The authors would like to acknowledge the contribution of our colleagues Sandrine Roch-Lefevre and Eric Gregoire of the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France). This work was supported by the Government of Canada Science and Technology program at Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), the CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), the Canadian Nuclear Safety Commission and by the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France).

Alle Maus-Handling und Behandlungsverfahren sollten Regeln her durch den Gesetzgeber und / oder Tierpflegeprogramme eingestellt und von einem lokalen Tierschutzkommission genehmigt einzuhalten. Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care mit Zustimmung des örtlichen Tierpflege Ausschuss durchgeführt. ACHTUNG: Alle Arbeiten mit Radioaktivität (einschließlich, aber nicht, um die Handhabung von Tritium, externen γ-Bestrahlung beschränkt, Umgang mit radioaktiven tierischen Geweben, Bettwäsche Abfälle) sollten Regeln her durch den Gesetzgeber und / oder Strahlenschutzbehörden setzen haften und durch autorisierte durchgeführt werden, Personal in einem zertifizierten Labor und / oder Einrichtung. 1. Tier Arbeit <ol><li> Tier Grouping <ol><li> Wenn Mäuse werden von einer externen Organisation Ankunft zu akklimatisieren Tiere für mindestens 10 Tage in der Tierhaltung. Wenn die Studie enthält mehrere Behandlungsgruppen, zu gewährleisten, dass das Tier Lieferant al sendenl Tieren als eine einzige Partie. </li><li> Mäuse nach dem Zufallsprinzip zuweisen, um den Behandlungsgruppen von 10 Mäusen pro Gruppe. Bei Verwendung von männlichen Mäusen des C57BL / 6-Stamm, die Tier Lieferanten vor, arrangieren Randomisierung von sehr jungen C57BL / 6 Männern in ihrer Einrichtung zu Aggression Probleme zu mildern. </li></ol></li><li> Chronische Exposition von Mäusen auf Internal β-Strahlung <ol><li> Bereiten Sie Arbeitskonzentrationen von Tritium (10 kBq / L und 1 MBq / L) in der Maus Trinkwasser durch Verdünnen der ursprünglichen Bestand von HTO und OBT (einer Mischung aus tritiierten Prolin, Alanin und Glycin Aminosäuren) Lösungen. </li><li> Validierung der Endkonzentrationen von Tritium im Trinkwasser durch Messung der Radioaktivität unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers. Einzustellen Konzentrationen, falls erforderlich. </li><li> Behandlung von Tieren für einen Monat durch den Zugang ad libitum an die Tritiumwasser. Wenn Wasser während der Behandlung Zeitraum von zwei Wochen zur Neige geht, fügen Sie mehr Wasser. Andernfalls ändern Flaschen auf zwei Wochen. </li><li> Treat schein-bestrahlten KontrollMäusen identisch. Halten Sie sie in einem separaten Raum &quot;sauber&quot; oder auf einem separaten &quot;sauber&quot; Rack unter Luftüberdruck, um Tritium Kreuzkontamination aus der Luft zu vermeiden. </li></ol></li><li> Chronische Exposition von Mäusen auf externe γ-Strahlung Hinweis: γ-Bestrahlungsanlage / Geräte werden je nach Standort variieren. </li><li> Verwenden von verfügbaren Methoden der Dosimetrie, bestimmen die Abstände von einem γ-Strahlungsquelle, Strahlungsfeldern die gewünschten Dosisleistungen haben. Stellen Sie sicher, Homogenität der Strahlungsfelder in den Bereichen Abdeckung der Tierkäfige. Anmerkung: 1,7 μGy / h entspricht einer Dosisrate von 1 MBq / L Tritium im Körper produziert. </li><li> Expose Mäusen, indem Mäusekäfige an den in Schritt 1.3.1 für einen Monat festgelegt Distanzen. Minimieren tägliche Unterbrechung γ-Bestrahlung 30 min. Verwenden Thermolumineszenz-Dosimeter zur Gesamtenergiedosen zu messen. </li></ol> 2. Opfer und Sampling <ol&gt; <li> Bereiten Sie sterile chirurgische Instrumente, 60 mm Petrischalen mit eingelegter 70-Mikrometer-Zelle Siebe, 15 ml und 1,5 ml Röhrchen, RPMI-Medium mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) und Ort, die alle innerhalb einer biologischen Sicherheitswerkbank ergänzt. Gewährleistung der Sterilität der Arbeit ist von entscheidender Bedeutung. </li><li> Verzichtet werden 5 ml RPMI-Medium in jede 60 mm-Petrischale. </li><li> Opfern Mäusen mit Hilfe eines von der lokalen Tierschutzkommission genehmigt Verfahren. Genickbruch ist eine gute Wahl für die in diesem Protokoll beschriebenen Splenozyten-Arbeit. Wenn jedoch Blutproben für weitere Assays (beispielsweise für die MFISH, Cytochalasin Block Mikronucleus oder ein anderer gemeinsamer genetoxicity Assays) benötigt werden, verwenden intrakardiale Punktion nach der Narkose mit Isofluran. </li><li> Legen Sie das Tier in Rückenlage, mit dem Kopf nach von Ihnen entfernt. Sprühen Sie die Maus nach unten mit 70% Ethanol. Mit einer Pinzette greifen die Haut nach vorne in die Harnröhrenöffnung und machen einen kleinen Schnitt mit der Schere in der Dammregion. <ol&gt; <li> Von diesem Schnitt, entlang der ventralen Mittellinie, um den Brustraum abgeschnitten, wobei darauf geachtet, um die Muskelwand nur unter schneiden Sie die Haut und nicht. Präparieren Sie die Haut weg von der Mittellinie. </li><li> Fassen Sie die Bauchwand mit einer Pinzette und entlang der Mittelachse der Muskelwand zu öffnen, die Bauchhöhle geschnitten. </li></ol></li><li> Auszuschneiden die Milz durch leichtes Greifen sie mit einer sterilen Pinzette und leichtes Ziehen an sie, während gleichzeitig Wegschneiden des Bindegewebes mit einer Schere. </li><li> Schneiden Sie ein kleines Stück von der Milz (etwa 1/10 der Milz) und in ein 1,5-ml-Tube. Schnellfrost in flüssigem Stickstoff für eine anschließende Lagerung bei -80 ° C für Ergänzungstests. </li><li> Platzieren des Restes der Milz in eine Zelle Sieb innerhalb einer 60 mm Petrischale mit 5 ml vorge verzichtet RPMI Medium. </li><li> Gehen Sie zum nächsten Maus. Hinweis: Extrahiert Milz kann in 60 mm-Schalen mit Medien gehalten werden (für bis zu 2 Stunden), während der Rest der Mäuse sind sacrificed. Abhängig von der Zahl der Teilnehmer, zwischen 5 und 15 Mäuse in einem Tag verarbeitet. </li></ol> 3. Herstellung von Splenozyten-Kulturen <ol><li> Homogenisierung der Milz durch Zerkleinern in einer Zelle Sieb mit einer sterilen Pinzette mit einer gebogenen Ende. </li><li> Entfernen Sie die Zelle Sieb und Sammeln des gefilterten Zellsuspension aus der 60-mm-Schale in einen 15-ml-Tube. </li><li> Spülen Zellsieb mit 5 ml Medium, um den Rest der Zellen zu sammeln. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min bei RT. </li><li> Dekantieren und resuspendieren Pellet in 10 ml RPMI. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min bei RT. </li><li> Dekantieren und resuspendieren Pellet in 5 ml RPMI. </li><li> 4 ml der Zellsuspension in eine 25 ml Gewebekulturflasche, und einem CO 2 -Inkubator entfernen (37 ° C, 5% CO 2, 80% Luftfeuchtigkeit) </li></ol> 4. Anspruchs Bestrahlung und Befestigung <ol><li> Übertragen Sie dierestlichen 1 ml Zellsuspension aus Schritt 3.8 in ein 1,5-ml-Röhrchen auf Eis und Zentrifugieren bei 300 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. DNA-Schäden in dieser Probe gemessen wird sowohl die Behandlung induzierte Schäden und t = 0 Datenpunkt für den Aufbau einer DNA-Reparatur-Kurve darstellen. </li><li> Vorsichtig den Überstand aspirieren mit einer Vakuumpumpe. Vorsichtig resuspendieren Pellet in 1 ml TBS-Puffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl). </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Vorsichtig den Überstand aspirieren mit einer Vakuumpumpe. Vorsichtig resuspendieren Pellet in 300 ul TBS. </li><li> Unter Mischen auf einem Vortex bei niedriger Geschwindigkeit, fügen 700 ul von -20 ° C 100% Ethanol. Schließen Sie den Deckel und schwenken, um zu mischen. </li><li> Lagern die Proben bei -20 ° C. Splenozyten in Ethanol fixiert werden bei -20 ° C für mindestens 12 Monate lang ohne nennenswerten Verlust in der γH2AX Signal gespeichert werden. </li><li> Bestrahlen die Splenozyten-Kulturen von Schritt 3.8 mit einem herausfordernden γ-rad<html> iation Dosis von 2 Gy in einer Dosisrate ≥ 200 mGy / min unter Verwendung verfügbarer Bestrahlungseinrichtung. Anmerkung: Der Zweck dieser Bestrahlung zu DNA-DSB-Reparatur zu induzieren, um die Maschinen herauszufordern. Röntgenstrahlung kann auch für diesen Zweck verwendet werden. </li><li> Die Kulturen sofort zu einem CO 2 Inkubator zurück. </li><li> 1 Stunde nach der anspruchsvollen 2 Gy Bestrahlung, entfernen Sie die Kulturen aus dem Inkubator zu einem biologischen Sicherheitsschrank. Um eine repräsentative Probe aliquoten sammeln, sanft resuspendieren Zellen mit einer Pipette und 1 ml der Zellsuspension in ein 1,5 ml Röhrchen auf Eis. Rückgabe der Zellkulturen zu einem CO 2 -Inkubator. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Vorsichtig den Überstand aspirieren mit einer Vakuumpumpe. Vorsichtig resuspendieren Pellet in 1 ml TBS. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,3-4,5. </li><li> 24 Stunden nach der Herausforderung 2 Gy γ-Bestrahlung, Ernte und beheben bei = 24 Stunden Probe, wie in Schritt 4.8 beschrieben - 4.10. </li></ol>tle &quot;&gt; 5. Immunfluoreszenz-Markierung mit Anti-γH2AX Antikörper Hinweis: In der Regel 15 - können 30 Proben pro Tag immunofluorescently markiert und mittels Durchflusszytometrie in einem einzigen Durchlauf getestet werden. Um einen genauen Vergleich zwischen den Behandlungsgruppen zu gewährleisten, sind Probe (n) aus jeder Gruppe. Siehe auch Referenz 16 für weitere Details. <ol><li> Bereiten Sie eine markierte Satz von Rohren für die Anzahl der zu verarbeitenden Proben und auf Eis. Verwenden Sie 12 x 75 mm nicht begrenzten Glasröhren. Sterilität wird nicht für diese Arbeit erforderlich. Fügen Sie eine weitere historische Kontrollprobe für die Kennzeichnung mit sekundärem Antikörper nur (&quot;nur 2. Ab&quot;). Verwenden Sie diese historische Kontrollprobe in jeder Durchflusszytometrie innerhalb einer Studie laufen. </li><li> 0,5 ml eiskaltem TBS in jedes Röhrchen. </li><li> Entfernen Sie feste Splenozyten von -20 ° C, Wirbel für 5 Sekunden und übertragen ein 0,5-ml-Aliquot auf vorbereiteten Röhrchen mit TBS. Setzen Sie den Rest der Proben zurück in -20 ° C Lagerung undhalten als Backup-Probe. </li><li> Zentrifuge Splenozyten bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren und sanft resuspendieren Pellet in 1 ml eiskaltem TBS mit 1% FBS </li><li> Zentrifuge Zellen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand abgießen und vorsichtig resuspendieren Pellet in 1 ml TST-Puffer (0,05% Triton X-100, 2% FBS in TBS). Inkubieren für 20 Minuten auf Eis. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand abgießen und vorsichtig resuspendieren Pellet in 200 ul des primären Anti γH2AX Antikörper verdünnt 1: 150 in TST-Puffer. Verwenden Sie 200 ul von TST für die &quot;2nd Ab nur&quot; Kontrollprobe. </li><li> Position Röhrchen auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei einem Winkel von 45 - 60 ° C und Schütteln für 1,5 h bei 300 · g bei RT. </li><li> Während Rohre Inkubieren, bereiten ein ausreichendes Volumen (200 ul / Probe) der Ziege-anti-Maus Sekundär-Antikörper mit Alexa-488 bei einer 1 konjugiert: 200-Verdünnung in TST-Puffer. Hinweis: Alle Arbeiten, die mit Alexa-488konjugierten Antikörper (Schritte 5,10-5,16 unten) sollte unter Schwachlicht-Bedingungen durchgeführt werden und markierten Proben sollten vor Licht durch Umwickeln Rohre in Aluminiumfolie geschützt werden. </li><li> Sobald die 1,5 h Inkubation abgeschlossen ist, wird mit 1 ml eiskaltem TBS, enthaltend 2% FBS in jedes Röhrchen und Zentrifugieren bei 300 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. Den Überstand abgießen und vorsichtig resuspendieren Pellet in 1 ml TBS, enthaltend 2% FBS. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren und vorsichtig resuspendieren Pellet in 200 &amp; mgr; l des sekundären Antikörpers aus Schritt 5.8. </li><li> Der Proben auf einem Schütteltisch 1 h inkubieren, wie in 5.7. </li><li> 1 ml eiskaltem TBS mit 1% FBS. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren und sanft resuspendieren Pellet in 1 ml eiskaltem TBS. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand abgießen und vorsichtig resuspendieren Pellet in 0,5 ml TBS, enthaltend 50 &amp; mgr; g / mlPropidiumiodid. </li><li> Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. </li><li> Analyse Proben auf einem Durchflusszytometer mit gerätespezifischen Protokollen 16. Lesen Sie mindestens 10.000 Zellen pro Probe. </li></ol>

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The authors declare that there are no known competing financial interests.

Die hier vorgestellte Protokoll ist nützlich für die Durchführung von Groß Maus in vivo Studien der Prüfung der genotoxischen Wirkungen von geringen Mengen von verschiedenen chemischen und physikalischen Mitteln, einschließlich ionisierender Strahlung. Unsere einzigartige spezifischen pathogenfreien Tierhaltung mit einer GammaBeam 150 Bestrahlungs ausgestattet und eine 30 Meter lange Bestrahlungshalle ermöglicht die Durchführung lebenslangen Studien mit niedrigen oder sehr niedrigen Dosisrate Bestrahlun...

Signifikante Kontroverse über die möglichen schädlichen Auswirkungen von entweder niedrigen oder sehr niedrigen Dosen ionisierender Strahlung und die Angst vor Strahlung Öffentlichkeit, durch Bilder der Hiroshima und Nagasaki Atombombenabwürfe und seltener AKW Unfälle angetrieben (verschärft durch Massenmedien), hat zu sehr strengen Strahlenschutzverordnung und Normen, die möglicherweise wissenschaftlich begründet sind es nicht. In den letzten drei Jahrzehnten wurden zahlreiche Berichte sowohl das Fehlen von schädlichen und das Vorhandensein von potenziell positiven biologischen Effekte von niedrig dosiertem Strahlen 1-4 induzierte dokumentiert. Der Hauptstrahlungsgesundheitsrisikofaktor ist die Wahrscheinlichkeit von Krebs, basierend auf epidemiologische Studien von Überlebenden der Atombomben Empfangen hohen oder mittleren Dosen von Strahlung geschätzt. Lineare Extrapolation dieser Daten (so genannte lineare-no-Schwelle oder LNT-Modell) verwendet wird, um Risiken von Krebs bei niedrigen Dosen zu schätzen. Allerdings hat dieser Ansatz nicht weltweiten wissenschaftlichen Akzeptanz erhaltenund ist stark umstritten 5. Es ist offensichtlich, dass weitere Studien erforderlich sind, um diese Frage zu klären und möglicherweise Strahlenschutznormen zu verbessern. Solche Studien sollten chronische Behandlungen (beste Angleichung der Umwelt- und Arbeitspositionen), in vivo-Tiermodellen (am besten für die Extrapolation Wirkungen auf die menschliche) und solchen Endpunkten als DNA-Schäden Tarife, DNA-Reparatur und Mutagenese beinhalten. Es ist bekannt, dass die DNA das primäre Ziel für Beschädigung Strahlungseffekte und unvollständige oder fehlerhafte Reparatur kann zum Mutagenese und Krebsentwicklung 6 führen. DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) sind eines der schädlichsten Arten von DNA-Läsionen und können den Zelltod der Tumorgenese und 7 führen. Es ist daher wichtig, dass das Niveau des DSB nach Exposition gegenüber niedrigen Strahlungsdosis und / oder anderen Stressfaktoren, wie zum Beispiel chemische Schadstoffe sicher und genau zu messen. Eine der sensitiven und spezifischen MarkernDNA-DSB phosphoryliert Histon H2AX, genannt γH2AX 8 noch weitere Marker und Methoden wurden vorgeschlagen 9,10. Es wird geschätzt, dass Tausende von H2AX Moleküle in der Nähe eines induzierten DSB, sind bei der Bildung von γH2AX was den Nachweis einzelner DSB durch Immunmarkierung mit einem Anti-Antikörper γH2AX und Fluoreszenzmikroskopie 11 beteiligt. Die Antwort ist sehr schnell und erreichte ihr Maximum zwischen 30 und 60 min. Beweise vorliegen, dass γH2AX erleichtert Reparatur von DNA-DSB durch die Gewinnung von anderen Reparaturfaktoren zu den Orten der Brüche und durch Modifikation der Chromatinstruktur zu gebrochenen DNA-Enden zu verankern und den Zugang für andere Reparaturproteine ​​(in 12 überprüft). Nach Abschluss der Reparatur von DNA-DSB, γH2AX wird dephosphoryliert und / oder durchläuft Abbau und neu synthetisierten H2AX Moleküle zu ersetzen γH2AX in den betroffenen Bereichen des Chromatins 10. Überwachung Bildung und Verlust der γH2AX können,liefern daher eine genaue Schätzung der DNA-DSB-Reparatur-Kinetik. Dieser Ansatz wurde verwendet, um die Reparatur von DSB in verschiedenen menschlichen Tumorzelllinien mit hohen Dosen von Strahlung und deren Geschwindigkeit und Rest DSB Niveaus bestrahlt wurde gezeigt, dass mit radiosensitivity 13-15 korrelieren studieren. Modifizierten wir dieses experimentellen Ansatzes und wendeten sie auf eine in vivo-Maus-Studie die Wirkung von niedrigen Dosen von chronischen γ- und β-Bestrahlung auf DNA-DSB-Reparatur-Ebenen und (1) zu untersuchen. Erstens, zeigen wir ein Verfahren, um einen langfristigen chronischen Exposition von Mäusen durchgeführt, um β-Strahlung entweder durch Tritium emittierte (Wasserstoff-3) in Form von tritiiertem Wasser (HTO) oder organisch gebundenem Tritium (OBT) gelöst im Trinkwasser . Die beiden Formen werden voraussichtlich zu akkumulieren und / oder anders im Körper und somit zu verteilen, erzeugen unterschiedliche biologische Wirkungen. Beide Formen sind potentielle Gefahren in der Nuklearindustrie. Diese Behandlungdurch chronische Einwirkung von γ-Strahlung in einer äquivalenten Dosis Rate parallel um einen korrekten Vergleich der beiden Strahlungsarten, die entscheidend für die Bewertung der relativen biologischen Wirksamkeit zu ermöglichen. Beta-Strahlung von Elektronen zusammengesetzt ist, so dass es sehr verschieden von der γ-Strahlung, Hochenergiephotonen. Aufgrund dieses Unterschieds Β-Strahlung stellt hauptsächlich Innen Gefahr für die Gesundheit und können unterschiedliche biologische Wirkungen im Vergleich zu γ-Strahlung zu erzeugen. Diese Komplikation zu erheblichen Kontroversen über die Regulierung der Einwirkung von β-Strahlung, die von HTO emittiert. So Regulierungsebenen HTO im Trinkwasser für die Öffentlichkeit variieren von 100 Bq / L in Europa zu 75.000 Bq / L in Australien. Es ist daher wichtig für die biologische Wirkung von HTO um äquivalente Dosen von γ-Strahlung zu vergleichen. Zweitens, die Rate der DNA-DSB wird in isolierten Splenozyten nach Beendigung der chronischen Exposition mit immunofluorescently markierten γH2AX erkennen gemessendurch Durchflusszytometrie ed. Dies erlaubt die Bewertung des Ausmaßes der DNA-Schädigung durch die in vivo Exposition zugefügt. Allerdings ist es sinnvoll, zu erwarten, dass solche eine niedrige Belastung möglicherweise nicht produzieren keine nachweisbaren Raten von DNA-DSB; statt, einige versteckte Änderungen / Reaktionen zu erwarten, dass die Fähigkeit der Zellen auf DNA-Schäden reparieren beeinflussen würde. Diese Veränderungen, falls vorhanden, kann entweder stimulierend (Herstellung eines nützlichen Effekt) oder inhibierende (Herstellung eines schädlichen Effekt). Das vorgeschlagene Protokoll erlaubt, bei der diese Änderungen durch die Herausforderung der entnommenen Milzzellen mit einer hohen Dosis an Strahlung, die eine erhebliche Menge an Schaden entsteht (zB 2 Gy Herstellung etwa 50 DNA-DSB pro Zelle oder eine. 3 - 5-fachen Zunahme der Gesamt γH2AX Ebene) . Anschließend wird die Bildung und den Verlust der γH2AX, was die Initiierung und Abschluss der DSB-Reparatur wird mittels Durchflusszytometrie kontrolliert. Auf diese Weise kann nicht nur die basale und Behandlung induzierten Niveaus von DNA-DSB gemessen werden, sondernauch ihre potenziellen Auswirkungen auf die Fähigkeit der Zellen zu reagieren und Reparatur DNA-Schäden, die durch viel höhere Stressniveaus induziert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HTO: tritiated water, [3H]</td>
			<td>locally obtained from a nuclear reactor&#160;</td>
			<td></td>
			<td>stock activity 3.7 GBq/mL;&#160; can be substituted with HTO from Perkin Elmer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET348005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET004005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET323005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tritiated water, [3H] (HTO)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET001B005MC</td>
			<td>substitute for HTO of local origin&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GammaBeam 150 irradiator</td>
			<td>Atomic Energy of Canada Limited</td>
			<td>locally manufactured</td>
			<td>can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tween-20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3025501</td>
			<td>Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1051-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-gH2AX antibody, clone JBW301</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody</td>
			<td>Life Technologies (formerly Invitrogen)</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4864-10ML</td>
			<td>1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P006-EAAN</td>
			<td>500ml bottles Absolute Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2682550</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td>sterile polypropylene centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td>P110403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 x 75 mm mL uncapped glass tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K60B1496126</td>
			<td>disposable borosilicate glass tubes with plain end</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA15708-120</td>
			<td>nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14068-12</td>
			<td>Wagner scissors 12cm sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps, straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11008-13</td>
			<td>Semken forceps 13cm, straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps, curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11003-12</td>
			<td>Narrow Pattern forceps 12 cm, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA25382-100</td>
			<td>BD Falcon tissue culture dish 60x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainers, 70 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td>Falcon cell strainers 50/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200mL of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS recipe: to make 10X Stock,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30g TRIS HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-1KG</td>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>88g NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Sodium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2g KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Potassium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissolve in 1L of deionized water, adjust pH to 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring dna damage and repair in mouse splenocytes after chronic in vivo exposure to very low doses of beta- and gamma-radiation

Niedrig dosierte Strahlenbelastung kann eine Vielzahl von biologischen Wirkungen, die in Menge und Qualität von den durch hohe Strahlendosen hergestellt Effekte unterschiedlich sind zu produzieren. Auf Fragen zu Umwelt-, Arbeits- und Gesundheitssicherheit in der richtigen und wissenschaftlich fundierte Weise bezogen in hohem Maße von der Fähigkeit, die biologischen Effekte von niedrig dosiertem Schadstoffe wie ionisierende Strahlung und chemische Substanzen genau zu messen. DNA Schädigung und Reparatur sind die wichtigsten Frühindikatoren für Gesundheitsrisiken aufgrund ihrer potentiellen langfristigen Folgen, wie zum Beispiel Krebs. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Auswirkungen von chronischen in vivo Exposition gegenüber niedrigen Dosen von γ- und β-Strahlung auf DNA-Schädigung und Reparatur in Mäusemilzzellen studieren. Verwendung eines allgemein akzeptierten Marker der DNA-Doppelstrangbrüche, phosphoryliert Histon H2AX genannt γH2AX zeigen wir, wie es verwendet werden kann, um nicht nur das Niveau der DNA-Schädigung zu beurteilen, sondern auch Änderungenin der DNA-Reparatur-Kapazität möglicherweise durch geringe Dosis in vivo Aufnahmen produziert. Durchflusszytometrie ermöglicht eine schnelle, genaue und zuverlässige Messung der immunofluorescently markierten γH2AX in einer großen Anzahl von Proben. DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur kann, indem extrahierte Milzzellen zu einer Herausforderung Dosis von 2 Gy, eine ausreichende Anzahl von DNA-Brüche zu erzeugen, um die Reparatur auslösen und durch Messung der induzierten (1 h nach der Bestrahlung) und Rest DNA-Schäden (ausgewertet werden 24 Stunden nach der Bestrahlung). Rest-DNA Schaden würde auf unvollständige Reparatur und die Gefahr von Langzeit genomische Instabilität und Krebs. In Kombination mit anderen Assays und Endpunkte, die sich leicht in solchen Untersuchungen in vivo (beispielsweise Chromosomenaberrationen, Mikronuclei Frequenzen im Knochenmark von Retikulozyten, Genexpression, etc.) gemessen werden können, ermöglicht diese Vorgehensweise eine genaue und Kontext Evaluierung der biologischen Wirkungen von Stressoren niedrigen Niveau.

Abbildung 2 zeigt Beispiele für die Durchflusszytometrie Graphen für Splenozyten erwartet unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Zellen werden zunächst auf Basis des &lt;elektronische Lautstärke-Seitenstreuung&gt; Streudiagramm gated (2A und 2D; elektronische Band ist gleichbedeutend mit Vorwärtsstreuung). FL3 / Propidiumiodid Histogramme (2B und 2E) bestätigen normalen Zellzyklus-Verteilung. Bedeuten ?...

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Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Mess DNA-Schädigung und -Reparatur in Maus-Splenozyten nach chronischer<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Exposition gegenüber sehr niedrigen Dosen von Beta- und Gamma-Strahlung

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

measuring-dna-damage-repair-mouse-splenocytes-after-chronic-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

11.0K Aufrufe.  Canadian Nuclear Laboratories. A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented. 

Serie: Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

Imaging Mismatch Reparatur und zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden in Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Forschung

Biologie

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

Visualisierung der MG53-vermittelte Cell Membrane Repair mit In vivo Und In-vitro- Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

gDNA Enrichment durch eine Transposase-basierte Technologie für NGS-Analyse der gesamten Sequenz von<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt; Und 9 Gene in der DNA-Reparatur beteiligt Schäden

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the different aspects of visual, cross-modal and developmental plasticity along the mammalian visual system1-4.
Here, we demonstrate an elegant and straightforward technique for the removal of one or both eyes in the mouse, which is validated in mice of 20 days old up to adults. Briefly, a disinfected curved forceps is used to clamp the optic nerve behind the eye. Subsequently, circular movements are performed to constrict the optic nerve and remove the eyeball. The advantages of this technique are high reproducibility, minimal to no bleeding, rapid post-operative recovery and a very low learning threshold for the experimenter. Hence, a large amount of animals can be manipulated and processed with minimal amount of effort. The nature of the technique may induce slight damage to the retina during the procedure. This side effect makes this method less suitable as compared to Mahajan et al. (2011)5 if the goal is to collect and analyze retinal tissue. Also, our method is limited to post-eye opening ages (mouse: P10 - 13 onwards) since the eyeball needs to be displaced from the socket without removing the eyelids. The in vivo enucleation technique described in this manuscript has recently been successfully applied with minor modifications in rats and appears useful to study the afferent visual pathway of rodents in general.

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

The removal of eyes, also called enucleation, provides a useful strategy to study aspects of visual, cross-modal, and developmental plasticity along the mammalian visual system since it induces irreversible partial (monocular) or complete (binocular) vision loss. Here we describe a highly reproducible and straightforward approach to perform in vivo enucleation.

Ein hoch reproduzierbare und einfache Methode, um Führen<em&gt; In Vivo</em&gt; Ocular Enukleation in der Maus nach Augenöffnung

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Mess Glutathion-induzierte Fütterung Antwort in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Erkennung und Analyse von DNA-Schädigungen in Maus-Skelettmuskel<em&gt; In-situ-</em&gt; Verwenden der TUNEL-Methode

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

In - vivo - Alkaline Comet Assay und enzymmodifizierten Alkaline Comet Assay zur Messung von DNA - Strangbrüchen und oxidative DNA - Schäden in der Rattenleber

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Messung der Steifigkeit von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Aorten Mit Rasterkraftmikroskopie

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles

Nanomaterial exposure can cause replication stress and genomic instability in cells. The degree of instability depends on the chemistry, size, and concentration of the nanomaterials, the time of exposure, and the exposed cell type. Several established methods have been used to elucidate how endogenous/exogenous agents impact global replication. However, replicon-level assays, such as the DNA fiber assay, are imperative to understand how these agents influence replication initiation, terminations, and replication fork progression. Knowing this allows one to understand better how nanomaterials increase the chances of mutation fixation and genomic instability. We used RAW 264.7 macrophages as model cells to study the replication dynamics under graphene oxide nanoparticle exposure. Here, we demonstrate the basic protocol for the DNA fiber assay, which includes pulse labeling with nucleotide analogs, cell lysis, spreading the pulse-labeled DNA fibers onto slides, fluorescent immunostaining of the nucleotide analogs within the DNA fibers, imaging of the replication intermediates within the DNA fibers using confocal microscopy, and replication intermediate analysis utilizing a computer-assisted scoring and analysis (CASA) software.

The methodology assists in the analysis of variation in DNA replication dynamics in the presence of nanoparticles. Different methodologies can be adopted based on the cytotoxicity level of the material of interest. In addition, a description of the image analysis is provided to help in DNA fiber analysis.