאים דרך רשת 30 מיקרומטר ניילון (מסנני preseparation, 30 מיקרומטר) כדי להסיר גושי תא אפשריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר הסלולרי באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה השעיה תא XG 300 10 דקות בטמפרטורת חדר (RT). לשאוב supernatant לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend תא גלולה ב30 μl של חיץ PBS / EDTA / BSA לכל 10 7 תאים בסך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl FCR חסימה מגיב לכל 10 7 תאים בסך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של קוקטייל ביוטין-נוגדן לכל 10 7 תאים בסך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב דגירה במשך 5 דקות ב 2-8 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μl של חיץ לכל 10 7 תאים בסך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של microbeads Anti-ביוטין לכל 10 7 תאים בסך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב דגירה 10 דקות ב 2-8 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend עד 10 8 תאים ב500 μl של חיץ PBS / EDTA / BSA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפריד מגנטיation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם למספר הכולל של התאים, בחר עמודה מתאימה MACS וMACS מפריד (ראה גליון הנתונים של טור MACS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הטור בשדה המגנטי של מפריד MACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את העמודה על ידי שטיפה עם הכמות המתאימה של חיץ PBS / EDTA / BSA (עמודות MS: 500 μl; עמודות LS: 3 מיליליטר). הערה: עמודות הן &quot;זרימת עצירה&quot; ולא לרוץ יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל השעיה תא על הטור. לאסוף זרימה דרך מכיל תאים ללא תווית, המייצג את החלק היחסי מונוציטים מועשרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף עמודה 3x עם PBS חיץ / EDTA / BSA (500 μl לטרשת נפוצה ו3 מיליליטר לLS לכל לשטוף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים ללא תווית שעוברים דרך, המייצגים את תאי מונוציטים מועשרים, ולהוסיף לזרימה דרך מסעיף 3.2.4. הערה: לשטוף את העמודה על ידי הוספת aliquots PBS חיץ / EDTA / BSA רק כאשר מאגר העמודה ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי) הסר את העמודה ממפריד ולמקם אותו על צינור איסוף מתאים. פיפטה את החיץ על הטור (עמודות MS: 1 מיליליטר; עמודות LS: 5 מיליליטר). מייד לשטוף את תאי nonmonocyte שכותרתו מגנטית על ידי תקיפות דוחפים את הבוכנה לתוך הטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות מטוהרת מונוציטים RPMI-1640 להשלים עם 10% בסרום ואנטיביוטיקה אנושיים. </li></ol></li></ol> 4. טיהור ראשונית מונוציטים מדם מלא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר מונוציטים מהדם כולו באמצעות ערכת בידוד מונוציטים בדם כל הבאה הוראות יצרן. </li></ol> 5. Nanoparticle ההפנמה בLeukocytes הדם ומונוציטים מטוהרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 x 10 5 מיליליטר פלייט תאים / (1 ​​מיליליטר / טוב) של PBMCs המבודדת או מונוציטים החיוביים CD14 המטוהרים ב12 גם צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון ורטקס FITC-SiO 2 nanoparticle מניות ו resuspend במדיום מלא לריכוז עבודה של 100 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של nanop עובדהשעיה מאמר (100 ננומטר) לדגימות שטופלו כדי להגיע לריכוז סופי nanoparticle של 1 ננומטר. להוסיף את אותו נפח בינוני מלא עבור פקדים שלא טופלו היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפנמת 1 שעות לאסוף את הדגימות בצינור פוליפרופילן 1.5 מיליליטר ו צנטריפוגות במשך 3 דקות ב6,000 XG ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכדור עם 1 מיליליטר של חיץ ריצת 3 דקות ב 6,000 XG ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור ב200 μl של הפעלת מאגר. התאים מוכנים לקריאה על ידי cytometry זרימה עכשיו. </li></ol> 6. בידוד של תרבויות גליה מעורבות ראשיים (ראה Bertero et al. 7) 7. Replating תרבית תאי גלייה מחוברות מעורבת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בקבוק T-75 פעם אחת עם 10 מיליליטר של PBS (w / o Ca 2 + / Mg 2 +), ולאחר מכן להוסיף 10 מיליליטר של Versene ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 5-7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את supernatant מעלה ומטה מספר פעמים על מנת לנתק את התאים מפני שטח T-75 ולפזרתא מצרפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את ההשעיה תא צינור פוליפרופילן 15 מיליליטר. לאסוף כמות קטנה של השעיה סלולרית לספור את התאים עם hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה תא דקות 5 ב XG 300 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend את הכדור בריכוז סופי של 5 x 10 5 תאים / מיליליטר במדיום התרבות השלם גליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 0.5 מיליליטר / היטב בצלחת 24 גם ולתת לתאים להסתפק 2-4 שעות לפני טיפול nanoparticle. </li></ol> 8. Nanoparticle ההפנמה בMicroglia <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של מדיום תרבות גליה מלא (לפקדים שלא טופלו) או 500 μl של השעיה 2x Rhodamine-SiO 2 nanoparticle במדיום תרבות גליה מלא (לדגימות שטופלו) זה טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את התאים כדי לאפשר הניתוק של תאים דבקים-nonrapid בנקודות הזמן שנבחרו ולאסוף אותם ב2 צינורות פוליפרופילן מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μlשל Versene לכל היטב דגירה את הצלחת ב-C ° 37 למשך 5 דקות, ולאחר מכן לנתק את החלק היחסי של תאים הנותרים ולאסוף כל דגימה עם תאי nonadhering המקבילים של השלב הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הדגימות במשך 3 דקות XG 300 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור בריצה של AutoMACS חיץ 100 μl. </li></ol> 9. צביעה עם CD11b-VioBlue <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של נוגדן אנושי / עכבר VioBlue-CD11b להשעית תא (1:11 יחס) 100 μl בהפעלת מאגר ודגירה 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של הפעלת מאגר ומערבבים את ההשעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם זה במשך 3 דקות ב300 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend את הכדור ב 100-150 μl של הפעלת מאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הדגימות לcytometer (לאחסן הדגימות ב 4 ° C בין שני השלבים האחרונים). חשוב: לפני ניתוח הדגימות, המשך לפיצוי של אותות חופפים iספקטרום פליטת n נצפה בין fluorochromes שונה (חלקיקי fluorochrome מצומדות או נוגדנים). </li></ol> 10. לשפוך ספקטרלי על פיצויים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את &quot;הגדרות מכשיר&quot; התיבה (קיים בכל התוכנה במכשיר התוכניות). הערה: אם אתם משתמשים במכשיר שונה מזה שדווח בטבלת החומר, עיין במדריך הספציפי המכשיר לפרטי הרכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש מדגם שלא טופל (ללא חלקיקים) במהירות fluidic נמוכה (אם מותר על ידי המכשיר). במהלך הרכישה, להתאים ידני קדימה ופיזור צד (FSC ו SSC, בהתאמה) על ידי ויסות ערוצי המתח. שים לב: שנה את קשקשי ציר SSC ו FSC על מנת להמחיש את אוכלוסיית תא המלאה בעלילה הטובה ביותר. ניתן ליצור מכשיר הגדרת תבנית לכל סוג תא של עניין, יישמר וישמש לרכישות עתידיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח הספציפיכרטיסייה &quot;אזור&quot; בתוכנה. צייר אזור מתאים גדול (&quot;שער&quot;) מסביב לאוכלוסייה הרצויה. הערה: הפנמה של חלקיקים גורמת שינוי SSC של התאים. אם השער מוגבל מדי הדוק סביב אוכלוסיית התא של עניין, את הנתונים שנרכשו ככל הנראה יחמיצו חלק מהתאים כדי להתגלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשתי דגימות ללא רבב, אחד לשימוש כמדגם ריק ואחד לפיצויים נגד מכתים לצרכן (אופציונלי), מדגם מוכתם אחד עם fluorochrome המתאים לכל ערוץ הקרינה להיות מתוגמלים. הערה: השתמש בצינור מדגם 1.5 מיליליטר שונה עבור כל נוגדן fluorochrome מצומדות לשימוש בתיוג הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הכרטיסייה &quot;פיצוי&quot; בתיבת &quot;הגדרות מכשיר&quot;. להגדיל או להקטין את גורם הפיצוי במהלך הרכישה עד לעוצמת הקרינה בערוץ הגלישה היא בערך אותו הדבר לקופת fluorochromeitive ואוכלוסייה שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש דגימות שטופלה nanoparticle לאחר הפיצוי הותאם. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+nanomaterials+and+biological+systems:+Implications+to+personalized+nanomedicine.">Interactions of nanomaterials and biological systems: Implications to personalized nanomedicine.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 1363-1384 (2012).</li><li>Radad, K., Al-Shraim, M., Moldzio, R., Rausch, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+benefits+and+hazards+of+engineered+nanoparticles.">Recent advances in benefits and hazards of engineered nanoparticles.</a> Environ. Toxicol. Pharmacol. 34, 661-672 (2012).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+engineered+nanomaterials.">Immunological properties of engineered nanomaterials.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 469-478 (2007).</li><li>Shi, C., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+recruitment+during+infection+and+inflammation.">Monocyte recruitment during infection and inflammation.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 762-774 (2011).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).</li><li>Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+engineering+for+immunomodulation.">Materials engineering for immunomodulation.</a> Nature. 462, 449-460 (2009).</li><li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+functionalisation+regulates+polyamidoamine+dendrimer+toxicity+on+blood-brain+barrier+cells+and+the+modulation+of+key+inflammatory+receptors+on+microglia.">Surface functionalisation regulates polyamidoamine dendrimer toxicity on blood-brain barrier cells and the modulation of key inflammatory receptors on microglia.</a> Nanotoxicology. 8, 158-168 (2013).</li><li>Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+engineered+nanoparticles+with+in+vitro+toxicity+assays.">Interference of engineered nanoparticles with in vitro toxicity assays.</a> Arch. Toxicol. 86, 1123-1136 (2012).</li><li>Malvindi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SiO2+nanoparticles+biocompatibility+and+their+potential+for+gene+delivery+and+silencing.">SiO2 nanoparticles biocompatibility and their potential for gene delivery and silencing.</a> Nanoscale. 4, 486-495 (2012).</li><li>Bardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SiO2+NPs:+Promising+Candidates+for+Drug+and+Gene+Delivery.">SiO2 NPs: Promising Candidates for Drug and Gene Delivery.</a> Drug Deliv. Lett. 1, 9-12 (2011).</li><li>Bardi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biocompatibility+of+amino+functionalized+CdSe/ZnS+quantum-dot-Doped+SiO2+nanoparticles+with+primary+neural+cells+and+their+gene+carrying+performance.">The biocompatibility of amino functionalized CdSe/ZnS quantum-dot-Doped SiO2 nanoparticles with primary neural cells and their gene carrying performance.</a> Biomaterials. 31, 6555-6566 (2010).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+andgreen+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion andgreen fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol. Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי Miltenyi יוטק GmbH מימנה הגשת כתב היד הזה. HiQ-Nano חברה <a href="http://www.hiq-nano.com/index.html">(http://www.hiq-nano.com/index.html)</a> הוא ננוטכנולוגיה ספין אוף של החברה עלתה מ-IIT.

פרוטוקול הניסוי מציג נקודות קריטיות מאוד שיש לקחת בחשבון. זה באמת חשוב לעבוד על 4 ° C (על קרח), ואולי בחושך במהלך כל שלבי הצביעה, משום שטמפרטורות ואורות גבוהות יותר עשויות להשפיע לרעה על התשואה מכתים. חלקיקים יכולים להיות sonicated להיות טוב יותר resuspended רק לפני השימוש. זרימה נכונה ניתוח cytometry דורשת כיול נכון בערוצים השונים. כיול של המכשיר יש לבצע לפני כל פגישה ניסיונית. חוץ מבעיות טכניות עם המכשור, לא יכולה להיות גם בעיות עם תיוג הנוגדן. זה חובה להשתמש בנוגדן בריכוז מתאים. אם הריכוז גבוה מדי או נמוך מדי, עוצמות אות אי שביעות רצון יכולה להיות התוצאה. החסרונות של דאגה בטכניקה זו את הצורך בעבודה עם דגימות monodisperse, חוסר היכולת למקם אתאתר של מקור האות (תאים סלולריים שונים, כלומר). יש גם כמה מגבלות בבחירת fluorochromes לשמש בשילוב: אורך הגל של העירור ולהקות הפליטה חייב להיות מופרד במידה מספקת כדי לאפשר המדידה המתאימה שלהם. אם ספקטרום הנוגדן משמש חופף, נדרש פיצוי נכון. Cytometry זרימה היא שיטה רבת עוצמה לניתוח תא בנוכחות או עדר של חלקיקים. טכניקה זו מאפשרת מחקר multiparametric של תא, מספר גבוה של אירועים שנבדק, מהירות של ניתוח (יותר מ 1,000 תאים / sec), שחזור וקריאות סטטיסטיות. יכולות להיות מעובד דוגמאות בלי לאבד את יכולת הקיום של תאים. באמצעות חלקיקים שכותרתו fluorescently זה אפשרי להעפיל ולכמת ההפנמה שלהם בתת אוכלוסיות של תאים, אשר מזוהות על ידי סמנים ספציפיים נחשפו על קרום התא. פרמטרים ניידים יכולים לשנות בנוכחותו של ים<html> חלקיקי pecific. בהתאם למטרה של המחקר, ניתן להשתמש בם וריאציות אלה כדי לזהות תופעה ספציפית, כגון פיזור צד של תאים שאופן יחסי עולה עם קצב הפנמת nanoparticle הגובר. שינויים הנגרמים Nanoparticle של תא שטח יכולים גם לייצג מגבלה של הטכניקה. מסיבה זו, מחזור קולטני קרום התא חייב להיות תמיד נלקח בחשבון ואולי ידוע מראש לאפיין את אוכלוסיית התא של עניין בדיוק. ליקויים קיצוניים של אוסמוזה קרום בדגימות nanoparticle העמוס יכולים להוביל למוות של תאים. רעילות תלויה מינון nanomaterial צריכה להיבדק באופן אמפירי לכל אוכלוסיית תא. תאים מתים מוגדרים חייבים להיות מחוץ כימות הקרינה. למשל, מכתים Annexin V / PI הוא אחד ממספר השיטות משמשות בדרך כלל כדי לזהות תאי שני נמקים ואפופטוטיים. &quot;&gt; תאים ראשוניים-GFP-לבטא גם כלי רב עוצמה כדי לבחור subpopulation תאים מסוים ולאסוף נתונים ללא prelabeling. השילוב עם חלקיקי ניאון משלימים מאפשר כימות מהירה מאוד ומדויקת של אינטראקציה תא nanoparticle. הוא חשב משלוח סמים או גנטי כדי להשתפר בעתיד על ידי היישום של חלקיקים מסוגלים לשחרר ספציפי עומס תרופה לרקמות שנבחרו. תעסוקה של חלקיקי מאפננים כספציפיים נושאות אספקה ​​ו / או חיסון לרוקחות דורשת הידע של הסביבה הביולוגית (כלומר, באמצעות cytometry זרימה) כדי לחקור אינטראקציות תא nanoparticle.

ננו המהונדס כיום השראה האינטרס של מדעני חיים עבור יישומים פוטנציאליים לביו 1. מגוון רחב של חומרים אורגניים ואורגניים יכול לשמש לייצור ננו עם צורות שונות, פיזיות ותכונות כימיות. בין המבנים הללו, חלקיקים מהונדסים של צורה כדורית הפגינו פוטנציאל גדול לרפואת אבחון וtranslational 2. הליבה שלהם ועיצוב פני השטח מונעים על ידי יישום אפשרי וזה מרמז על מחקר מעמיק של תגובות תא היעד הבא במגע nanoparticle ואינטראקציה. חלקיקים כי הם חשבו להיות מנוהלים במכוון לבני אדם יבואו במגע ישיר עם מספר סוגים של תאי מערכת החיסון. האחריות שלהם כדי לשמור על שלמות הגוף הופכת אותם לנושא קריטי של החקירה בnanomedicine 3. החלק התאי של מערכת החיסון המולדת ה&quot;רשת phagocytes. ביניהם, את שושלת מונוציטים / מקרופאג תאים שמקורם, ביניהם מיקרוגליה תושב מערכת עצבים המרכזיים, לשחק תפקיד מפתח בהגנה החיסונית 4,5. הם מסוגלים לעורר תגובות המגן בתוך כמה שעות, לאחר שנקלע עם גופים זרים. יתר על כן, תאי monocytic לתאם ולהנחות את התגובה החיסונית אדפטיבית דרך השחרור של ציטוקינים. כל האירועים הללו מתרחשים גם בנוכחותם של חומרים מהונדסים, אשר נתפסים בעיקר כ&quot; nonself &quot;על ידי מערכת החיסון 6. בין השיטות היסטורית משמשות באימונולוגיה לניתוח תא, cytometry זרימה מייצגת את אחד הכלים החזקים ביותר. יתר על כן, הזמינות של טכנולוגיות לזיהוי או הטיהור של subpopulation ספציפי חיסוניים (לעתים קרובות מנצל את ההרחקה או נוכחות של חלבון קרום אחד) מאפשרת חקירה מדויקת של ההשפעות של nanoparticle מסוים על ce העיקרי מסויםסוג ll 7. עם זאת, תאים עשויים להציג שינויים פיסיולוגיים ומורפולוגיים לאחר חשיפה לחלקיקים. כמו כן, חלקיקים עלולים להפריע לפרמטרים ספציפיים אופטיים, כגון קליטה או פליטה של אור באורכי גל מוגדר, המשפיעים על התוצאות שהושגו 8. לכן, גבולות שימוש ועיבודים הסופיים של מבחני חיסוניים קלאסיים לחקר חומרים חדשים צריכים להיחשב. עבודה זו עוסקת באיתור של אינטראקציות nanoparticle עם תאים חיסוניים ראשוניים על ידי cytometry זרימה. כדי לטפל בבעיה זו, 50 ננומטר FITC-SiO 2 חלקיקים הועסקו כnanomaterial מודל כדי לתאר את השיטה. ניתן לייצר חלקיקי סיליקה באופן מדויק מאוד בקנה מידת ננו מטרי. גודל, צורה, ופני שטח תכונות, כגון תשלום או הידרופוביות, יכולות להיות מכוונת היטב כדי להגדיל את ההתאמה הביולוגית שלהם 9. תכונות רבות של SiO 2 חלקיקים מאפשרים להם לשמש כמודל עבור משלוח סמים חלקיקי 10. יתר על כן, יכולים להיות ממולכדים צבעי ניאון או נקודות קוונטיות, או צמוד לחלקיקים אלה מציעים ננו כלים שימושיים למטרות הדמיה 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">HBSS</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14170-088</td>
			<td style="width:256px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 (ATCC Modified)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum (lot n&#176; 1131917)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin 2.5%</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Pooled Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>34005100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Versene</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td>15040-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse I</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b-VioBlue human &#38; mouse</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACS BSA Stock Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">autoMACS Rinsing Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Running buffer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">autoMACS Running Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Human Pan monocyte isolation kit&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Whole Blood Column Kit</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Whole Blood CD14 MicroBeads, human</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MS Column</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">LS Column</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MidiMACS Separator</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Red Blood Cell Lysis Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Pre-Separation Filters 30 &#181;m</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACSQuant Analyzer flow cytometer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACSQuant Calibration Beads</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque Premium</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">GEH17544202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:272px;">FITC-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV)</td>
			<td style="width:107px;">HiQ-Nano Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:272px;">Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV)</td>
			<td style="width:107px;">HiQ-Nano Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">12-well plate Falcon</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of fluorescent nanoparticle interactions with primary immune cell subpopulations by flow cytometry

חלקיקים מהונדסים ניחנו עם תכונות מבטיחות מאוד למטרות טיפוליות ואבחון. עבודה זו מתארת ​​שיטה מהירה ואמינה של ניתוח על ידי cytometry זרימה ללמוד אינטראקציה nanoparticle עם תאים חיסוניים. יכולים להיות מטוהרים תאים חיסוניים ראשוניים בקלות מרקמות אדם או עכבר על ידי בידוד מגנטי בתיווך נוגדנים. במקרה הראשון, ניתן להבחין אוכלוסיות תאים השונות פועלות בcytometer זרימה על ידי האור מפוזר קדימה (FSC), שהיא פרופורציונלית לגודל תא, והאור מפוזר הצד (SSC), הקשורים לתא מורכב פנימי. יתר על כן, נוגדנים שכותרתו fluorescently נגד קולטני תא שטח ספציפי מאפשרים זיהוי של מספר אוכלוסיות במדגם זהה. לעתים קרובות, כל התכונות הללו להשתנות כאשר תאים שיפרה ידי גירויים חיצוניים המשנים את המצב הפיזיולוגי ומורפולוגיות שלהם. הנה, 50 ננומטר FITC-SiO 2 חלקיקים משמשים כמודל לזיהוי ההפנמת דואר של חומרי nanostructured בתאים חיסוניים בדם אדם. הקרינה הסלולרי וגידול אור מפוזר צד לאחר דגירה עם חלקיקים אפשרו לנו להגדיר את הזמן ואת תלות ריכוז של אינטראקציה nanoparticle תאים. יתר על כן, פרוטוקול כזה ניתן להאריך לחקור אינטראקציה 2 nanoparticle Rhodamine-SiO עם מיקרוגליה ראשוניים, תאי העצבים המרכזיים תושב מערכת חיסוניים, מבודדים מעכברים שעברו מוטציה שבמיוחד מבטאים את החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) בשושלת מונוציטים / מקרופאג. לבסוף, cytometry זרימת נתונים הקשורים להפנמת nanoparticle לתוך התאים אושרו על ידי מיקרוסקופיה confocal.

Cytometry זרימה הוא כלי שימושי כדי לזהות ולאפיין תאים שונים וזה הוא הטכניקה של בחירה כדי לזהות תאים חיסוניים ספציפיים, כגון מונוציטים, גרנולוציטים, תאי T, תאי B, תאי הרג טבעי (NK), תאים דנדריטים (DC), ואוכלוסיות אחרות של לויקוציטים. במאמץ כדי לאפיין את התנהגות תאי דם לבנים טוב יותר בתגובה לחלקיקים, ביצענו מבחני הפנמה עם לויקוציטים העיקרי מבודד מהדם של תורמים בריאים (איורים 1 ו -2) ועם שורת תאי מונוציטים אנושיים (THP-1 תאים, איור 3) . כפי שדווח באיור 1 א &#39;, שלוש אוכלוסיות ויקוציטים דם גדולות זוהו בבירור על ידי קדימה ופיזור צד לאחר בידוד PBMCs. יתר על כן, לאחר טיפול FITC-SiO 2, יש לימפוציטים (אפור), מונוציטים (כחול) וגרנולוציטים (אדום) n שונהקצב הפנמת anoparticle כפי שמוצג על ידי עוצמת הקרינה ירוקה (איור 1). הפרוטוקול המתואר מאפשר הטיהור של מונוציטים החיוביים העיקריים CD14 מPBMCs. איור 2A מדווח cytometry זרימת עלילת נקודה של CD14 + מונוציטים בנוכחות של FITC-SiO 2. איור 2B מראה הפנמת 2 FITC-SiO לכמת באותם התאים ובאו לידי ביטוי ב היסטוגרמה סולם לוגריתמים. ניסויי הפנמה דומים בוצעו על THP-1 מונוציטים שטופלו בריכוזים הולך וגדל של 2 חלקיקי FITC-SiO. תאים שלא טופלו שמשו בקרה שלילית. איור 3 א מציג עלייה תלוית מינון בפיזור צד עם קדימה ללא שינוי הפיזור בשורת התאים THP-1. באיור 3 ב, יחד עם היסטוגרמות של SSC וFSC בריכוז כל 2 nanoparticle FITC-SiO נבדק, כלומר עוצמת הקרינה (Mכימות FI) מוצג. הנתונים אלה מצביעים על כך שטיפול עם 2 חלקיקי FITC-SiO גורם הפנמה תלוית מינון במונוציטים מודגשים על ידי השיפור של גרעיניות תאית (פיזור בצד) וקרינה (מסלול ירוק). כדי לזכות בתובנה נוספות בסוג של אינטראקציה בין תאים וחלקיקים חיסוניים, תרבויות גליה מעורבות עיקריות היו מבודדות ומיקרוגליה, תאי העצבים המרכזיים תושב מערכת חיסוניים, היה מטוהרים. השימוש במודל עכבר מהונדס מבטא מיקרוגליה פלואורסצנטי ירוקים מאפשר ההדמיה של מנגנוני נוירו דלקתי שונים. העכבר המהונדס B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J משמש בעבודה זו מבטא את החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) תחת השליטה של אמרגן CX3CR1 12. לאחר 7 ימים במבחנה (DIV), מיקרוסקופ פלואורסצנטי תערוכות תרבות גליה עיקרי מעורבת במספר רב של האסטרוציטים (תא חסיד שלילי GFP<html> ים) וחלק מהתאים ירוקים (, איור 5 א GFP חיובי). במודל עכבר זה, ניתן להבחין בין שלוש אוכלוסיות גליה ידי cytometry זרימה עם כתמים בודדים CD11b נוגדנים: CD11b הראשון - ה-GFP - (האסטרוציטים ותאי גליה אחרים), קבוצה מובחנת שנייה של ה-GFP + + תאי CD11b microglial, ו GFP CD11b + שלישי - (איור 4 א) subpopulation. שתי אוכלוסיות אלה האחרונים שניהם מסוגלים להפנים חלקיקים עם יעילות מוגברת קלה על ידי-GFP + האוכלוסייה (המייצג את מיקרוגליה לא בשלה שסיירו על ידי השעתוק של אמרגן CX3CR1), כפי שמוצגים על ידי ניתוח cytometry זרימה (איור 4). ההפנמה התרחשה ניתן לאמת עוד יותר על ידי מיקרוסקופיה confocal משתמשת באותו ריכוז סופי של 2 חלקיקי Rhodamine-SiO כפי שמוצג באיור 5. = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1.jpg" /> איור 1. הפנמת 2 nanoparticle FITC-SiO בלויקוציטים דם המבודד.) קדימה נציג פיזור (FSC) לעומת פיזור צד (SSC) cytometry זרימת עלילת נקודה של לויקוציטים דם המבודד Ficoll-Paque. B) עלילת היסטוגרמה כיסוי הקרינה הירוקה של ויקוציטים דם שלושה גדולות תת אוכלוסיות של תאים בנוכחות של 1 2 חלקיקי ננומטר FITC-SiO (+45 mV) במשך שעה 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2.jpg" /> <strong&gt; איור 2. הפנמת FITC-SiO 2 nanoparticle בCD14 + מונוציטים מטוהרים.) קדימה נציג פיזור (FSC) לעומת פיזור צד (SSC) cytometry זרימת עלילת נקודה של מונוציטים החיוביים CD14 המטוהרים. B) עלילת היסטוגרמה הקרינה הירוקה של subpopulation מונוציטים המטוהרים בנוכחותם של 1nm FITC-SiO 2 חלקיקים (+45 mV) במשך שעה 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3.jpg" /> איור 3. השפעות של הפנמת 2 nanoparticle FITC-SiO על THP-1 תאים.) קדימה נציג פיזור (FSC) לעומת scatterin הצדg (SSC) cytometry זרימת עלילת נקודה של שורת תאי מונוציטים THP-1, בעקבות חשיפת 1 שעות של FITC-SiO 2 חלקיקי הגדלת וריאציה ריכוז. ב &#39;) תלוי ריכוז של פיזור הצד (SSC), קדימה פיזור (FSC) וירוק הקרינה בנוכחות של FITC-SiO 2 חלקיקים (+45 mV) במשך שעה 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4.jpg" /> איור 4. Rhodamine-SiO 2 הפנמת nanoparticle למיקרוגליה עיקריים מבודדים מעכברי tm1Litt / J-B6.129P CX3CR1.) חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), לעומת תזרים CD11b-VioBlue cytometry עלילת נקודה של יחסי ציבורגליה מעורבת imary מבודדת מעכברי tm1Litt / J-B6.129P CX3CR1. CD11b + + ה-GFP וCD11b + GFP - אוכלוסיות מוצגות בעלילת היסטוגרמה כיסוי הקרינה האדומה של אוכלוסיות מיקרוגליה בנוכחות של 1 2 חלקיקי ננומטר Rhodamine-SiO (+45 mV) הימנית העליונה והרביעים ימני התחתונים, בהתאמה ב &#39;) ל30. דקות (היסטוגרמה האדומה) לעומת בקרה (היסטוגרמה אפורה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5.jpg" /> איור 5. ויזואליזציה של ה-GFP +-מיקרוגליה. (א) מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב7 DIV ומיקרוסקופיה confocal (ב &#39;)הפנמת 2 nanoparticle Rhodamine-SiO (חצים אדומים) ב- GFP +-מיקרוגליה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry at JoVE.com

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

ניתוח של אינטראקציה nanoparticle עם אוכלוסיות מוגדרות של תאי מערכת החיסון על ידי cytometry זרימה.

איתור של פלורסנט אינטראקציות Nanoparticle עם אוכלוסיות ראשוניות של תא חיסון על ידי זרימת cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

detection-fluorescent-nanoparticle-interactions-with-primary-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.4K Views.  Istituto Italiano di Tecnologia.  ניתוח של אינטראקציה nanoparticle עם אוכלוסיות מוגדרות של תאי מערכת החיסון על ידי cytometry זרימה. 

Video: Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

הערכה כמותית של תאים חיסוניים רקמות חוט השדרה נפגע על ידי זרימת cytometry: השתמש חדשנית שיטת טיהור Cell

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

לא ניתוחי Intratracheal החדרה של עכברים עם ניתוח ריאות וניקוז ריאות בלוטות הלימפה על ידי זרימת cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

חקר אינטראקציות של<em&gt; סטפילוקוקוס</em&gt; עם נויטרופילים ידי cytometry זרימה מיקרוסקופית וזמן לשגות

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

איתור של<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; מיתוג גליקופרוטאין Surface Variant ידי מגנטי Activated Cell מיון cytometry זרימה

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. Setup of a classic multicolor panel requires high-end instruments, custom labeled antibodies, and careful study design to minimize spectral overlap. We developed a multiparametric analysis to identify major human immune populations (CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes) in peripheral blood by combining seven lineage markers using only two fluorochromes. Our strategy is based on the observation that lineage markers are constantly expressed in a unique combination by each cell population. Combining this information with a careful titration of the antibodies allows investigators to record five additional markers, expanding the optical limit of most flow cytometers. Head-to-head comparison demonstrated that the vast majority of immune cell populations in peripheral blood can be characterized with comparable accuracy between our method and the classic &#34;one fluorochrome-one marker approach&#34;, although the latter is still more precise for identifying populations such as NKT cells and &#947;&#948; T cells. Combining seven markers using two fluorochromes allows for the analysis of complex immune cell populations and clinical samples on affordable 6-10 fluorochrome flow cytometers, and even on 2-3 fluorochrome field instruments in areas with limited resources. High-end instruments can also benefit from this approach by using extra fluorochromes to accomplish deeper flow cytometry analysis. This approach is also very well suited for screening several cell populations in the case of clinical samples with limited number of cells.

Here, we present a flow cytometric protocol to identify CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes in human peripheral blood by using only two fluorochromes instead of seven. With this approach, five additional markers can be recorded on most flow cytometers.

אפליה של שבע קבוצות משנה תא החיסון על ידי שני-fluorochrome לזרום Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...