ברצוננו להודות למעבדה שלי באוניברסיטת מינסוטה למתן דגימות רקמת חוט השדרה העכבר שהיו בשימוש. עבודה זו נתמכה על ידי המחלקה לתכנית ביטחון סרטן השחלות מחקר (OCRP) OC093424 לMB, על ידי חקר הסרטן וקהילה קרן רנדי מכונת גילוח לMB ועל ידי השחלות ברית סרטן מינסוטה (MOCA) לMB. היו הממנים לא היה תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

1. תמוגה הצפת הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר סוכרוז במים ללא יונים (DI) כדי להפוך את פתרון מניות 2 M. סנן פתרון 2 M של סוכרוז באמצעות ואקום מונע 0.22 מיקרומטר פלואוריד polyvinylidene מסנן (PVDF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר dithiothreitol (DTT) במי DI לעשות פתרון 500 מ&quot;מ מניות וחנות בתנאים אנאירוביים. לפזר מגנזיום כלוריד (MgCl 2) במי DI לעשות פתרון מניות 100 מ&quot;מ. לפזר אדנוזין טריפוספט disodium מימה (ATP) במי DI לעשות פתרון מניות 50 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איפור פתרון טריס בpH 7.4 ידי המסת hydrochloride Trizma במי DI והתאמת pH באמצעות נתרן הידרוקסידי (NaOH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב חלקים מפתרונות המניות במים די כדי להפוך את מאגר תמוגה עם ריכוז סוכרוז של 250 מ&quot;מ, ריכוז DTT של 1 מ&quot;מ, MgCl 2 ריכוז של 5 מ&quot;מ, ריכוז ה- ATP של 1 מ&quot;מ וריכוז טריס של 50 מ&quot;מ . לדוגמא, לערבב 535.3 μl של טריס, 500 μl של MgCl 2, 1.25 מיליליטר של סוכרוז, 20 μl של DTT, 200 μl של ה- ATP ו7.4947 מיליליטר של מים די כדי להפוך את 10 מיליליטר של חיץ תמוגה. זה יכול לשמש לכ -20 ניסויים. </li></ol> 2. תאים culturing לניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את התקשורת על ידי aliquoting 30 מיליליטר של DMEM + 10% בסרום שור עוברי (FBS) לצינור חרוטי 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את תאי M17 או הלה קפוא מאחסון חנקן נוזלי לכוס קטנה עם מים פושרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי צינור חרוטי 50 מיליליטר. ראשית, להוסיף קצת תקשורת לבקבוקון התא. לאחר מכן להעביר את תאי resuspended בתוך 5 שניות של הפשרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא ב 450 XG במשך 5 דקות כדי לקבל תא גלולה. הוסף 20 מיליליטר של תקשורת לתוך בקבוק T75. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מהתאים באמצעות יניקה. הוסף 5 מיליליטר של תקשורת טריות לתא גלולה וגלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא 5 מיליליטר ל -20 מיליליטר של תקשורת בבקבוק T75 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס. ChAnge התקשורת בכל 3 ימים. </li></ol> קציר 3. סלולארי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה באמצעות יניקה, נזהר שלא לגעת בתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו פוספט (PBS). הסר PBS באמצעות יניקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 3 מיליליטר של חומצת טריפסין-ethylenediaminetetraacetic (EDTA) לבקבוק T75 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 מיליליטר של תקשורת טריות לבקבוק וresuspend התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה לצינור חרוטי 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 290 × גרם במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהוסיף 5 מיליליטר של PBS. לטפוח בעדינות את החלק התחתון של הצינור כדי לשבור את גלולה. צנטריפוגה ב 290 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.6 שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS וresuspend התאים 1 מיליליטר של PBS הטרי. העברה לצינור Eppendorf (1.5 מיליליטר). ספין ב290 XG במשך 5 דקות. </li></ol> 4. תא תמוגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הנפח המשוער של גלולה באמצעות פיפטהd לשקול את חרוזי זכוכית במסה: יחס נפח של 1: 1. להוסיף פעמיים הנפח של גלולה במאגר תמוגה. הערה: להוסיף למאגר לפני הוספת חרוזי הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים בצינור Eppendorf בתסיסה המרבית למשך 30 דקות ב 4 ° C על ידי vortexing בחדר קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה צנטריפוגות ב XG 200 במשך 30 שניות כדי ליישב את חרוזים. לאסוף את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את אותו הנפח של חרוזי זכוכית כמו קודם לsupernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת שוב בתסיסה המרבית למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה צנטריפוגות ב XG 200 במשך 30 שניות כדי ליישב את חרוזי הזכוכית. לאסוף את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 5,030 XG במשך 5 דקות כדי להסיר את הגרעינים, וקרומי תאים רצופים. לאסוף את supernatant, המהווה את lysate התא. </li></ol> Homogenization 5. רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך המוני: נפח של 1: 9 פתרון של רקמת חוט השדרה עכבר למאגר תמוגה. הערה: שיטה זו ישימה למגוון שונהדגימות רקמה אף אוזן גרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize הרקמות באמצעות הגדרה של רמה 2 על homogenizer למשך 30 שניות כדי לוודא שאין גושים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה ב5,030 XG במשך 3 דקות כדי להסיר את הגרעינים, וקרומי תאים רצופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את supernatant, המהווה את lysate. </li></ol> Derivatization 6. לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע חומצת bicinchoninic (BCA) בניתוח צלחת 96-היטב כדי לקבוע את ריכוז החלבון של lysate הרקמות באמצעות קורא צלחת 96-היטב colorimetric כמפורט בפרוטוקול ערכת assay חלבון BCA פירס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא aliquot המתאים עד 20 מיקרוגרם של חלבון הכולל 50 μl באמצעות מים מיוננים דה (DI). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של 1.35 מיקרומטר של sulfone HA-UB-ויניל (VS) לפתרון דגירה עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. התוצאה 20 מיקרוגרם של lysate 50 ננומטר של בדיקה בתערובת התגובה הסופית. זה בעודף טוחנת גדול כדי להבטיח תיוג של ממכן פונקציונלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אניncubate המדגם במאגר המדגם של Laemmli במשך 5 דקות על 95 מעלות צלזיוס. לתגובת שימוש נפח 52 μl 26 μl של חיץ מדגם 2x, 13 μl של חיץ מדגם 4x או 8.87 μl של חיץ מדגם 6x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגניב על קרח לפני טעינת ג&#39;ל. </li></ol> 7. מערבי כתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון 4-20% ג&#39;ל טריס-גליצין 12 גם עם 40 μl של המדגם מוכן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הג&#39;ל על 95 V עד חזית היון מגיעה לתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע העברת לילה של הג&#39;ל על קרום difluoride polyvinylidene (PVDF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הקרום בכתם השחור amido ולסרוק membane לקבל תמונה המציגה את כמות החלבון בכל מסלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Destain קרום דגירה ב 5% בחלב PBS עבור שעה 1 לחסום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הקרום בנוגדן אנטי HA העיקרי בריכוז של 1: 10,000 בחלב 5% ב PBS או לילה ב 4 מעלות צלזיוס או במשך 4 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 3 שוטף Fאו 5 דקות כל אחד בPBS עם 0.1% אבקת Tween-20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הקרום בperoxidase חזרת עכבר בריכוז של 1: 10,000 בחלב 5% ב PBS לפחות 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 3 שוטף במשך 5 דקות כל אחד בPBS עם 0.1% אבקת Tween-20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שטיפה 1 למשך 5 דקות בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הקרום במגיב איתור chemiluminescent במשך 10 דקות ולזהות באמצעות גלאי chemiluminescent. השתמש בחשיפה האוטומטית הגדרה בגלאי. </li></ol>

<ol>
	<li>Ovaa, H., Kessler, B. M., Rol&#233;n, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-+based+ubiquitin-specific+(USP)+profiling+of+virus-infected+and+malignant+human+cells.">Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).</li><li>Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+deubiquitination:+Targeting+of+proteins+for+degradation+by+the+proteasome.">Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome.</a> Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).</li><li>Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+proteolysis+by+human+deubiquitinating+enzymes.">Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes.</a> Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).</li><li>Rol&#233;n, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+Profiling+of+Deubiquitinating+Enzymes+in+Cervical+Carcinoma+Biopsies+and+Cell+Lines.">Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines.</a> Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).</li><li>Borodovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry-Based+Functional+Proteomics+Reveals+Novel+Members+of+the+Deubiquitinating+Enzyme+Family.">Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family.</a> Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).</li><li>Andersson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+Parkinson&#8217;s-disease-associated+mutations+on+the+deubiquitinating+enzyme+UCH-L1.">The effect of Parkinson&#8217;s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1.</a> J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).</li><li>Poon, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Amyloid+(A&#946;)+oligomers+impair+brain-derived+neurotrophic+factor+retrograde+trafficking+by+down-regulating+ubiquitin+C-terminal+hydrolase+UCH-L1.">&#946;-Amyloid (A&#946;) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1.</a> J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).</li><li>Nijman, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+USP1+regulates+the+Fanconi+anemia+pathway.">The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway.</a> Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).</li><li>Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+USP2a+regulates+the+p53+pathway+by+targeting+Mdm2.">The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2.</a> EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).</li><li>Coughlin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+RA-9+inhibits+proteasome-associated+DUBs+and+ovarian+cancer+in+vitro+and+in+vivo+via+exacerbating+unfolded+protein+responses.">Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses.</a> Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).</li><li>Colla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+Reticulum+Stress+Is+Important+for+the+Manifestations+of+&#945;-Synucleinopathy+In.">Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of &#945;-Synucleinopathy In.</a> Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

מאז ubiquitination היא פעילות סלולרית בסיסית, הבנת מנגנוני הרגולציה יכולה להיות המפתח לחושף את תהליכי המחלה ופתולוגיה. השימוש בHA מתויג בדיקות אתר מכוונות פעילים נגזרות UB דיווחו כאן מספקת שיטה קלה, אבל זה אפשרי מאוד ללימוד פירוק חלבונים בתיווך UB. שיטה זו היא מהירה יותר וזול ?...

מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום (UPS) משמשת כאחד ממסלולי השפלה המרכזיים בתא היונקים. מצעים מחויבים לפירוק בפרוטאזום מתויגים קוולנטית עם פולימרים של היוביקוויטין (UB) 1. לפני המצע הממוקד נכנס לפרוטאזום לשפלה, יש להסיר את תג פולי-יוביקוויטין. כיתה של אנזימים המכונים deubiquitinating אנזימים (dubs) אחראית לפינוי והמיחזור של מולקולות יוביקוויטין 2. זה כבר חזה מהגנום האנושי שיש כמעט מאה ממכן עובד בתא 3. עם מספר כה גדול של ממכן שליטה תהליכים תאיים בתיווך UB, לומד אנזימים אלה מציב אתגר מאז טכניקות mRNA לא נותנים מידע על פעילות ומערבית סופג רק נותן מידע על רמות ביטוי. השימוש בhemagglutinin השפעת (HA) מתויג, UB-נגזר בדיקות אתר מכוונות פעילים מאפשר לmod קוולנטייםification של ממכן הפונקציונלי ולכן נותן להדמיה ישירה של הפעילות של אנזימים אלה על כתם מערבי 4. יש בדיקות קבוצה תגובתי תיאול C-מסוף המשמשת כמצע להתאבדות שאריות ציסטאין אתר הפעיל 5. עם בדיקות אלה, ניתן ללמוד את הפעילות וביטוי פוטנציאל של ממכן רבים תחת שני מצבים פתולוגיים ופיסיולוגיים של התא. שינויים בפעילות DUB היו מעורבים במגוון של מצבים פתולוגיים כגון פרקינסון, אלצהיימר, אנמיה וסוגי סרטן שונים 6-10. טכניקה זו מספקת כלי רב עוצמה לחקר המחלה. בעבודה הנוכחית, אנו מציגים את היישום של טכניקה זו בתאי הלה וM17 שכבר lysed באמצעות חרוזים זכוכית. בנוסף, אנו מתארים כיצד להשתמש בשיטה זו בדגימות רקמת חוט השדרה עכבר. המידע שהתקבל מטכניקה זו יכול לשמש כנקודת פתיחה לזיהוימטרות טיפוליות, כמו גם דגמי ההקמה לחקר תנאי מחלה שונים. השירות האמיתי של טכניקה זו הוא ביכולתה לספק מידע על ממכן מרובה בassay אחד.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:615px;" width="615">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PowerGen 125 ( Homogenizer)</td>
			<td style="width:113px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-261-02P</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacuum-driven filters .22&#181;M&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td style="width:119px;">BPV2210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass beads, acid washed &#8804;106&#181;m (~140 U.S. sieve)</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G4649-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:113px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S6-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:113px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:113px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue culture flask 75cm2 w/ filter cup 250 ml 120/ cs</td>
			<td style="width:113px;">Cellstar</td>
			<td style="width:119px;">T-3001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:113px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HI FBS</td>
			<td style="width:113px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H9658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag)</td>
			<td style="width:113px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">BML-UW0155-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Laemmli&#39;s SDS-Sample Buffer (4X, reducing)</td>
			<td style="width:113px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-110R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:113px;">ThermoScientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for measuring the activity of deubiquitinating enzymes in cell lines and tissue samples

לאחרונה מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום הייתה מעורבת בפתולוגיות שונות כולל מחלות ניווניות וסרטן. לאור זאת, טכניקות ללימוד מנגנון הרגולציה של מערכת זו הן חיוניות להבהרת התהליכים התאיים ומולקולריים של המחלות הנ&quot;ל. השימוש בבדיקות היוביקוויטין hemagglutinin נגזר המתוארות במאמר זה משמש ככלי רב ערך למחקר של מערכת זו. מאמר זה מפרט שיטה המאפשרת למשתמש לבצע מבחני שנותנים להדמיה ישירה של deubiquitinating פעילות אנזים. אנזימי Deubiquitinating לשלוט השפלה proteasomal ולשתף הומולוגיה פונקציונלית באתרים הפעילים שלהם, המאפשר למשתמש לחקור את הפעילות של אנזימים רבים בassay אחד. מתקבל lysates דרך הפרעה תא מכאנית עדינה וטופחו עם בדיקות מכוונות אתר פעיל. אנזימים פונקציונליים מתויגים עם הבדיקות תוך אנזימים פעילים יישארו מאוגד. על ידי הפעלהנינג assay זה, המשתמש מקבל את המידע משני הפעילות וביטוי פוטנציאל של אנזימי deubiquitinating מרובים באופן מהיר וקל. השיטה הנוכחית היא באופן משמעותי יעילה יותר באמצעות נוגדני פרט למאה האנזימים deubiquitinating חזו בתא האנושי.

תאי M17 והלה תרבותיים נקצרו בשיטה מפורטת ב( קציר Cell 3.) פרוטוקול ורקמת חוט השדרה עכבר הושגה. תא גלולה / רקמת חוט השדרה הוצבה בצינור עם חיץ תמוגה המתואר בסעיף הכנת מגיב. כדורי תא היו lysed באמצעות חרוזים זכוכית (איור 1 א) ודגימות רקמת חוט השדרה עכבר היו הומוגני באמצעו?...

Watch this Scientific Journal Video about Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples at JoVE.com

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

הפרוטוקול הנוכחי מפרט שיטה למדידת הפעילות של אנזימים תפקודי הומולוגי deubiquitinating. בדיקות מיוחדות קוולנטית לשנות את האנזים ולאפשר לגילוי. שיטה זו מחזיקה את הפוטנציאל לזהות מטרות טיפוליות חדשות.

שיטה למדידת הפעילות של אנזימי Deubiquitinating בשורות תאים ודגימות רקמה

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

method-for-measuring-activity-deubiquitinating-enzymes-cell-lines

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K Views.  University of Minnesota.  הפרוטוקול הנוכחי מפרט שיטה למדידת הפעילות של אנזימים תפקודי הומולוגי deubiquitinating. בדיקות מיוחדות קוולנטית לשנות את האנזים ולאפשר לגילוי. שיטה זו מחזיקה את הפוטנציאל לזהות מטרות טיפוליות חדשות. 

Video: Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Assay למדידת פעילות Escherichia coli ועין מתנהלת ליזין Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

עשה זאת בעצמך התקן להבראת דוגמאות Cryopreserved בטעות ירד לתוך טנקים אחסון קריוגני

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate energy for mechanical work, such as protein trafficking and degradation, solute transport, and cellular movements. The protocol described here is a basic assay for measuring the in vitro activity of purified ATPases for functional characterization. Proteins hydrolyze ATP in a reaction that results in inorganic phosphate release, and the amount of phosphate liberated is then quantitated using a colorimetric assay. This highly adaptable protocol can be adjusted to measure ATPase activity in kinetic or endpoint assays. A representative protocol is provided here based on the activity and requirements of EpsE, the AAA+ ATPase involved in Type II Secretion in the bacterium Vibrio cholerae. The amount of purified protein needed to measure activity, length of the assay and the timing and number of sampling intervals, buffer and salt composition, temperature, co-factors, stimulants (if any), etc. may vary from those described here, and thus some optimization may be necessary. This protocol provides a basic framework for characterizing ATPases and can be performed quickly and easily adjusted as necessary.

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

We describe a basic protocol for quantitating in vitro ATPase activity. This protocol can be optimized based on the level of activity and requirements for a given purified ATPase.

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות ATPase עבור אנזימתי אפיון

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

השוואה של שלוש שיטות שונות לקביעת שגשוג תאים בשורות תאי סרטן השד

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

מדידת פעילות אנזימטי לקטאז במעבדת ההוראה

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

-Cut ההיברידי: שיטת חתך משופרת עבור דוגמאות רקמות צמח סרבן

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

דיסקציה של בולה השמיעה של עכברים אחרי לידה: בידוד של עצמות באוזן התיכונה ניתוח היסטולוגית

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...