מאמר זה תיאר שיטה פשוטה לראית פצעים במערכת תלת מימדית ורב-תאית של מודלים של תרבות איברים. אנחנו עושים את זה באמצעות עיני חזיר, אבל גם אם אתה לא מכיר את העיניים, אתה יכול לעשות את הראיה הזאת. כ סקירה כללית, קיבלנו עיני פורצ'ין, לגזור את הגלובוסים, לעשות פצע מעגלי בקרנית שעוברת את האפיתל וכשליש מהסטרומה.
אנחנו חותכים את הקרנית, ולהוות אותו על בסיס אגר, ולשים את המבנה הזה באינקובטור. הרקמה תמלא ביצירת צלקת בקרנית. אתה לא צריך להוסיף כל גורמי גדילה, או אפילו סרום.
הדבר נעשה במדיה נטולת סרום. למרות שזה מבוצע בקרנית, זה יכול לשמש כמערכת מודל לריפוי פיברוטי בכלל. כמו רבים של מסלולים הסלולר המופעלים במהלך הצטלקות דומים בין מערכות.
במכסה המנוע biosafety, להשתמש בלהב כירורגי קצה ישר כדי להסיר את הגלובוס מהמכסה על קרש חיתוך ניקה אתנול, ולהסיר את רקמת השומן העודפת מכל עין. החזקת הגלובוס הנקי לאחר מכן במטסים טובלים מיד את העין ב-PBS ואחריו שלושה מטבלים מהירים ב-10% יוד ושני מטבלים מהירים ב-PBS. ואז לעטוף את העין היקפית עם רקמת מעבדה נקייה לעטוף עם מספיק לחץ כדי להשיג משטח קרנית מתוח מבלי ליצור קשר עם הקרנית.
באמצעות טרפין שישה מילימטר, לחדור את האפיתל בסטרומה הקדמית במרכז הקרנית מבלי לעשות פצע עובי מלא דרך הקרנית כולה, ולסובב את trephine 180 מעלות בכיוון השעון נגד כיוון השעון חמש פעמים תוך הפעלת לחץ אור כדי להעמיק את הפצע. כאשר הפצע עמוק מספיק כדי לאפשר לדש רקמה להיות מורם עם ממטרות, להשתמש בלהב כירורגי לחתוך את הדש במקביל לגלובוס תוך המשך להרים את הקרנית הפנימית בתוך שולי הפצע. כאשר הדש כולו הוסר, פצע עגול צריך להיות ממוקם במרכז הקרנית.
כדי לקצור את הקרנית לתפוס את העין עם רקמת המעבדה, ולהשתמש בלהב כירורגי כדי להפוך חתך קטן מילימטר אחד מקצה הקרנית כדי לכלול את הגפיים ואת איסוף הרקמות. באמצעות מספריים קטנים וחדים ממשיכים את החתך ברחבי העולם ושומרים על שוליים מילימטריים על פני הקרנית כדי לשמור על הלימבוס במישוש. לאחר מכן מניחים את הקרנית, בצד הפצע למטה, בצלחת 60 מילימטר, או 100 מילימטר המכיל מיליליטר אחד של PBS.
כדי לעלות על הקרנית, השתמשו בשני זוגות מדפים כדי להחזיק את קרנית האפיתל בצד למעלה כדי ליצור, ולהשתמש פיפטה העברה סטרילית להוסיף פתרון אגר מחומם לתוך הקרנית עד ה מלאה. לאחר אגר מתקשה, בזהירות למקם את הקרנית חדש 60 מילימטר צלחת אגר בצד למטה לכסות את הצלחת עם מכסה. לאחר מכן הוסיפו ארבעה מיליליטר של מדיום בתוספת סרום לכל צלחת קרניות ששומרות על הקרניות בממשק נוזלי אוויר בגבול הלימבי באינקובטור של תרבות התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני, והרטבת משטחי הקרנית פעם ביום עם טיפה אחת של מדיום ללא סרום בתוספת מהמדיום הממוזג בצלחת כדי לשמור על הרקמות לחות.
להפלת גנים, יש לערבב חמישה מיקרוליטרים של הפרעה קטנה או siRNa עם 50 מיקרוליטרים של מדיום חיוני מינימלי מופחת בסרום ושני מיקרוליטרים של ריאגנטים לתרגום. עם 50 מיקרוליטרים של מדיום סרום מופחת לכל קרנית. לאחר חמש דקות, מערבבים את שתי תערובות יחד, ומוסיפים 200 microliters של בינוני מינימלי סרום מופחת לכל תערובת siRNA.
ואז פיפטה פתרונות siRNA טיפה חכם על כל פצע. ואז לשים את הקרניות לתוך החממה. לאחר שלוש שעות, השתמש במדיום בכל מנה כדי לשטוף את siRNA מפני הקרנית, ולהחליף את המדיום הממוזג בכל מנה עם מדיום טרי בתוספת סרום בתוספת אנטיביוטיקה.
ואז להחזיר את תרבות הקרנית לחממת תרבות התא, ולאורות במשך שבועיים. שש שעות לאחר הפציעה, אפיתל הקרנית נעדר. שישה ימים לאחר הפציעה, האפיתל גדל מחדש.
כתמי אמינו פלואורסצנטיים עם אקטין שרירים חלק אלפא מגלה שיפוע של myofibroblasts פעיל לאורך שולי הפצע מן הפצע מהקדימה אל סטרומה האחורית. כתמים אימונו-היסטוכימיים עבור אקטין שרירים חלק אלפא מגלה עלייה דרמטית בביטוי חלבון אקטין שריר חלק אלפא פצוע בתוספת בקרניות siRNA שליטה. בהשוואה ל- siRNA חלבון לא מבוסס ומטרה מטופל, קרניות פצועות.
באופן דומה, תחום נוסף fibronectin A מוסדר בקרניות פצועות siRNA מטופלים לעומת siRNA חלבון unwounded ו היעד מטופלים קרניות פצועות. הפגנת הפלה מוצלחת של חלבון היעד. כמו כן, טיפול בקרניות הפצועות עם הרעלן שכוון באופן לא ספציפי לחלבון היעד מונע אפיתליזציה מחדש וכתוצאה מכך מוות תאי איכותי, מטריצה לא מאורגנת, ו vacuoles סטרומה מציע כי הרעלן אינו מקדם ריפוי בריכוז assayed.
לסיכום, בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור לשמור על הלהב מקביל לרקמה בעת החיתוך, כך שהוא לא לחדור את כדור הארץ. טכניקות פציעה שונות ניתן להשתמש עם בדיקה זו, כולל כוויה כימית או שריטה אפיתל. זה יכול לשמש גם עבור בדיקות רעילות סמים כדי לקבוע אם האפיתל מרפא ובקצב.
זוהי חיסכון בעלויות ex vivo, מערכת מודל תרבות איברים שיכולה להקדים את מחקרי ריפוי פצעים in vivo שלך.
