The authors would like to acknowledge Marcos Di Falco for his expertise and advice with the preparation of the samples for nano-LC MS/MS as well as Dr. Zoran Minic from the University of Regina for the LC MS/MS analysis. This work was supported by NSERC (DG402214-2011) and CRC (950-221184) funding. D.C. was supported by Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems and FQRNT.

1. הכן ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון SDS-חילוץ: 0.1 M טריס- HCl pH 7.5, גליצרול 5%, 10 mM EDTA ו -1% SDS. מסנן לעקר באמצעות מסנן וחנות 0.22 מיקרומטר על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ריאגנטים מניות דרושים לג&#39;ל polyacrylamide. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1.5 M טריס-HCl pH 8.8. מסנן לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 M טריס-HCl pH 6.8. מסנן לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10% SDS. סנן לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורת חדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות דרושים בג&#39;ל טריפסין לעכל ומיצוי פפטיד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100 אמוניום ביקרבונט מ&quot;מ. מסנן לעקר באמצעות מסנן וחנות 0.22 מיקרומטר על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מניות M DTT. מושעה באמוניום ביקרבונט 100 מ&quot;מ ולאחסן ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 550 מ&quot;מ מניות iodoacetamide. מושעה ב100 מ&quot;מ אמוניום ביקרבונט ולאחסן ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100 ng / μl מניות טריפסין. Aliquot 60 μl לתוך צינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge וחנות ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון חילוץ: 1% חומצה פורמית, אצטוניטריל 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון resuspension: אצטוניטריל 5% ושל 0.1% חומצה פורמית. </li></ol></li></ol> .2 בצע תא תמוגה ביחידת מסנן מחסנית עם תאים משומרים בRNA ייצוב הפתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרש את פתרון ייצוב RNA מיחידת מסנן מחסנית (1.5 מיליליטר) ולתוך צינור microcentrifuge 2 מיליליטר באמצעות מזרק 60 מיליליטר המצורף בסוף luer נעילה של המסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור microcentrifuge 2 מיליליטר במשך 10 דקות ב 17,000 XG כדי גלולה כל פסולת סלולרית. זה נעשה כך שהמסנן בשלב 2.3 לא לסתום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant ליחידת 10 K מסנן ultracentrifugal כדי ללכוד כל חלבונים שמקורם מהתאים שlysed מההקפאה / thaw של המדגם. לא זורק את הכדור. זה ישמש בשלב 2.5. בצע צנטריפוגה של יחידת מסנן ultracentrifugal ב3,270 XG למשך 30 דקות או עד שהנפח מופחת לכ -600 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממסים את קצה קצה P10 ולחסום את צד luer הנעילה שאינה של יחידת מסנן מחסנית עם הסוף הפתוח של הקצה. הפעולה זו תבטיח כי אין חיץ חילוץ וביומסה נמלט במהלך שלבים 2.5-2.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את גלולה ב 1 מיליליטר פתרון SDS-חילוץ ופיפטה אותו ליחידת מסנן מחסנית המקורית. הדרך הקלה ביותר פיפטה ליחידת מסנן המחסנית היא מחסנית קצה p200 על קצה P1000 ולהשתמש הקצה הכפול הזה לpipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של תמיסת מיצוי SDS ליחידת מסנן מחסנית כך הנפח הכולל הוא כ 2 מיליליטר ודגירה של 10 דקות בטמפרטורת חדר תוך סיבוב בתנור הכלאה. מניחים 3 מעבדה מקומטת מגבונים בחלק התחתון של צינור חרוטי 50 מיליליטר. Parafilm שני הקצוות של יחידת מסנן מחסנית הסגורולשים את יחידת מסנן מחסנית לתוך שפופרת 50 מיליליטר. סגור את המכסה ולשים את הצינור לתנור ההכלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות מקום Sterivex לסנן על מצוף קצף ולאבטח אותו במקום עם מזרק 5 מיליליטר בסוף luer נעילה. לצוף ודגירה במי אמבטיה 95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו יחידת מסנן מחסנית מגניב ולסובב בטמפרטורת חדר במשך שעה 1 (כמו בשלב 2.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרש את lysate פתרון חילוץ / תא SDS מתוך המסנן עם מזרק 60 מ&quot;ל לאותה יחידת מסנן ultracentrifugal כמו קודם (שלב 2.3). הוסף 1 מיליליטר של תמיסת מיצוי הטרי SDS ליחידת מסנן מחסנית ולערבב למשך 30 שניות ביד, אז לגרש לתוך יחידת מסנן ultracentrifugal באמצעות מזרק 60 מיליליטר. זה לשטוף את יחידת מסנן מחסנית כדי להבטיח את כל החלבונים הוסרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע צנטריפוגה על יחידת מסנן ultracentrifugal במשך 45 דקות ב 3,270 XG או עד הנפח ביחידת המסנן הוא פחות מ -600 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימה דרך מחק ועליון את יחידת מסנן ultracentrifugal עם פתרון SDS-מיצוי טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה יחידת המסנן לעוד 45 דקות ב3,270 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.11 2.12 ועוד פעמיים. להבטיח את הנפח הסופי ביחידת מסנן ultracentrifugal הוא לכל היותר 600 μl בסוף הסיבוב האחרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, לפצל את התרכיז בשני. חלק אחד ישמש למשקעי DNA ואחר למשקעי חלבון. הערה: סכום חלוקה תלוי בכמות של ביומסה שהיה מסוננת והשימושים המיועדים של המוצרים. במקרה שלנו, אנו לפצל את התרכיז עם 10% כלפי המשקעים DNA ו- 90% למשקעי חלבון. </li></ol> רטיבות 3. חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מתנול 4 כרכים: אצטון (50:50) לכרך אחד של תרכיז ומערבולת למשך 10 שניות. דגירה הלילה ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה ב17,000 XG למשך 30 דקות. למזוג supernatantולתת גלולה (עשויה להיות בלתי נראה) יבשה בspeedvac עבור שעה 1 (או עד יבש). הערה: אל מעל לייבש את גלולה כמו זה עלול להקשות על resuspend. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את גלולה ב 25 μl של פתרון SDS-חילוץ. בואו לשבת במשך שעה אחת לאחר מכן resuspend ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת חלבון באמצעות ערכת assay חלבון והוראות יצרנים. </li></ol> 4. DNA רטיבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף פתרון SDS-חילוץ לשבריר להתרכז לשמש למשקעי DNA עד סימן 500 μl. צעד זה הוא פשוט להגביר את עוצמת הקול של הפתרון, מה שהופך את זה יותר קל לעבוד עם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף .583 כרכים של מגיב משקעים חלבון (כגון מגיב MPC חלבון המשקעים) ומערבולת למשך 10 שניות. אתה צריך לראות את צורת משקע לבנה. הערה: יש לנו גם משמשים פנול: שיטות מיצוי DNA כלורופורם, אבל זה קשה יותר בשל ההיקפים הנמוכים. השגנו תשואות טובות יותר באמצעות DNAחלבון MPC רטיבות מגיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 17,000 XG ו4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לעוד צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ולהוסיף 0.95 כרכים של isopropanol. היפוך 30-40 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס במהירות המרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג בזהירות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף פעמיים עם 750 μl של 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר כמה שיותר אתנול ככל האפשר על ידי pipetting, אז תן אוויר יבש. הערה: אל מעל לייבש את ה- DNA שכן דבר עלול להקשות על resuspend. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב 25 μl של חיץ נמוך TE, pH 8 (10 מ&quot;מ טריס-HCl, 0.1 מ&quot;מ EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את ה- DNA באמצעות ערכת assay dsDNA והוראות יצרנים. בצע agarose ג&#39;ל (1%) אלקטרופורזה על 3 μl של ה- DNA כדי לבדוק את האיכות שלה. </li></ol> 5. SDS-PAGE ג&#39;ל של חלבונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ מדגם (חיץ מדגם Laemmli 950 μl ו -50 β-mercaptoethanol μl). &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף הנפח המתאים במשך 15 מיקרוגרם של חלבון, או מקסימום של 20 μl לנפח שווה של חיץ מדגם ולהרתיח במשך 4 דק &#39;. כעת ניתן לאחסן דגימות ב -80 ° C עד יכול להתבצע SDS-PAGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;ל פתרון 10% acrylamide עם 5% ג&#39;ל לערום acrylamide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הג&#39;ל עם דגימות ו -4 μl של סולם חלבון. הפעל את הג&#39;ל על 120 קבועים V עד סמן סולם kDa 250 יש רק הגעתי לג&#39;ל הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם ג&#39;ל באמצעות Coomassie כתם על פי הוראות יצרנים מבוססים. </li></ol> 6. בג&#39;ל טריפסין לעכל ופפטיד הפקה הערה: כל צעדים מכאן עד 6.10 מבוצעים בארון בטיחות ביולוגי כדי למזער זיהום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הג&#39;ל עודף תחת סימן סולם kDa 10 לכל מסלול. כל מסלול ינותח על MS / MS בנפרד. חותך כל נתיב למ&quot;מ x ריבועי 1 מ&quot;מ 1 להגדיל שטח פנים ולמקם את כל squaמיל מהנתיב לתוך צינור מיקרו צנטריפוגות מחייב נמוך. חזור על פעולה זו עבור כל הנתיבים. (1% חומצה אצטית יכולה לשמש כדי למנוע את הג&#39;ל מהתייבשות והופך קשה לחתוך). הערה: מזעור זיהום הוא קריטי בשלב זה, כך חיתוך ג&#39;ל מתבצע בארון בטיחות ביולוגי בתבנית ג&#39;ל זכוכית SDS-PAGE משמש כדי להפוך את הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דה-כתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 50 μl של 100 אמוניום ביקרבונט מ&quot;מ לתוך צינור אחד מחייב נמוך, כובע קרוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 50 μl של אצטוניטריל, כובע קרוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק 150 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 6.2.1 ו6.2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק 95 μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייבשות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 50 אצטוניטריל μl, קרוב כובע ולחכות 5 דקות. לשאוב ולזרוק 45 μl ולחכות 10 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחתה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 50 μl DTT (10 מ&quot;מ, בדילול מלא 100 מ&quot;מ AMMביקרבונט onium), קרוב כובע ולחכות 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקילציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר iodoacetamide 50 μl (55 מ&quot;מ, בדילול מלא 100 אמוניום ביקרבונט מ&quot;מ), קרוב כובע ולחכות 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר של אצטוניטריל, כובע קרוב 100 μl ודגירה של 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. לשאוב ולזרוק 195 μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר אמוניום ביקרבונט 50 μl, קרוב כובע ודגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 50 μl של אצטוניטריל, כובע קרוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לשאוב ולזרוק 120 μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייבשות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 50 אצטוניטריל μl, קרוב כובע ולחכות 5 דקות. לשאוב ולזרוק 45 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 50 μl של אצטוניטריל, לחכות 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק 75 μl ולחכות 5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 25-30 μl של 6 ng / μl טריפסין (until כל שברי ג&#39;ל מכוסים). כובע ולסגור לחכות 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הלילה (מינימום 4.5 שעות) על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו לשבת בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חילוץ והעברת פפטיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 30 μl של פתרון חילוץ ולכסות עם מכסה למשך 30 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב 30 μl ולוותר נפח aspirated בצינור מחייב נמוך שכותרתו חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 12 μl של פתרון חילוץ ו -12 μl של אצטוניטריל לתוך הצינור המקורי (עם ג&#39;ל). כובע ולסגור דגירה במשך 30 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> μl לשאוב 15 והפקדה לתוך הצינור החדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרו על שלבים (6.9.3 ו6.9.4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צינורות חדשים בSpeedVac עד יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב 50 μl של פתרון resuspension. מערבולת במדיום במשך 10 דקות כדי resuspend. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון פפטיד פיפטה לאו ננו בקבוקונים / LC או 96-גם צלחות מתאימים לננו / LCעבודת MS / MS. </li></ol>

<ol>
	<li>Madsen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microorganisms+and+their+roles+in+fundamental+biogeochemical+cycles.">Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles.</a> Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).</li><li>El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+assemblages+and+short-lived+blooms+in+coastal+northwest+Atlantic+Ocean+bacterioplankton.">Seasonal assemblages and short-lived blooms in coastal northwest Atlantic Ocean bacterioplankton.</a> Environmental microbiology. , (2014).</li><li>Galand, P. E., Potvin, M., Casamayor, E. O., Lovejoy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrography+shapes+bacterial+biogeography+of+the+deep+Arctic+Ocean.">Hydrography shapes bacterial biogeography of the deep Arctic Ocean.</a> The ISME journal. 4 (4), 564-576 (2010).</li><li>Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahlt, D. A., Sogint, M. L., Pace, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+16S+ribosomal+RNA+sequences+for+phylogenetic+analyses.">Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4972 (1986).</li><li>Williams, T. J., Long, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metaproteomic+assessment+of+winter+and+summer+bacterioplankton+from+Antarctic+Peninsula+coastal+surface+waters.">A metaproteomic assessment of winter and summer bacterioplankton from Antarctic Peninsula coastal surface waters.</a> The ISME journal. 6 (10), (2012).</li><li>Sheik, C. S., Jain, S., Dick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+flexibility+of+enigmatic+SAR324+revealed+through+metagenomics+and+metatranscriptomics.">Metabolic flexibility of enigmatic SAR324 revealed through metagenomics and metatranscriptomics.</a> Environmental microbiology. 16 (1), 304-317 (2014).</li><li>Venter, J. C., Remington, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+genome+shotgun+sequencing+of+the+Sargasso+Sea.">Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea.</a> Science (New York, N.Y.). 304, 66-74 (2004).</li><li>Tyson, G. W., Chapman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+structure+and+metabolism+through+reconstruction+of+microbial+genomes+from+the+environment.">Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment.</a> Nature. 428, 37-43 (2004).</li><li>Schneider, T., Riedel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+proteomics:+analysis+of+structure+and+function+of+microbial+communities.">Environmental proteomics: analysis of structure and function of microbial communities.</a> Proteomics. 10 (4), 785-798 (2010).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nature reviews. Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).</li><li>Hettich, R. L., Pan, C., Chourey, K., Giannone, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaproteomics:+harnessing+the+power+of+high+performance+mass+spectrometry+to+identify+the+suite+of+proteins+that+control+metabolic+activities+in+microbial+communities.">Metaproteomics: harnessing the power of high performance mass spectrometry to identify the suite of proteins that control metabolic activities in microbial communities.</a> Analytical chemistry. 85 (9), 4203-4214 (2013).</li><li>Von Bergen, M., Jehmlich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+quantitative+metaproteomics+and+protein-stable+isotope+probing+into+microbial+ecology.">Insights from quantitative metaproteomics and protein-stable isotope probing into microbial ecology.</a> The ISME journal. 7 (10), 1877-1885 (2013).</li><li>Giovannoni, S. J., Bibbs, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteorhodopsin+in+the+ubiquitous+marine+bacterium+SAR11.">Proteorhodopsin in the ubiquitous marine bacterium SAR11.</a> Nature. 438 (7064), 82-85 (2005).</li><li>Georges, A. A., El-Swais, H., Craig, S. E., Li, W. K., Walsh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaproteomic+analysis+of+a+winter+to+spring+succession+in+coastal+northwest+Atlantic+Ocean+microbial+plankton.">Metaproteomic analysis of a winter to spring succession in coastal northwest Atlantic Ocean microbial plankton.</a> The ISME journal. , 1-13 (2014).</li><li>Morris, R. M., Nunn, B. L., Frazar, C., Goodlett, D. R., Ting, Y. S., Rocap, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+metaproteomics+reveals+ocean-scale+shifts+in+microbial+nutrient+utilization+and+energy+transduction.">Comparative metaproteomics reveals ocean-scale shifts in microbial nutrient utilization and energy transduction.</a> The ISME journal. 4 (5), 673-685 (2010).</li><li>Williams, T. J., Cavicchioli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+metaproteomics:+deciphering+the+microbial+metabolic+food+web.">Marine metaproteomics: deciphering the microbial metabolic food web.</a> Trends in microbiology. 22 (5), 248-260 (2014).</li><li>Saito, M. a., McIlvin, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+nutrient+stresses+at+intersecting+Pacific+Ocean+biomes+detected+by+protein+biomarkers.">Multiple nutrient stresses at intersecting Pacific Ocean biomes detected by protein biomarkers.</a> Science. 345 (6201), 1173-1177 (2014).</li><li>Bertrand, E., Moran, D., McIlvin, M., Hoffman, J., Allen, A., Saito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methionine+synthase+interreplacement+in+diatom+cultures+and+communities:+Implications+for+the+persistence+of+B12+use+by+eukaryotic+phytoplankton.">Methionine synthase interreplacement in diatom cultures and communities: Implications for the persistence of B12 use by eukaryotic phytoplankton.</a> Limnology and Oceanography. 58 (4), 1431-1450 (2013).</li><li>Hawley, A. K., Kheirandish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+investigating+microbial+community+structure+and+function+in+oxygen-deficient+marine+waters.">Molecular tools for investigating microbial community structure and function in oxygen-deficient marine waters.</a> Methods in enzymology. 531, 305-329 (2013).</li><li>Da Walsh, ., Zaikova, E., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+volume+(1-3L)+filtration+of+coastal+seawater+samples.">Small volume (1-3L) filtration of coastal seawater samples.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (28), 1-2 (2009).</li><li>Thompson, M., Chourey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+approach+for+deep+proteome+measurements+from+small-scale+microbial+biomass+samples.">Experimental approach for deep proteome measurements from small-scale microbial biomass samples.</a> Analytical. 80 (24), 9517-9525 (2008).</li><li>Lu, X., Digestion Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tube-Gel. , 1948-1958 (2005).</li><li>Sharma, R., Dill, B. D., Chourey, K., Shah, M., VerBerkmoes, N. C., Hettich, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+a+detergent+lysis/cleanup+methodology+with+intact+protein+fractionation+for+enhanced+proteome+characterization.">Coupling a detergent lysis/cleanup methodology with intact protein fractionation for enhanced proteome characterization.</a> Journal of proteome research. 11 (12), 6008-6018 (2012).</li><li>Santoro, A. E., Dupont, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+proteomic+characterization+of+"Candidatus+Nitrosopelagicus+brevis":+An+ammonia-oxidizing+archaeon+from+the+open+ocean.">Genomic and proteomic characterization of "Candidatus Nitrosopelagicus brevis": An ammonia-oxidizing archaeon from the open ocean.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (4), 1173-1178 (2015).</li><li>Rusch, D. B., Halpern, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+expedition:+northwest+Atlantic+through+eastern+tropical+Pacific.">The Sorcerer II Global Ocean Sampling expedition: northwest Atlantic through eastern tropical Pacific.</a> PLoS biology. 5 (3), e77 (2007).</li><li>Swan, B. K., Martinez-Garcia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+chemolithoautotrophy+among+ubiquitous+bacteria+lineages+in+the+dark+ocean.">Potential for chemolithoautotrophy among ubiquitous bacteria lineages in the dark ocean.</a> Science (New York, N.Y.). 333 (6047), 1296-1300 (2011).</li><li>Rinke, C., Schwientek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter.">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li><li>Saito, M. A., Bulygin, V. V., Moran, D. M., Taylor, C., Scholin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+microbial+proteome+preservation+techniques+applicable+to+autonomous+environmental+sample+collection.">Examination of microbial proteome preservation techniques applicable to autonomous environmental sample collection.</a> Frontiers in microbiology. 2, 215 (2011).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, J. H., Olsen, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2007).</li><li>Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomics+-+a+guide+from+sampling+to+data+analysis.">Metagenomics - a guide from sampling to data analysis.</a> Microbial Informatics and Experimentation. 2 (1), 3 (2012).</li><li>Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEGAN+analysis+of+metagenomic+data.">MEGAN analysis of metagenomic data.</a> Genome research. 17 (3), 377-3786 (2007).</li><li>Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -. J., Weber, N., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+environmental+sequences+using+MEGAN4.">Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4.</a> Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).</li><li>Ea Ottesen, ., Marin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metatranscriptomic+analysis+of+autonomously+collected+and+preserved+marine+bacterioplankton.">Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton.</a> The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).</li><li>Feike, J., J&#252;rgens, K., Hollibaugh, J. T., Kr&#252;ger, S., Jost, G., Labrenz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+unbiased+metatranscriptomics+in+suboxic+waters+of+the+central+Baltic+Sea+using+a+new+in+situ+fixation+system.">Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system.</a> The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

שימור דגימה הוא מפתח ללימודי metaproteomic והעבודה קודמת הוכיחה כי פתרון ייצוב RNA הוא חיץ אחסון שימושי לאחסון תאים לפני מיצוי חלבון 28. באופן אידיאלי, דגימות תישמרנה באתר לשלול משמרות בביטוי חלבון במהלך טיפול 33,34. למעשה, באתר טכנולוגיות דגימה וקיבעון פו...

מיקרואורגניזמים נמצאים בכל מקום ולשחק תפקידים חיוניים במחזורי biogeochemical של כדור הארץ 1. נכון לעכשיו, יש גישות מולקולריות רבות זמינות לאפיון מבנה קהילת חיידקים ותפקוד. הנפוץ ביותר הוא הניתוח של גן 16S rRNA רצפי PCR-מוגבר מ- DNA הסביבתי 2 - 4. חסרון של ניתוח גנטי 16S rRNA הוא שזה רק מספק מידע על זהות פילוגנטי ומבנה קהילה, עם מעט מידע על תפקוד מטבולים. לעומת זאת, גישות כגון metagenomics, metatranscriptomics וmetaproteomics לספק מידע על מבנה קהילה וחילוף חומרים. Metagenomics, או הניתוח של תוכן הגן של מכלול של אורגניזמים, מספק מידע על המבנה ואת הפוטנציאל התפקודי של הקהילה 5 - 8. למרות עוצמה, פוטנציאל פונקציונלי זה לא מתאים מטבוליםפעילות של אורגניזמים. גנוטיפ של האורגניזם מיוצג על ידי הגנים שלו, כל אחד מהם יכול להיות עיבד ותרגמו לרנ&quot;א לחלבון נוסף, וכתוצאה מכך פנוטיפ. לכן, כדי לסייע בהבנה של פעילות פונקציונלית של חיידקים בסביבה, ניתוח שלאחר הגנומי צריך להתבצע 9. Metatranscriptomics, או הניתוח של תעתיקי רנ&quot;א הוא שימושי משום שהוא חושף שגנים מתועתקים בכל סביבת נתונה. עם זאת, רמות ה- mRNA לא תמיד תואמות את רמות החלבון המתאימים בשל רגולציה translational, RNA מחצית חיים, והעובדה שעותקים חלבון מרובים יכולים להיות שנוצרו עבור כל mRNA 10. לmetaproteomics מסיבות אלה מוכר כיום ככלי חשוב למיקרוביולוגיה הסביבתית. הנפוץ metaproteomic מנתח להשתמש בגישת proteomic רובה שבו ההשלמה מלאה ליד של חלבונים במדגם מורכב הם מטוהרים ונותחה בו-זמנית, בדרך כלל באמצעות enעיכול zymatic לפפטידים וניתוח על ספקטרומטר מסה. ספקטרומטר מסת טנדם לאחר (MS / MS) &quot;טביעת אצבע פפטיד&quot; משמשת כדי לקבוע את רצף הפפטיד וחלבון פוטנציאלי ממוצא ידי מסד נתוני חלבון חיפוש (לסקירה ראה 11). עבודת proteomic יש כברת דרך ארוכה ב -25 השנים האחרונות הודות לעלייה בזמינויות הנתונים הגנומי והעלייה ברגישות והדיוק של ספקטרומטרים המוניים המאפשרים זיהוי חלבון תפוקה גבוהה וכימות 11,12. מאז חלבונים הם המוצר הסופי של ביטוי גנים, נתונים metaproteomic יכולים לעזור לקבוע אילו אורגניזמים פעילים בכל סביבה ומה חלבונים הם מביעים נתון. זהו יתרון כאשר מנסים לקבוע איך קבוצה מסוימת של משתנים סביבתיים תשפיע על הפנוטיפ של האורגניזם או קהילה. בשלב מוקדם, מחקרי metaproteomic מבוססי MS MS / בים היו משמשים לזיהוי חלבונים ספציפיים בממוקדשושלות חיידקים, עם המחקר הראשון מתמקד בproteorhodopsin משאבת פרוטון האור מונע בחיידקים הימיים SAR11 13. לאחרונה, ניתוחי metaproteomic השוואתיים שהובהרו דפוסי ביטוי חלבון ההפרש בין קהילות מורכבות. דוגמאות כוללות זיהוי של משמרות זמניות בחילוף חומרים בצפון-מערב האוקיינוס ​​האטלנטי חוף 14 או חצי האי האנטארקטי 5. מחקרים אחרים תיארו שינויים בדפוסי ביטוי חלבון על פני קשקשים מרחבית, למשל, לרוחב, גיאוגרפי מסיבובי אוקיינוס ​​נמוך תזונתיים למערכת upwelling חוף פרודוקטיבי 15. לביקורות נוספות של metaproteomics אנו ממליצים שניידר et al. (2010) 9 ווויליאמס et al. (2014) 16. פרוטאומיקה ממוקדת גם הועסקה בשנים האחרונות לכמת ביטוי של מסלולי מטבוליים מסוימים בסביבה 17,18. Therדואר שלושה שלבים עיקריים בניתוח metaproteomic. השלב הראשון הוא הכנת מדגם, הכוללת איסוף דגימה, תמוגה תא וריכוז של חלבון. אוסף מדגם במיקרוביולוגיה הימית לעתים קרובות כרוך בסינון של מי ים דרך מראש מסנן כדי להסיר תאים גדולים יותר אוקריוטים, חלקיקים וחיידקים הקשורים חלקיקים, ואחרי סינון ללכידתו של תאי חיידקי חיים חופשיים, בדרך כלל עם השימוש במחסנית 0.22 מיקרומטר יחידת מסנן 19,20. מסננים אלה עטויות כפפה בגליל פלסטיק ותמוגה תא ופרוטוקול מיצוי חלבון שניתן לבצע בתוך יחידת המסנן יהיה כלי רב ערך. ברגע שמתקבלת ביומסה, התאים חייבים להיות lysed כדי לאפשר מיצוי חלבון. יכולים להיות מועסקים במספר שיטות, כולל סולפט guanidine-HCl dodecyl תמוגה 21 ונתרן (SDS) שיטות תמוגה מבוססות. למרות שחומרי ניקוי כמו SDS הם מאוד יעילים בשיבוש קרומים וsolubilizing סוגים רבים חלבון, concentratiONS נמוך כמו 0.1% יכולים להפריע לעיכול חלבון במורד הזרם וניתוח MS 22. דאגה עיקרית הוא ההשפעות השליליות של SDS על יעילות עיכול טריפסין, פתרון כוח של כרומטוגרפיה נוזלית הפוכה שלב ודיכוי יון או הצטברות בתוך יון המקור 23. השלב השני הוא חלוקה וניתוח, שבו חלבוני נתונים לעיכול אנזימטי ואחרי ניתוח LC MS / MS, וכתוצאה מכך דפוס פיצול בבוקר / z שניתן להשתמש בי לברר את רצף חומצות אמינו העיקרי של הפפטיד tryptic הראשוני. ניתן לבצע שיטות עיכול שונות בהתאם לסוגים של חומרי ניקוי המשמשים, כמו גם את העבודה ספקטרומטר מסה במורד הזרם. בפרוטוקול שלנו, אלקטרופורזה עמוד 1-D ואחריו ההסרה של SDS מג&#39;ל מנוצלת כדי להסיר כל זיהום חומר ניקוי. הניתוח של חלבונים שקשה solubilize, כגון חלבוני קרום, מחייב השימוש גבוה concentrations של SDS או חומרי ניקוי אחרים. זה מוביל לבעיות תאימות עם אלקטרופורזה SDS-ג&#39;ל. אם מטרתו של מחקר דורשת solubilization קשה אלה לsolubilize חלבונים, מערכת הצינור-ג&#39;ל ניתן להשתמש 22,24. שיטת הצינור-ג&#39;ל משלבת חלבונים בתוך מטריצת ג&#39;ל ללא השימוש באלקטרופורזה. בהמשך לכך כל חומרי ניקוי המשמש לsolubilization יוסרו לפני עיכול חלבון. השלב השלישי הוא ניתוח bioinformatic. בשלב זה נתונים פפטיד MS / MS הם חיפשו מול מסד נתונים של רצפי נוקליאוטידים תרגמו כדי לקבוע אילו פפטידים וחלבונים נמצאים במדגם. זיהוי של פפטידים תלוי בבסיס הנתונים שהוא חיפש נגד. נתונים metaproteomic ימיים חיפשו נפוצים מול מסדי נתונים מורכבים מהגנום התייחסות, נתונים metagenomic כגון בסיס הנתונים הגלובלי אוקיינוס ​​דגימת 25, כמו גם הגנום תא מוגבר אחד מli הבורneages 26,27. זיהוי חלבון גם יכול להיות מוגבר על ידי ההכללה של רצפי metagenomic מאותו המדגם נתונים metaproteomic נגזר 5. כאן אנו מספקים פרוטוקול עבור הדור של פפטידים מתאימים לניתוח מבוסס MS MS / ביומסה חיידקים שנאספו על ידי סינון ומאוחסנים בפתרון ייצוב RNA. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לדנ&quot;א וחלבון להיות מבודדים מאותו המדגם, כך שכל הצעדים שהובילו לחלבון ומשקעי DNA זהים. מנקודת מבט מעשית, נדרש פחות סינון שכן רק אחד מסנן נדרש לחלבון וגם מיצוי DNA. אנחנו רוצים גם להודות שפרוטוקול זה נוצר באמצעות שילוב, עיבוד והשינוי של שני פרוטוקולים שפורסמו בעבר. צעדי תמוגה התא מותאמים מאל סאיטו et. (2011) 28 וטריפסין ב- ג&#39;ל לעכל רכיב מותאם ShevcheNKO et al. (2007) 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterivex -GP 0.22 &#956;m filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Stabilization Solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>77-86-1 or TB0196-500G</td>
			<td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>15-21-3</td>
			<td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10K Amicon Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337-4L</td>
			<td>Protein Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td>Protein Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPC Protein Precipitation reagent</td>
			<td>Epicenter</td>
			<td>mmP03750</td>
			<td>DNA Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td>DNA Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Protein Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0375EDU</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CABDH6044-4</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4HCO3</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>1066-33-7</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500ML</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-4L</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tube 1.5ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL ROBO vial 9mm</td>
			<td>Candian Life Science</td>
			<td>VT009/C395SB</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP BM insert, No spring</td>
			<td>Candian Life Science</td>
			<td>4025P-631</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an aquatic microbial metaproteomics workflow: from cells to tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based analysis

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

כהפגנה, שבצענו את הפרוטוקול בשתי דגימות מי ים שנאספו מפני השטח ומקסימום כלורופיל של אוקיינוס ​​החוף בצפון קנדה. בעוד בים, 6-7 ליטר של מי ים עבר דרך prefilter / GF D 3 מיקרומטר, אז תאי חיידקים נאספו על יחידת מסנן מחסנית 0.22 מיקרומטר הבא הפרוטוקול של et al וולש. 20. תאים או?...

Watch this Scientific Journal Video about An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis at JoVE.com

An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Metaproteomics זרימת עבודה Aquatic מיקרוביאלית: מתאים לtryptic פפטידים מתאימים לניתוח מבוסס ספקטרומטריית מסת טנדם

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

an-aquatic-microbial-metaproteomics-workflow-from-cells-to-tryptic

Research

JoVE Journal

Environment

8.7K Views.  Concordia University. This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Video: An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study provides a protocol for the passive sampler preparation, calibration, extraction method and instrumental analysis. Sampling rates (RS) and passive sampler-water partition coefficients (KPW) were calculated for silicone rubber, polar organic chemical integrative sampler POCIS-A, POCIS-B, SDB-RPS and C18 disk. The uptake of the selected compounds depended on their physicochemical properties, i.e., silicone rubber showed a better uptake for more hydrophobic compounds (log octanol-water partition coefficient (KOW) &#62; 5.3), whereas POCIS-A, POCIS-B and SDB-RPS disk were more suitable for hydrophilic compounds (log KOW &#60; 0.70).

A protocol about the characterization and application of five different passive sampling devices is presented.

אפיון ויישום של דוגמים פסיביים עבור ניטור של דברה במים

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Alternative Method of Removing Otoliths from Sturgeon

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a transverse vertical incision on the top of the skull with a hand or electrical saw may damage the otolith if not performed correctly. Sturgeons (Acipenseridae) are one family in particular that have a very large and thick skull. A new laboratory method entering the brain cavity from the ventral side of the fish to expose the otoliths was easier than other otolith extraction methods found in the literature. Methods reviewed in the literature are designed for the field and are more efficient at processing large quantities of fish quickly. However, this new technique was designed to be more suited for a laboratory setting when time is not pressing and successful extraction from each specimen is critical. The success of finding and removing otoliths using this technique is very high and does not compromise the structure in any manner. This alternative technique is applicable to other similar fish species for extracting the otoliths.

The goal of the protocol is to show an effective method to extract the otoliths from sturgeon carcasses.

שיטה חלופית של הסרת Otoliths מ חדקן

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

הפקה וניתוח של פוספוליפידים מיקרוביאלית חומצות שומן בקרקעות

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells

In plasma medicine, ionized gases with temperatures close to that of vertebrate systems are applied to cells and tissues. Cold plasmas generate reactive species known to redox regulate biological processes in health and disease. Pre-clinical and clinical evidence points to beneficial effects of plasma treatment in the healing of chronic ulcer of the skin. Other emerging topics, such as plasma cancer treatment, are receiving increasing attention. Plasma medical research requires interdisciplinary expertise in physics, chemistry, and biomedicine. One goal of plasma research is to characterize plasma-treated cells in a variety of specific applications. This includes, for example, cell count and viability, cellular oxidation, mitochondrial activity, cytotoxicity and mode of cell death, cell cycle analysis, cell surface marker expression, and cytokine release. This study describes the essential equipment and workflows required for such research in plasma biomedicine. It describes the proper operation of an atmospheric pressure argon plasma jet, specifically monitoring its basic emission spectra and feed gas settings to modulate reactive species output. Using a high-precision xyz-table and computer software, the jet is hovered in millisecond-precision over the cavities of 96-well plates in micrometer-precision for maximal reproducibility. Downstream assays for liquid analysis of redox-active molecules are shown, and target cells are plasma-treated. Specifically, melanoma cells are analyzed in an efficient sequence of different consecutive assays but using the same cells: measurement of metabolic activity, total cell area, and surface marker expression of calreticulin, a molecule important for the immunogenic cell death of cancer cells. These assays retrieve content-rich biological information about plasma effects from a single plate. Altogether, this study describes the essential steps and protocols for plasma medical research.

A high-throughput cold physical plasma treatment protocol of liquids and cells is shown. It involves setting up different feed gas compositions for plasma ignition, measuring the plasma&#39;s emission spectra, and the subsequent analysis of liquids and cellular activity after plasma treatment.

מחקר בסיסי ברפואה פלזמה - הגישה של תפוקה של נוזלים תאים

In plasma medicine, ionized gases with temperatures close to that of vertebrate systems are applied to cells and tissues. Cold plasmas generate reactive ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

אפיון Biofilms ימיים עם Cytometry זרימה

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

בידוד וניתוח של הקהילות מיקרוביאלית בקרקע, Rhizosphere ושורשים בניסויים עשב רב שנתי

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and toxicological studies. Using automated digital tracking platforms, recent efforts in neuropharmacology are leveraging larval fish locomotor behaviors to identify potential therapeutic targets for novel small molecules. Similar to these efforts, research in the environmental sciences and comparative pharmacology and toxicology is examining various behaviors of fish models as diagnostic tools in tiered evaluation of contaminants and real-time monitoring of surface waters for contaminant threats. Whereas the zebrafish is a popular larval fish model in the biomedical sciences, the fathead minnow is a common larval fish model in ecotoxicology. Unfortunately, fathead minnow larvae have received considerably less attention in behavioral studies. Here, we develop and demonstrate a behavioral profile protocol using caffeine as a model neurostimulant. Though photomotor responses of fathead minnows were occasionally affected by caffeine, zebrafish&#160;were markedly more sensitive for photomotor and locomotor endpoints, which responded at environmentally relevant levels. Future studies are needed to understand comparative behavioral sensitivity differences among fish with age and time of day, and to determine whether similar behavioral effects would occur in nature and be indicative of adverse outcomes at the individual or population levels of biological organization.

Here, we present a protocol to examine larval zebrafish and fathead minnow locomotor activities and photomotor responses (PMR) using an automated tracking software. When incorporated in common toxicology bioassays, analyses of these behaviors provide a diagnostic tool to examine chemical bioactivity. This protocol is described using caffeine, a model neurostimulant.

נסיוני לבחינת תגובה התנהגותית פרופילים בדגים זחל: ליישום הקפאין נוירו-ממריץ

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the local to federal levels. The continuing evolution of PFAS chemistries presents a challenge to the environmental monitoring, where ongoing development of targeted methods necessarily lags the discovery of new chemical compounds. There is a need, therefore, to have forward-looking methodologies that can detect emerging and unexpected compounds, monitor these species over time, and resolve details of their chemical structure to enable future work in human health. To this end, non-targeted analysis by high-resolution mass spectrometry offers a broad base detection approach that can be combined with almost any sample preparation scheme and provides significant capabilities for compound identification after detection. Herein, we describe a solid-phase extraction (SPE) based sample concentration method tuned for shorter chain and more hydrophilic PFAS chemistries, such as per fluorinated ether acids and sulfonates, and describe analysis of samples prepared in this fashion in both targeted and non-targeted modes. Targeted methods provide superior quantification when reference standards are available but are intrinsically limited to expected compounds when performing analysis. In contrast, a non-targeted approach can identify the presence of unexpected compounds and provide some information about their chemical structure. Information about chemical features can be used to correlate compounds across sample locations and track abundance and occurrence over time.

Here, we present a protocol for the sequential targeted quantification and non-targeted analysis of fluorinated compounds in water by mass spectrometry. This methodology provides quantitative levels of known fluorochemical compounds and identifies unknown chemicals in related samples with semi-quantitative estimates of their abundance.

זיהוי לכל-כימית Polyfluorinated מינים בזרימת עבודה משולבת יישוב, שאינו ממוקד-סינון ברזולוציה גבוהה ספקטרומטר מסה

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial communities has many limitations, and determining a predator, prey, and predatory rates is often difficult. Presented here is an optimized method based on the addition of fluorescently labelled prey as a tracer, which allows for reliable quantitation of the grazing rates in aquatic predatory eukaryotes and estimation of nutrient transfer to higher trophic levels.

Presented here is a protocol for a single-cell, epifluorescence microscopy-based technique to quantify grazing rates in aquatic predatory eukaryotes with high precision and taxonomic resolution.

בקטריה מתויג חיידקים כנותב כדי לחשוף מסלולים הרומן של זרימת פחמן אורגנית במסגרת אקולוגית מימיים

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

A Guide to Concentration Alternating Frequency Response Analysis of Fuel Cells

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency response analysis (cFRA) on proton-exchange membrane (PEM) fuel cells. During cFRA experiments, the modulated concentration feed was sent to the cathode of the cell at different frequencies. The electric response, which can be cell potential or current depending on the control applied on the cell, was registered in order to formulate a frequency response transfer function. Unlike traditional electrochemical impedance spectroscopy (EIS), the novel cFRA methodology makes it possible to separate the contribution of different mass transport phenomena from the kinetic charge transfer processes in the frequency response spectra of the cell. Moreover, cFRA is able to differentiate between varying humidification states of the cathode. In this protocol, the focus is on the detailed description of the procedure to perform cFRA experiments. The most critical steps of the measurements and future improvements to the technique are discussed.

We present a protocol for concentration alternating frequency response analysis of fuel cells, a promising new method of studying fuel cell dynamics.

מדריך לריכוז התגובה בתדר מתחלפים של תאים דלק

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency ...