The authors would like to acknowledge the contribution of our colleagues Sandrine Roch-Lefevre and Eric Gregoire of the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France). This work was supported by the Government of Canada Science and Technology program at Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), the CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), the Canadian Nuclear Safety Commission and by the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France).

כל נהלי הטיפול וטיפול העכבר צריכים לדבוק בכללים שנקבעו על ידי מחוקק התוכניות ו / או טיפול בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי החיים מקומית. כל השיטות שתוארו בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים באישור ועדת טיפול בבעלי החיים המקומית. זהירות: כל העבודה עם רדיואקטיביות (כולל, אך לא מוגבלת לטיפול בטריטיום, γ-קרינה חיצונית, טיפול ברקמות בעלי החיים רדיואקטיבי, פסולת מצעים) צריך לדבוק בכללים שנקבעו על ידי הרשויות המחוקקת ו / או הגנה מפני קרינה ותבוצע על ידי מורשה כוח אדם במעבדה ו / או מתקן מוסמכים. 1. בעלי החיים עבודה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי החיים קיבוץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם עכברים מגיעים מארגון חיצוני, להתאקלם חיות לפחות 10 ימים במתקן בעלי החיים. אם המחקר כולל קבוצות טיפול מרובות, להבטיח כי ספק בעלי החיים ניתן לשלוח אלבעלי החיים l כיצווה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן אקראי להקצות עכברים לקבוצות טיפול של 10 עכברים לכל קבוצה. אם משתמש בעכברי זכרים של זן C57BL / 6, יש לי ספק החיה מראש לארגן אקראי של C57BL זכרים / 6 צעירים מאוד במתקן שלהם כדי למתן בעיות תוקפנות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשיפה כרונית של עכברים β-קרינה פנימית ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ריכוזי עבודה של טריטיום (10 kBq / L וMBq 1 / L) במי שתיית עכבר על ידי דילול המניות המקוריות של HTO וOBT (תערובת של פרולין tritiated, אלאנין וחומצות אמינו גליצין) פתרונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאמת את הריכוזים הסופיים של טריטיום במי השתייה על ידי מדידת רדיואקטיביות באמצעות מונה נצנץ נוזלי. התאם ריכוזים, במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפל בבעלי חיים לחודש אחד על ידי מתן כרצונך גישה למים טריטיום. אם מים טיפול מקבלים נמוכים בתקופה של השבועיים, להוסיף עוד מים. אחרת, לשנות בקבוקים בשבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמה-מוקרנת התייחס שליטהעכברים זהים. שמור אותם בחדר &quot;נקי&quot; נפרד או על מדף נפרד &quot;נקי&quot; תחת לחץ אוויר חיובי כדי למנוע טריטיום זיהום צולב מהאוויר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשיפה כרונית של עכברים γ-קרינה חיצונית ל הערה: γ-קרינת מתקן / ציוד ישתנה בהתאם למיקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשיטות זמינות של dosimetry, לקבוע את המרחקים ממקור γ-קרינה שיש לי שדות קרינת הפקת שיעורי מינון הרצויים. ודא ההומוגניות של שדות קרינה באזורי כיסוי כלובי חיות. הערה: 1.7 μGy / h הוא שווה ערך לשיעור מינון המיוצר על ידי 1 MBq / טריטיום L בגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף עכברים על ידי הצבת כלובי עכבר במרחקים שנקבעו בשלב 1.3.1 לחודש אחד. למזער הפרעה יומית של γ-קרינה 30 דקות. השתמש מד מינון thermoluminescence למדוד מינונים נקלטו כולל. </li></ol> 2. קורבנות ודגימה <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מכשירי ניתוח סטרילי, צלחות פטרי 60 מ&quot;מ עם מסננות הוכנסו 70 מיקרון תא, 15 מיליליטר וצינורות 1.5 מיליליטר, תקשורת RPMI בתוספת סרום 5% שור עוברי (FBS) ומקום כל בתוך ארון בטיחות ביולוגי. הבטחת סטריליות של העבודה היא קריטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 5 מיליליטר של תקשורת RPMI לכל צלחת פטרי 60 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכברים באמצעות שיטה שאושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי החיים המקומית. נקע בצוואר הרחם הוא בחירה טובה עבור עבודת splenocyte המתוארת בפרוטוקול זה. עם זאת, אם דגימות דם למבחנים אחרים (לדוגמא, לmFISH, הגרעינון בלוק cytochalasin או מבחני genetoxicity הנפוץ אחרים) נדרשות, להשתמש לנקב פנים-לב לאחר הרדמה עם isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה שכיבתה על גב, עם הראש והצביע ממך. לרסס את העכבר למטה עם 70% אתנול. בעזרת מלקחיים, לתפוס את עור anteriorly לפתיחת השופכה ולעשות חתך קטן עם מספריים באזור החיץ הנקבי. <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחתך זה, לחתוך לאורך קו האמצע הגחון לחלל החזה, להיות זהיר, כדי לחתוך רק את העור ולא קיר השריר מתחת. לנתח את העור מקו האמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוס את דופן הבטן עם מלקחיים ולחתוך לאורך הציר החציוני של קיר השרירים לפתוח את חלל הבטן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו הטחול על ידי בקלילות תופס אותו עם מלקחיים סטריליות ומשייכתו בעדינות על זה תוך צמצום מרחק בו זמנית רקמת חיבור במספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי חתיכה קטנה של הטחול (כ 1/10 של הטחול) והמקום בצינור 1.5 מיליליטר. Snap להקפיא בחנקן נוזלי לאחסון שלאחר מכן ב -80 ° C למבחנים משלימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שארית הטחול לתוך מסננת תא בתוך צלחת פטרי 60 מ&quot;מ עם 5 מיליליטר של תקשורת RPMI-לוותר מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לעכבר הבא. יכולים להיות כל הזמן טחולים חולץ ב -60 מנות מ&quot;מ עם תקשורת (עד 2 שעות) בעוד שאר העכברים להקריב את: הערהאד. בהתאם למספר האנשים שהשתתפו, בין 5 ל 15 עכברים יכולים להיות מעובד ביום אחד. </li></ol> 3. הכנת תרבויות Splenocyte <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize הטחול על ידי מיותר בתוך מסננת תא עם מלקחיים סטרילי עם קצה מעוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מסננת התא ולאסוף את ההשעיה התא המסוננת מצלחת 60 מ&quot;מ לתוך צינור 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את מסננת התא עם 5 מיליליטר של תקשורת כדי לאסוף את שארית התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant ולמזוג מחדש להשעות גלולה ב 10 מיליליטר של RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant ולמזוג מחדש להשעות גלולה ב 5 מיליליטר של RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 4 מיליליטר של השעיה תא לתוך בקבוק 25 מיליליטר תרבות רקמות ולהסיר לחממת CO 2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 80% לחות) </li></ol> 4. מאתגרי הקרנה ותיקון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר אתנותר 1 מיליליטר של השעיה תא מהצעד 3.8 לתוך צינור 1.5 מיליליטר על קרח וצנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. הנזק לדנ&quot;א שנמדד במדגם זה מייצג שני נזק הנגרם הטיפול וt = 0 נתוני נקודה לבניית עקומת תיקון DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant באמצעות משאבת ואקום. בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של חיץ TBS (20 מ&quot;מ טריס pH 7.4, 150 מ&quot;מ NaCl, 2.7 מ&quot;מ KCl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בזהירות לשאוב supernatant באמצעות משאבת ואקום. בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 300 μl של TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך ערבוב במערבולת במהירות נמוכה, להוסיף 700 μl של -20 אתנול 100% מעלות צלזיוס. סגור את המכסה ולהפוך כמה פעמים כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הדגימות ב -20 ° C. Splenocytes הקבוע באתנול ניתן לאחסן ב -20 ° C לפחות 12 חודשים ללא כל אובדן מורגש באות γH2AX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשיר את תרבויות splenocyte מצעד 3.8 עם γ-רד מאתגר<html> מינון iation של 2 Gy ב≥ שיעור מינון 200 mGy / דקות באמצעות מכשיר הקרנה זמין. הערה: המטרה של קרינה זו היא לגרום לDNA DSB לאתגר את מכונות התיקון. גם צילומי רנטגן יכול לשמש למטרה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להחזיר את התרבויות לחממת CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שעה 1 לאחר הקרנת Gy 2 המאתגרת, להסיר את התרבויות מן החממה לארון בטיחות ביולוגית. לאסוף aliquot מדגם מייצג, בעדינות מחדש להשעות תאים באמצעות pipettor והעברה 1 מיליליטר של ההשעיה תא צינור 1.5 מיליליטר על קרח. להחזיר את תרביות תאים לחממת CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בזהירות לשאוב supernatant באמצעות משאבת ואקום. בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.3-4.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר 2 γ-הקרנת Gy, הקציר המאתגר ולתקן ב= מדגם 24 שעות כמתואר בשלב 4.8-4.10. </li></ol>ייתכנו &quot;&gt; 5. תיוג Immunofluorescent עם אנטי-γH2AX נוגדן הערה: בדרך כלל, 15-30 דגימות ליום יכולות להיות מתויגות immunofluorescently וassayed ידי cytometry זרימה בטווח אחת. כדי להבטיח השוואה מדויקת בין קבוצות טיפול, כולל מדגם (ים) מכל קבוצה. ראית גם התייחסות 16 לפרטים נוספים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ערכת שכותרת של צינורות למספר הדגימות להיות מעובד ומניחים על קרח. השתמש 12 x 75 מ&quot;מ צינורות זכוכית הסירו את מכסה. עקרות אינה נדרשות לעבודה זו. כולל דגימה אחת נוספת היסטורית שליטה לתיוג עם נוגדנים משני בלבד (&quot;2 Ab רק&quot;). השתמש מדגם שליטה היסטורי זה בכל cytometry זרימה לרוץ בתוך מחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של TBS קר כקרח על צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר splenocytes קבוע מ-20 ° C, מערבולת במשך 5 שניות ולהעביר aliquot 0.5 מיליליטר לצינורות מוכנים עם כפות. מניחים את שארית דגימות בחזרה לאחסון -20 ° C ולשמור כמדגם גיבוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> splenocytes צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של קר כקרח TBS המכיל 1% FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של חיץ TST (0.05% X-100, 2% FBS טריטון ב TBS). דגירה של 20 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 200 μl של נוגדן אנטי γH2AX העיקרי בדילול 1: 150 במאגר TST. השתמש 200 μl של TST ל&quot; 2 Ab רק &quot;מדגם השליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות עמדה על שייקר מסתובב בזווית של 45 - 60 מעלות ולנער תמורת 1.5 שעות ב 300 XG ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד צינורות דוגרים, להכין נפח מספיק (200 μl / מדגם) של הנוגדנים משני אנטי העכבר העז מצומדות עם Alexa-488 בדילול 1: 200 במאגר TST. הערה: כל העבודה שיש בי Alexa-488נוגדן מצומדת (שלבים 5.10-5.16 להלן) צריך להיעשות בתנאי אור עמומים וצריכה להיות מוגן דגימות שכותרתו מאור על ידי עטיפת צינורות בנייר אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהדגירה 1.5 שעות הושלמה, להוסיף 1 מיליליטר של TBS קר כקרח המכיל 2% FBS על צינור אחד וצנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של TBS המכיל 2% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 200 μl של פתרון נוגדנים משני מהשלב 5.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הדגימות על פלטפורמה רועדת עבור שעה 1 כמו בשלב 5.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של TBS קר כקרח המכיל 1% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של TBS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 0.5 מיליליטר של TBS המכיל 50 מיקרוגרם / מיליליטריודיד propidium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 5 דקות על RT המוגנים מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות על cytometer זרימה באמצעות פרוטוקולי מכשיר ספציפי 16. קראו לפחות 10,000 תאים לדגימה. </li></ol>

<ol>
	<li>Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adaptive+response+modifies+latency+for+radiation-induced+myeloid+leukemia+in+CBA/H+mice.">The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice.</a> Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).</li><li>Shadley, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+adaptive+response+in+human+lymphocytes.">Chromosomal adaptive response in human lymphocytes.</a> Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).</li><li>Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+[3H]thymidine-induced+adaptive+response+of+human+lymphocytes+to+subsequent+doses+of+X-rays+involves+the+induction+of+a+chromosomal+repair+mechanism).">Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism).</a> Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).</li><li>Mitchel, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dose+window+for+radiation-induced+protective+adaptive+responses.">The dose window for radiation-induced protective adaptive responses.</a> Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).</li><li>Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linear+no-threshold+relationship+is+inconsistent+with+radiation+biologic+and+experimental+data.">The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data.</a> Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).</li><li>Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+stability+and+the+DNA+double-stranded+break+connection.">Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection.</a> Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).</li><li>Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+and+repairing+DNA+double-strand+breaks.">Sensing and repairing DNA double-strand breaks.</a> Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).</li><li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin.">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li><li>Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+(125)IdU-induced+DNA+double-strand+breaks+with+gamma-H2AX+antibody.">Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody.</a> Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).</li><li>Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus+on+histone+variant+H2AX:+to+be+or+not+to+be.">Focus on histone variant H2AX: to be or not to be.</a> FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).</li><li>Taneja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H2AX+phosphorylation+as+a+predictor+of+radiosensitivity+and+target+for+radiotherapy.">Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy.</a> J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).</li><li>Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+histone+H2AX+in+spheroids,+tumors,+and+tissues+of+mice+exposed+to+etoposide+and+3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide.">Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide.</a> Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).</li><li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions.">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4 (2010).</li><li>Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+DNA+double-strand+breaks+is+not+modulated+by+low-dose+gamma+radiation+in+C57BL/6J+mice.">Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice.</a> Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).</li><li>Runge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+interpretation+of+ionizing+radiation-induced+gammaH2AX+foci+by+the+novel+pattern+recognition+system+AKLIDES(R).">Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R).</a> Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).</li><li>Jucha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FociCounter:+A+freely+available+PC+programme+for+quantitative+and+qualitative+analysis+of+gamma-H2AX+foci.">FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci.</a> Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).</li><li>Garty, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RABIT:+a+rapid+automated+biodosimetry+tool+for+radiological+triage.">The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage.</a> Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).</li><li>Kovalchuk, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+changes+in+DNA+repair+in+radiation-exposed+mice.">Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice.</a> Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).</li><li>Rube, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+in+the+context+of+chromatin:+new+molecular+insights+by+the+nanoscale+detection+of+DNA+repair+complexes+using+transmission+electron+microscopy.">DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy.</a> DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).</li><li>Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+stress+genes+by+low+doses+of+gamma+rays.">Induction of stress genes by low doses of gamma rays.</a> Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).</li></ol>

The authors declare that there are no known competing financial interests.

הפרוטוקול שהוצג במאמר זה הוא שימושי לניהול עכבר בקנה מידה גדול במחקרי vivo בוחנים את השפעות genotoxic של רמות נמוכות של חומרים כימיים ופיסיים שונים, כוללים קרינה מייננת. המתקן שלנו ייחודי ספציפי הפתוגן ללא בעלי החיים מצויד בirradiator GammaBeam 150 ואולם הקרנה ארוכה 30 מטר מאפשר ?...

מחלוקת מהותית על ההשפעות המזיקות האפשריות של שני מינונים נמוכים או נמוכים מאוד של קרינה מייננת ופחד של הציבור של קרינה, מונע על ידי תמונות של ההפצצות האטומיות על הירושימה ונגסקי ותאונות כור גרעיני נדירות (שהוחמרה על ידי תקשורת המונים), הובילה למאוד רגולציה קפדנית הגנה מפני קרינה ותקנים שהם בעלות פוטנציאל לא מדעי מוצדקים. בשלושת העשורים האחרונים, דיווחים רבים תעדו שני חוסר מזיק ואת הנוכחות של השפעות ביולוגיות פוטנציאלי הנגרמות על ידי קרינה מועילות במינון נמוך 1-4. גורם הסיכון בריאותי קרינה העיקרי הוא ההסתברות של סרטן, המוערכת בהתבסס על מחקרים אפידמיולוגיים של ניצולי פצצה אטומיים שקיבלו מינון גבוה או בינוני של קרינה. אקסטרפולציה ליניארית של נתונים אלה (מה שנקרא ליניארי-אין-סף או מודל LNT) משמשת להערכת סיכונים של סרטן במינונים נמוכים. עם זאת, גישה זו לא קיבלה קבלה מדעית ברחבי העולםוהוא דנו בכבדות 5. ניכר כי מחקרים נוספים נדרשים כדי להבהיר סוגיה זו ואולי לשפר את הסטנדרטים להגנה מפני קרינה. מחקרים כאלה צריכים לערב טיפולים כרוניים (הקירוב הטוב ביותר של חשיפות סביבתיות ותעסוקתיות), במודלים של בעלי החיים vivo (הטובים ביותר עבור אקסטרפולציה אפקטים לאדם) ונקודתי קצה כגון שיעורי נזק לדנ&quot;א, תיקון DNA וmutagenesis. זה ידוע שה- DNA הוא היעד העיקרי לפגיעת השפעות קרינה ולא שלמים או אי-תיקון עלול להוביל להתפתחות הסרטן וmutagenesis 6. הפסקות DNA פעמיים גדיל (DSB) הן אחד מהסוגים מזיקים ביותר של נגעי DNA ועלולות להוביל למוות של תאים ויצירת הגידולים 7. זהו, אם כן, חשוב להיות מסוגל אמין ומדויק למדידת הרמה של DSB לאחר חשיפה לקרינה במינון נמוכה ו / או גורמי לחץ אחרים, כגון מזהמים כימיים. אחד מהסמנים הרגישים והספציפיים ביותרשל DNA DSB הוא H2AX היסטון פוספורילציה, נקרא γH2AX 8, עדיין סמנים ושיטות אחרים כבר הציעו 9,10. ההערכה היא כי אלפי מולקולות H2AX, בקרבת DSB מושרה, מעורבים בהיווצרות γH2AX מאפשרת זיהוי של DSB הבודד על ידי תיוג immunofluorescent עם הנוגדן ומיקרוסקופ פלואורסצנטי אנטי γH2AX 11. התגובה היא מהירה מאוד, והגיע המקסימלית שלה בין 30 ל -60 דקות. ראיות לכך שγH2AX מאפשר תיקון של דנ&quot;א DSB ידי משיכת גורמי תיקון אחרים לאתרים של הפסקות ועל ידי שינוי מבנה הכרומטין לעגן קצות DNA השבורים ולספק גישה לחלבונים אחרים תיקון (ביקורת ב -12). עם השלמת התיקון של דנ&quot;א DSB, γH2AX מקבל דה-פוספורילציה ו / או עובר השפלה, ומולקולות H2AX מסונתזים חדש להחליף γH2AX באזורים שנפגעו מהכרומטין 10. ניטור היווצרות ואובדן γH2AX יכול,לכן, לספק הערכה מדויקת של קינטיקה תיקון DNA DSB. גישה זו נעשתה שימוש כדי ללמוד תיקון DSB בשורות תאי גידול שונים אנושיות מוקרנים עם מינונים גבוהים של קרינה ושיעורה ורמות DSB שייר הוכח לתאם עם radiosensitivity 13-15. אנחנו שונה הגישה הניסויית הזה וליישם אותו למחקר עכבר in vivo לבחון את ההשפעות של מינונים נמוכים של γ- הכרוני וβ-קרינה ברמות ה- DNA DSB ותיקון (איור 1). ראשית, אנחנו מדגימים שיטה לביצוע חשיפה כרונית ארוך טווח של עכברים לβ-קרינה הנפלטת באמצעות טריטיום (מימן-3) בצורה של המים tritiated (HTO) או כטריטיום מחויב אורגני (OBT) מומס במי שתייה . שתי הצורות צפויות לצבור ו / או להפיץ בצורה שונה בגוף ולכן, לייצר השפעות ביולוגיות שונות. שני צורות הן סכנות פוטנציאליות בתעשיית גרעין. טיפול זההקביל לחשיפה כרונית לקרינת γ-בשיעור מינון שווה ערך כדי לאפשר השוואה נכונה של שני סוגי הקרינה, שהוא חיוני להערכת היעילות הביולוגית היחסית שלהם. Beta-קרינה מורכבת מאלקטרונים, מה שהופך את שונה מאוד מγ-הקרינה, הפוטונים באנרגיה גבוהים. בשל הבדל זה, Β-קרינה מייצגת סכנה בריאותית בעיקר פנימית ועלולה לייצר השפעות ביולוגיות שונות בהשוואה לγ-קרינה. סיבוך זה הביא מחלוקות משמעותיות על פני הרגולציה של חשיפה לβ-קרינה הנפלטת על ידי HTO. לפיכך, רמות רגולציה של HTO במי שתייה לציבור משתנות מקרל 100 / L באירופה 75,000 בקרל / L באוסטרליה. זהו, אם כן, חשוב להשוות השפעות ביולוגיות של HTO למינונים מקבילים של γ-קרינה. שנית, שיעור ה- DNA DSB נמדד בsplenocytes המבודד עם השלמת חשיפות כרוניות באמצעות כותרת immunofluorescently γH2AX לזהותאד על ידי cytometry זרימה. זה מאפשר ההערכה של מידת נזק שנגרם על ידי ה- DNA in vivo החשיפות. עם זאת, זה הגיוני לצפות שחשיפות כגון רמה נמוכה לא יכולות לייצר כל שיעורי זיהוי של ה- DNA DSB; במקום זאת, כמה שינויים נסתרים / ניתן לצפות תגובות שמשפיעות על היכולת של התאים כדי לתקן נזק ל- DNA. שינויים אלה, אם מצאו, יכולים להיות גם גירוי (ייצור אפקט מועיל) או מעכב (ייצור אפקט מזיק). הפרוטוקול המוצע מאפשר חושף שינויים כאלה על ידי מאתגרים splenocytes חילוץ עם מינון גבוה של קרינה שמייצר כמות משמעותית של נזק (למשל, 2 Gy ייצור כ -50 DNA DSB לכל תא או 3 -. עלייה של 5 לקפל בסך הכל רמת γH2AX) . בהמשך לכך, ההיווצרות ואובדן γH2AX, המשקף את הייזום והשלמת תיקון DSB, מנוטרת על ידי cytometry זרימה. בדרך זו, לא רק בסיס ורמות מושרה טיפול של ה- DNA DSB ניתן למדוד, אבלגם השפעתה הפוטנציאלית על היכולת של התאים להגיב ונזק לדנ&quot;א תיקון הנגרם על ידי רמות לחץ גבוהות בהרבה.

<table><tbody><tr><td>HTO: tritiated water, [3H]</td><td>locally obtained from a nuclear reactor&amp;nbsp;</td><td></td><td>stock activity 3.7 GBq/mL;&amp;nbsp; can be substituted with HTO from Perkin Elmer</td></tr><tr><td>OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET348005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET004005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET323005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>tritiated water, [3H] (HTO)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET001B005MC</td><td>substitute for HTO of local origin&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GammaBeam 150 irradiator</td><td>Atomic Energy of Canada Limited</td><td>locally manufactured</td><td>can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td>Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL</td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1051-100ML</td><td></td></tr><tr><td>anti-gH2AX antibody, clone JBW301</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody</td><td>Life Technologies (formerly Invitrogen)</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864-10ML</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Commercial Alcohols</td><td>P006-EAAN</td><td>500 ml bottles Absolute Ethanol</td></tr><tr><td>1.5 ml tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>2682550</td><td>microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>15 ml tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-5</td><td>sterile polypropylene centrifuge tubes</td></tr><tr><td>liquid nitrogen</td><td>Linde</td><td>P110403</td><td></td></tr><tr><td>12 x 75 mm uncapped glass tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>K60B1496126</td><td>disposable borosilicate glass tubes with plain end</td></tr><tr><td>T25 flasks</td><td>VWR</td><td>CA15708-120</td><td>nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340)</td></tr><tr><td>scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14068-12</td><td>Wagner scissors 12 cm sharp/sharp</td></tr><tr><td>forceps, straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td>Semken forceps 13 cm, straight</td></tr><tr><td>forceps, curved</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-12</td><td>Narrow Pattern forceps 12 cm, curved</td></tr><tr><td>60 mm petri dishes</td><td>VWR</td><td>CA25382-100</td><td>BD Falcon tissue culture dish 60 x 15 mm</td></tr><tr><td>cell strainers, 70 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>Falcon cell strainers 50/case</td></tr><tr><td>PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200 ml of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td></tr><tr><td>TBS recipe: to make 10x stock</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 g TRIS HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253-1KG</td><td>Trizma hydrochloride</td></tr><tr><td>88 g NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Sodium Chloride</td></tr><tr><td>2 g KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>Potassium Chloride</td></tr><tr><td>Dissolve in 1 L of deionized water, adjust pH to 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring dna damage and repair in mouse splenocytes after chronic in vivo exposure to very low doses of beta- and gamma-radiation

חשיפה לקרינה במינון נמוכה עלולה לייצר מגוון רחב של השפעות ביולוגיות שהם שונים בכמות ובאיכות מתופעות המיוצרות על ידי מינוני קרינה גבוהים. התמודדות עם שאלות הקשורות לבטיחות בריאות סביבתית, תעסוקתית וציבורית באופן ראוי ומוצדק מבחינה מדעית מסתמכת במידה רבה על היכולת למדוד במדויק את ההשפעות הביולוגיות של מזהמים במינון נמוכים, כגון חומרים מייננת קרינה וכימיקלים. נזק לדנ&quot;א ותיקון הם הסימנים המוקדמים החשובים ביותר של סיכונים בריאותיים בשל השלכותיהם הפוטנציאליות לטווח ארוך, כגון סרטן. כאן אנו מתארים פרוטוקול ללמוד את ההשפעה של חשיפה כרונית בvivo למינונים נמוכים של קרינת β γ- ועל נזק לדנ&quot;א ותיקון בתאי טחול עכבר. באמצעות סמן מקובל של DNA הפסקות גדיל פעמיים, H2AX היסטון phosphorylated נקרא γH2AX, אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש בו כדי להעריך לא רק את הרמות של נזק לדנ&quot;א, אלא גם משניםביכולת תיקון DNA שהופק על ידי פוטנציאל מינון נמוך בחשיפות vivo. Cytometry זרימה מאפשרת מדידה מהירה, מדויקת ואמינה של γH2AX כותרת immunofluorescently במספר גדול של דגימות. תיקון הפסקה כפול גדיל DNA יכול להיות מוערך על ידי חשיפת splenocytes חילוץ למנה מאתגרת של 2 Gy לייצר כמות מספקת של DNA פורץ להפעלת תיקון ועל ידי המדידה המושרית (לאחר ההקרנה 1 שעה) ונזק לדנ&quot;א שייר (24 שעות לאחר הקרנה). הנזק לדנ&quot;א שיורי יהיה מעיד על תיקון חלקי והסיכון של חוסר יציבות גנומית לטווח ארוך וסרטן. בשילוב עם מבחני אחרים ונקודתי קצה שיכול בקלות להיות נמדדים בכך במחקרי vivo (למשל, סטיות כרומוזומליות, תדרי גרעינונים בreticulocytes מח עצם, ביטוי גנים, וכו &#39;), גישה זו מאפשרת הערכה מדויקת וקונטקסטואלית של ההשפעות הביולוגיות לחצים רמה הנמוכה של.

איור 2 מציג דוגמאות של cytometry זרימת הגרפים הצפויים לsplenocytes מוכנים תוך שימוש בשיטה שתוארה כאן. תאים מגודר ראשון המבוסס על &lt;נפח בצד הפיזור אלקטרוני&gt; עלילת פיזור (איור 2 א ו 2 ד; נפח אלקטרוני הוא שווה ערך לפיזור קדימה). היסטוגרמות יוד FL3 / propidium <str...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation at JoVE.com

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

מדידת נזק לדנ&quot;א ותיקון בSplenocytes העכבר לאחר כרוני<em&gt; In vivo</em&gt; חשיפה למינונים נמוכים מאוד של בטא וגמא-קרינה

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

measuring-dna-damage-repair-mouse-splenocytes-after-chronic-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

11.0K Views.  Canadian Nuclear Laboratories. A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented. 

Video: Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Cancer Research

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Genetics

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas including genome integrity, genotoxicity, radiation biology, aging, cancer, and drug development. In response to DSB, the histone H2AX is phosphorylated at Serine 139 in a region of several megabase pairs forming discrete nuclear foci detectable by immunofluorescence microscopy. In addition, 53BP1 (p53 binding protein 1) is another important DSB-responsive protein promoting repair of DSB by nonhomologous end-joining while preventing homologous recombination. According to the specific functions of &#947;H2AX and 53BP1, the combined analysis of &#947;H2AX and 53BP1 by immunofluorescence microscopy may be a reasonable approach for a detailed analysis of DSB. This manuscript provides a step-by-step protocol supplemented with methodical notes for performing the technique. Specifically, the influence of the cell cycle on &#947;H2AX foci patterns is demonstrated in normal fibroblasts of the cell line NHDF. Further, the value of the &#947;H2AX foci as a biomarker is depicted in x-ray irradiated lymphocytes of a healthy individual. Finally, genetic instability is investigated in CD34+ cells of a patient with acute myeloid leukemia by immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1.

This manuscript provides a protocol for the analysis of DNA double-strand breaks by immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1.

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ו 53BP1 לניתוח את היווצרות והתיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: תפוקה גבוהה 96-ובכן פלטפורמה למדידת נזק לדנ&quot;א בתאי Microarrayed אדם

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Bioengineering

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage response induced by neutron-gamma mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT). Specifically, the proposed methodology is applied for the detection of repair proteins activation which can be visualized as foci using antibodies specific to DNA double-strand breaks (DNA-DSBs). DNA repair foci were assessed by immunofluorescence in colon cancer cells (HCT-116) after irradiation with the neutron-mixed beam. DNA-DSBs are the most genotoxic lesions and are repaired in mammalian cells by two major pathways: non-homologous end-joining pathway (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR). The frequencies of foci, immunochemically stained, for commonly used markers in radiobiology like &#947;-H2AX, 53BP1 are associated with DNA-DSB number and are considered as efficient and sensitive markers for monitoring the induction and repair of DNA-DSBs. It was established that &#947;-H2AX foci attract repair proteins, leading to a higher concentration of repair factors near a DSB. To monitor DNA damage at the cellular level, immunofluorescence analysis for the presence of DNA-PKcs representative repair protein foci from the NHEJ pathway and Rad52 from the HRR pathway was planned. We have developed and introduced a reliable immunofluorescence staining protocol for the detection of radiation-induced DNA damage response with antibodies specific for repair factors from NHEJ and HRR pathways and observed radiation-induced foci (RIF). The proposed methodology can be used for investigating repair protein that is highly activated in the case of neutron-mixed beam radiation, thereby indicating the dominance of the repair pathway.

Radiation-induced DNA damage response activated by neutron mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT) has not been fully established. This protocol provides a step-by-step procedure to detect radiation-induced foci (RIF) of repair proteins by immunofluorescence staining in human colon cancer cell lines after irradiation with the neutron-mixed beam.

Immunofluorescence הדמיה של נזק לדנ א ותיקון Foci בתאי סרטן המעי הגס האנושי

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Immunology and Infection

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a pseudostratified epithelium lining the lateral ventricles of the embryonic brain. Genotoxic stresses, such as ionizing radiation, have highly deleterious effects on the developing brain related to the high sensitivity of NSPC. Elucidation of the cellular and molecular mechanisms involved depends on the characterization of the DNA damage response of these particular types of cells, which requires an accurate method to determine NSPC progression through the cell cycle in the damaged tissue. Here is shown a method based on successive intraperitoneal injections of EdU and BrdU in pregnant mice and further detection of these two thymidine analogues in coronal sections of the embryonic brain. EdU and BrdU are both incorporated in DNA of replicating cells during S phase and are detected by two different techniques (azide or a specific antibody, respectively), which facilitate their simultaneous detection. EdU and BrdU staining are then determined for each NSPC nucleus in function of its distance from the ventricular margin in a standard region of the dorsal telencephalon. Thus this dual labeling technique allows distinguishing cells that progressed through the cell cycle from those that have activated a cell cycle checkpoint leading to cell cycle arrest in response to DNA damage.
An example of experiment is presented, in which EdU was injected before irradiation and BrdU immediately after and analyzes performed within the 4 hr&#160;following irradiation. This protocol provides an accurate analysis of the acute DNA damage response of NSPC in function of the phase of the cell cycle at which they have been irradiated. This method is easily transposable to many other systems in order to determine the impact of a particular treatment on cell cycle progression in living tissues.

Administration of two analogs of thymidine, EdU and BrdU, in pregnant mice allows the analysis of cell cycle progression in neural and progenitor cells in the embryonic mouse brain. This method is useful to determine the effects of genotoxic stress, including ionizing radiation, during brain development.

התקדמות מחזור תא הערכה של גזע עצבי ובתאים במוח המתפתח העכבר, למרות מתח genotoxic

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Neuroscience

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and negatively impact patient quality of life and long term survival. Advances in the understanding of the biological pathways associated with normal tissue toxicities have allowed for the development of interventional drugs, however, current response studies are limited by a lack of quantitative metrics for assessing the severity of skin reactions. Here we present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe the instrumentation design of the DOS system as well as the inversion algorithm for extracting the optical parameters. Finally, to demonstrate clinical utility, we present representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema and compare the results with a commonly employed visual scoring. The described DOS method offers an objective, high through-put evaluation of skin toxicity via functional response that is translatable to the clinical setting.

We present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe DOS instrumentation design, optical parameters extraction algorithms and the animal handling procedures required to yield representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema.

מפוזר ספקטרוסקופיה אופטית עבור הערכה כמותית של רעילות העור לקרינה מייננת מושרה חריפה שימוש במודל של עכברים

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Medicine

Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis

Analysis of biomarkers in peripheral blood is becoming increasingly important in clinical trials to establish proof of mechanism to evaluate effects of treatment, and help guide dose and schedule setting of therapeutics. From a single blood draw, peripheral blood mononuclear cells can be isolated and processed to analyze and quantify protein markers, and plasma samples can be used for the analysis of circulating tumor DNA, cytokines, and plasma metabolomics. Longitudinal samples from a treatment provide information on the evolution of a given protein marker, the mutational status and immunological landscape of the patient. This can only be achieved if the processing of the peripheral blood is carried out effectively in clinical sites and samples are properly preserved from the bedside to bench. Here, we present an optimized general-purpose protocol that can be implemented at clinical sites for obtaining PBMC pellets and plasma samples in multi-center clinical trials, that will enable clinical professionals in hospital laboratories to successfully provide high quality samples, regardless of their level of technical expertise. Alternative protocol variations are also presented that are optimized for more specific downstream analytical methods. We apply this protocol for studying protein biomarkers against DNA damage response (DDR) on X-ray irradiated blood to demonstrate the suitability of the approach in oncology settings where DDR drugs and/or radiotherapy have been practiced as well as in preclinical stages where mechanistic hypothesis testing is required.

This protocol details clinically implementable preparation of high quality PBMC and plasma biosamples at the clinical trial site that can be used for translational biomarker analysis.

הכנת כדורי תאים מונונוקולריים בדם היקפי ופלזמה מהגרלת דם אחת באתרי ניסוי קליני לניתוח סמנים ביולוגיים

Analysis of biomarkers in peripheral blood is becoming increasingly important in clinical trials to establish proof of mechanism to evaluate effects of ...

מדידת נזק לדנ"א ותיקון בSplenocytes העכבר לאחר כרוני

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video