This work was supported by National Institutes of Health Grant to A.S.M. (EY021784).

הפרוטוקול הבא עומד בהנחיות הטיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש אוניברסיטת תומס ג&#39;פרסון ועם הצהרת ארוו לשימוש בבעלי חיים במחקר חזון. 1. התקנה והכנת עדשות לתרבות Ex Vivo פצע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שלוש 100 מ&quot;מ צלחות פטרי ב, זרימה למינרית סטרילי. מלא שתי צלחות פטרי באמצע הדרך עם חיץ טריס / דקסטרוז (חיץ TD, 140 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 0.7 מ&quot;מ Na 2 PO 4, 5 מ&quot;מ D-גלוקוז, 8.25 מ&quot;מ טריס בסיס, pH 7.4 עם HCl) ב RT , עוזב את ריק שלישי. תקשורת ותרבות טרום חמה (199 מדיה בתוספת, 1% L- גלוטמין ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין) עד 37 מעלות צלסיוס הערה: הפצע הסטנדרטי ריפוי תקשורת והתרבות הוא סרום ללא, כפי שקורה בvivo; עם זאת, ניתן לגדל תרבויות פצע-תיקון בהצלחה בתנאים שהוגדרו בתקשורת הכוללים סרום או גורמים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ד העוברי הפורהאיי 15 ביצת אפרוח ליבורנו לבנה מחממה (מוחזק ב37.7 מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שנבחרה ביצה בזרימה למינרית ומחוץ נקי של פגז עם אתנול 70% מבקבוק לשטוף. לנהל את כל ההליכים המפורטים להלן בתנאים אספטיים בזרימה למינרית, תוך שימוש בפתרונות וכלים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפצח תוכן ביצה ומקום לצלחת פטרי 100 מ&quot;מ הריקים. לערוף עובר באמצעות מלקחיים סטנדרטיים ומספריים עדינים. מניחים את ראש עובר אפרוח בצלחת פטרי המכילה מאגר TD ולהשליך כיאות את השארית של העובר. לחלופין לשמור על הראשים עוברים אפרוח במאגר TD לתקופה קצרה של זמן, לא יותר מ -15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את ראש עובר אפרוח על מכסה צלחת פטרי. בעזרת מלקחיים דיוק גבוהים, להסיר את העדשה יחד עם ההומור שלה מצורף זגוגית מהעין ברצף הבא. לצבוט את החלק האחורי של העין עם המלקחיים כדי ליצור פתח קטן בחלק האחורי של העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לתפוס את הומור זגוגי wמלקחיים ה- i ובעדינות למשוך על הזגוגית בתנועת גלגול, הזגוגית עם העדשה מצורפת, וחילצה מן העין. עדשת מקום / זגוגית בצלחת פטרי שנותרה המכילה מאגר TD. לאפשר העדשות להישאר במאגר TD לא יותר מ -30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את העדשה למכסה צלחת פטרי חדש תחת מיקרוסקופ לנתח. בשלב זה לבצע את כל הפעולות תחת מיקרוסקופ לנתח. עם מלקחיים דיוק גבוהים לצחצח בזהירות כל גוף הריסים (תאי פיגמנט) שחלצו עם העדשה באמצעות קצה המלקחיים, לוקח זהירות שלא לפגוע ברקמת העדשה. הערה: הסרת גוף הריסים מבטיחה כי סוגי תאים שאינם אנדוגני לעדשה אינם כלולים בתרבות תיקון פצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את העדשה מהזגוגית עם מלקחיים דיוק גבוהים על ידי צובט את הגוף הזגוגי מהקשר שלה עם הקפסולה העדשה האחורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות דיוק גבוה מלקחיים להעביר את העדשה לירידה קטנהשל חיץ TD (כ -200 μl) בצלחת תרבית רקמת 35mm. </li></ol> 2. ניתוח קטרקט מוק הבמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכוון את העדשה בירידה של חיץ TD בצלחת 35 מ&quot;מ עם ההיבט הקדמי של העדשה פונה כלפי מעלה. הערה: הקדמי של העדשה מזוהה בקלות על ידי הנוכחות של טבעת צפופה ברקמה שמציינת את הגבול בין קדמי ואזור קו המשווה של האפיתל העדשה. לעומת זאת, יש העדר סימונים על האחורי של הקפסולה העדשה שתאי עדשת הסיבים מחוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשני מלקחיים דיוק גבוהים לעשות חתך קטן (כ 850μm) במרכז הקפסולה הקדמית העדשה, הקרום במרתף העבה המקיף את רקמת העדשה, ואפיתל העדשה קדמית הקשורים אליו, תוך כדי אחיזה ברקמה עם מלקחיים בכל יד ו בעדינות מושך בכיוונים מנוגדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מסת תאי סיבים, מה שהופך את חלק הארי של רקמת עדשה, dislodגינג מנספחיו לאפיתל העדשה ומקיפה כמוסת עדשה על ידי הידרו-elution (גישה המשמשת בניתוחי קטרקט קלאסיים, דגם באיור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאי מזרק 1 מיליליטר עם קצה מחט 27.5 G עם 300 μl של חיץ TD. הכנס את קצה המחט לתוך החתך שנעשה בכמוסת העדשה הקדמית, ובערך באמצע הדרך לעדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לדכא את מזרק הזרקת חיץ TD למסת תאי סיבי עדשה. להזריק בין 50 ל 200 TD μl, ולא יותר מ -300 μl. שים לב למסת תאי סיבי התרופפות עצמו מכמוסת האפיתל ועדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים דיוק גבוהים, להסיר את מסת תאי סיבים משוחררת מהעדשה דרך אתר החתך הקדמי. הערה: הליך זה יוצא הקפסולה העדשה האחורית קרום במרתף כדי שתאי הסיבים היו קשורים ערום של תאים, ואפיתל עדשה נפצע רק בסמוך לאתר זה. </li></ol> 3. ומתכונניםז העדשות הפצועים לאקס תרבות Vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטח את שקית קופסית העדשה, הנובעת מניתוח הקטרקט שתואר לעיל על צלחת התרבות, צד עד תא, על ידי ביצוע חמישה חתכים בהיבט הקדמי של תיק קופסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך בניצב לאתר החתך המקורי ועד לקו המשווה של הכדור. שטחו את חמישה &quot;הדשים&quot; התוצאה של כמוסת עדשה עם אפיתל המצורף בצד כמוסת צלחת התרבות למטה, בצד עד תא. שים לב לעדשה נפצעה vivo לשעבר עכשיו צריך לקחת על כוכב או צורה דמוית פרחים (ראה איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח את הקפסולה לצלחת, עיתונות ברכות למטה עם המלקחיים בכל נקודה של הכוכב. זה יהפוך את כניסה קטנה בחמשת הטיפים מחוץ ביותר של explant ולגרום לקובץ מצורף מתמשך לצלחת. הערה: ניתן לפגוע בכמוסה במהלך הליך זה ולכן חשוב להבטיח את הקפסולה לצלחת הקרובה לטיפים של פלורידהנ.ב. ככל האפשר, כמו גם להפוך את הכמות המינימאלית של נקודות הבטחת ככל האפשר (בדרך כלל שתיים, מקסימום שלושה לדש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חיץ TD מצלחת 35mm ולהחליף אותו עם 1.5 מיליליטר של תקשורת מחוממת מראש. מכסה את צלחת 35mm עם המכסה שלה ומקום בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). </li></ol> 4. הפרדה של מרכז הגירת האזור (CMZ), שבו מחדש epithelialization של האזור הפצוע בקפסולה אחורית מתרחש, מהקובץ המצורף המקורי האזור (OAZ) של תאי אפיתל העדשה, לניתוח כמותי. הערה: התאים מתחילים לנוע לאזור CMZ מייד בתגובה לפציעה. ביום אחד בתרבות מספיק תאים נודדים ברחבי CMZ לניתוח מולקולרי וביוכימיים, הבאים הפרדת CMZ וOAZ על ידי מיקרו לנתיחה 23. פרוטוקול זה כרוך ההסרה של כנף אחת (OAZ) בכל פעם מהאזור הפצוע של הקפסולה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב Demarקטיון, נראה בבירור מתחת למיקרוסקופ לנתח, בין OAZ וCMZ (ראה איור 2 א). שימוש בשני מלקחיים דיוק גבוהים, לתפוס בשני המלקחיים בקצה קו OAZ / CMZ, אחד רק בסמוך לאחר, משני צדי הקו (ראה איור 2 א, ב, חץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ביד אחת / אחד מלקחיים בצד CMZ להמשיך להחזיק בתרבות הפצועה, בעוד עם היד / מלקחיים אחרים, משוך בעדינות את OAZ לאורך קו OAZ / CMZ. CMZ קלות מפריד מOAZ לאורך הקו הזה. תמשיך לאורך הקו הזה מסביב לכל התרבות עד שני האזורים מופרדים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללמוד את השברים המופרדים OAZ וCMZ לניתוח מולקולרי כמו 24 או ביוכימיים ניתוח RNA-Seq כגון כתם מערבי או שיתוף immunoprecipitation 23,25. </li></ol>

<ol>
	<li>Walker, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+precursors+for+the+mesenchymal+cells+involved+in+injury+response+and+fibrosis.">Unique precursors for the mesenchymal cells involved in injury response and fibrosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 13730-13735 (2010).</li><li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 10, 445-457 (2009).</li><li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration.">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> Journal of laboratory automation. 17, 59-65 (2012).</li><li>Khalil, A. A., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+leader+cells+in+collective+cell+migration.">Determinants of leader cells in collective cell migration.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 2, 568-574 (2010).</li><li>Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+SRC+kinases+signals+induction+of+posterior+capsule+opacification.">Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 48, 2214-2223 (2007).</li><li>Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+basement+membrane+after+corneal+debridement.">Disruption of the basement membrane after corneal debridement.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 41, 1045-1053 (2000).</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+the+study+of+recurrent+corneal+epithelial+erosions:+alpha9beta1+integrin+implicated+in+progression+of+the+disease.">A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 45, 1775-1788 (2004).</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+the+basement+membrane+enhances+corneal+wound+healing.">Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing.</a> Experimental eye research. 93, 927-936 (2011).</li><li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals.">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental eye research. 121, 178-193 (2014).</li><li>Kuwabara, T., Perkins, D. G., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sliding+of+the+epithelium+in+experimental+corneal+wounds.">Sliding of the epithelium in experimental corneal wounds.</a> Investigative ophthalmology. 15, 4-14 (1976).</li><li>Sherrard, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corneal+endothelium+in+vivo:+its+response+to+mild+trauma.">The corneal endothelium in vivo: its response to mild trauma.</a> Experimental eye research. 22, 347-357 (1976).</li><li>Stramer, B. M., Zieske, J. D., Jung, J. C., Austin, J. S., Fini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+controlling+the+fibrotic+repair+phenotype+in+cornea:+implications+for+surgical+outcomes.">Molecular mechanisms controlling the fibrotic repair phenotype in cornea: implications for surgical outcomes.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 44, 4237-4246 (2003).</li><li>Escamez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+wound+healing+in+genetically+modified+skin-humanized+mice.">An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice.</a> The Journal of investigative dermatology. 123, 1182-1191 (2004).</li><li>Werner, S., Breeden, M., Hubner, G., Greenhalgh, D. G., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+keratinocyte+growth+factor+expression+is+reduced+and+delayed+during+wound+healing+in+the+genetically+diabetic+mouse.">Induction of keratinocyte growth factor expression is reduced and delayed during wound healing in the genetically diabetic mouse.</a> The Journal of investigative dermatology. 103, 469-473 (1994).</li><li>Tarin, D., Croft, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+of+wound+healing+in+mouse+skin.+II.+Dermo-epidermal+interrelationships.">Ultrastructural studies of wound healing in mouse skin. II. Dermo-epidermal interrelationships.</a> Journal of anatomy. 106, 79-91 (1970).</li><li>Croft, C. B., Tarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+of+wound+healing+in+mouse+skin+I.+Epithelial+behaviour.">Ultrastructural studies of wound healing in mouse skin I. Epithelial behaviour.</a> Journal of anatomy. 106, 63-77 (1970).</li><li>Winstanley, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+reaction+in+the+healing+of+excised+cutaneous+wounds+in+the+dog.">The epithelial reaction in the healing of excised cutaneous wounds in the dog.</a> Journal of comparative pathology. 85, 61-75 (1975).</li><li>Wormstone, I. M., Wride, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ocular+lens:+a+classic+model+for+development,+physiology+and+disease.">The ocular lens: a classic model for development, physiology and disease.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 366, 1190-1192 (2011).</li><li>Danysh, B. P., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lens+capsule.">The lens capsule.</a> Experimental eye research. 88, 151-164 (2009).</li><li>Awasthi, N., Guo, S., Wagner, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterior+capsular+opacification:+a+problem+reduced+but+not+yet+eradicated.">Posterior capsular opacification: a problem reduced but not yet eradicated.</a> Archives of ophthalmology. 127, 555-562 (2009).</li><li>Walker, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+attempts+to+reduce+posterior+capsule+opacification+after+cataract+surgery--a+review.">Pharmacological attempts to reduce posterior capsule opacification after cataract surgery--a review.</a> Clinical &amp; experimental ophthalmology. 36, 883-890 (2008).</li><li>Schmidbauer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterior+capsule+opacification.">Posterior capsule opacification.</a> International ophthalmology clinics. 41, 109-131 (2001).</li><li>Menko, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+central+role+for+vimentin+in+regulating+repair+function+during+healing+of+the+lens+epithelium.">A central role for vimentin in regulating repair function during healing of the lens epithelium.</a> Molecular biology of the cell. 25, 776-790 (2014).</li><li>Chauss, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+state-specific+mitochondrial+dynamic+regulatory+networks+are+revealed+by+global+transcriptional+analysis+of+the+developing+chicken+lens.">Differentiation state-specific mitochondrial dynamic regulatory networks are revealed by global transcriptional analysis of the developing chicken lens.</a> G3 (Bethesda). 4, 1515-1527 (2014).</li><li>Leonard, M., Zhang, L., Bleaken, B. M., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+N-Cadherin+linked+c-Src+and+fyn+kinases+in+lens+development.">Distinct roles for N-Cadherin linked c-Src and fyn kinases in lens development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 242, 469-484 (2013).</li><li>Sieg, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAK+integrates+growth-factor+and+integrin+signals+to+promote+cell+migration.">FAK integrates growth-factor and integrin signals to promote cell migration.</a> Nature cell biology. 2, 249-256 (2000).</li><li>Sieg, D. J., Hauck, C. R., Schlaepfer, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Required+role+of+focal+adhesion+kinase+(FAK)+for+integrin-stimulated+cell+migration.">Required role of focal adhesion kinase (FAK) for integrin-stimulated cell migration.</a> Journal of cell science. 112 (Pt 16), 2677-2691 (1999).</li><li>Hauck, C. R., Hsia, D. A., Schlaepfer, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+focal+adhesion+kinase--a+regulator+of+cell+migration+and+invasion).">The focal adhesion kinase--a regulator of cell migration and invasion).</a> IUBMB life. 53, 115-119 (2002).</li><li>Zhao, X., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+kinase+and+its+signaling+pathways+in+cell+migration+and+angiogenesis.">Focal adhesion kinase and its signaling pathways in cell migration and angiogenesis.</a> Advanced drug delivery reviews. 63, 610-615 (2011).</li><li>Menko, A. S., Bleaken, B. M., Walker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional-specific+alterations+in+cell-cell+junctions,+cytoskeletal+networks+and+myosin-mediated+mechanical+cues+coordinate+collectivity+of+movement+of+epithelial+cells+in+response+to+injury.">Regional-specific alterations in cell-cell junctions, cytoskeletal networks and myosin-mediated mechanical cues coordinate collectivity of movement of epithelial cells in response to injury.</a> Experimental cell research. 322, 133-148 (2014).</li><li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration.">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li><li>Ferguson, M. W., O'Kane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scar-free+healing:+from+embryonic+mechanisms+to+adult+therapeutic+intervention.">Scar-free healing: from embryonic mechanisms to adult therapeutic intervention.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359, 839-850 (2004).</li><li>Redd, M. J., Cooper, L., Wood, W., Stramer, B., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+inflammation:+embryos+reveal+the+way+to+perfect+repair.">Wound healing and inflammation: embryos reveal the way to perfect repair.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359, 777-784 (2004).</li><li>Nodder, S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+in+embryos:+a+review.">Wound healing in embryos: a review.</a> Anatomy and embryology. 195, 215-228 (1997).</li><li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryoni...

ניתוח הקטרקט הרלוונטי מבחינה קלינית, מדומה, לשעבר vivo מודל ריפוי פצעי אפיתל המתואר כאן פותח כדי לספק כלי לחקר המנגנונים המווסתים את התיקון של רקמות האפיתל בתגובה לפציעה. תכונות עיקריות שנועדו ביצירת מודל זה כלול 1 תנאים) ובלבד שמשוכפלים מקרוב את התגובה בvivo לנפצע בהגדרת תרבות, 2) להקל בויסות אלמנטי הרגולציה של תיקון, ו- 3) יכולת תמונת תהליך התיקון, בשלמותו, בזמן אמת. האתגר, לכן, היה ליצור מודל תרבות שבה ניתן היה ללמוד, ולטפל, לתקן פצע אפיתל במייקרו-הסביבה האם של התאים. הזמינות של מודל פצע-תיקון זה פותחת אפשרויות חדשות לזיהוי רמזי איתות אנדוגני ממטריצת חלבונים, ציטוקינים וכמוקינים המסדירים את תהליך התיקון. בנוסף, המודל אידיאלי לבחינה איךn האפיתל הוא מסוגל לנוע כגיליון קולקטיבי מחדש epithelialize אזור פצע 2,3, ולקביעת השושלת של תאי מנהיג mesenchymal בשולי הפצע שפועלים בהכוונת ההגירה הקולקטיבית של האפיתל נפצע 4. מודל זה גם מספק פלטפורמה שעם לזהות תרופות שיכולים לקדם את ריפוי פצע יעיל ולמנוע תיקון פצע חריג 5. יש כבר מספר דגמי פצע-תיקון זמינים, הן בתרבות וin vivo, שספק את רוב מה שידוע על תהליך תיקון הפצע היום. במודלים של בעלי חיים פציעה, כגון קרנית 6-12 ועור 13-17, יש את ההזדמנות ללמוד את התגובה של הרקמה לפציעתם בהקשר של כל מתווכי התיקון שיכול להיות מעורב בתהליך, כוללים תרומות מ מערכת עצבים כלי דם ו. עם זאת, יש מגבלות למניפולציה של ההתנסותתנאים נפשיים in vivo, וזה עדיין לא ניתן לבצע מחקרי הדמיה של תגובת תיקון in vivo, רציף ולאורך זמן. לעומת זאת, רוב דגמי תרבות במבחנה פצע-תיקון, כגון פצע השריטה, ניתן להשפיע בקלות ואחריו לאורך זמן, אבל חסרים את ההקשר הסביבתי של לימוד ריפוי פצעים ברקמות in vivo. בעוד מודלים vivo לשעבר מציעים את היתרון של לימוד תהליך תיקון פגיעה ברציפות לאורך זמן בהקשר של מייקרו-הסביבה של התאים בשילוב עם היכולת לווסת את הרגולטורים המולקולריים של תיקון בכל נקודה בתהליך זמן, יש כמה דגמים שמתאימים אלה פרמטרים. כאן מתואר הליך כדי ליצור vivo לשעבר פצע אפיתל מאוד לשחזור ריפוי תרבויות שלשכפל התגובה של רקמת האפיתל לפציעה פיזיולוגית. שימוש בעדשה עובר אפרוח כמקור רקמות, vivo לשעבר MOCניתוח קטרקט k מתבצע. העדשה היא רקמה אידיאלית לשימוש עבור מחקרים אלה שכן הוא בתוך כמוסת קרום במרתף עבה עצמאי, avascular, לא innervated, וללא כל סטרומה קשורה 18,19. במחלות של בני אדם, ניתוח קטרקט מתייחס לאובדן ראייה עקב עננות של העדשה, וכרוך בהסרת מסת תאי עדשת סיבים, הכוללת את חלק הארי של העדשה. חזון ניתוח קטרקט בעקבות משוחזר באמצעות ההחדרה של עדשה תוך-עינית מלאכותית. ניתוח הקטרקט, באמצעות הסרת תאי סיבים, גורם תגובת פציעה באפיתל העדשה הסמוכה, שמגיב בepithelialization מחדש של האזור האחורי של הקפסולה העדשה שנכבש על ידי תאי הסיבים. בניתוח קטרקט, כמו ברוב תגובות תיקון הפצע, יש לפעמים מתרחש תוצאה חריגה fibrotic לתגובת ריפוי הפצע, הקשורים בהופעתה של myofibroblasts, אשר בעדשה ידועה כאחורי Capsule העננות 20-22. על מנת ליצור את מודל ריפוי פצע ניתוח קטרקט, ניתוח קטרקט הוא חיקה בעדשות הוסרו מן העין עובר אפרוח לייצר פגיעה פיזיולוגית. הסרת מייקר תוצאות תאי עדשת סיבים באזור פצע עגול מאוד עקבי מוקף תאי אפיתל העדשה. אוכלוסיית תא זה נשארה מחובר היטב לכמוסת הקרום במרתף עדשה והוא נפגע על ידי ההליך כירורגי. תאי האפיתל להעביר על האזור הערום של הקרום במרתף אנדוגני לרפא את הפצע, בראשות אוכלוסייה של תאי mesenchymal vimentin העשיר הידועים בתהליך תיקון תאי מנהיג 1. בעזרת מודל זה התגובה של האפיתל לפציעה ניתן דמיין בקלות ואחריו עם זמן בהקשר של מייקרו-הסביבה של התאים. התאים נגישים לשינויים בביטוי או ההפעלה של המולקולות צפויות לשחק תפקיד בתיקון פצע. תכונה חזקה של ההוא מודל הוא היכולת לבודד ולחקור שינויי הגירה ספציפית במסגרת ריפוי פצעים. היכולת להכין מספר גדול של תרבויות בגילים תואמות vivo לשעבר ריפוי פצע ללימודים היא יתרון נוסף של מודל זה. לפיכך, מערכת מודל זה מספקת הזדמנות ייחודית ללהפריד מנגנוני תיקון פצע ותרופות מבחן להשפעתם על תהליך ריפוי פצע. מודל ניתוח קטרקט המדומה vivo לשעבר צפוי להיות תחולה רחבה, מתן משאבים קריטיים לחקר מנגנונים של תיקון פציעה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>Use at 140mM in TD Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Use at 5mM in TD Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876</td>
			<td>Use at .7mM in TD Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose (Dextrose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>Use at 0.5mM in TD Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Use at 8.25mM in TD Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td>Use to pH TD buffer to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media 199</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11150-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning/CellGro</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td>Use at 1% in Media199</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning/CellGro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Use at 1% in Media199</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU01RE</td>
			<td>Use to filter sterilize Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps (need 2)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge 1mL SlipTip with precision glide needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91100-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Other Items Needed: General dissection instruments,&#160; fertile white leghorn chicken eggs,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">check egg incubator (humidified, 37.7&#176;C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model for investigating epithelial wound repair in a native microenvironment

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells&#8217; native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens1. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Ex Vivo דגם נוצר כדי ללמוד את תהליך ריפוי הפצע במייקרו-הסביבה האם של התאים לחקור מנגנונים מעורבים בויסות ריפוי פצע של האפיתל במייקרו-הסביבה המקומית של התאים, מודל ניתוח קטרקט רלוונטי קליני vivo לשעבר מדומה נוצר. מודל זה נוצר ...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment at JoVE.com

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

הקמת קלינית רלוונטי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; דגם ניתוח קטרקט מוק לחקירת תיקון פצע אפיתל במייקרו-סביבה של ילידים

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

establishment-clinically-relevant-ex-vivo-mock-cataract-surgery-model

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

6.5K Views.  Thomas Jefferson University. Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment. 

Video: Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

Epicardial תולדת תרבות Assay ו<em&gt; Ex Vivo</em&gt; הערכה של נדידת תאים שמקורם Epicardial

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

תרפיה adenoviral ג&#39;ין עבור סוכרתית keratopathy: השפעות על ריפוי פצע גזע ביטוי נייד מרקר ב קרניות אדם איברים בתרבית תאים לימבלית אפיתל

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך<em&gt; אקס אובו</em&gt; זמן לשגות הדמיה של מוקדם צ&#39;יק עובר

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

ותרופות טיפול<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של אוסטאובלסטים-osteoclast אינטראקציות במודל אוסטאופורוזיס Medaka דגים

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own body. The ability to grow bone de novo using a patient's own cells would allow bony defects to be filled with adequate tissue without the morbidity of harvesting native bone. There is interest in the use of adipose-derived stromal cells (ASCs) as a source for tissue engineering because these are obtained from an abundant source: the patient's own adipose tissue. However, ASCs are a heterogeneous population and some subpopulations may be more effective in this application than others. Isolation of the most osteogenic population of ASCs could improve the efficiency and effectiveness of a bone engineering process. In this protocol, ASCs are obtained from subcutaneous fat tissue from a human donor. The subpopulation of ASCs expressing the marker BMPR-IB is isolated using FACS. These cells are then applied to an in vivo calvarial defect healing assay and are found to have improved osteogenic regenerative potential compared with unsorted cells.

Adipose-derived stromal cells may be useful for engineering new tissue from a patient's own cells. We present a protocol for the isolation of a subpopulation of human adipose-derived stromal cells (ASCs) with increased osteogenic potential, followed by application of the cells in an in vivo calvarial healing assay.

בידוד מהיר של BMPR-IB + השומן שמקורם בתאי סטרומה לשימוש במודל ריפוי פגם calvarial

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

מכשיר לביצוע נדידת תאים / ריפוי פצעים צלחת 96-ובכן

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

הקמתה של הזחל דג זברה כמודל חיה כדי Investigate Trypanosoma cruzi תנועתיות Vivo ב

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological questions in cell and developmental biology. In addition, organoids together with recent technical advances in gene editing and viral gene delivery promises to advance medical research and development of new drugs for treatment of diseases. Organoids grown in vitro in basement matrix provide powerful model systems for studying the behavior and function of various proteins and are well suited for live-imaging of fluorescent-tagged proteins. However, establishing the expression and localization of the endogenous proteins in ex vivo tissue and in in vitro organoids is important to verify the behavior of the tagged proteins. To this end we have developed and modified tissue isolation, fixation, and immuno-labeling protocols for localization of microtubules, centrosomal, and associated proteins in ex vivo intestinal tissue and in in vitro intestinal organoids. The aim was for the fixative to preserve the 3D architecture of the organoids/tissue while also preserving antibody antigenicity and enabling good penetration and clearance of fixative and antibodies. Exposure to cold depolymerizes all but stable microtubules and this was a key factor when modifying the various protocols. We found that increasing the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) concentration from 3 mM to 30 mM gave efficient detachment of villi and crypts in the small intestine while 3 mM EDTA was sufficient for colonic crypts. The developed formaldehyde/methanol fixation protocol gave very good structural preservation while also preserving antigenicity for effective labeling of microtubules, actin, and the end-binding (EB) proteins. It also worked for the centrosomal protein ninein although the methanol protocol worked more consistently. We further established that fixation and immuno-labeling of microtubules and associated proteins could be achieved with organoids isolated from or remaining within the basement matrix.

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

We present protocols for isolation of intestinal 3D structures from in vivo tissue and in vitro basement matrix embedded organoids, and detail different fixation and staining protocols optimized for immuno-labeling of microtubule, centrosomal, and junctional proteins as well as cell markers including the stem cell protein Lgr5.

חיסונית-פלורסנט תיוג של Microtubules וחלבונים Centrosomal Vivo לשעבר רקמת המעי ו 3D במבחנה Organoids מעיים

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic age-related macular degeneration (AMD) which represents 90% of the cases. Therapies are needed to slow or retard the development of geographic atrophy (GA), and understanding Bruch&#39;s membrane pathology is part of this process. Alterations in human Bruch&#39;s membrane precede the progression of AMD by contributing to the damage of retinal pigment epithelial (RPE) cells. Given the lack of sufficient animal models to study AMD, ex vivo models of aged human Bruch&#39;s membrane serve as a useful tool to study the behavior of RPE cells from immortalized and primary cell lines as well as RPE lines derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs). Here, we present a detailed method that allows one to determine the effects of RPE cell behavior seeded on harvested human Bruch&#39;s membrane explants from human donors, including attachment, apoptosis and proliferation, ability to phagocytize photoreceptor outer segments, establishment of polarity, and gene expression. This assay provides an ex vivo model of aged Bruch&#39;s membrane to assess the functional characteristics of RPE cells when seeded on aged/compromised extracellular matrix.

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch&#039;s Membrane

The goal of this protocol is to demonstrate the culturing of retinal pigment epithelial (RPE) cells on aged and/or diseased human Bruch&#39;s membrane. This method is suitable to study RPE cell behavior on a compromised extracellular matrix.

Culturing תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית על מודל לשעבר Vivo של הממברנה של ברוך בן אנוש

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...