The authors would like to acknowledge the contribution of our colleagues Sandrine Roch-Lefevre and Eric Gregoire of the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France). This work was supported by the Government of Canada Science and Technology program at Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), the CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), the Canadian Nuclear Safety Commission and by the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France).

Toutes les procédures de manutention et de traitement souris doivent se conformer aux règles édictées par les programmes de l&#39;Assemblée législative et / ou soins des animaux et approuvées par un comité de protection des animaux. Toutes les méthodes décrites dans le présent protocole ont été effectuées en conformité avec les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux, avec l&#39;approbation du comité de protection des animaux. ATTENTION: Tous les travaux avec la radioactivité (y compris, mais non limité à la manipulation de tritium, γ-irradiation externe, la manipulation des tissus animaux radioactifs, déchets de litière) devrait adhérer aux règles énoncées par les autorités de l&#39;Assemblée législative et / ou de radioprotection et être effectuée par des personnes autorisées le personnel dans un laboratoire et / ou des installations certifiées. 1. animale Travail <ol><li> Groupement animal <ol><li> Si les souris arrivent d&#39;une organisation externe, acclimater les animaux pendant au moins 10 jours dans l&#39;animalerie. Si l&#39;étude comprend plusieurs groupes de traitement, veiller à ce que le fournisseur des animaux peut envoyer all les animaux comme un seul lot. </li><li> Allouer au hasard les souris à des groupes de 10 souris par groupe de traitement. Si vous utilisez des souris mâles de la souche C57BL / 6, ont le fournisseur des animaux pré-organiser la randomisation de très jeunes C57BL / 6 mâles dans leur établissement pour atténuer les problèmes d&#39;agressivité. </li></ol></li><li> Exposition chronique de souris à β-Internal Radiation <ol><li> Préparer des concentrations de travail de tritium (10 kBq / L et 1 MBq / L) dans l&#39;eau potable de la souris en diluant le stock initial de HTO et OBT (un mélange de proline tritiée, l&#39;alanine et la glycine acides aminés) des solutions. </li><li> Validate les concentrations finales de tritium dans l&#39;eau de boisson par mesure de la radioactivité en utilisant un compteur à scintillation liquide. Ajuster la concentration, si nécessaire. </li><li> Traiter les animaux pendant un mois en fournissant un accès ad libitum à l&#39;eau de tritium. Si l&#39;eau de traitement est faible au cours de la période de deux semaines, ajouter plus d&#39;eau. Sinon, changer bouteilles à deux semaines. </li><li> Traiter imposture irradié commandesouris identique. Gardez-les dans une pièce séparée «propre» ou sur une grille séparée &quot;propre&quot; sous pression d&#39;air positive pour éviter la contamination croisée tritium dans l&#39;air. </li></ol></li><li> Exposition chronique de souris externe à γ-radiations Remarque: γ-irradiation installation / équipement varie en fonction de l&#39;emplacement. </li><li> En utilisant des méthodes de dosimétrie disponibles, déterminer les distances à partir d&#39;une source de rayonnement γ qui ont des champs de rayonnement produisant les doses désirées. Assurer l&#39;homogénéité de champs de rayonnement dans les zones couvrant les cages pour animaux. Remarque: 1,7 Gy / h est équivalente à un taux de dose produite par une MBq / L de tritium dans le corps. </li><li> Exposer les souris en plaçant les cages de souris à des distances déterminées à l&#39;étape 1.3.1 pour un mois. Réduire interruption quotidienne de γ-irradiation à 30 min. Utilisez dosimètres à thermoluminescence pour mesurer des doses totales absorbées. </li></ol> 2. sacrifices et d&#39;échantillonnage <ol&gt; <li> Élaborer des instruments chirurgicaux stériles, 60 mm boîtes de Pétri avec insérées crépines cellulaires 70 microns, 15 ml et tubes de 1,5 ml, milieu RPMI supplémenté avec 5% de sérum fœtal bovin (FBS) et le lieu tout dans une enceinte de sécurité biologique. Assurer la stérilité du travail est cruciale. </li><li> Distribuer 5 ml de milieu RPMI dans chaque boîte de Pétri de 60 mm. </li><li> Sacrifiez souris en utilisant une méthode approuvée par le comité de protection des animaux. La dislocation cervicale est un bon choix pour le travail de splénocyte décrites dans ce protocole. Toutefois, si des échantillons de sang pour les autres essais (par exemple, pour le mFISH, le micronoyau de bloc de cytochalasine ou d&#39;autres dosages de genetoxicity commune) sont nécessaires, utiliser ponction intra-cardiaque après l&#39;anesthésie à l&#39;isoflurane. </li><li> Placez l&#39;animal en décubitus dorsal, la tête vers le loin de vous. Vaporiser la souris vers le bas avec 70% d&#39;éthanol. En utilisant des pinces, saisir la peau antérieurement à l&#39;ouverture de l&#39;urètre et de faire une petite incision avec des ciseaux dans la région périnéale. <ol&gt; <li> De cette incision, couper le long de la ligne médiane ventrale de la cavité de la poitrine, en faisant attention à ne couper la peau et non la paroi musculaire dessous. Disséquer la peau loin de la ligne médiane. </li><li> Saisir la paroi abdominale avec une pince et couper le long de l&#39;axe médian de la paroi musculaire à ouvrir la cavité abdominale. </li></ol></li><li> Exciser la rate par une légère saisissant avec des pinces stériles et en tirant doucement sur elle, tout en réduisant simultanément loin le tissu conjonctif avec des ciseaux. </li><li> Coupez un petit morceau de la rate (environ 1/10 de la rate) et placer dans un tube de 1,5 ml. Aligner congeler dans de l&#39;azote liquide pour un stockage ultérieur à -80 ° C pour des analyses supplémentaires. </li><li> Passer le reste de la rate dans un tamis cellulaire à l&#39;intérieur d&#39;une boîte de Petri de 60 mm avec 5 ml de milieu RPMI pré-distribué. </li><li> Passez à la prochaine souris. Remarque: Extrait rates peuvent être conservés dans des boîtes de 60 mm avec les médias (pour un maximum de 2 heures), tandis que le reste des souris sont sacrificéd. En fonction du nombre de participants, entre 5 et 15 souris peuvent être traitées en une seule journée. </li></ol> 3. Préparation de cultures splénocytes <ol><li> Homogénéiser la rate en hachant l&#39;intérieur d&#39;un tamis cellulaire avec des pinces stériles avec une extrémité recourbée. </li><li> Retirer le filtre de la cellule et de recueillir la suspension de cellules filtré à partir de la boîte de 60 mm dans un tube de 15 ml. </li><li> Rincer la crépine de cellules avec 5 ml de milieu pour collecter le reste des cellules. </li><li> Tubes à centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Décanter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 10 ml de RPMI. </li><li> Tubes à centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Décanter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 5 ml de RPMI. </li><li> Transfert 4 ml de suspension de cellules dans un ballon de culture de 25 ml de tissu et la déplacer dans un incubateur à CO2 (37 ° C, 5% de CO2, 80% d&#39;humidité) </li></ol> 4. Remettre en question l&#39;irradiation et de fixation <ol><li> Transférer lereste 1 ml de suspension cellulaire de l&#39;étape 3.8 dans un tube de 1,5 ml sur la glace et centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. dommages à l&#39;ADN mesurée dans cet échantillon représentera les dommages induite par le traitement et t = 0 point de données pour la construction d&#39;une courbe de réparation d&#39;ADN. </li><li> Aspirer soigneusement le surnageant en utilisant une pompe à vide. Doucement remettre en suspension le culot dans 1 ml de tampon TBS (Tris 20 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, KCl 2,7 mM). </li><li> Tubes à centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer soigneusement le surnageant en utilisant une pompe à vide. Doucement remettre en suspension le culot dans 300 pi de TBS. </li><li> Tout en mélangeant au vortex à faible vitesse, ajouter 700 ul de -20 ° C 100% d&#39;éthanol. Fermer le couvercle et retourner plusieurs fois pour mélanger. </li><li> Conserver les échantillons à -20 ° C. Splénocytes fixes dans l&#39;éthanol peuvent être conservés à -20 ° C pendant au moins 12 mois sans perte notable dans le signal γH2AX. </li><li> Irradier les cultures de splénocytes de l&#39;étape 3.8 avec un γ-rad difficile<html> dose de iation de 2 Gy à un débit de dose ≥ 200 mGy / min à l&#39;aide disponible dispositif d&#39;irradiation. Remarque: Le but de cette irradiation est d&#39;induire l&#39;ADN ORD pour contester la machinerie de réparation. Les rayons X peuvent également être utilisés à cette fin. </li><li> Remettre immédiatement les cultures à un incubateur à CO2. </li><li> 1 heure après la difficile irradiation 2 Gy, retirez les cultures de l&#39;incubateur à une enceinte de sécurité biologique. Pour prélever un échantillon aliquote représentant, doucement remettre en suspension les cellules à l&#39;aide d&#39;une pipette et le transfert de 1 ml de la suspension cellulaire à un tube de 1,5 ml sur de la glace. Remettre les cultures de cellules à un incubateur à CO 2. </li><li> Tubes à centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer soigneusement le surnageant en utilisant une pompe à vide. Doucement remettre en suspension le culot dans 1 ml de TBS. </li><li> Répétez les étapes 4.3 à 4.5. </li><li> 24 heures après la 2 Gy γ-irradiation difficile, la récolte et la fixer à 24 heures = échantillon tel que décrit à l&#39;étape 4/8 à 4/10. </li></ol>TLE &quot;&gt; 5. immunofluorescence marquage avec Anti-γH2AX Anticorps Remarque: En règle générale, 15 - 30 échantillons par jour peuvent être immunofluorescence étiquetés et analysés par cytométrie de flux en un seul passage. Pour assurer une comparaison exacte entre les groupes de traitement, y compris l&#39;échantillon (s) de chaque groupe. Voir aussi la référence 16 pour plus de détails. <ol><li> Préparer un ensemble marqué de tubes pour le nombre d&#39;échantillons à traiter et les placer sur la glace. Utilisez 12 x 75 mm tubes en verre non plafonnés. La stérilité est pas nécessaire pour ce travail. Inclure un échantillon de contrôle historiques supplémentaires pour le marquage avec l&#39;anticorps secondaire seulement (&quot;Ab 2e seulement&quot;). Utilisez cet exemple de commande historique dans tous les cytométrie de flux de fonctionner au sein d&#39;une étude. </li><li> Ajouter 0,5 ml de glace-froid SCT à chaque tube. </li><li> Retirer splénocytes fixes de -20 ° C, vortex pendant 5 secondes et de transférer une aliquote de 0,5 ml à tubes préparés avec le SCT. Placez le reste des échantillons de nouveau dans -20 ° C stockage etgarder comme un échantillon de sauvegarde. </li><li> splénocytes de centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le surnageant et remettre en suspension doucement le culot dans 1 ml de glace-froid du TBS contenant 1% de FBS </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le surnageant et remettre en suspension doucement le culot dans 1 ml de tampon TST (0,05% de Triton X-100, 2% de FBS dans du TBS). Incuber pendant 20 min sur de la glace. </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le surnageant et remettre en suspension doucement le culot dans 200 pl d&#39;anticorps anti-γH2AX primaire dilué 1: 150 dans du tampon TST. Utilisez 200 pi de TST pour le &quot;2e Ab seulement&quot; échantillon de contrôle. </li><li> tubes de position sur un agitateur rotatif à un angle de 45 - 60 ° et agiter pendant 1,5 h à 300 g à RT. </li><li> Bien que les tubes sont en incubation, préparer un volume suffisant (200 ul / échantillon) de l&#39;anticorps secondaire anti-souris de chèvre conjugué à Alexa-488 à une dilution de 1: 200 dans du tampon TST. Remarque: Tous les travaux impliquant Alexa-488anticorps conjugué (étapes 5.10 à 5.16 ci-dessous) doit être effectuée dans des conditions de faible luminosité et des échantillons étiquetés doit être protégé de la lumière en enveloppant les tubes dans une feuille d&#39;aluminium. </li><li> Une fois que le 1,5 heures d&#39;incubation est terminée, ajouter 1 ml de TBS glacée contenant 2% de FBS à chaque tube et centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le surnageant et remettre en suspension doucement le culot dans 1 ml de TBS contenant 2% de FBS. </li><li> Centrifugeuse à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le surnageant et remettre en suspension doucement le culot dans 200 pl de la solution d&#39;anticorps secondaire de l&#39;étape 5.8. </li><li> Incuber les échantillons sur une plate-forme agitation pendant 1 h comme dans l&#39;étape 5.7. </li><li> Ajouter 1 ml de glace-froid du TBS contenant 1% de FBS. </li><li> Centrifugeuse à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le surnageant et remettre en suspension doucement culot dans 1 ml de glace-froid SCT. </li><li> Centrifugeuse à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le surnageant et remettre en suspension doucement le culot dans 0,5 ml de TBS contenant 50 ug / mliodure de propidium. </li><li> Incuber pendant 5 min à température ambiante à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Analyser les échantillons sur un cytomètre de flux en utilisant des protocoles spécifiques à l&#39;instrument 16. Lisez au moins 10 000 cellules par échantillon. </li></ol>

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The authors declare that there are no known competing financial interests.

Le protocole présenté dans ce document est utile pour la réalisation à grande échelle de la souris dans les études in vivo portant sur ​​les effets génotoxiques des faibles niveaux de divers agents chimiques et physiques, y compris les rayonnements ionisants. Notre installation unique et spécifique des animaux exempts de pathogènes équipé d&#39;un irradiateur GammaBeam 150 et une salle d&#39;irradiation longue de 30 mètres permet la réalisation d&#39;études long de la vie impliquant d...

Une importante controverse sur les effets nocifs potentiels de doses soit faibles ou très faibles de rayonnement et de la peur de publique de rayonnement, tirée par les images des bombardements atomiques d&#39;Hiroshima et de Nagasaki et de rares accidents de centrales nucléaires ionisants (exacerbée par les médias de masse), a conduit à de très la réglementation et les normes qui sont potentiellement pas scientifiquement justifiée radioprotection stricte. Au cours des trois dernières décennies, de nombreux rapports ont documenté à la fois l&#39;absence de nuisibles et la présence d&#39;effets biologiques potentiellement bénéfiques induits par une faible dose rayonnement 1-4. Le principal facteur de risque pour la santé de rayonnement est la probabilité de cancer, estimé sur la base des études épidémiologiques des survivants de la bombe atomique recevant des doses élevées ou moyennes de rayonnement. Extrapolation linéaire de ces données (dites linéaire sans seuil ou modèle LNT) est utilisé pour estimer les risques de cancer à faibles doses. Cependant, cette approche n&#39;a pas reçu l&#39;acceptation scientifique mondialet est fortement débattue 5. Il est évident que d&#39;autres études sont nécessaires pour clarifier cette question et peut-être améliorer les normes de radioprotection. Ces études devraient impliquer des traitements chroniques (meilleur rapprochement des expositions environnementales et professionnelles), dans des modèles animaux in vivo (meilleure pour les effets pour la santé humaine) et en extrapolant ces points extrêmes que les taux de lésions de l&#39;ADN, réparation de l&#39;ADN et la mutagénèse. Il est connu que l&#39;ADN est la cible principale pour endommager les effets des rayonnements et incomplètes ou mal-réparation peut conduire à la mutagenèse et le développement du cancer 6. Cassures double-brin d&#39;ADN (ORD) sont l&#39;un des types les plus délétères de lésions de l&#39;ADN et peuvent conduire à la mort cellulaire et la tumorigenèse 7. Il est donc important de pouvoir mesurer de manière fiable et précise le niveau de l&#39;ORD après l&#39;exposition au rayonnement à faible dose et / ou d&#39;autres facteurs de stress, tels que les polluants chimiques. L&#39;un des marqueurs les plus sensibles et spécifiquesde l&#39;ADN DSB histone H2AX phosphorylée est appelé γH2AX 8, mais d&#39;autres marqueurs et procédés ont été suggérés 9,10. On estime que des milliers de molécules d&#39;H2AX, dans le voisinage d&#39;un ORD induite, sont impliqués dans la formation de γH2AX permettant la détection de l&#39;individu ORD par marquage immunofluorescent avec un anticorps et la microscopie à fluorescence anti-γH2AX 11. La réaction est très rapide, atteignant son maximum entre 30 et 60 min. Il existe des preuves que γH2AX facilite la réparation de l&#39;ADN de l&#39;ORD en attirant d&#39;autres facteurs de réparation des sites de pauses et en modifiant la structure de la chromatine pour ancrer extrémités d&#39;ADN cassées et fournir un accès à d&#39;autres protéines de réparation (12) examinés dans. À la fin de la réparation de l&#39;ADN de l&#39;ORD, γH2AX se dé-phosphorylée et / ou subit une dégradation, et des molécules d&#39;H2AX nouvellement synthétisées remplacer γH2AX dans les zones touchées de la chromatine 10. La formation et la perte de γH2AX surveillance peut,par conséquent, fournir une estimation précise de l&#39;ADN de l&#39;ORD cinétique de réparation. Cette approche a été utilisée pour étudier la réparation de l&#39;ORD dans diverses lignées cellulaires tumorales humaines irradiées avec des doses élevées de niveaux résiduels ORD rayonnement et son taux et ont été corrélée à la radiosensibilité 13-15. Nous avons modifié cette approche expérimentale et appliquée à une étude in vivo de la souris pour examiner les effets des faibles doses de γ- chronique et β-irradiation sur les niveaux d&#39;ADN de l&#39;ORD et la réparation (Figure 1). Tout d&#39;abord, nous démontrons une méthode pour effectuer une exposition chronique à long terme des souris à β-rayonnement soit émis par le tritium (hydrogène 3) sous la forme d&#39;eau tritiée (HTO) ou que le tritium lié organiquement (OBT) dissous dans l&#39;eau potable . Les deux formes sont attendus pour accumuler et / ou distribuer différemment dans le corps et, par conséquent, de produire différents effets biologiques. Les deux formes sont les dangers potentiels dans l&#39;industrie nucléaire. Ce traitementva de pair avec une exposition chronique à γ-rayonnement à un débit de dose équivalente pour permettre une comparaison correcte des deux types de rayonnement, qui est crucial pour l&#39;évaluation de leur efficacité biologique relative. Le bêta-rayonnement est constitué d&#39;électrons, ce qui rend très différente de la γ-rayonnement, les photons de haute énergie. En raison de cette différence, Β-rayonnement représente danger pour la santé essentiellement interne et peut produire des effets biologiques différents par rapport à γ-rayonnement. Cette complication a donné lieu à des controverses importantes sur la réglementation de l&#39;exposition à la β-rayonnement émis par HTO. Ainsi, les niveaux réglementaires de HTO dans l&#39;eau potable pour le public varient de 100 Bq / L en Europe à 75.000 Bq / L en Australie. Il est donc important de comparer les effets biologiques de HTO à des doses équivalentes de γ-irradiation. Deuxièmement, le taux de l&#39;ADN de l&#39;ORD est mesurée dans les splénocytes isolés lors de l&#39;achèvement des expositions chroniques à l&#39;aide immunofluorescence marqué γH2AX détectered par cytométrie de flux. Ceci permet l&#39;évaluation de l&#39;importance des dégâts infligés par les ADN exposition in vivo. Cependant, il est raisonnable de s&#39;attendre à ce que de telles expositions de bas niveau ne peuvent pas produire des taux détectables d&#39;ADN ORD; à la place, quelques changements cachés / réponses peuvent être attendus qui pourraient affecter la capacité des cellules à réparer les dommages de l&#39;ADN. Ces changements, si trouvé, peuvent être soit de stimulation (produisant un effet bénéfique) ou inhibiteur (produisant un effet délétère). Le protocole proposé permet de révéler de tels changements en contestant les splénocytes extraites avec une forte dose de rayonnement qui produit une quantité importante de dommages (par exemple, 2 Gy produisant environ 50 ADN ORD par cellule ou d&#39;un 3 -. Augmentation de 5 fois dans le niveau de γH2AX totale) . Par la suite, la formation et la perte de γH2AX, reflétant l&#39;initiation et l&#39;achèvement de la réparation DSB, est surveillée par cytométrie de flux. De cette façon, non seulement de base et des niveaux d&#39;ADN ORD induites par le traitement peuvent être mesurés, maisaussi son effet potentiel sur la capacité des cellules à répondre et les dommages de réparation de l&#39;ADN induite par des taux de stress beaucoup plus élevés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HTO: tritiated water, [3H]</td>
			<td>locally obtained from a nuclear reactor&#160;</td>
			<td></td>
			<td>stock activity 3.7 GBq/mL;&#160; can be substituted with HTO from Perkin Elmer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET348005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET004005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET323005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tritiated water, [3H] (HTO)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET001B005MC</td>
			<td>substitute for HTO of local origin&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GammaBeam 150 irradiator</td>
			<td>Atomic Energy of Canada Limited</td>
			<td>locally manufactured</td>
			<td>can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tween-20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3025501</td>
			<td>Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1051-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-gH2AX antibody, clone JBW301</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody</td>
			<td>Life Technologies (formerly Invitrogen)</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4864-10ML</td>
			<td>1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P006-EAAN</td>
			<td>500ml bottles Absolute Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2682550</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td>sterile polypropylene centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td>P110403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 x 75 mm mL uncapped glass tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K60B1496126</td>
			<td>disposable borosilicate glass tubes with plain end</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA15708-120</td>
			<td>nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14068-12</td>
			<td>Wagner scissors 12cm sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps, straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11008-13</td>
			<td>Semken forceps 13cm, straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps, curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11003-12</td>
			<td>Narrow Pattern forceps 12 cm, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA25382-100</td>
			<td>BD Falcon tissue culture dish 60x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainers, 70 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td>Falcon cell strainers 50/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200mL of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS recipe: to make 10X Stock,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30g TRIS HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-1KG</td>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>88g NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Sodium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2g KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Potassium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissolve in 1L of deionized water, adjust pH to 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring dna damage and repair in mouse splenocytes after chronic in vivo exposure to very low doses of beta- and gamma-radiation

L&#39;exposition aux rayonnements à faible dose peut produire une variété d&#39;effets biologiques qui sont différentes en quantité et de la qualité des effets produits par de fortes doses de rayonnement. Aborder les questions relatives à la sécurité de la santé environnementale, professionnelle et publique d&#39;une manière appropriée et justifiée scientifiquement repose largement sur la capacité de mesurer avec précision les effets biologiques des polluants à faible dose, tels que des substances chimiques et des rayonnements ionisants. dommages à l&#39;ADN et la réparation sont les plus importants indicateurs précoces de risques pour la santé en raison de leurs conséquences à long terme potentiels, tels que le cancer. Ici, nous décrivons un protocole pour étudier l&#39;effet de l&#39;exposition in vivo chronique à de faibles doses de γ- et β-rayonnement sur ​​les dommages de l&#39;ADN et la réparation dans les cellules de rate de souris. En utilisant un marqueur couramment acceptée de cassures de l&#39;ADN double-brin, phosphorylée H2AX histone appelé γH2AX, nous démontrons comment il peut être utilisé pour évaluer non seulement les niveaux de dommages à l&#39;ADN, mais change ausside la capacité de réparation de l&#39;ADN potentiellement produite par une faible dose de l&#39;exposition in vivo. La cytométrie en flux permet une mesure rapide, précise et fiable des immunofluorescence marqué γH2AX dans un grand nombre d&#39;échantillons. ADN double-brin de réparation des cassures peut être évaluée en exposant splénocytes extraites à une dose stimulante de 2 Gy pour produire un nombre suffisant de cassures de l&#39;ADN pour déclencher la réparation et en mesurant l&#39;induit (1 h post-irradiation) et les dommages de l&#39;ADN résiduel (24 heures post-irradiation). Lésions de l&#39;ADN résiduel serait indicative de réparation incomplète et le risque d&#39;instabilité génomique à long terme et le cancer. Combiné avec d&#39;autres analyses et points d&#39;extrémité qui peuvent être facilement mesurés dans cette étude in vivo (par exemple, des aberrations chromosomiques, des fréquences de micronoyaux dans les réticulocytes de la moelle osseuse, l&#39;expression des gènes, etc.), cette approche permet une évaluation précise et contextuelle des effets biologiques de facteurs de stress de bas niveau.

La figure 2 montre des exemples de cytométrie de flux graphiques attendues pour splénocytes préparés en utilisant le procédé décrit ici. Les cellules sont d&#39;abord déclenchés sur la base du &lt;électronique scatter volume côté&gt; nuage de points (figure 2A et 2D; volume électronique est équivalente à diffusion vers l&#39;avant). FL3 / propidium histogrammes iode (Figure 2B et 2E) confirment la distribution du cycle ce...

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Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Mesure de dommages et réparation de l&#39;ADN dans les splénocytes de souris Après chronique<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;exposition à de très faibles doses de bêta et gamma Rayonnement

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

11.0K vues.  Canadian Nuclear Laboratories. A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented. 

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Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

Mismatch repair imagerie et les réponses cellulaires aux dommages de l&#39;ADN dans<emBacillus subtilis></em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Recherche

Biologie

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

L&#39;imagerie in vivo et des traitements thérapeutiques dans un modèle de souris orthotopique de cancer des ovaires

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

Visualisation de MG53 médiation réparation de la membrane cellulaire utilisant In vivo Et In vitro Systèmes

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

ADNg enrichissement par une technologie basée Transposase-NGS Analyse de la séquence plénier de<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt;, et 9 gènes impliqués dans la réparation des dommages de l&#39;ADN

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the different aspects of visual, cross-modal and developmental plasticity along the mammalian visual system1-4.
Here, we demonstrate an elegant and straightforward technique for the removal of one or both eyes in the mouse, which is validated in mice of 20 days old up to adults. Briefly, a disinfected curved forceps is used to clamp the optic nerve behind the eye. Subsequently, circular movements are performed to constrict the optic nerve and remove the eyeball. The advantages of this technique are high reproducibility, minimal to no bleeding, rapid post-operative recovery and a very low learning threshold for the experimenter. Hence, a large amount of animals can be manipulated and processed with minimal amount of effort. The nature of the technique may induce slight damage to the retina during the procedure. This side effect makes this method less suitable as compared to Mahajan et al. (2011)5 if the goal is to collect and analyze retinal tissue. Also, our method is limited to post-eye opening ages (mouse: P10 - 13 onwards) since the eyeball needs to be displaced from the socket without removing the eyelids. The in vivo enucleation technique described in this manuscript has recently been successfully applied with minor modifications in rats and appears useful to study the afferent visual pathway of rodents in general.

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

The removal of eyes, also called enucleation, provides a useful strategy to study aspects of visual, cross-modal, and developmental plasticity along the mammalian visual system since it induces irreversible partial (monocular) or complete (binocular) vision loss. Here we describe a highly reproducible and straightforward approach to perform in vivo enucleation.

Une méthode hautement reproductible et facile à Effectuer<em&gt; In Vivo</em&gt; Oculaire énucléation chez la souris après ouverture des yeux

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Mesure induite glutathion-réponse d&#39;alimentation à Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Détection et analyse de l&#39;ADN dommages souris muscle squelettique<em&gt; In Situ</em&gt; Utilisation de la méthode TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

In Vivo Alkaline Comet Assay et Enzyme modifiée Alkaline Comet Assay pour mesurer Breaks brin d&#39; ADN et l&#39; ADN oxydative dommages de foie de rat

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Mesure de la rigidité de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Souris aortes Utiliser Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles

Nanomaterial exposure can cause replication stress and genomic instability in cells. The degree of instability depends on the chemistry, size, and concentration of the nanomaterials, the time of exposure, and the exposed cell type. Several established methods have been used to elucidate how endogenous/exogenous agents impact global replication. However, replicon-level assays, such as the DNA fiber assay, are imperative to understand how these agents influence replication initiation, terminations, and replication fork progression. Knowing this allows one to understand better how nanomaterials increase the chances of mutation fixation and genomic instability. We used RAW 264.7 macrophages as model cells to study the replication dynamics under graphene oxide nanoparticle exposure. Here, we demonstrate the basic protocol for the DNA fiber assay, which includes pulse labeling with nucleotide analogs, cell lysis, spreading the pulse-labeled DNA fibers onto slides, fluorescent immunostaining of the nucleotide analogs within the DNA fibers, imaging of the replication intermediates within the DNA fibers using confocal microscopy, and replication intermediate analysis utilizing a computer-assisted scoring and analysis (CASA) software.

The methodology assists in the analysis of variation in DNA replication dynamics in the presence of nanoparticles. Different methodologies can be adopted based on the cytotoxicity level of the material of interest. In addition, a description of the image analysis is provided to help in DNA fiber analysis.