The authors would like to acknowledge funding from a National Institutes of Health grant RO1AI049294 (to M. S.).

1. בצע תגובת ATP הידרוליזה עם חלבונים מטוהרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מניות של כל ריאגנטים נדרשים דגירה עם חלבונים מטוהרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5x HEPES / NaCl / גליצרול (HNG) מאגר המכיל 100 מ&quot;מ HEPES pH 8.5, 65 mM NaCl, ו -5% גליצרול (או חיץ assay אחרים על פי הצורך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 100 מ&quot;מ MgCl 2 (או מתכת אחרת, אם ATPase הוא תלוי מתכת) במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טרי 100 מ&quot;מ ATP ב 200 מ&quot;מ טריס הבסיס (לא להתאים את pH נוספת) באמצעות ATP טוהר גבוהה. Aliquot ולאחסן את המניה ATP ב -20 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מכמה שבועות, כמו ATP יהיה לשבור לאורך זמן, ולהימנע הקפאה להפשרה מניית ATP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Premix MgCl 2 ו- ATP ביחס של 1: 1 רק לפני הגדרת התגובה הידרוליזה ATP. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תווית 1.5 מ&quot;ל צינורות לאיסוף דגימות במרווחים קבועים לאורך התגובה. הכן צינורות לאיסוף דגימות בשלב 0 ו בשלב 15, 30,45, ו 60 דקות. הערה: כחלופה, לאסוף דגימות רק בזמן 0 ואת נקודת הסיום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ HNG 1x 245 μl על צינור אחד כדי לדלל דגימות שנאספו התגובות הידרוליזה ATP 1:50. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן אמבט קרח אתנול יבשים להקפאת דגימות במהירות כדי לעצור את התגובה. בתוך דלי קרח גומי או בטוחים אחרים (לא פלסטיק) מיכל, להוסיף כמה חתיכות של קרח יבש ובזהירות לשפוך מספיק 70-100% אתנול לכיסוי קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל חלבונים מטוהרים במאגר HNG 1x, על פי הצורך (בדרך כלל 5-10 מיקרומטר), ולשמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את התגובות הידרוליזה ATP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 0.5 מ&quot;ל צינורות נפרדים עבור כל דגימה, מוסיפים את ריאגנטים הבאים (לפי הסדר): H 2 O (עד לנפח סופי של 30 μl), 6 μl 5x HNG או חיץ אחר, 3 μl 100 מ&quot;מ MgCl 2 תערובת -ATP, ו 0.25-5 חלבון מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלול תנאי בקרה שלילי חיץ-היחידה שבה אין חלבון הוא הוסיף.</li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 5 μl מן התגובה בזמן 0, לדלל 01:50 בצינור 1.5 מ&quot;ל מוכן המכיל חיץ 245 μl HNG, ומיד להקפיא את הדוגמה באמבט קרח / אתנול יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תגובות ב 37 ° C כדי לאפשר הידרוליזה ATP להתרחש במשך שעה 1. בכל מרווח (15, 30, 45, ו -60 דק &#39;), להסיר 5 aliquots μl מן התגובה ולהוסיף דוגמיות שכותרתו המכיל HNG חיץ כמו בשלב 1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף תגובת הידרוליזה ATP, להעביר בדילול דגימות במקפיא -80 מעלות צלזיוס לאחסון. כדי להבטיח את כל דגימות קפואות לחלוטין, להמתין לפחות 10 דקות לפני שתמשיך. </li></ol> 2. דוגמאות דגירה המכילים Pi חינם עם איתור מגיב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה בדילול דגימות המכילות aliquots תגובת הידרוליזה ATP בכל נקודת זמן (המתקבלות צעדים 1.6 ו 1.7) בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת צלחת 96-היטב המכילה דגימות וסטנדרטים פוספט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך 0.5 מ&quot;ל tuלהיות, לדלל את רמת פוספט (מסופק עם מגיב זיהוי Pi) מ 800 מיקרומטר עד 40 מיקרומטר על ידי הוספת 5.5 μl של למאגר HNG 800 מיקרומטר רגיל 104.5 μl. מערבבים היטב, ולהוסיף 100 μl של 40 מיקרומטר זה Pi סטנדרטי היטב A1 של צלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl HNG חיץ לבארות B1-H1 טוב 1: 1 דילולים סידוריים של תקן Pi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 50 μl של 40 מיקרומטר Pi מבאר A1 ולהוסיף למאגר assay 50 μl ב B1 היטב, לערבב, ולהסיר 50 μl מבאר B1 ולהוסיף גם C1, דילולים ועד ל G1 היטב. מחק 50 μl מבאר G1 לאחר ערבוב כדי להבטיח היטב כל יש את אותו נפח. ובכן H1 צריך להכיל חיץ רק ליצור תקן Pi מן 40 עד 0 מיקרומטר. הערה: אם גורם נוסף (כגון מעכבים) נוסף הדגימות, ליצור עקומת סטנדרט המכילה גורמים לשלוט על שינויים במהדורה פוספט או ספיג בתנאים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של כל sample בשני עותקים לצלחת. להוסיף דוגמאות מאותה נקודת זמן בטורים אנכית (זמן מדגם 1 0 = A2, A3; מדגם 2 זמן 0 = B2, B3) ו בנקודות זמן שונות אופקית. זה מאפשר עד 8 דגימות ו -5 נקודות זמן לכל צלחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipet סטרילי להסיר מספיק מלכיט מגיב זיהוי Pi ירוק / molybdate להוסיף 100 μl לכל אחד בארות המכיל דגימות ותקנים (מגיב הצורך (מ&quot;ל) = 0.1 x מספר דוגמאות וסטנדרטים) ולהוסיף לצלחת עבור pipetting קל באמצעות pipet הרב ערוצית. אין לשפוך מגיב זיהוי ישירות לתוך התבשיל, כמו זיהום Pi צפוי להתרחש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipet רב ערוצית, להוסיף 100 μl של מגיב זיהוי Pi היטב כל ומערבבים ידי pipetting למעלה בזהירות למטה מספר עקבי של פעמים ללא בועות מציגות, רצוי בסדר עדיפות מהנקודות בפעם האחרונות לנקודות לראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחת במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר, או על פי maכיוונים של nufacturer. </li></ol> 3. תוצאות לכמת באמצעות קורא microplate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הספיגה של הדגימות ב 650 ננומטר באמצעות קורא microplate ספיג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך עקומת סטנדרט Pi. באמצעות תוכנת גרפים, גרף את הערכים הספיגים עבור דגימות תקן Pi לעומת ריכוז כדי למצוא משוואה להשתמש כדי לפתור את כמות הפוספט מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את פעילות ATPase עבור כל דגימה על ידי כיול עם תקן פוספט. פוספט שוחרר = (OD 650 - ליירט Y) / המדרון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע לצרכן הכולל כפילויות של כל דגימה. הפחת את הקריאה הספיגה של שליטת החיץ בלבד ממספר זה. הכפל זאת על ידי גורם לדילול (50 בדוגמה שלנו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את Pi nmol שוחרר לכל חלבון μmol. Graphing ערכים אלה עבור כל נקודת זמן ב assay הקינטית אמור להניב מתאים ליניארי של לפחות R = 0.99 (איור 1); אם not, assay יכול להיות מותאם עם יותר או פחות חלבון או זמן דגירה ארוך או קצר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייצגים את התוצאות כפי nmol Pi / μmol חלבון / min (איורים 2, 3), או כפי nmol Pi / מיקרוגרם חלבון / min אם תרצה בכך. </li></ol>

<ol><li>Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA%2B+proteins%3A+have+engine%2C+will+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">AAA+ proteins: have engine, will work.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).</li>
<li>Baker, T. A., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClpXP%2C+an+ATP-powered+unfolding+and+protein-degradation+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).</li>
<li>Maxson, M. E., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vacuolar-type+H%2B-ATPase+at+a+glance+-+more+than+a+proton+pump%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump.</a> J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).</li>
<li>Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+of+genes+for+secretion+NTPases%3A+Identification+of+the+widespread+tadA+subfamily+and+development+of+a+diagnostic+key+for+gene+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).</li>
<li>Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+the+Extracellular+Protein+Secretion+NTPase+EpsE+of+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae.</a> J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).</li>
<li>Camberg, J. L., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+Vibrio+cholerae+type+II+secretion+ATPase+EpsE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE.</a> J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).</li>
<li>Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+secretion+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Type II secretion and pathogenesis.</a> Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).</li>
<li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct%2C+Real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).</li>
<li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green%3A+An+improvement+and+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation.</a> J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li>
<li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microassay+for+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A microassay for ATPase.</a> Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).</li>
<li>Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+kinetic+analysis+of+the+intracellular+domain+of+human+protein+tyrosine+phosphatase+%CE%B2+%28HPTP+%CE%B2%29+using+synthetic+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides.</a> Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).</li>
<li>Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+stimulation+of+EpsE+ATP+hydrolysis+by+EpsL+and+acidic+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids.</a> EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).</li>
<li>McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+the+weak+ATPase+activity+of+human+Hsp90+by+a+client+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein.</a> J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).</li>
<li>Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XpsE+oligomerization+triggered+by+ATP+binding%2C+not+hydrolysis%2C+leads+to+its+association+with+XpsL%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL.</a> EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).</li>
<li>Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaeal+flagellar+ATPase+motor+shows+ATP-dependent+hexameric+assembly+and+activity+stimulation+by+specific+lipid+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding.</a> Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).</li>
<li>Savvides, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VirB11+ATPases+are+dynamic+hexameric+assemblies%3A+new+insights+into+bacterial+type+IV+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion.</a> EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).</li>
<li>Sanghera, J., Li, R., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+luminescent+ADP-Glo+assay+to+a+standard+radiometric+assay+for+measurement+of+protein+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Techn%22%5BJournal%5D)">Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity.</a> Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).</li>
<li>Sherman, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoupling+catalytic+activity+from+biological+function+of+the+ATPase+that+powers+lipopolysaccharide+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cofactor+regulation+with+disease-associated+p97%2FVCP+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).</li>
<li>Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

זהו פרוטוקול כללי למדידת בפעילות ATPase במבחנה של חלבונים מטוהרים לאפיון ביוכימיים. שיטה זו מותאמת במיוחד בקלות; למשל, התאמת כמות חלבון, חיץ ויצירות מלח, טמפרטורה, וגיוון האורך ומרווחי assay (כולל הגדלת המספר הכולל של מרווחים) יכול לשפר quantitation פעילות. זמין מסחרי ריאגנטים ירוק מבוססת מלכיט רגיש מאוד, והוא יכול לזהות כמויות קטנות של פוספט חינם (~ 50 pmol ב 100 μl). בשל הרגישות של assay זה, חשוב להשתמש כלי פלסטיק חד פעמיים, מי ultrapure, מאגרים, ריאגנטים נטולי זיהום פוספט. לאחר חלבונים מטהרים, הדרת גודל או כרומטוגרפיה חילוף יונים מומלצת לשפר טוהר חלבון ולהסיר מזהמים. עבור חלבונים המוצגים חלשים בפעילות ATPase במבחנה, ממריצים ניתן להוסיף התגובה כדי לשפר דוארפעילות nzymatic. גורמים רבים המעודדים פעילות ATPase מתאפיינים. לדוגמה, cardiolipin ושומנים קרום אחרים, חלבוני הלקוח של מלווים כגון Hsp90, וחלבונים אחרים המעורבים בתמיכה תצורות או בסביבות מסוימות שבהן ATPases לתפקד 13-15. המעבדה שלנו ראשונה מאופיינת EpsE ידי טיהורם מונומרים עם פעילות ATPase חלשה לעומת ATPases ההומולוגי 6. אנו מאוחר יותר גילינו שכאשר EpsE היה copurified עם תחום cytoplasmic של EpsL, חלבון הטרנסממברני ושותף עקדת EpsE במערכת T2S, תוספת של פוספוליפידים חומציים כגון cardiolipin לתערובת התגובה הגדילה את פעילות ATPase מאוד של EpsE 12. מחק סביר זה התנאים חוויות EpsE על הממברנה cytoplasmic שעשויה לקדם oligomerization. שימשו טכניקות רבות לכמת פעילות במבחנה ATPase של חלבונים מטוהרים. γ- רדיואקטיביים <sup&gt; 32 P כבר תדיר בהצלחה מיושם לכמת הידרוליזה ATP 14,16, עם זאת, הבטיחות היא דאגה ומחייב אישור לשימוש במעבדה של רדיואקטיביות. בעוד רגיש ביותר, זמן מחצית החיים הקצר של γ- 32 P הוא גם חיסרון. שיטות זיהוי פוספט מסחרי אחרות זמינות, כמו אלה המסתמכים על ההיווצרות של מוצר ניאון. חלק מהשיטות הללו הם גם מאוד רגישים, אבל לעתים קרובות דורש תוספת של אנזימים אחרים התגובה, וכתוצאה מכך ריאגנטים כי הם פחות יציבים לאורך זמן. בנוסף, ערכות זמינות המאתרות ADP שפורסם במהלך הידרוליזה ATP באמצעות ריאגנט מבוסס הארה יציב, אך אלה עשויים להיות פחות אידיאליים ATPases עם רמות נמוכות של פעילות 17. Assay המתואר כאן מורכב צעד מדידת שחרור פוספט אחד בלבד, הוא רגיש מאוד, ובדרך כלל ניתן לבצע תוך מספר שעות. כמו כן ניתן prepaמחדש מצע ירוק המכיל מלכיט להימנע רכישת ערכה מרוכל מסחרי 6,9. שיקול אחד לפני ביצוע assay זה הינו שהצעד בין הוספת מגיב איתור פוספט ולקיחת קריאות ספיגת הוא יחסית זמן רגיש חייב להיות בין 20-30 דקות. פרוטוקול בסיסי זה יכול לשמש כדי לקבוע את התפקיד של חומרים ממריצים (כמתואר), יריבים, יחידות משנה, תחומים, ושאריות ספציפיות בפעילות ATPase 15,16,18,19. assay זה יכול להתארך גם למדוד את הפעילות של phosphatases או אנזימים אחרים המשחררים פוספט במהלך קטליזה. בנוסף, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על הקרנת תפוקה גבוהה עבור מעכבי ATPase 20.

ATPases are integral enzymes in many processes across all kingdoms of life. ATPases act as molecular motors that use the energy of ATP hydrolysis to power such diverse reactions as protein trafficking, unfolding, and assembly; replication and transcription; cellular metabolism; muscle movement; cell motility; and ion pumping1-3. Some ATPases are transmembrane proteins involved in transporting solutes across membranes, others are cytoplasmic and may be associated with a biological membrane such as the plasma membrane or those of organelles.
AAA+ ATPases (ATPases associated with various cellular activities) make up a large group of ATPases that share some sequence and structural conservation. These proteins contain conserved nucleotide binding motifs such as Walker-A and -B boxes and form oligomers (generally hexamers) in their active state1. Large conformational changes in these proteins upon nucleotide binding have been characterized among diverse members of the AAA+ family. EpsE is a AAA+ ATPase and member of the bacterial Type II/IV secretion subfamily of NTPases4-6. EpsE powers Type II Secretion (T2S) in Vibrio cholerae, the causative agent of cholera. The T2S system is responsible for the secretion of a wide variety of proteins, such as the virulence factor cholera toxin that causes profuse watery diarrhea when V. cholerae colonizes the human small intestine7. 
Techniques for quantitating in vitro ATPase activity are varied, but commonly measure phosphate release using colorimetric, fluorescent, or radioactive substrates8-11. We describe a basic method for determining in vitro ATPase activity of purified proteins using a colorimetric assay based on a commercially available malachite green-containing substrate that measures liberated inorganic phosphate (Pi). At low pH, malachite green molybdate forms a complex with Pi and the level of complex formation can be measured at 650 nm. This simple and sensitive assay may be used to functionally characterize new ATPases and to evaluate the roles of potential activators or inhibitors, to determine the importance of domains and/or specific residues, or to assess the effect of particular treatments on enzymatic activity.

<table><tbody><tr><td>HEPES buffer</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine triphosphate (ATP)</td><td>Fisher</td><td>BP41325</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates (clear, flat-bottom)</td><td>VWR</td><td>82050-760</td><td></td></tr><tr><td>BIOMOL Green</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-AK111</td><td>Preferred phosphate detection reagent. Caution: irritant.</td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td></td><td></td><td>BioTek Synergy or comparable</td></tr><tr><td>Prism 5</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring in vitro atpase activity for enzymatic characterization

אנזימים אדנוזין hydrolyzing-אדנוזין, או ATPases, לשחק תפקיד קריטי במגוון תחומי פעילות התאים. חלבונים דינמיים אלה יכולים לייצר אנרגיה לעבודה מכאנית, כגון סחר חלבון ושפלה, תחבורה מומסת, ותנועות הסלולר. הפרוטוקול המתואר כאן הוא assay בסיסי למדידת הפעילות חוץ גופייה של ATPases המטוהר עבור אפיון פונקציונלי. חלבונים hydrolyze ATP בתגובה כי התוצאות שחרור פוספטים אנאורגניים, ואת כמות פוספט שוחררה לאחר מכן ונרשמת באמצעות assay colorimetric. ניתן להתאים מאוד זה פרוטוקול להתאמה כדי למדוד את פעילות ATPase מבחני קינטית או נקודת הסיום. פרוטוקול נציג מסופק כאן מבוסס על פעילות ודרישות של EpsE אא&quot;א + ATPase מעורב Type II הפרשת ב החיידק Vibrio cholerae. כמות החלבון מטוהר צורך למדוד פעילות, האורך של assay ואת העיתוי מספר saבמרווחי mpling, חיץ רכב מלח, טמפרטורה, שיתוף גורמים, ממריצים (אם בכלל), וכו &#39;עשוי להשתנות מאלו המתוארים כאן, וכך כמה אופטימיזציה עשוי להיות נחוץ. פרוטוקול זה מספק מסגרת בסיסית ATPases המאפיינת וניתן לבצעו במהירות להתאים בקלות במידת הצורך.

פעילות חוץ גופית של EpsE T2S ATPase יכול להיות מגורה על ידי copurification של EpsE עם תחום cytoplasmic של EpsL (EpsE-cytoEpsL) ותוספת של cardiolipin פוספוליפידים חומצי 12. כמו כן ניתן לקבוע את התפקיד של שאריות EpsE מסוימות הידרוליזה ATP על ידי השוואת פעילות של סוג בר (WT) כדי הגירסות שונות של החלבון באמצעות assay. הנה, את ההשפעה של החלפת שתי שאריות ליזין בתחום אבץ מחייב EpsE נמדדת על ידי השוואת פעילות ATPase של מטוהרים WT EpsE-cytoEpsL החלופה K417AK419A-cytoEpsL EpsE. באיור 1, שחרור פוספט ממשיך באופן ליניארי במהלך של assay הקינטית 1 hr, דרישת כימות מדויקת של פעילות ATPase קינטית. איור 2 מציג נתונים מאותו דגימות החלבון מטוהרות כמו איור 1 כי היו assayed שלוש פעמים כפולות ונרשמות במונחים שלשיעור ממוצע של שחרור פוספט. נתונים אלה מראים כי K417 ו K419 להיראות חשוב לפעילות EpsE ATPase. עם זאת, השוואה של unstimulated (לא cardiolipin) מחירים פעילות ATPase (איור 3) מראה כי K417 ו K419 לא תרמו לפעילות הבסיס של EpsE אלא ליכולת של החלבון להיות מגורה על ידי cardiolipin. Lysines בעלי מטען חשמלי חיובי בתחום אבץ מחייב EpsE יכול לתקשר ישירות עם פוספוליפידים טעונים שלילית, ובכך לתרום את הגירוי בתיווך פוספוליפידים הפעילות EpsE ATPase. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54305/54305fig1.jpg" /> איור 1: פוספט הוא פורסם באופן ליניארי ב assay קינטי ATPase שעה אחת הקינטית מגורה cardiolipin assay ATPase השוואת שחרור פוספט של 0.5 מיקרומטר WT EpsE-cytoEpsL כדי EpsE K417AK419A-cytoEpsL עם אלבומין בסרום שור (BSA) assayed כפי.כביקורת שלילית. נתונים [כמות פוספט שוחרר (ציר y) לעומת הזמן (ציר x)] היו זממו ו נתון ניתוח רגרסיה ליניארית. השיפוע מייצג את שיעור הידרוליזה ATP. גרף נציג עם משוואות רגרסיה ליניארית במשך שלושת החלבונים מוצג. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54305/54305fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54305/54305fig2.jpg" /> איור 2:.. Double ליזין מוטציות EpsE אבץ-Binding Domain להפחית מאולצת ATPase פעילות תוצאות של assay ATPase הקינטית 1 hr מגורה cardiolipin עם אותו החלבונים ותנאים כמו באיור 1 מבחנים בוצעו שלוש פעמים נפרדות בשני עותקים טכניים שיעור הידרוליזה ATP חושב כמו פוספט nmol שנוצר לדקה לכל מיקרומטר pr<html> otein באמצעות משוואות רגרסיה ליניארית. התוצאות הממוצעות עם סטיית התקן מוצגות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54305/54305fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54305/54305fig3.jpg" /> איור 3: Double ליזין מוטציות EpsE האבץ-Binding Domain אינו מפריע unstimulated ATPase פעילות הלילה (16 שעות) נקודת סיום unstimulated (לא cardiolipin) assay ATPase השוואת הפעילות של 5 מיקרומטר WT EpsE-cytoEpsL כדי EpsE K417AK419A-cytoEpsL עם BSA. כביקורת שלילית. מבחנים בוצעו שלוש פעמים נפרדות בשני עותקים טכניים ותוצאות ממוצעות עם סטיית התקן מוצגות. רמת הבסיס של פעילות unstimulated EpsE ATPase assayed על פני תקופה של 16 שעות הוא ~ 1,000 פי הנמוך מ -1 hr הקינטית פעילות מגורה cardiolipin.e.com/files/ftp_upload/54305/54305fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization at JoVE.com

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

We describe a basic protocol for quantitating in vitro ATPase activity. This protocol can be optimized based on the level of activity and requirements for a given purified ATPase.

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות ATPase עבור אנזימתי אפיון

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

measuring-in-vitro-atpase-activity-for-enzymatic-characterization

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

18.0K Views.  University of Michigan. We describe a basic protocol for quantitating in vitro ATPase activity. This protocol can be optimized based on the level of activity and requirements for a given purified ATPase.

Video: Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Biochemistry

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Nucleoside Triphosphate Hydrolases Assay in Toxoplasm gondii and Neospora caninum for High-Throughput Screening using a Robot Arm

Protozoan parasites infect humans and many warm-blooded animals. Toxoplasma gondii, a major protozoan parasite, is commonly found in HIV-positive patients, organ transplant recipients and pregnant women, resulting in the severe health condition, Toxoplasmosis. Another major protozoan, Neospora caninum, which bears many similarities to Toxoplasma gondii, causes serious diseases in animals, as does Encephalomyelitis and Myositis-Polyradiculitis in dogs and cows, resulting in stillborn calves. All these exhibited similar nucleoside triphosphate hydrolases (NTPase). Neospora caninum has a NcNTPase, while Toxoplasma gondii has a TgNTPase-I. The enzymes are thought to play crucial roles in propagation and survival. In order to establish compounds and/or extracts preventing protozoan infection, we targeted these enzymes for drug discovery. The next step was to establish a novel, highly sensitive, and highly accurate assay by combining a conventional biochemical enzyme assay with a fluorescent assay to determine ADP content. We also validated that the novel assay fulfills the criteria to carry out high-throughput screening (HTS) in the two protozoan enzymes. We performed HTS, identified 19 compounds and six extracts from two synthetic compound libraries and an extract library derived from marine bacteria, respectively. In this study, a detailed explanation has been introduced on how to carry out HTS, including information about the preparation of reagents, devices, robot arm, etc.

<meta charset="utf8"></head><body>בדיקת הידרולאזות נוקלאוזיד טריפוספט בטוקסופלזמה גונדי ו-Neospora caninum להקרנה בתפוקה גבוהה באמצעות זרוע רובוט

Toxoplasma gondii and Neospora caninum infections are found in humans and animals and lead to serious health issues. The two parasites share similar nucleoside triphosphate hydrolases and play important roles in propagation and survival. We established a high-standard assay of the enzymes requiring robot arm usage.

בדיקת הידרולאזות נוקלאוזיד טריפוספט בטוקסופלזמה גונדי ו-Neospora caninum להקרנה בתפוקה גבוהה באמצעות זרוע רובוט

Protozoan parasites infect humans and many warm-blooded animals. Toxoplasma gondii, a major protozoan parasite, is commonly found in HIV-positive ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

זיהוי ישיר של פעילות Acetate יוצרי של קינאז Acetate אנזימים

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to substrates to create phosphorylated products. The use of &#947;-32-P labeled NTP precursors allows simultaneous monitoring of substrate utilization and product formation by radiography. Thin layer chromatography (TLC) on cellulose plates allows rapid separation and sensitive quantification of substrate and product. We present a method for utilizing the thin-layer chromatography to assay the pyrophosphokinase activity of a purified (p)ppGpp synthetase. This method has previously been used to characterize the activity of cyclic nucleotide and dinucleotide synthetases and is broadly suitable for characterizing the activity of any enzyme that hydrolyzes a nucleotide triphosphate bond or transfers a terminal phosphate from a phosphate donor to another molecule.

A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Here, we describe a method for purifying histidine-tagged pyrophosphokinase enzymes and utilizing thin layer chromatography of radiolabelled substrates and products to assay for the enzymatic activity in vitro. The enzyme activity assay is broadly applicable to any kinase, nucleotide cyclase, or phosphor-transfer reaction whose mechanism includes nucleotide triphosphate hydrolysis.

ב חוץ גופית Assay פעילות עבור ppGpp (p) המעביר מ Clostridium difficile וטיהור

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...

Immunology and Infection

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

הערכה של פונקציות מיטוכונדריאלי וכדאיויות תא בתאי כלית overexpressing חלבון קינאז C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

מבחני ביוכימיים לניתוח פעילויות של ATP תלוי הכרומטין שיפוץ אנזימים

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

מדידה

Summary

Explore More Videos

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

בדיקת הידרולאזות נוקלאוזיד טריפוספט בטוקסופלזמה גונדי ו-Neospora caninum להקרנה בתפוקה גבוהה באמצעות זרוע רובוט

בדיקת הידרולאזות נוקלאוזיד טריפוספט בטוקסופלזמה גונדי ו-Neospora caninum להקרנה בתפוקה גבוהה באמצעות זרוע רובוט

זיהוי ישיר של פעילות Acetate יוצרי של קינאז Acetate אנזימים

ב חוץ גופית Assay פעילות עבור ppGpp (p) המעביר מ Clostridium difficile וטיהור

הערכה של פונקציות מיטוכונדריאלי וכדאיויות תא בתאי כלית overexpressing חלבון קינאז C Isozymes

מבחני ביוכימיים לניתוח פעילויות של ATP תלוי הכרומטין שיפוץ אנזימים

במבחנה Assay למדוד Phosphatidylethanolamine Methyltransferase פעילות