אנו מודים למיכאל Feiss וז&#39;אן עם הקש להדרכה על יצירת phage וטיהור. אנו מודים למיכאל Elowitz לאספקת תוכנה לזיהוי התא, Schnitzcell. עבודה במעבדת גולדינג נתמכת על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות (R01GM082837), הקרן הלאומי למדע (082265, PFC: מרכז לפיסיקה של תאי חיים), קרן וולש (גרנט Q-1759) ומדע Frontier אנוש התכנית (RGY 70/2008).

<ol>
	<li>Oppenheim, A. B., Kobiler, O., Stavans, J., Court, D. L., Adhya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switches+in+bacteriophage+lambda+development.">Switches in bacteriophage lambda development.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 409-429 (2005).</li><li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A genetic switch : phage lambda revisited. , (2004).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lambda II. , (1983).</li><li>Hershey, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Bacteriophage lambda. , (1971).</li><li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decision+making+at+a+subcellular+level+determines+the+outcome+of+bacteriophage+infection.">Decision making at a subcellular level determines the outcome of bacteriophage infection.</a> Cell. 141, 682-691 (2010).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+infection+is+targeted+to+cellular+poles.">Bacteriophage infection is targeted to cellular poles.</a> Mol. Microbiol. , (2008).</li><li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current protocols in molecular biology. , (1994).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Fasman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical handbook of biochemistry and molecular biology. , (1989).</li><li>Kaiser, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+internal+structure+of+bacteriophage+lambda.">On the internal structure of bacteriophage lambda.</a> J. Gen. Physiol. 49, 171-178 (1966).</li><li>Kobiler, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinetic+analysis+of+the+bacteriophage+lambda+genetic+network.">Quantitative kinetic analysis of the bacteriophage lambda genetic network.</a> Proc Natl Acad Sci. 102, 4470-4475 (2005).</li><li>Shaner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Personal communication with M. Feiss. , .</li><li>Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adsorption+of+coliphage+lambda+to+its+host:+effect+of+variations+in+the+surface+density+of+receptor+and+in+phage-receptor+affinity.">The adsorption of coliphage lambda to its host: effect of variations in the surface density of receptor and in phage-receptor affinity.</a> J. Mol. Biol. 103, 521-536 (1976).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

זני חיידקים, וphage פלסמידים: מתח LE392 הוא supF. הוא נבחר כדי לדכא Sam7 המוטציה בגנום phage (ראה טבלת מס &#39;1 לפרטים נוספים). לפיכך, lysogens המושרה סופו של דבר lyse ושחרור חלקיקי phage, כפי שיהיה גם תאים נגועים שבחרו מסלול מוסס. התאים גדלים Lysogenic של 30 ° C בשל הנוכחות של הטמפרטורה הרגישה CI 857 אלל בגנום פאג. לאחר אינדוקצית חום, GPD-EYFP והפראי הסוג GPD הם שיתוף המתבטאים מהגנום של λ LZ1 וpPlate פלסמיד * D בהתאמה. כתוצאה מכך, של capsid החדש שנוצר phage λ LZ2 מכיל תערובת של חלבוני GPD GPD-EYFP ו. phage פסיפס זה הוא יציב מבחינה מבנית ומספיק ניאון כדי לאפשר זיהוי של פאגים בודדים 5. PP רי - mCherry הוא כתב פלסמיד המשמש לאיתור בחירת lysogenic pathway. RE P האמרגן מופעל על ידי כת&quot;ש בהקמת lysogeny 1,11. PP רי - mCherry 5 נגזר מPE-GFP 11 על ידי החלפת GFP עם 12 mCherry. לפרטים נוספים ראה את העבודה שלנו לפני 5. פרמטרי מצב צמיחה: במהלך אינדוקצית lysogen (סעיף 1), רעידות קלות ב 180 סל&quot;ד נותנות תשואת וירוס טובה 13. השימוש בגלוקוז במדיום הגידול יש להימנע ככל שחילוף חומרים של הגלוקוז מייצר מוצרים מטבוליות חומציים, וחלקיקי מבדה בוגרים אינם יציבים ב pH חומצי 13. התוספת של 4 MgSO נועדה לייצב phage 3 capsid. לפאגים נושאים סוג CI הפרוע (במקום CI 857), lysogen יכול להיגרם באמצעות mitomycin הסוכן ה-DNA ניזק 3 ג&#39;. בשלב 1.3, הדגירה על 37 המעלות צלזיוס צריכה בדרך כלל לא תעלה על 90 דקות. זה usef<html> אול כדי לבדוק את צפיפות התא על ידי OD 600 בכל 30 דקות. לlysate טוב, OD 600 יורד לכ 0.2 או פחות, ונותר 600 OD הוא תוצאה של פסולת תא. דגירה ארוכה מדי עלולה לגרום לתשואה נמוכה מאז phage phage החדש שנוצר יכול להתחיל להזריק DNA שלהם לתוך תא פסולת. כדי להשיג להקת phage גלויה (לפחות 1 10 11 חלקיקי phage x) בשלבים ו2.11 2.13, לגדול תרבות מ&quot;ל לפחות 500 בשלב 1.2. התוספת של 0.2% למלטוז מדיום גידול בצעדי 5.1 ו 5.2 מיועדת לזירוז ביטוי של כבש, הקולטן לפאג מבדה ספיחת 3,14. דילול 1000-לקפל במקום 100-לקפל בשלב 5.2 נועד להקטין את רמת רקע mCherry מRE הכתב פלסמיד PP - mCherry. בשלב 5.5 להזרקת דנ&quot;א phage מפעיל, 35 ° C נבחר כדי להימנע מגיוס של אלל cI857 הרגיש לטמפרטורה. טיהור phage: jove_content &quot;&gt; שלבי טיהור phage (שלבים 2.1 עד 2.11) יכולים להיות מוחלפים עם פרוטוקולי טיהור אחרות 5, אבל ultracentrifugation הסופי דרך שיפוע שיווי המשקל CsCl (צעדים ו2.12 2.13) הוא בלתי נמנע. הרוטורים דלי Swinging יש צורך בצעדי 2.10 2.12 ועד להבטיח להקות phage גלויות חדות. קבלת מניות phage טהורות יכולה בקלות לקחת עד שבוע, ולכן יש צורך לבדוק את כייל phage לאורך הדרך כדי לוודא ששום דבר משתבש במהלך שלבי ביניים. טיפול phage: במהלך כל הליכי הטיהור בסעיף 2, זה קריטי לטפל phage lysate עדינות, כדי למנוע הטית זנבות phage מראשי phage. במהלך הדבקת תא בסעיף 5 (למשל, צעדי 5.5 דרך 5.7), הוא גם קריטי כדי למנוע ההטיה של חלקיקי phage מהתא הנגוע. שים לב שאם phage הוא טעון מהתא הנגוע לאחר הזרקת ה-DNA שלו, התוצאה היא זיהום &quot;אפל&quot;, כלומר בתוצאת fection תהיה נצפתה בניסוי, אבל phage מדביק לא. כדי למזער את בעיות כאלה, אנו משתמשים קצה פיפטה רחבה בכל פעם שטיפול פאגים או תערובת phage / תא. DAPI בדיקה: מכתים את מניות phage עם DAPI (סעיף 4) היא שיטה מהירה ויעילה כדי לבדוק את הטוהר של מניית פאג. זה גם יכול לשמש כדי לבדוק לפירוק אפשרי של מניות phage קיימות לאורך זמן. למניות טהורות, שיתוף הלוקליזציה של אותות YFP וDAPI תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי צריכה להיות קרוב ל 100%. אנחנו בדרך כלל לצפות כי פחות מ 1% מנקודתי YFP אינם מכילים DAPI (המייצג capsids ללא הגנום הנגיפי), המצביע על כך שהחלקיקים אלה לא לארוז את ה-DNA הנגיפית בהצלחה או כבר הזריק DNA שלהם במקום אחר. פחות מ 1% מנקודתי DAPI אינם מכילים YFP (מתאים לפאגים שאינם ניאון). אם זה לא המקרה, צעדי 2.12 דרך 2.14 צורך לחזור בorder לטהר שוב. בכל קשורים לפרמטרי הדמיה, התקנת מיקרוסקופ בשלב 4.3 היא לא קריטית כמו בסעיף 5, כי אין הדמיה ארוכת טווח חי תאים נדרשת כאן. עם זאת, שמירה על הגדרות מיקרוסקופיה כמו בסעיף 5 היא שימושית אם רוצה לכייל את עוצמת הקרינה של חלקיק phage אחת. אם לוח PBS-agarose הוא לא מאוד נקי, או יותר מדי DAPI צבע משמש, כמה נקודות מתאימות ל-DNA phage DAPI עשויות להיות מוקפות ב&quot; הילה &quot;. אם צבע DAPI מעט מדי נעשה שימוש, את האות מערוץ DAPI עשויה להיות חלשה מאוד. מערכת מיקרוסקופ: להדמיה בסעיף 6, נסתכל במיקרוסקופ epifluorescence הפוך מסחרי (Eclipse TE2000-E, ניקון) עם מטרת 100x (התכנית Fluo, צמצם מספרי 1.40, טבילת שמן) וקובע מסנן רגיל (ניקון). מקור האור פלואורסצנטי הוא מנורת קשת עם שליטה בעוצמת אור. התכונות הבאות הן מבוקר מחשב: X, Y ו Z position; שדה בהיר ותריסי קרינה; ובחירת מסנן קרינה. תכונת פוקוס אוטומטי נדרשה. אחרת, ייתכן שההתמקדות בקלות להיסחף במהלך סרט זמן לשגות (בדרך כלל 4 שעות ארוכות). היכולת לרכוש מרובות (x, y) עמדות בכל נקודת זמן היא שימושית, שכן היא מאפשרת לעקוב אחר אירועי זיהום מרובים במקביל. אנחנו בדרך כלל לרכוש 8 עמדות במה בכל סרט, בעקבות אירועים עד 100 זיהום. המצלמה אנו משתמשים היא מקורר 512x512 CCD עם פיקסל מצלמת מיקרומטר 16x16 עם טווח דינמי של 16 סיביים (Cascade512, Photometrics). רכישה מתבצעת באמצעות MetaMorph תוכנה (התקנים מולקולריים). מיקרוסקופ צריך להיות ממוקם בחדר עם הטמפרטורה מבוקרת, או לחלופין, את שלב המיקרוסקופ צריך להיות מוקף בחדר עם בקרת הטמפרטורה. יבוא תמונות: עבור הדמית חית תאים, זה הוא קריטי כדי למנוע חשיפה מיותרת של המדגם, אשר עלול להוביל להלבנה ופtotoxicity. לכן, הדרך טובה ביותר לאפיין את המערכת שלך כדי למצוא את חשיפת אור אופטימלית המאפשרת זיהוי פלואורסצנטי ואילו לא מוביל לצמיחת תאי הלבנה מוגזמת או עיכוב. כדי לקבל תמונה טובה פלואורסצנטי, לשחק עם עוצמת האור המרגש, זמן חשיפה ורווח מצלמה. בצעדים 6.2-6.3, מרווח המסגרת 10 דקות נבחר למטרה למזער חשיפה לאור. בכל מסגרת, רק תמונה אחת בפוקוס יש צורך בשלב ניגוד (להכרת תא) וערוצי ניאון (לקביעת גורל תא). בנקודת הזמן הראשונה, לעומת זאת, תמונות מרובות Z-עמדה דרך ערוץ YFP נדרשות כדי ללכוד את כל פאגים מדביקים על פני התא. זמן חשיפת YFP במסגרת הראשונית עלול גם צריך להיות גבוה יותר מזו המשמשת לסרט זמן לשגות במסגרות הזמן מאוחר יותר. ניתוח תמונה: ספירת חלקיקי phage בזהירות רבה מסביב לתא השטח בשלב 7.1. כמואמור לעיל, לנקוט בשורה של Z-ערימות דרך ערוץ YFP בשלב 6.2. עם זאת, זה עדיין עשוי להשאיר כמה חלקיקי ניאון phage מחוץ למיקוד, המאתגר את הספירה. אורך התא במסגרת הזמן הראשונית נמדד באמצעות תוכנת Metamorph. אורך התא גם יכול להימדד ImageJ או כלי תוכנה אחרות. בנוסף, תכנית נבנתה Matlab אוטומטית בית יכולה להיות מאוד שימושית בקבלת מידע כגון שינוי פלואורסצנטי לאורך הזמן לאורך שושלות תאים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> כלורופורם </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> C298-500 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> S271-3 </td></tr><tr><td> אני DNase </td><td> סיגמא </td><td> D4527-10KU </td></tr><tr><td> RNase </td><td> סיגמא </td><td> R4642-10 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP233-1 </td></tr><tr><td> SM חיץ </td><td> Teknova </td><td> S0249 </td></tr><tr><td> NZYM </td><td> Teknova </td><td> N2062 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> סיגמא </td><td> C3011-250 </td></tr><tr><td> מזרק </td><td> הקיטון דיקינסון </td><td> 309585 </td></tr><tr><td> מחט </td><td> הקיטון דיקינסון </td><td> 305176 </td></tr><tr><td> קלטת דיאליזה </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66333 </td></tr><tr><td> שקופית מיקרוסקופ </td><td> קורנינג </td><td> 2947-75x50 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP160-100 </td></tr><tr><td> צינור SW40Ti אולטרה ברור </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344060 </td></tr><tr><td> צינור SW60Ti אולטרה ברור </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344062 </td></tr><tr><td> SW40Ti הרוטור </td><td> Beckman Coulter </td><td> 331302 </td></tr><tr><td> SW60Ti הרוטור </td><td> Beckman Coulter </td><td> 335649 </td></tr><tr><td> Refractometer </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 13-947 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ Epifluorescence </td><td> ניקון </td><td> ליקוי TE2000-E </td></tr></tbody></table> טבלת 2. ריאגנטים וציוד.

following cell-fate in e. coli after infection by phage lambda

המערכה המהווה bacteriophage (פאג) למבדה וחיידק E. coli שמש זמן רב כדוגמה לנחישות 1,2 תא גורל. בעקבות הזיהום בו הזמני של התא על ידי מספר פאגים, אחד משני מסלולים נבחר: 3,4 מוסס (ארסי) או lysogenic (רדום). לאחרונה פתחנו שיטה לתיוג פאגים בודדים fluorescently, והצליחו לבחון את ההחלטה לאחר פגיעה בזמן אמת מתחת למיקרוסקופ, ברמה של 5 פאגים ותאים בודדים. כאן, אנו מתארים את ההליך המלא לביצוע ניסויי הזיהום המתוארים בעבודתנו הקודמת 5. זה כולל יצירה של פאגים ניאון, זיהום של התאים, הדמיה מתחת למיקרוסקופ וניתוח נתונים. Phage הניאון הוא שיתוף מבטא-גרסות &quot;היברידיות&quot;, סוג פרוע וYFP היתוך של חלבון GPD capsid. Lysate phage גולמי הושג לראשונה על ידי גרימת lysogen של GPD-EYFP (Enhanced חלבון) phage פלורסנט הצהוב, חסת סוג הבעת GPD פראי פלסמיד. סדרה של שלבים לטיהור הם בצעו אז, אחרי DAPI תיוג והדמיה מתחת למיקרוסקופ. הדבר נעשה במטרה לאמת את האחידות, יעילות אריזת ה-DNA, אות פלואורסצנטי ויציבות מבנית של מניית פאג. הספיחה הראשונית של פאגים לחיידקים מתבצעת על קרח, ואז אחרי דגירה קצרה ב 35 ° C כדי לעורר הזרקת DNA נגיפית 6. Phage / תערובת חיידקים ואז עבר למשטח של גוש דק תזונתי אגר, מכוסה coverslip וצלם תחת מיקרוסקופ epifluorescence. התהליך שלאחר הזיהום במעקב במשך 4 שעות, במרווח דקות 10. עמדות שלבים מרובות מעקב כזה ש~ 100 זיהומים סלולריים יכולים להיות נעוצים בניסוי אחד. בכל נקודת זמן ומקום, תמונות שנרכשו בשלב הניגוד והערוצים אדומים וירוקים זרחניים. תמונת שלב הניגוד משמשת מאוחר יותר לאוטומטי celהכרת l בעוד ערוצי הניאון משמשים לאפיין את תוצאת הזיהום: ייצור של פאגים ניאון חדשים (ירוק) ואחרי תמוגה תא, או ביטוי של גורמי lysogeny (אדום) ואחריו צמיחה וחלוקת תאים התחדש. את הסרטים שנרכשו זמן לשגות מעובדים באמצעות שילוב של שיטות ידניות ואוטומטיות. תוצאות ניתוח נתונים בזיהוי פרמטרי זיהום לכל אירוע זיהום (מספר דוגמה ועמדות של הדבקת פאגים), כמו גם תוצאת זיהום (תמוגה / lysogeny). פרמטרים נוספים ניתן לחלץ במקרה צורך.

Watch this Scientific Journal Video about Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda at JoVE.com

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

מאמר זה מתאר את התהליך להכנת גרסה מתויגת-fluorescently של bacteriophage מבדה, זיהום של<em&gt; א coli</em&gt; חיידקים, בעקבות תוצאת הזיהום מתחת למיקרוסקופ, וניתוח של תוצאות זיהום.

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

following-cell-fate-in-e-coli-after-infection-by-phage-lambda

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

23.2K Views.  University of Illinois at Urbana-Champaign. מאמר זה מתאר את התהליך להכנת גרסה מתויגת-fluorescently של bacteriophage מבדה, זיהום של א coli חיידקים, בעקבות תוצאת הזיהום מתחת למיקרוסקופ, וניתוח של תוצאות זיהום.

Video: Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such as Chronic Wasting Disease (CWD) of cervids and scrapie in sheep. The Prion hypothesis asserts that this abnormal conformer constitutes most or all of the infectious prion. The role of the immune system in early events in peripheral prion pathogenesis has been convincingly demonstrated for CWD and scrapie 1-3. Transgenic and pharmacologic studies in mice revealed an important role of the Complement system in retaining and replicating prions early after infection 4-6. In vitro and in vivo studies have also observed prion retention by dendritic cells 7-10, although their role in trafficking remains unclear 11-16. Macrophages have similarly been implicated in early prion pathogenesis, but these studies have focused on events occurring weeks after infection 3,11,17. These prior studies also suffer from the problem of differentiating between endogenous PrPC and infectious prions. Here we describe a semiquantitative, unbiased approach for assessing prion uptake and trafficking from the inoculation site by immune cells recruited there. Aggregated prion rods were purified from infected brain homogenate by detergent solubilization of non-aggregated proteins and ultracentrifugation through a sucrose cushion. Polyacrylamide gel electrophoresis, coomassie blue staining and western blotting confirmed recovery of highly enriched prion rods in the pelleted fraction. Prion rods were fluorochrome-labeled then injected intraperitoneally into mice. Two hours later immune cells from peritoneal lavage fluid, spleen and mediastinal and mesenteric lymph nodes were assayed for prion rod retention and cell subsets identified by multicolor flow cytometry using markers for monocytes, neutrophils, dendritic cells, macrophages and B and T cells. This assay allows for the first time direct monitoring of immune cells acquiring and trafficking prions in vivo within hours after infection. This assay also clearly differentiates infectious, aggregated prions from PrPC normally expressed on host cells, which can be difficult and lead to data interpretation problems in other assay systems. This protocol can be adapted to other inoculation routes (oral, intravenous, intranervous and subcutaneous, e.g.) and antigens (conjugated beads, bacterial, viral and parasitic pathogens and proteins, egg) as well.

Here we describe a novel assay for monitoring prion uptake and trafficking by immune cells immediately following intraperitoneal inoculation by purifying and fluorescently labeling aggregated prion rods from infected brain material then monitoring their uptake and movement from the injection site and characterizing the cells mediating these events.

ניטור החיסונית תאים פלורסנט סחר Prion שעות לאחר ההדבקה מוטות intraperitoneal

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

הפקת חלבון סה&quot;כ ו2-D שיטות ג&#39;ל אלקטרופורזה עבור<em&gt; Burkholderia</em&gt; מינים

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

גבוהה Scalable תפוקה בחירה מספריות נוגדן סינטטיים-מוצג הפאג

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

דגם לא פולשנית של Neuropathogenic<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; זיהום בעכברוש הילודים

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phenomics הפאג: גישות פיזיולוגיות לאפיין חלבונים חדשים ויראלי

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

טרנספורמציה של שמרים פרוביוטיים ושחזור שלהם מרקמות העיכול החיסון בעקבות Gavage אוראלי עכברים

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and water-screening methods used currently. While conventional bacterial detection methods, such as polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can specifically detect pathogenic contaminants, they require extensive sample preparation and lengthy waiting periods. In addition, these practices demand sophisticated laboratory instruments and settings, and must be executed by trained professionals. Herein, a protocol is proposed for a simpler diagnostic technique that features the unique combination of magnetic and fluorescent parameters in a nanoparticle-based platform. The proposed multiparametric magneto-fluorescent nanosensors (MFnS) can detect E. coli O157:H7 contamination with as little as 1 colony-forming unit present in solution within less than 1 h. Furthermore, the ability of MFnS to remain highly functional in complex media such as milk and lake water has been verified. Additional specificity assays were also used to demonstrate the ability of MFnS to only detect the specific target bacteria, even in the presence of similar bacterial species. The pairing of magnetic and fluorescent modalities allows for the detection and quantification of pathogen contamination in a wide range of concentrations, exhibiting its high performance in both early- and late-stage contamination detection. The effectiveness, affordability, and portability of the MFnS make them an ideal candidate for point-of-care screening for bacterial contaminants in a wide range of settings, from aquatic reservoirs to commercially packaged foods.

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

The overall goal of this protocol is to synthesize functional nanosensors for the portable, cost-effective, and rapid detection of specifically targeted pathogenic bacteria through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.

והקאה הפתוגן הקרנה באמצעות מגנטו-פלורסנט ננו-חיישן: איתור מהיר של e. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

זיהוי של כיבוש Escherichia Coli Enterohemorrhagic מאתר מארח על-ידי המערכת לא פולשנית In Vivo ביולומינסנציה

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

יצירה של צפוף Transposon ההכנסה הספרייה באמצעות קוניוגציה Enterobacterial זנים כגון Escherichia Coli או שיגלה flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...