חבר מומן על ידי בריטניה מחקר לאגודה פרקינסון (גרנט F1002). עבודה זו נתמכה על ידי MRC החדש החוקר במענק מחקר (מר/L010933/1), על-ידי תוכנית MRC להעניק מר/N026004/1 ל- PAL, ועל ידי BBSRC studentship BB/M017222/1 למטוס. אנו מודים על עוקבה 2014-15 של MPharm חלק 1 סטודנטים מאוניברסיטת רדינג עבור השתתפות איטרציה הראשון של גדודים הזה מעשי, ובעקבות משוב, קלט.

הערה: להלן הפרוטוקול פותחה שיתקיים במשך שעתיים (כולל השלמת גליונות עבודה ב- class) במעבדה הוראה בנוי למטרה. המדרגות ניסיוני היו בכוונה לשים יחד כדי לא לכלול ניתוח מפורט יותר של קינטיקה אנזימטית (המבוצע במסגרת קורס זה באמצעות מודל נתונים); עם זאת – כאמור בדיון – הפרוטוקול מספק תבנית עבור ניתוחים מתקדמים יותר בהתאם רמת הפרי זמן ומתקנים, סטודנט.
בטיחות: מעשית זו צריכה להתבצע על פי הכללים של טוב כימי מעבדת האימון (GCLP) — ציוד מגן אישי, כולל מעבדה מהודק מעיל, כפפות חד פעמיות, בטיחות משקפיים צריכים ללבוש כל הזמן במעבדה .
1. חילוץ האנזים
<ol><li>למחוץ לקטאז טבליה אחת, המכילה 200 מ ג של אנזים, אבקת אפילו באמצעות ומכתש.</li>
	<li>מקם את האבקה המתקבלת לתוך צינור 15 מ"ל מתויג"ההשעיה", resuspend ב- 10 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS) של 100 מ מ.</li>
	<li>מערבולת עבור 1 דקות למקסם את שאיבת אנזימים.</li>
	<li>להעביר 1 מ"ל מ ההשעיה לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 mL צנטריפוגה עבור 1 דקות ב x 10,000 ג'י לחלקיקים מוצקים משקעים.</li>
	<li>העברת µL 500 של תגובת שיקוע צינור נקי mL 1.5 מתויג "לקטאז להוצאת".</li>
</ol>2. התבוננות התגובה ערכי צבע מוחלטים
<ol><li>µL במקום 390 מ"מ PBS לתוך צינור 1.5 mL מתויג"תגובה A".</li>
	<li>להוסיף 100 µL של 5 מ מ ONPG פתרון, לערבב היטב על ידי vortexing. התראה: מעשית זו משתמשת אורתופדיה-Nitrophenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) כתחליף לקטוז. מאחר ONPG הוא מתחם בעל תאים פנוליים, זה צריך להיות מטופל בזהירות. במקרה של מגע עם העור עם ONPG העור חשוף צריך לרחוץ באופן מיידי. נשפך כל שצריך למחות מיד עם מגבות נייר כדי להיות מסולק לתוך זרם פסולת המתאים.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של תמצית לתוך צינור התגובה A ו לערבב היטב על ידי vortexing.</li>
	<li>לצפות את תערובת התגובה למשך 5 דקות, הערה כל שינוי ערכי צבע מוחלטים לפתרון.</li>
</ol>3. מדידת פעילות אנזים
<ol><li>להגדיר את שני צינורות 1.5 mL: אחד מתויג "התגובה B", אחד שכותרתה "שליטה".</li>
	<li>להוסיף µL 390 מ"מ PBS התגובה B שפופרת, µL 400 מ"מ PBS אל הצינור שליטה ולאחר מכן להוסיף 100 µL של 5 מ מ ONPG כל שפופרת.</li>
	<li>מערבבים את התוכן על-ידי vortexing.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של תמצית לקטאז הצינור התגובה B, לערבב על ידי vortexing ולאפשר את התגובה להמשיך עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>ברגע 1 דקות חלף, להוסיף 500 µL של 1 מ' סודיום קרבונט שני צינורות כדי לעכב את האנזים לקטאז על ידי הגדלת ה-pH, ובכך מסיימת את התגובה.</li>
	<li>העבר 500 µL כל שפופרת לתוך וואקום ספקטרופוטומטרים נקי ולמדוד את ספיגת-420 nm באמצעות ספקטרופוטומטרים את.</li>
	<li>הערה ספיגת עבור התגובה B ודגימות הבקרה ולאחר מכן לחסר את ערך הפקד מהערך תגובת להפיק בשינוי ספיגת עקב הידרוליזה של ONPG בנוכחות האנזים פעיל.</li>
</ol>4. השפעת הטמפרטורה על פעילות האנזים
<ol><li>להגדיר פקד שלושה צינורות וצינורות התגובה שלושה כמתואר בסעיף 3, תווית אלה "4 ° C", "חדר Temp" ו- "37 ° C".</li>
	<li>בעקבות תוספת של אנזים לחלץ, דגירה שפופרת אחת על קרח, אחד בטמפרטורת החדר, ואחד ב 37 מעלות צלזיוס (באמבט מים מחומם מראש).</li>
	<li>לאפשר את תגובות המשך עבור 1 דקות, ואז לסיים את התגובה על-ידי הוספת µL 500 של 1 מ' סודיום קרבונט כל שפופרת.</li>
	<li>למדוד את ספיגת-420 nm לכל שפופרת כמתואר בסעיף 3. להקליט את הערכים, לחסר את ערך הפקד מהערך התגובה בכל מקרה ומקרה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, J. G., Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , (2015).</li><li>Jittam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+seaweed+enzyme-catalyzed+bromination+of+bromophenol+red:+An+inquiry-based+kinetics+laboratory+experiment+for+undergraduates.">Red seaweed enzyme-catalyzed bromination of bromophenol red: An inquiry-based kinetics laboratory experiment for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37, 99-105 (2009).</li><li>Troelsen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult-type+hypolactasia+and+regulation+of+lactase+expression.">Adult-type hypolactasia and regulation of lactase expression.</a> Biochimica et biophysica acta. 1723, 19-32 (2005).</li><li>Juers, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+view+of+the+action+of+Escherichia+coli+(lacZ)+beta-galactosidase.">A structural view of the action of Escherichia coli (lacZ) beta-galactosidase.</a> Biochemistry. 40, 14781-14794 (2001).</li><li>Plimmer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+presence+of+lactase+in+the+intestines+of+animals+and+on+the+adaptation+of+the+intestine+to+lactose.">On the presence of lactase in the intestines of animals and on the adaptation of the intestine to lactose.</a> Journal of Physiology. 35, 20-31 (1906).</li><li>Krebs, H. A., Salvin, E., Johnson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+citric+and+alpha-ketoglutaric+acids+in+the+mammalian+body.">The formation of citric and alpha-ketoglutaric acids in the mammalian body.</a> The Biochemical journal. 32, 113-117 (1938).</li><li>Vesa, T. H., Marteau, P., Korpela, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactose+intolerance.">Lactose intolerance.</a> Journal of the American College of Nutrition. 19, 165S-175S (2000).</li><li>Robayo-Torres, C. C., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+differentiation+of+congenital+lactase+deficiency+from+adult-type+hypolactasia.">Molecular differentiation of congenital lactase deficiency from adult-type hypolactasia.</a> Nutrition Reviews. 65, 95-98 (2007).</li><li>Swallow, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+lactase+persistence+and+lactose+intolerance.">Genetics of lactase persistence and lactose intolerance.</a> Annual Review of Genetics. 37, 197-219 (2003).</li><li>Enattah, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+introduction+of+two+lactase-persistence+alleles+into+human+populations+reflects+different+history+of+adaptation+to+milk+culture.">Independent introduction of two lactase-persistence alleles into human populations reflects different history of adaptation to milk culture.</a> American Journal of Human Genetics. 82, 57-72 (2008).</li><li>Lowe, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rapid+detection+of+lactose+fermentation+in+paracolon+organisms+by+the+demonstration+of+beta-D-galactosidase.">The rapid detection of lactose fermentation in paracolon organisms by the demonstration of beta-D-galactosidase.</a> Journal of Medical Laboratory Technology. 19, 21-25 (1962).</li><li>Russo, S. F., Moothart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+study+of+the+Enzyme+Lactase.">Kinetic study of the Enzyme Lactase.</a> Journal of Chemical Education. 63, 242 (1986).</li></ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

נתונים היסטוריים הידע וההבנה של אנזימים, תגובות אנזימטיות, קינטיקה אנזימטית נדרש עבור מגוון רחב של נושאים המתפרסות על-פני הביולוגיה, וההתערבות ו פרמקולוגיה. הפרוטוקול המתואר לעיל משתמש לקטאז כדוגמה של אנזים הרלוונטיים לבריאות האדם על הפגנת אנזימטיות, מתן מפתח מיומנויות שיכול לשמש בניסויים מבוסס מעבדה מתקדמים יותר.
פרוטוקול זה תוכנן בכוונה להיות הכי חזקים כמו אפשרי, דבר המאפשר לתלמידים עם מעט או ללא ניסיון מעבדה רטוב לתוצאות interpretable בזמן קצר של זמן. בשנת 2014/2015 הלימודים בביה ס מאוניברסיטת רדינג של בית מרקחת, סך של 144 סטודנטים, מאורגנת בקבוצות של 3, ביצעו את הניסוי "מדידת לקטאז", עם מסוגלים לזהות רמה מסוימת של פעילות אנזימטי של לקטאז tablet כל הקבוצות תמציות.
ישנם מספר צעדים קריטיים של פרוטוקול זה. קודם כל, זה חיוני כי החילוץ הראשוני הוא יעיל, ומאפשר solubilization של האנזים פעיל מספיק עבור ניתוחים שלאחר מכן. מניסיוננו, בשנה הראשונה סטודנטים ניתן להשיג זאת על-ידי ביצוע הפרוטוקול כמתואר; עם זאת הדרכה של מפגינים מעבדה נדרשה בשלב זה. למרות נראה נקודה מובנת מאליה, אחד מגורמי ההצלחה של פרוטוקול זה הוא היכולת למדוד באמצעי אחסון, כראוי בתווית צינורות ובזהירות ההוראות. בעוד רמה מסוימת של מיומנות ניתן להניח עבור סטודנטים רבים, פיקוח קפדני, בקשה ברורה לתלמידים לבקש סיוע בכל מקרה שבו הם בטוחים מה לעשות הבא מספק את הסבירות הגדולה ביותר של assay מוצלחת.
הערכת התלמיד יכול להתבצע על ידי ב- class בגליון העבודה (זמין כחומר משלים), מבקשים התלמידים לציין נתוני הניסויים, תגובה על התוצאות שלהם קישור לקריאת/רקע מידע מחומר ההרצאות, או יותר מפורט, מתוך הערכה בכיתה עם מודל נתונים שסופקו המאפשר ניתוח קינטי להיות ניסיון ולא מוערכים.
פרוטוקול שהוצגו במסמך זה הוא דוגמה פשוטה assay פעילות לקטאז תחת תנאי מעבדה מלמד, קואנקה כדי להגדיל את המורכבות של הניסוי כדי לאפשר ניתוח מתקדם יותר. בפרט, פרוטוקול שהוצגו מספקת מבוא לרעיון של קינטיקה אנזימטית אך אינו מאפשר ניתוח קינטי של נתוני הניסוי. ככזה, אנו ממליצים לצפייה הפרוטוקול המתואר כמו תבנית הראשוני עבור מחלקות, עם הפרטים המדויקים הותאם שיתאים את מטרות ספציפיות ואת כישוריו של קבוצה סטודנט התחייבות הניסויים. דוגמאות לניסויים המורחבת יכול לכלול: לחזור על המדידות בטמפרטורות שונות, באמצעות ריכוז סובסטרט שונים כדי לאפשר ניתוח סטטיסטי, קינטי ניתוח של נתונים (מתאים עבור סטודנטים ביוכימיה/מקצועות ראשיים), החל מספר לוחות שונים, המאפשר את התלמידים להעריך את פעילות שונים של האנזים בכל אחד (עם התוספת של שליטה טבליות, מתאים למדע פורנזי סטודנטים/מקצועות ראשיים), הערכת ההשפעה של חום דנטורציה או נושאת את המתחרים ניסויים על-ידי תוספת של לקטוז או מעכבים של לקטאז (טבלה 1). פרוטוקול מפורט לניתוח קינטי של לקטאז בעבר כבר פורסם12.
כוח חשוב של פרוטוקול זה הוא כי הוא משלב הקדמה בסיסי קינטיקה אנזימולוגיה, האנזים עם חקר מקרה אמיתי של אנזימולוגיה ברפואה. זה הופך את המעבדה. ניסוי הרלוונטיות לסטודנטים לרפואה, בית מרקחת, ביו ונושאים קשורים נוספים. חשוב מכך, העובדה כי יש בעיה רפואית רצינית וגם בעיית תזונה נפוצה יותר המשויכים לקטוז קטבוליזם מספק הזדמנות להעלות מגוון רחב של בעיות רפואיות ואתיות עם התלמידים. זה יכול לכלול את הנושאים בדיקה גנטית לטיפול בבעיות רפואיות, הקשורים דיונים הנוגעים ריפוי גנטי ייעוץ גנטי, כמו גם שימוש ואת מכירת צמחי מרפא תוספי מזון. מגבלה אחת גדולה היא כי הפרוטוקול אינו מאפשר הערכה מדויקת של ריכוז אנזים, עקב החומר ההתחלתי המשמש להפקת. שינוי להביא בחשבון זה, עם זאת, יהיה לשימוש ריאגנט כיתה אנזים וזמינותו. חשוב, זה יאפשר גם לחישוב מדויק יותר של קינטיקה של האנזים לקטאז.
לסיכום, assaying את הפעילות של לקטאז במעבדת ההוראה מספק סביבה חזקים, מרתק ומעניין הקדמה השדה של ביולוגיה אנזים בשלב מוקדם סטודנטים.

אנזימים הם סוג מיוחד של חלבון זה לשמש זרזים ביולוגיים עבור תגובות כימיות חי אורגניזמים1. הפעולה של אנזימים חיונית לחיים, לאספקת אנרגיה, סילוק פסולת, ומאפשר אורגניזמים לתפקד. ההבנה אנזימים, לפיכך, הוא קריטי עבור הבנה מלאה של החיים. ידע כזה חיוני עבור מגוון רחב של תוכניות ברמת תואר באוניברסיטה, החל מדעי הרפואה לביולוגיה. בעוד רקע מפורט ועד עקרונות זרז מודלים תיאורטיים של פעילות אנזים יכולה להינתן לתלמידים באמצעות הרצאות, חומר קריאה, המאפיינים של אנזים תגובות הכי מובנת על ידי ידיים על ניסיון מעשי של אנזימים בפעולה כאמור הפגינו2. פרוטוקול זה מספק פשוט לעקוב פרדיגמה נסיונית למדידת פעילות אנזים בתנאי מעבדה, לקטאז כדוגמא של אנזים עם פעילות הנוגעים לתזונה אנושית ובריאות.
ההידרולז glycosidic לקטאז (EC 3.2.1.23/26) הוא אנזים חשיבות התזונה מרכזית עבור יונקים3. הפעילות של לקטאז מאוד כולו דרך האבולוציה, ונגזרת ממשפחת בטא-galactosidase של אנזימים – משפחה מתנת Escherichia coli דרך הומו ספיינס (איור 1, PDB 1JZ8)4. חשיבות קריטית לקטאז באווירה התזונה האנושית נובעת תפקידה המאפשר פירוק של לקטוז למרכיביו בוחרים חד-סוכר, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש ליצירת אנרגיה בגוף. לקטאז ה מזרז הידרוליזה של קשר גליקוזידי ב דו-סוכר חלב (לקטוז), שחרור גלקטוז וגלוקוז (איור 2)5. Monosaccharides אלה משמשים אז בעיקר לדור של אדנוזין טריפוספט (ATP) דרך מעגל קרבס, זרחון חמצוני6. במהלך neonate והתפתחות תינוקות, לקטאז מתבטאת במיוחד מערכת העיכול האנושית, פירוק לקטוז קיבל חלב של לקטוז אילו הוא הרכיב העיקרי פחמימות, ואחד מקורות מרכזיים של תזונה במהלך השנים הראשונות 7. החשיבות הרפואית של לקטאז מודגשת על ידי מולדת לקטאז (המחלקה לחקירות), מצב נדיר הקרים autosomal נגרמת על ידי מוטציות בגן לקטאז (LCT) קידוד האנזים לקטאז8. תינוק בן יומו תינוקות עם המחלקה לחקירות להפגין מעט מאוד פעילות לקטאז, ובכך הם אינו ניתן להזנה על חלב אם, בכל סוג אחר של חלב, או נוסחה המכילה לקטוז.
במהלך הילדות, ביטוי לקטאז מוקטן בדרך כלל; עם זאת, הפחתה זו בעקבות הגמילה משתנה מבחינה גיאוגרפית, כ- 35% של מבוגרים ברחבי העולם ממשיכים להביע את האנזים9. ביטוי מתמשכת של לקטאז, המכונה התמדת לקטאז, מאפשר ליחידים להמשיך לעכל חלב ומוצרי חלב ממגוון מקורות. לעומת זאת, האובדן של לקטאז הביטוי יכול להוביל אי סבילות ללקטוז, המכונה גם למבוגרים hypolactasia (ATH), הנובע חוסר היכולת לפרק לקטוז בבטן. ATH מאופיין על ידי תהליך בנייה למעלה של לקטוז במעי הגס מבליעת לקטוז המכילה מוצרי מזון. במעי הגס, מותסס של לקטוז שנצבר על ידי החי והצומח מיקרוביאלית מעיים, שחרור גזים כולל מימן, מתאן, הפחמן הדו-חמצני. הייצור של גזים אלה אצל אנשים עם ליקויים האנזים לקטאז לקדם נפיחות בבטן, גזים מוגברת, כאב, בחילות, ו- borborygmi (הבטן מקרקרת)7. רמות גבוהות של לקטוז במערכת העיכול יכול גם להוביל שרפרפים רופף.
השליטה של ביטוי גנים LCT הוא מווסת על ידי פולימורפיזמים ממוקם ב אינטרונים של הגן MCM6 הסמוך. אנשים עם ביטוי מתמשכת של לקטאז לשאת פולימורפיזמים המתפקדים חזקה דיסטלי מרחיבי LCT ביטוי גנים, ובכך קיזוז הרגיל למטה רגולציה של שעתוק LCT במהלך הגמילה, וכתוצאה מכך ביטוי לקטאז מתפעל לבגרות3. משפר פולימורפיזמים שהוצעו חיובי שבחרו בעקבות הביות של בקר וגמלים במזרח התיכון לפני חמשת אלפים שנה9,10.
ניתן לנהל את הסימפטומים הנובעים ATH על-ידי הפחתת צריכת חלב (לקטוז), לדוגמה על-ידי הסרת מוצרי חלב בתזונה. גישה חלופית עבור ATH, הגישה של בחירה עבור המחלקה לחקירות, הוא השימוש של תוספי לקטאז, זמין נרחב מבתי מרקחת. תוספות אלה מספקים לקטאז מבודד ממגוון רחב של מקורות, כולל שמרים וחיידקים, בצורה נוזלית או מבוסס-הגלולה שניתן לקחת עם או להוסיף מזון המכיל לקטוז. תוספת hydrolyze שיעור של לקטוז נוכח המזון למוצרים גלוקוז, גלקטוז, ובכך יאפשר לקליטתם ומניעת הצטברות של לקטוז מעוכל המצע בבטן.
בהתבסס על השימוש של תוספי לקטאז כסיוע תזונתיים, פיתחנו ניסוי מעבדה אנזימולוגיה פשוט מתאים לתלמידי השנה הראשונה ביו המדע או בית מרקחת. בניסוי מעבדה מנצל תוספי לקטאז זמינים מסחרית, והשימושים אורתופדיה-nitrophenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) כדי לספק נקודת סיום ערכי צבע מוחלטים למדידת המחשוף של איגרות חוב glycosidic על ידי לקטאז ( איור 3)11. ONPG פועל על סובסטרט מלאכותי עבור? לקטאז, אשר כאשר נתון הידרוליזה על ידי אנזים זה מייצר D-גלקטוז אורתופדיה-nitrophenol. המוצר האחרון בעל צבע צהוב, קליטת אור באורך-גל של 420 ננומטר. מאת לכימות שינויים כלשהם ספיגת-420 nm הבאים חשיפת ONPG לקטאז, זה אפשרי להעריך את הפעילות של אנזים זה. בניסוי מעבדה מספק הפגנה של פעילות ההידרולז אנזימטיות. על ידי בבניין משכפל נוסף, בביצוע מבחני בתנאים שונים, זה ניתן לשלב ניתוח מתוחכמות יותר של קינטיקה אנזימטית, מתן דוגמה ממשית ערך של אנזימים בפעולה הרלוונטיים לבריאות האדם.

<table><tbody><tr><td>Lactase tablet</td><td>Lamberts</td><td>8511-60</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (powdered)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td>Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM</td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Sigma</td><td>N1127</td><td>Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate</td><td>Sigma</td><td>451614</td><td>Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M</td></tr><tr><td>De-ionized water</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pestle and mortar</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Jenway 6315</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubes</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer cuvettes</td><td>Jenway</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Vortex genie 2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weighing scales</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring lactase enzymatic activity in the teaching lab

להבין איך עובדים אנזימים, הנוגעים זה דוגמאות בחיים האמיתיים, הינה קריטית מגוון רחב של דרגות לתואר ראשון במדעי ביולוגי וביו. זה קל לעקוב אחר הפרוטוקול פותחה עבור סטודנטים לתואר ראשון בית מרקחת בשנה הראשונה ומספק מבוא ברמה התחלתית אנזים תגובות ונהלים אנליטי עבור ניתוח האנזים. האנזים של הבחירה היא? לקטאז, כמו זה מייצג דוגמה של אנזים זמינים מסחרית הרלוונטיים לאימון המחלה האנושית/פרמצבטיקה. לקטאז מופק תוסף תזונה טבליות, העריך שימוש assay ערכי צבע מוחלטים בהתבסס על הידרוליזה של סובסטרט מלאכותי של לקטאז (אורתופדיה-nitrophenol -beta-D-galactopyranoside, ONPG). שחרורו של אורתופדיה-nitrophenol בעקבות את המחשוף hydrolytic של ONPG על ידי לקטאז נמדד על ידי שינוי ספיגת-420 ננומטר, ואת השפעת הטמפרטורה על התגובה אנזימטי מוערך על-ידי ביצוע התגובה על קרח, בטמפרטורת החדר ו- 37 מעלות צלזיוס. ניתוח מתקדם יותר ניתן ליישום בעזרת פרוטוקול זה על ידי הערכת הפעילות אנזים בתנאים שונים באמצעות נוגדנים שונים.

נציג תוצאות בסעיף 2 של הפרוטוקול מוצגים באיור 4A. התגובה שליטה, בהיעדרו של האנזים לקטאז, נשארת ברורה בזמן הפתרון התגובה, המכיל תמצית מן הלוח? לקטאז, הופך צהוב כמו ONPG hydrolyzed שחרור אורתופדיה- nitrophenol. איור 4B מראה כימות באמצעות יחידות שרירותי של סעיף 4 של הפרוטוקול, הניתוח הבא דוגמאות שימוש ספקטרופוטומטרים. הייצור של אורתופדיה-nitrophenol הוא כאשר התגובה מודגרת על קרח, הגבוהים והנמוכים ביותר כאשר התגובה מתבצע ב- 37 מעלות צלזיוס.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig1.jpg"> איור 1 : E. coli בטא-galactosidase. (א) מבנה גבישי של בטא-galactosidase מ- Escherichia coli, מציג את המבנה tetrameric של הפעילים מורכבים. Allolactose (B) (מוצג באדום) מאוגדים האתר הפעיל של בטא-galactosidase. תמונות שנוצרו PDB 1JZ84. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig2.jpg"> איור 2 : פעולה אנזימטי של לקטאז. הידרוליזה של לקטוז על ידי לקטאז לייצר beta-D-גלקטוז, beta-D-גלוקוז. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig3.jpg"> איור 3 : הידרוליזה מאורתופדיה-nitrophenol - בטא -D-galactopyranoside. ONPG הידרוליזה על ידי לקטאז לייצר beta-D-גלקטוז, אורתופדיה-nitrophenol (שהוא בצבע צהוב), המאפשר להערכת הפעילות לקטאז על ידי מדידה של ספיגת-420 ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig4.jpg"> איור 4 : הידרוליזה ONPG. התוצאות נציג של הידרוליזה ONPG, מציג צינורות שליטה ותגובה (A), נציג נתונים בסעיף 4 של הפרוטוקול שנרשם בגליונות ב- class, מציג raw ספיגת ביחידות שרירותי-420 nm, מתוקנות על רקע ו בטמפרטורות שלוש שונות (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>תנאי ניסיוני</td>
			<td>משתני הניסוי</td>
		</tr>
<tr>
<td>טמפרטורה</td>
			<td>0 ° צלזיוס, 10 ° C, 20 ° C, 30 מעלות צלזיוס, 50 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריכוז המצע</td>
			<td>מ מ 0, 1 מ"מ, 5 מ"מ, 10 מ מ ONPG</td>
		</tr>
<tr>
<td>עיכוב תחרותי</td>
			<td>לקטוז ONPG פלוס מ מ 0, 1 מ"מ, 5 מ"מ או 10 מ מ 5 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>התלות בזמן</td>
			<td>0 s, 15 s, 30 s, 1 דקות, 5 דקות, 10 דקות, 20 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>דנטורציה בחום</td>
			<td>תמצית לקטאז מחומם ל 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות לפני כדי assay</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: פוטנציאל מורחב התנאי ניסיוני. הציע ניסויים מורחבת, יבוצע שהפקידים, חוקרת היבטים ספציפיים של לקטאז הביולוגיה.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab at JoVE.com

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

הפעילות האנזימטית מתרחשת של לקטאז חיוני קטבולי עיבוד דו-סוכר חלב (לקטוז). כאן, הפעילות של לקטאז נמצאו ב תוספי מזון הוא לבדיקה באמצעות וזמינותו של ערכי צבע מוחלטים. הדבר מספק לתלמידים פלטפורמה ניסיוני להבנת הפעילות של קינטיקה לקטאז, אנזים.

מדידת פעילות אנזימטי לקטאז במעבדת ההוראה

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

measuring-lactase-enzymatic-activity-in-the-teaching-lab

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Biology

Analytical Chemistry

Anatomy and Physiology

Unit 1

Biochemistry of the Cell

Fundamentals of Chemistry

Energy and Catalysis

Chemical Applications of Statistical Analyses

SCIENTISTS IN ACTION

113.3K Views.  University of Reading. הפעילות האנזימטית מתרחשת של לקטאז חיוני קטבולי עיבוד דו-סוכר חלב (לקטוז). כאן, הפעילות של לקטאז נמצאו ב תוספי מזון הוא לבדיקה באמצעות וזמינותו של ערכי צבע מוחלטים. הדבר מספק לתלמידים פלטפורמה ניסיוני להבנת הפעילות של קינטיקה לקטאז, אנזים.

Video: Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ metabolic activity assays can provide information about the spatial distribution of metabolic activity within a tissue. We provide here a detailed protocol for monitoring the activity of the enzyme lactate dehydrogenase directly in tissue samples. Lactate dehydrogenase is an important determinant of whether consumed glucose will be converted to energy via aerobic or anaerobic glycolysis. A solution containing lactate and NAD is provided to a frozen tissue section. Cells with high lactate dehydrogenase activity will convert the provided lactate to pyruvate, while simultaneously converting provided nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH and a proton, which can be detected based on the reduction of nitrotetrazolium blue to formazan, which is visualized as a blue precipitate. We describe a detailed protocol for monitoring lactate dehydrogenase activity in mouse skin. Applying this protocol, we found that lactate dehydrogenase activity is high in the quiescent hair follicle stem cells within the skin. Applying the protocol to cultured mouse embryonic stem cells revealed higher staining in cultured embryonic stem cells than mouse embryonic fibroblasts. Analysis of freshly isolated mouse aorta revealed staining in smooth muscle cells perpendicular to the aorta. The methodology provided can be used to spatially map the activity of enzymes that generate a proton in frozen or fresh tissue.

We describe a protocol for mapping the spatial distribution of enzymatic activity for enzymes that generate nicotinatmide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) + H+ directly in tissue samples.

מיפוי החומרים: פיקוח על פעילות לקטט דהידרוגנאז ישירות בתוך הרקמה

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Biochemistry

Measuring Enzymatic Stability by Isothermal Titration Calorimetry

This work demonstrates a new method for measuring the stability of enzyme activity by isothermal titration calorimetry (ITC). The peak heat rate observed after a single injection of the substrate solution into an enzyme solution is correlated with enzyme activity. Multiple injections of the substrate into the same enzyme solution over time show the loss of enzyme activity. The assay is autonomous, requiring very little personnel time, and is applicable to most media and enzymes.&#160; &#160;

The thermal stability of enzyme activity is readily measured by isothermal titration calorimetry (ITC). Most protein stability assays currently used measure protein unfolding, but do not provide information about enzymatic activity. ITC enables direct determination of the effect of enzyme modifications on the stability of enzyme activity.

מדידת אנזימטי יציבות על ידי טיטור איזותרמי Calorimetry

This work demonstrates a new method for measuring the stability of enzyme activity by isothermal titration calorimetry (ITC). The peak heat rate observed ...

Environment

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Assay למדידת פעילות Escherichia coli ועין מתנהלת ליזין Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Bioengineering

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

הכנת תאי לבלב acinar לצורך סידן ההדמיה, פגיעה בתא המדידות, וזיהום adenoviral

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

לקטט דהידרוגנאז פחמיות וזמינותו — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת נפח פעילות פחמיות Autophagic בתאים בתרבית

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Enzyme Activity

<h4>Biological Catalysts</h4>

All living organisms continuously perform numerous biochemical reactions to sustain their presence. Most of these reactions require an input of energy to start, which is called the activation energy. Catalysts are chemicals that lower the activation energy. Even though catalysts facilitate a chemical reaction, they are not consumed by it. This means a catalyst can facilitate a specific chemical reaction over and over in succession, increasing the rate of that reaction.

Enzymes are biological catalysts that increase the speed and efficiency of biochemical reactions. Most enzymes are proteins but certain ribonucleic acid molecules also have catalytic properties. Each type of enzyme can only bind to one or a few specific substrates, therefore, there is a vast diversity of enzymes, all with distinct functions. The specific reaction of an enzyme depends on its active sites, which has shapes that closely matches the shape of its substrates. Upon substrate binding, the enzyme changes shape slightly in a way that allows the chemical reaction to happen more readily, thus reducing the activation energy of the reaction. Once the reaction takes place, the enzyme releases the products and returns to its original shape, which allows it to repeat the process again.

<h4>Catabolytic versus Anabolic Enzymes</h4>

Most enzymatic reactions can be categorized as either catabolic and anabolic, which have opposite functions. Enzymes that mediate catabolic reactions break down larger substances into multiple products. A well-known catabolic enzyme is lactase, which splits the disaccharide lactose in dairy products into monosaccharides galactose and glucose. Humans have large amounts of lactase in their small intestine after birth, however many individuals lose more than 90% of their lactase by early childhood1. This reduction diminishes the ability to digest lactose in an age-dependent manner, which is known as lactose intolerance2.

Anabolic enzymes combine multiple substances into a single product. For example, the enzyme DNA polymerase synthesizes DNA molecules by joining nucleotides together. Similarly, the enzyme glycogen synthase connects glucose molecules to generate glycogen. Insulin regulates the activity of glycogen synthase, therefore diabetic patients with low to no insulin levels cannot synthesize glycogen without insulin treatment3.

<h4>Environmental Factors</h4>

The shape and charge of the active site of an enzyme is tailored to the specific chemical reaction it catalyzes, therefore the enzyme activity is influenced by factors that affect its active site. Hence, enzymes require specific conditions to work at optimal levels and depending on their function and location, these conditions can vary greatly. These factors include pH and temperature. For example, active sites of enzymes often contain acidic or basic amino acids. Deviations from the optimum pH alter the charges in the active site, making it difficult for the substrates to interact with the enzyme. This property has been used for centuries to preserve food by pickling, which reduces the pH of the pickled food item to a level that effectively inhibits microbial enzymatic activity. Similarly, each enzyme works at an optimal temperature range. If the temperature shifts below or above this range, it alters the shape of the active site, preventing it from effectively interacting with its substrates. In most cases, returning to the optimal temperature restores the enzyme&#8217;s original shape and function, however, temperatures that are too high can denature or irreversibly damage the enzyme structure. Again, these properties are useful for food safety; we cook meat thoroughly to kill harmful bacteria by denaturing their enzymes and refrigerate most food items to slow down enzymatic activity of microorganisms.

Extremophiles, or organisms found in extreme conditions that are lethal to most forms of life, have enzymes capable of functioning at those extremes. For instance, Thermus aquaticus is a bacterium found in hot springs and hydrothermal vents reaching temperatures at which most proteins would denature. Taq polymerase is a thermostable DNA polymerase found in T. aquaticus, which has allowed the development of polymerase chain reaction (PCR), a widely-used laboratory method for rapid DNA replication. PCR requires high temperatures to separate the strands of the DNA double helix to be replicated. Taq polymerase remains stable at these high temperatures while most enzymes would be degraded. PCR cycles between high temperatures that break the DNA into single strands and lower temperatures that allow the polymerase to build new double stranded DNA.

<h4>Molecular Factors that Influence Enzyme Activity</h4>

In addition to specific pH and temperature ranges, some enzymes function better in the presence of other molecules or ions. Coenzymes are biomolecules that bind to the active site of the enzyme and participate in catalysis without getting consumed by the reaction. Coenzymes often transport electrons, specific atoms and functional groups, and thus act as intermediary carriers. B vitamins act as coenzymes for numerous biochemical reactions. For instance, coenzyme A (coA), which is the active form of pantothenic acid, is required by 4% of all mammalian enzymes4. Cofactors are often classified as inorganic substances, such as ions, that are required for the enzymatic function. For example, all DNA polymerase enzymes require Mg2+ or Mn2+ for DNA replication as well as excision of incorrectly incorporated nucleotides5.

There are also other molecules that are not necessary for an enzyme to function but are capable of altering the enzymatic activity. Substances that increase the enzyme activity are called activators, whereas others that decrease the enzyme activity are called inhibitors. These molecules bind to enzymes either at the active site or other locations on the enzyme known as allosteric sites. Sometimes these molecules can bind to the exact location in the active site as the substrate, and thus compete with the substrate for the enzyme binding. Others, especially the substances that bind to allosteric sites, can alter enzyme function without blocking the substrate binding to the active site, and are thus non-competitive. Moreover, binding of inhibitors can be reversible or irreversible. When the interaction is reversable, the enzyme can resume its function once the inhibitor detaches. However, when the binding is irreversible, the inhibitor never detaches from the enzyme and the enzyme becomes irreparably damaged and needs to be replaced. Nevertheless, enzyme inhibitors are useful as well. For instance, inhibitors have been utilized as antibiotics to inhibit bacterial growth, and as chemotherapeutics to inhibit the uncontrolled division of cancer cells6.

<h4>Measuring Enzyme Function</h4>

One method used by scientists to study the effects of different conditions on enzyme function is to quantify the reaction rate, which is how fast the enzyme is catalyzing the reaction. Therefore, a higher reaction rate indicates that the enzyme is catalyzing reactions more efficiently, whereas a lower rate means that it is working less efficiently. To determine the reaction rate, the reaction velocity is calculated by measuring the amount of product made per unit time. This is done by measuring the product concentration starting right at the beginning of the reaction when the product concentration is increasing linearly, until the enzyme is completely saturated with the substrate and the catalysis reaches a steady level. Once the baseline reaction rate is determined, it can be used as a reference point, or control, when comparing between a variety of treatments. We can assess reaction rates as relative or absolute measures. A relative reaction rate is a comparative measure that shows differences between two or more conditions, such as treatments in a single experiment, but does not give a value for what is being measured. An absolute reaction rate relies on a quantitative measure of the progress of the reaction. An easy way to understand the difference between relative and absolute reaction rates is to consider measuring the speed of a car in a race. A relative method would compare by assessing the ranking of cars at the finish line, whereas the absolute rate would assess and compare the speed of individual cars in miles per hour.

Since enzymes are so widely used, researchers have begun looking for ways to create and modify enzymes to suit specific needs, known as protein engineering. Recombinant DNA technology allows amino acid sequences to be changed in order to alter an enzyme&#8217;s shape or active site affinity. This has been used to create highly sensitive diagnostic tests for various conditions, as well as for bioremediation efforts and waste management tools7.

<h4>References</h4>

<ol class="references">
	<li>Swagerty DL Jr, Walling AD, Klein RM. Lactose intolerance. Am Fam Physician. 2002, Vol. 65, 9: 1845-50.</li>
	<li>Lomer MC, Parkes GC, Sanderson JD. Review article: lactose intolerance in clinical practice--myths and realities. Aliment Pharmacol Ther. 2008, Vol. 27, 2: 93-103.</li>
	<li>AR, Saltiel. New perspectives into the molecular pathogenesis and treatment of type 2 diabetes. Cell. 2001, Vol. 104, 4: 517-29.</li>
	<li>DO, Kennedy. B Vitamins and the Brain: Mechanisms, Dose and Efficacy--A Review. Nutrients. 2016, Vol. 8, 2: 68 doi:10.3390/nu8020068.</li>
	<li>Vashishtha AK, Wang J, Konigsberg WH. Different Divalent Cations Alter the Kinetics and Fidelity of DNA Polymerases. J Biol Chem. 2016, Vol. 291, 40: 20869-20875.</li>
	<li>Watson ID, Stewart MJ, Platt DJ. Clinical pharmacokinetics of enzyme inhibitors in antimicrobial chemotherapy. Clin Pharmacokinet. 1988, Vol. 15, 3: 133-64.</li>
	<li>Ahuja SK, Ferreira, GM, Moreira AR. Utilization of Enzymes for Environmental Applications. Crit Rev Biotech. 2004, Vols. 2-3, 125-54.</li>
</ol>

Enzyme Activity: Effect of pH and Temperature on Peroxidase Activity - Concept

פעילות אנזימים

Biological Catalysts

All living organisms continuously perform numerous biochemical reactions to sustain their presence. Most of these reactions require ...

JoVE Lab Manual

Cellular Processes

Evaluating Cytotoxicity and Membrane Integrity in Lung Slices via Lactate Dehydrogenase Assay

Source: Neuhaus, V., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57042">Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the lactate dehydrogenase, LDH assay to measure the cytotoxic effect of a test substance and its effect on the membrane integrity in human precision-cut lung slices. The assay provides a quantitative measure of cell death or damage in the sample.

הערכת ציטוטוקסיות ותקינות הממברנה בפרוסות ריאה באמצעות בדיקת לקטט דהידרוגנאז

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines
1. General Preparation of Human PCLS ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

Quantifying Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Source: Luhr, M. et al., <a href="https://app.jove.com/v/57971">The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The video demonstrates an assay for assessing bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells. It utilizes electroporation to release cytosolic proteins, including lactate dehydrogenase (LDH). The sequestered LDH and total cellular LDH fractions are determined to assess LDH sequestration, providing insights into the overall bulk sequestration activity.

כימות פעילות קיבוע אוטופגית בתפזורת בתאי יונקים

1. Cell Seeding and Treatment

	Culture adherent cells in 75 cm2&#160;tissue culture flasks in a humidified incubator with 5% CO2&#160;at 37 &#176;C, ...

Cellular Immunodiagnostics

Colorimetric Assay for Quantification of Lactate in Test Samples

To measure the concentration of lactate, use a colorimetric assay kit to carry out duplicate analysis for the test samples. Add 10 microliters of the test samples to each well of a 96-well plate, and then add lactate assay buffer to each sample to adjust the volume to 50 microliters.
Dilute 100 millimolar L(+)-Lactate standard with lactate assay buffer to 1 millimolar. Then, into a series of wells, add 0, 2, 4, 6, 8, and 10 microliters of diluted L(+)-Lactate standard. Add 50 microliters of reaction mix into each well, and incubate at room temperature protected from light for at least 30 minutes for the color to develop.
Finally, use a microplate reader to measure the absorbance of each well at 570 nanometers. Subtract the absorbance of the background control mix from the absorbance of the reaction mix. Then, plot the lactate standard curve, and calculate the lactate concentrations from the curve by multiplying each concentration by 2.25.