AF נתמכה על ידי מענק החל ממועצת המחקר האירופית תחת שביעי תכנית המסגרת של הקהילה האירופית (FP7 / 2007-2013) / הסכם ERC גרנט N ° 203,413 ועל ידי מרכז מינרבה לביו-היברידי systems.HA המורכב וAI נתמך על ידי דליה ודן מידן המלגה לסטודנטים לתואר מתקדם באוניברסיטת עברית בירושלים.

1. עיצוב מערך פפטיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את הרצף של חלבון המטרה לחופף חלקית 10-20 פפטידים שאריות. לשנות את כמות החפיפה בניסוי הספציפי והמשאבים של המעבדה ביצוע, אבל באופן עקרוני כבר החפיפה טובה יותר. בעת תכנון פפטידים לקחת באלמנטי מבנה המשני חשבון ידוע בחלבון שיכול להיות אחראי לאינטראקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזמן את מערך פפטיד המיועד דרך ספקים מסחריים. כאן, פפטידים שימוש קשורים קוולנטית למערך באמצעות C-הסופי. </li></ol> 2. חסימה הלא ספציפי מחייבת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון חיץ 50 מ&quot;מ טריס או פוספט המכיל 0.05% Tween 20 (TBST / PBST) ולהתאים את ה- pH הרצוי עם כמות מדודה של HCl או NaOH (כדי לדעת הכוח היוני המדויק) וכוח יוני הרצוי עם NaCl . כאן, להשתמש pH של 7.5 וחוזק יוני של 150 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון החסימה2.5% (w / v) ברפרוף אבקת חלב ב TBST / PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע הלא ספציפי מחייב, לטבול את המערך ב 5 מיליליטר של תמיסת חסימה. דגירה המערך ל2-4 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ºC על שייקר. </li></ol> 3. דוגרים עם החלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את המערך ראשון עם 5 מיליליטר של תמיסת חסימה למשך 30 שניות ולאחר מכן פעמיים עם 5 מיליליטר TBST / PBST במשך 5 דקות על שייקר בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המערך נשטף עם 5 מיליליטר של מתויג פתרון החלבון המכיל 2.5% (w / v) ברפרוף אבקת חלב כדי למנוע הלא ספציפי מחייב. כאן, להשתמש 4.5 מיקרומטר של פתרון חלבון (STIL 500-650) מומס בפתרון החסימה המתואר. הערה: בדרך כלל חלבון מיקרומטר 5-10 משמש להקרנה, אך ריכוז החלבון יכול להיות אפילו נמוך כמו 2-3 מיקרומטר, בהתאם לזיקה המחייבת והריכוזים המקומיים של פפטידים שקשרו במערך (יעילות של סינתזה). החיץ שבו החלבוןנמס יכול להשתנות, אך הוא נפוץ לדלל את החלבון באמצעות אותו פתרון החסימה שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את המערך בפתרון החלבון ל3-8 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ºC. </li></ol> 4. דוגרים עם הנוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את המערך שלוש פעמים עם 5 מיליליטר TBST / PBST. ההדחה הראשונה היא למשך 30 שניות ואחריו שני 5 שוטף דקות על שייקר בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המערך נשטף עם 5 מיליליטר של נוגדן HRP-מצומדות מדולל (1: 1,500) בחיץ דגירה המכיל את אותם מרכיבים באותו הריכוזים כפתרון חסימה, עבור שעה 1 על שייקר בטמפרטורת חדר. הנוגדן יכול להיקשר גם חלבון המטרה או התג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניסויי שליטה בודקת את האינטראקציה של הנוגדן עם פפטידים על המערך, במיוחד אם המערך מכיל פפטידים מחלבון המטרה (למשל, לoligomerization מחקרים) על ידי חזרה על אותו הפרוטוקול ללא STEעמ &#39;3, דוגרים עם החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את המערך שלוש פעמים עם 5 מיליליטר TBST / PBST. ההדחה הראשונה היא למשך 30 שניות ואחריו שני 5 שוטף דקות על שייקר בטמפרטורת חדר. </li></ol> 5. קריאת המערך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע פיתוח chemiluminescence עם ערכה מערבית סופג ECL מצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את זיהוי עם מנתח תמונה זורח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את התוצאות. ודא ששני הכפילויות במערך מראות את אותה אותות, ולכן התוצאות הן אמינות. אם המבנה של שותף החלבון ידוע, לחפש במבנה לפפטידים המחייבים ולחפש אתרי קישור. גם פפטידים שהם רחוקים ברצף יכולים להיות קרובים זה לזה במבנה שלישוני וליצור אתר קישור. </li></ol>

<ol>
	<li>Benyamini, H., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+peptides+to+study+protein&#8211;protein+interactions.">Using peptides to study protein&#8211;protein interactions.</a> Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).</li><li>Geysen, H. M., Wagner, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+or+mass+encoding+of+combinatorial+libraries.">Isotope or mass encoding of combinatorial libraries.</a> Chemistry &amp; Biology. 3 (8), 679-688 (1996).</li><li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spot-synthesis:+an+easy+technique+for+the+positionally+addressable,+parallel+chemical+synthesis+on+a+membrane+support.">Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support.</a> Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).</li><li>Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein-protein+interactions+using+peptide+arrays.">Studying protein-protein interactions using peptide arrays.</a> Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).</li><li>Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Mapping+of+Linear+Antibody+Epitopes+in+Human+Serum+Albumin+Using+High-Density+Peptide+Arrays.">Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays.</a> PLoS ONE. 8 (7), (2013).</li><li>Uecker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+substrate+peptide+for+the+FLT3+receptor+tyrosine+kinase.">A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase.</a> British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).</li><li>Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+relationship+studies+using+peptide+arrays:+the+example+of+HIV-1+Rev-integrase+interaction.">Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction.</a> Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).</li><li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SPOT-synthesis+technique:+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports&#8212;principles+and+applications.">The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports&#8212;principles and applications.</a> Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).</li><li>Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+Small+Molecule+Microarray+for+High+Throughput+Cell+Adhesion+and+Functional+Assays.">Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays.</a> Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).</li><li>Castiel, A., Danieli, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stil+protein+regulates+centrosome+integrity+and+mitosis+through+suppression+of+Chfr.">The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr.</a> Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).</li><li>Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STIL+protein+contains+intrinsically+disordered+regions+that+mediate+its+protein-protein+interactions.">The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions.</a> Chemical Communications. 50, 5245-5247 (2013).</li><li>Izraeli, S., Lowe, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SIL+gene+is+required+for+mouse+embryonic+axial+development+and+left-right+specification.">The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification.</a> Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).</li><li>Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+SIL+gene+is+correlated+with+growth+induction+and+cellular+proliferation.">Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation.</a> Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).</li><li>Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -. D., Nigg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Cell-cycle-regulated+expression+of+STIL+controls+centriole+number+in+human+cells.">a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells.</a> Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).</li><li>Tang, C. J., Lin, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+microcephaly+protein+STIL+interacts+with+CPAP+and+is+required+for+procentriole+formation.">The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation.</a> Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).</li><li>Vulprecht, J., David, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIL+is+required+for+centriole+duplication+in+human+cells.">STIL is required for centriole duplication in human cells.</a> Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).</li><li>Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sil+phosphorylation+in+a+Pin1+binding+domain+affects+the+duration+of+the+spindle+checkpoint.">Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint.</a> Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).</li><li>Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCL/TAL1+interrupting+locus+derepresses+GLI1+from+the+negative+control+of+suppressor-of-fused+in+pancreatic+cancer+cell.">SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell.</a> Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).</li><li>Chaturvedi, P., Sudakin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chfr+regulates+a+mitotic+stress+pathway+through+its+RING-finger+domain+with+ubiquitin+ligase+activity.">Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity.</a> Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).</li><li>Olaussen, K. a., Commo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+proapoptotic+effects+of+the+two+tyrosine+kinase+inhibitors+pazopanib+and+lapatinib+on+multiple+carcinoma+cell+lines.">Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines.</a> Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).</li><li>Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Vif&#8211;A3G+interaction+using+peptide+arrays:+A+basis+for+anti-HIV+lead+peptides.">Mapping the Vif&#8211;A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).</li><li>Katz, C., Benyamini, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+the+interaction+between+the+antiapoptotic+Bcl-2+family+proteins+and+the+proapoptotic+protein+ASPP2.">Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).</li><li>Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+of+the+Interaction+between+Proapoptotic+Truncated+BID+(tBID)+Protein+and+Mitochondrial+Carrier+Homologue+2+(MTCH2)+Protein:+KEY+PLAYERS+IN+MITOCHONDRIAL+DEATH+PATHWAY.">Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).</li><li>Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+characterization+of+myosin+IIC+tailpiece+and+its+effect+on+filament+assembly.">High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הקרנת מערך פפטיד היא כלי מצוין לזיהוי אתרי הקישור של חלבון מטרה בשותפיה. assay זה הוא מהיר וקל לביצוע וניתן לקבל תוצאות באחד או שני ימי עבודה. הקרנת מערך פפטיד היא תכליתית ויכולה לשמש למטרות רבות. ניתן להשתמש בו לאפיון שינויי תרגום פוסט כגון זרחון וזיהוי מצעים של קינאזו?...

אינטראקציות בין חלבונים לתווך את רוב התהליכים בתא החי. אינטראקציות חלבון פגומות עלולות לגרום למחלה, מה שהופך את אינטראקציות חלבון מטרה לתרופות חשובות. מכיוון שכך, חשוב מאוד להבין האינטראקציות הללו ברמה המולקולרית. אינטראקציות חלבון נלמדות תוך שימוש במגוון של טכניקות הנעות בין מבחני סלולריים וביוכימיים למבחנים ביו-פיסיקליים כמותי, ואלה עשויים להתבצע גם עם חלבונים באורך מלא, עם תחומים חלבון או עם פפטידים. פפטידים לשמש כלי מצוין כדי לחקור אינטראקציות חלבון. סיבה לכך הוא פפטידים יכולים להיות מסונתזים בקלות ולאפשר התמקדות באתר אינטראקציה ספציפית מצד אחד, ועל מטרות חלבון מרובות באופן תפוקה גבוהה על יד 1,2 האחר. הקרנת מערך פפטיד היא מהיר, קל לביצוע בשיטה לקבלת כמות גדולה של נתונים על האינטראקציות של חלבון מטרה עם שותפים רבים בזמן קצר 3. שלא כמו שיטות ביוכימיות או ביו-פיסיקליות אחרות לאיתור וניתוח אינטראקציות בין חלבונים, הקרנת מערך פפטיד דורשת ריכוז נמוך מאוד של חלבון והוא יכול לזהות חלש מאוד מחייב. מערכי פפטיד יכולים לשמש ליישומים רבים באינטראקציות פפטיד חלבון כגון מיפוי חלבונים או אתרי האינטראקציה קולטן ליגנד 4, ממשקים שָׁוֶה או הטרו-oligomerization של, נוגדנים המאפיינים epitopes 5, לומדים פעילויות אנזים 6 ותפוקה גבוהה structure- יחסי פעילות (SAR) לומדים 7. לבחינה מעמיקה על הקרנת מערך פפטיד לראות כץ ואח &#39;. 4 מספר סוגים של מערכי פפטיד קיימים כיום. ישנן שתי אסטרטגיות עיקריות סינתטיות להכנת מערכי פפטיד: סינתזה של פפטידים לפני צירופם התמיכה המוצקה, או הסינתזה של פפטידים ישירות על התמיכה המוצקה, בעיקר באמצעות 4,8 טכניקת SPOT.פפטידים מסונתזים על התמיכה המוצקה בדרך כלל על ידי 9-fluorenylmethyloxycarbonyl כימיה (Fmoc) 8. בין התוכניות סינתטיות הנפוצות קובץ מצורף פפטיד דרך התחנה הסופית N (למשל, מערכי pepstar JPT 9) וקובץ מצורף פפטיד דרך התחנה הסופית C הם (למשל, מערכי pepchip PEPSCAN 10, מערכי JPT pepspot 9 ומערכי celluspot INTAVIS 11) 4. התמיכה המוצקה יכולה להשתנות וכך גם הכימיה של צימוד פפטיד אליו. יכולים להיות מחוברים פפטידים הופסקו-Cys שקופיות זכוכית באמצעות קבוצת תיאול 12. התחנה הסופית N של פפטיד יכולה להיות מחויבת קוולנטית לקבוצת הידרוקסיל על הקרום תאית באמצעות esterification של חומצת אמינו מחובר 8. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לסינון מערכי פפטיד כשיטה לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון. המערך השתמשנו הוא מערך Celluspots, שהוא מיקרו-מערך המכיל amo הגדולUNT של כתמים (כפילויות של עד 384 נקודות) על קרום תאית קטן הנתמכים על ידי שקופית זכוכית. זה מאפשר עבודה עם כמויות נמוכות של חלבון ונוגדנים וקבלת כמות משמעותית של נתונים לכל ניסוי בודד. מערך זה מכיל גם צפיפות פפטיד גבוהה המאפשרת זיהוי של זיקה נמוכה מחייבת. המערך שימש למיפוי האינטראקציה Stil-CHFR, וזה חשוב מאוד לשליטה בתא נורמלי התפשטות 13. אינטראקציה בלתי מבוקרת בין שני החלבונים יכולה להוביל להתפתחות הסרטן. על ידי מיפוי אינטראקציה זו שמצאנו את אתר הקישור הספציפי ומחייבים שאריות 14. זו סוללת את הדרך לעיצוב מעכבים רציונאליים המעכבים אינטראקציה חלבון-חלבון זה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:231px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptide array</td>
			<td>INTAVIS Bioanalytical Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">His-probe Antibody (H-3) HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8036 HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-ECL Kit</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>20-500-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Skim Milk</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:119px;">232100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LAS-3000 camera&#160;</td>
			<td>FUJI film</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays

אינטראקציות בין חלבונים לתווך את רוב התהליכים בתא הומאוסטזיס ושליטה חיים של האורגניזם. אינטראקציות חלבון פגומות עלולות לגרום למחלה, מה שהופך את אינטראקציות חלבון מטרה לתרופות חשובות. מכיוון שכך, חשוב מאוד להבין האינטראקציות הללו ברמה המולקולרית. אינטראקציות חלבון נלמדות תוך שימוש במגוון של טכניקות הנעות בין מבחני סלולריים וביוכימיים למבחנים ביו-פיסיקליים כמותי, ואלה עשויים להתבצע גם עם חלבונים באורך מלא, עם תחומים חלבון או עם פפטידים. פפטידים לשמש כלי מצוין כדי לחקור אינטראקציות חלבון שכן הוא יכול להיות מסונתזים פפטידים בקלות ולאפשר התמקדות באתרי אינטראקציה ספציפיות. מערכי פפטיד יאפשר זיהוי של אתרי האינטראקציה בין שני חלבונים, כמו גם הקרנה לפפטידים שנקשרים חלבון המטרה למטרות טיפוליות. הם גם מאפשרים מחקרי SAR תפוקה גבוהה. לזיהוי אתרי קישור, typiמערך פפטיד קאל מכיל בדרך כלל חופף חלקית 10-20 פפטידים שאריות נגזרים מהרצפים מלאים של חלבונים אחד מבני זוג או יותר של חלבון המטרה הרצויה. הקרנת המערך לכריכה חלבון המטרה מגלה פפטידים המחייבים, המקביל לאתרי הקישור בחלבונים הדומים, בשיטה קלה ומהירה רק באמצעות כמות קטנה של חלבון. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להקרנת מערכי פפטיד למיפוי אתרי האינטראקציה בין חלבון מטרה ושותפיה. מערך פפטיד נועד מבוסס על הרצפים של חלבוני השותף לוקחים בחשבון מבנים משניים שלהם. מערכי שימוש בפרוטוקול זה היו מערכי Celluspots שהוכנו על ידי מכשירי Bioanalytical INTAVIS. המערך חסום כדי למנוע נוקבים מחייבים ולאחר מכן הודגרו עם החלבון הנחקר. זיהוי באמצעות נוגדן חושף פפטידים מחייבים המתאימים לאתרי אינטראקציה הספציפיים בין החלבונים.

STIL הוא חלבון centrosomal חשוב מאוד. היא שולטת התפשטות חלוקת תאים נורמלית ותאי 13,15 - 19. STIL אינטראקציה עם כמה חלבונים 18,20,21, ורוב האינטראקציות מתרחשים דרך החלק המרכזי שלה, שהוא אזור במהות סדר (IDR) 14. עיצבנו מערך המורכב של פפטידים הנגזרים מCHFR החלבון הקושר STIL. CHFR ה...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays at JoVE.com

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

identifying-protein-protein-interaction-sites-using-peptide-arrays

Research

JoVE Journal

Biology

17.9K Views.  The Hebrew University of Jerusalem. Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Video: Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-יוביקוויטין ממברנה שמרים בהתבסס שני היברידי (מיתוס) מערכת: כלי רב עוצמה עבור זיהוי חלבונים אינטראקציות

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

ניתוח הספציפי של החלבון ליזין Methyltransferases שימוש SPOT פפטיד מערכים

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...