The authors would like to acknowledge the contribution of our colleagues Sandrine Roch-Lefevre and Eric Gregoire of the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France). This work was supported by the Government of Canada Science and Technology program at Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), the CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), the Canadian Nuclear Safety Commission and by the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France).

כל נהלי הטיפול וטיפול העכבר צריכים לדבוק בכללים שנקבעו על ידי מחוקק התוכניות ו / או טיפול בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי החיים מקומית. כל השיטות שתוארו בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים באישור ועדת טיפול בבעלי החיים המקומית. זהירות: כל העבודה עם רדיואקטיביות (כולל, אך לא מוגבלת לטיפול בטריטיום, γ-קרינה חיצונית, טיפול ברקמות בעלי החיים רדיואקטיבי, פסולת מצעים) צריך לדבוק בכללים שנקבעו על ידי הרשויות המחוקקת ו / או הגנה מפני קרינה ותבוצע על ידי מורשה כוח אדם במעבדה ו / או מתקן מוסמכים. 1. בעלי החיים עבודה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי החיים קיבוץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם עכברים מגיעים מארגון חיצוני, להתאקלם חיות לפחות 10 ימים במתקן בעלי החיים. אם המחקר כולל קבוצות טיפול מרובות, להבטיח כי ספק בעלי החיים ניתן לשלוח אלבעלי החיים l כיצווה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן אקראי להקצות עכברים לקבוצות טיפול של 10 עכברים לכל קבוצה. אם משתמש בעכברי זכרים של זן C57BL / 6, יש לי ספק החיה מראש לארגן אקראי של C57BL זכרים / 6 צעירים מאוד במתקן שלהם כדי למתן בעיות תוקפנות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשיפה כרונית של עכברים β-קרינה פנימית ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ריכוזי עבודה של טריטיום (10 kBq / L וMBq 1 / L) במי שתיית עכבר על ידי דילול המניות המקוריות של HTO וOBT (תערובת של פרולין tritiated, אלאנין וחומצות אמינו גליצין) פתרונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאמת את הריכוזים הסופיים של טריטיום במי השתייה על ידי מדידת רדיואקטיביות באמצעות מונה נצנץ נוזלי. התאם ריכוזים, במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפל בבעלי חיים לחודש אחד על ידי מתן כרצונך גישה למים טריטיום. אם מים טיפול מקבלים נמוכים בתקופה של השבועיים, להוסיף עוד מים. אחרת, לשנות בקבוקים בשבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמה-מוקרנת התייחס שליטהעכברים זהים. שמור אותם בחדר &quot;נקי&quot; נפרד או על מדף נפרד &quot;נקי&quot; תחת לחץ אוויר חיובי כדי למנוע טריטיום זיהום צולב מהאוויר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשיפה כרונית של עכברים γ-קרינה חיצונית ל הערה: γ-קרינת מתקן / ציוד ישתנה בהתאם למיקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשיטות זמינות של dosimetry, לקבוע את המרחקים ממקור γ-קרינה שיש לי שדות קרינת הפקת שיעורי מינון הרצויים. ודא ההומוגניות של שדות קרינה באזורי כיסוי כלובי חיות. הערה: 1.7 μGy / h הוא שווה ערך לשיעור מינון המיוצר על ידי 1 MBq / טריטיום L בגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף עכברים על ידי הצבת כלובי עכבר במרחקים שנקבעו בשלב 1.3.1 לחודש אחד. למזער הפרעה יומית של γ-קרינה 30 דקות. השתמש מד מינון thermoluminescence למדוד מינונים נקלטו כולל. </li></ol> 2. קורבנות ודגימה <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מכשירי ניתוח סטרילי, צלחות פטרי 60 מ&quot;מ עם מסננות הוכנסו 70 מיקרון תא, 15 מיליליטר וצינורות 1.5 מיליליטר, תקשורת RPMI בתוספת סרום 5% שור עוברי (FBS) ומקום כל בתוך ארון בטיחות ביולוגי. הבטחת סטריליות של העבודה היא קריטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 5 מיליליטר של תקשורת RPMI לכל צלחת פטרי 60 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכברים באמצעות שיטה שאושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי החיים המקומית. נקע בצוואר הרחם הוא בחירה טובה עבור עבודת splenocyte המתוארת בפרוטוקול זה. עם זאת, אם דגימות דם למבחנים אחרים (לדוגמא, לmFISH, הגרעינון בלוק cytochalasin או מבחני genetoxicity הנפוץ אחרים) נדרשות, להשתמש לנקב פנים-לב לאחר הרדמה עם isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה שכיבתה על גב, עם הראש והצביע ממך. לרסס את העכבר למטה עם 70% אתנול. בעזרת מלקחיים, לתפוס את עור anteriorly לפתיחת השופכה ולעשות חתך קטן עם מספריים באזור החיץ הנקבי. <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחתך זה, לחתוך לאורך קו האמצע הגחון לחלל החזה, להיות זהיר, כדי לחתוך רק את העור ולא קיר השריר מתחת. לנתח את העור מקו האמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוס את דופן הבטן עם מלקחיים ולחתוך לאורך הציר החציוני של קיר השרירים לפתוח את חלל הבטן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו הטחול על ידי בקלילות תופס אותו עם מלקחיים סטריליות ומשייכתו בעדינות על זה תוך צמצום מרחק בו זמנית רקמת חיבור במספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי חתיכה קטנה של הטחול (כ 1/10 של הטחול) והמקום בצינור 1.5 מיליליטר. Snap להקפיא בחנקן נוזלי לאחסון שלאחר מכן ב -80 ° C למבחנים משלימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שארית הטחול לתוך מסננת תא בתוך צלחת פטרי 60 מ&quot;מ עם 5 מיליליטר של תקשורת RPMI-לוותר מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לעכבר הבא. יכולים להיות כל הזמן טחולים חולץ ב -60 מנות מ&quot;מ עם תקשורת (עד 2 שעות) בעוד שאר העכברים להקריב את: הערהאד. בהתאם למספר האנשים שהשתתפו, בין 5 ל 15 עכברים יכולים להיות מעובד ביום אחד. </li></ol> 3. הכנת תרבויות Splenocyte <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize הטחול על ידי מיותר בתוך מסננת תא עם מלקחיים סטרילי עם קצה מעוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מסננת התא ולאסוף את ההשעיה התא המסוננת מצלחת 60 מ&quot;מ לתוך צינור 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את מסננת התא עם 5 מיליליטר של תקשורת כדי לאסוף את שארית התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant ולמזוג מחדש להשעות גלולה ב 10 מיליליטר של RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant ולמזוג מחדש להשעות גלולה ב 5 מיליליטר של RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 4 מיליליטר של השעיה תא לתוך בקבוק 25 מיליליטר תרבות רקמות ולהסיר לחממת CO 2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 80% לחות) </li></ol> 4. מאתגרי הקרנה ותיקון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר אתנותר 1 מיליליטר של השעיה תא מהצעד 3.8 לתוך צינור 1.5 מיליליטר על קרח וצנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. הנזק לדנ&quot;א שנמדד במדגם זה מייצג שני נזק הנגרם הטיפול וt = 0 נתוני נקודה לבניית עקומת תיקון DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant באמצעות משאבת ואקום. בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של חיץ TBS (20 מ&quot;מ טריס pH 7.4, 150 מ&quot;מ NaCl, 2.7 מ&quot;מ KCl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בזהירות לשאוב supernatant באמצעות משאבת ואקום. בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 300 μl של TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך ערבוב במערבולת במהירות נמוכה, להוסיף 700 μl של -20 אתנול 100% מעלות צלזיוס. סגור את המכסה ולהפוך כמה פעמים כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הדגימות ב -20 ° C. Splenocytes הקבוע באתנול ניתן לאחסן ב -20 ° C לפחות 12 חודשים ללא כל אובדן מורגש באות γH2AX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשיר את תרבויות splenocyte מצעד 3.8 עם γ-רד מאתגר<html> מינון iation של 2 Gy ב≥ שיעור מינון 200 mGy / דקות באמצעות מכשיר הקרנה זמין. הערה: המטרה של קרינה זו היא לגרום לDNA DSB לאתגר את מכונות התיקון. גם צילומי רנטגן יכול לשמש למטרה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להחזיר את התרבויות לחממת CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שעה 1 לאחר הקרנת Gy 2 המאתגרת, להסיר את התרבויות מן החממה לארון בטיחות ביולוגית. לאסוף aliquot מדגם מייצג, בעדינות מחדש להשעות תאים באמצעות pipettor והעברה 1 מיליליטר של ההשעיה תא צינור 1.5 מיליליטר על קרח. להחזיר את תרביות תאים לחממת CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בזהירות לשאוב supernatant באמצעות משאבת ואקום. בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.3-4.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר 2 γ-הקרנת Gy, הקציר המאתגר ולתקן ב= מדגם 24 שעות כמתואר בשלב 4.8-4.10. </li></ol>ייתכנו &quot;&gt; 5. תיוג Immunofluorescent עם אנטי-γH2AX נוגדן הערה: בדרך כלל, 15-30 דגימות ליום יכולות להיות מתויגות immunofluorescently וassayed ידי cytometry זרימה בטווח אחת. כדי להבטיח השוואה מדויקת בין קבוצות טיפול, כולל מדגם (ים) מכל קבוצה. ראית גם התייחסות 16 לפרטים נוספים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ערכת שכותרת של צינורות למספר הדגימות להיות מעובד ומניחים על קרח. השתמש 12 x 75 מ&quot;מ צינורות זכוכית הסירו את מכסה. עקרות אינה נדרשות לעבודה זו. כולל דגימה אחת נוספת היסטורית שליטה לתיוג עם נוגדנים משני בלבד (&quot;2 Ab רק&quot;). השתמש מדגם שליטה היסטורי זה בכל cytometry זרימה לרוץ בתוך מחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של TBS קר כקרח על צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר splenocytes קבוע מ-20 ° C, מערבולת במשך 5 שניות ולהעביר aliquot 0.5 מיליליטר לצינורות מוכנים עם כפות. מניחים את שארית דגימות בחזרה לאחסון -20 ° C ולשמור כמדגם גיבוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> splenocytes צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של קר כקרח TBS המכיל 1% FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של חיץ TST (0.05% X-100, 2% FBS טריטון ב TBS). דגירה של 20 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 200 μl של נוגדן אנטי γH2AX העיקרי בדילול 1: 150 במאגר TST. השתמש 200 μl של TST ל&quot; 2 Ab רק &quot;מדגם השליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות עמדה על שייקר מסתובב בזווית של 45 - 60 מעלות ולנער תמורת 1.5 שעות ב 300 XG ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד צינורות דוגרים, להכין נפח מספיק (200 μl / מדגם) של הנוגדנים משני אנטי העכבר העז מצומדות עם Alexa-488 בדילול 1: 200 במאגר TST. הערה: כל העבודה שיש בי Alexa-488נוגדן מצומדת (שלבים 5.10-5.16 להלן) צריך להיעשות בתנאי אור עמומים וצריכה להיות מוגן דגימות שכותרתו מאור על ידי עטיפת צינורות בנייר אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהדגירה 1.5 שעות הושלמה, להוסיף 1 מיליליטר של TBS קר כקרח המכיל 2% FBS על צינור אחד וצנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של TBS המכיל 2% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 200 μl של פתרון נוגדנים משני מהשלב 5.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הדגימות על פלטפורמה רועדת עבור שעה 1 כמו בשלב 5.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של TBS קר כקרח המכיל 1% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של TBS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 0.5 מיליליטר של TBS המכיל 50 מיקרוגרם / מיליליטריודיד propidium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 5 דקות על RT המוגנים מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות על cytometer זרימה באמצעות פרוטוקולי מכשיר ספציפי 16. קראו לפחות 10,000 תאים לדגימה. </li></ol>

<ol>
	<li>Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adaptive+response+modifies+latency+for+radiation-induced+myeloid+leukemia+in+CBA/H+mice.">The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice.</a> Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).</li><li>Shadley, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+adaptive+response+in+human+lymphocytes.">Chromosomal adaptive response in human lymphocytes.</a> Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).</li><li>Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+[3H]thymidine-induced+adaptive+response+of+human+lymphocytes+to+subsequent+doses+of+X-rays+involves+the+induction+of+a+chromosomal+repair+mechanism).">Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism).</a> Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).</li><li>Mitchel, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dose+window+for+radiation-induced+protective+adaptive+responses.">The dose window for radiation-induced protective adaptive responses.</a> Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).</li><li>Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linear+no-threshold+relationship+is+inconsistent+with+radiation+biologic+and+experimental+data.">The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data.</a> Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).</li><li>Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+stability+and+the+DNA+double-stranded+break+connection.">Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection.</a> Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).</li><li>Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+and+repairing+DNA+double-strand+breaks.">Sensing and repairing DNA double-strand breaks.</a> Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).</li><li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin.">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li><li>Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+(125)IdU-induced+DNA+double-strand+breaks+with+gamma-H2AX+antibody.">Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody.</a> Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).</li><li>Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus+on+histone+variant+H2AX:+to+be+or+not+to+be.">Focus on histone variant H2AX: to be or not to be.</a> FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).</li><li>Taneja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H2AX+phosphorylation+as+a+predictor+of+radiosensitivity+and+target+for+radiotherapy.">Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy.</a> J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).</li><li>Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+histone+H2AX+in+spheroids,+tumors,+and+tissues+of+mice+exposed+to+etoposide+and+3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide.">Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide.</a> Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).</li><li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions.">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4 (2010).</li><li>Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+DNA+double-strand+breaks+is+not+modulated+by+low-dose+gamma+radiation+in+C57BL/6J+mice.">Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice.</a> Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).</li><li>Runge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+interpretation+of+ionizing+radiation-induced+gammaH2AX+foci+by+the+novel+pattern+recognition+system+AKLIDES(R).">Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R).</a> Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).</li><li>Jucha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FociCounter:+A+freely+available+PC+programme+for+quantitative+and+qualitative+analysis+of+gamma-H2AX+foci.">FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci.</a> Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).</li><li>Garty, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RABIT:+a+rapid+automated+biodosimetry+tool+for+radiological+triage.">The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage.</a> Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).</li><li>Kovalchuk, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+changes+in+DNA+repair+in+radiation-exposed+mice.">Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice.</a> Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).</li><li>Rube, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+in+the+context+of+chromatin:+new+molecular+insights+by+the+nanoscale+detection+of+DNA+repair+complexes+using+transmission+electron+microscopy.">DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy.</a> DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).</li><li>Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+stress+genes+by+low+doses+of+gamma+rays.">Induction of stress genes by low doses of gamma rays.</a> Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).</li></ol>

The authors declare that there are no known competing financial interests.

הפרוטוקול שהוצג במאמר זה הוא שימושי לניהול עכבר בקנה מידה גדול במחקרי vivo בוחנים את השפעות genotoxic של רמות נמוכות של חומרים כימיים ופיסיים שונים, כוללים קרינה מייננת. המתקן שלנו ייחודי ספציפי הפתוגן ללא בעלי החיים מצויד בirradiator GammaBeam 150 ואולם הקרנה ארוכה 30 מטר מאפשר ?...

מחלוקת מהותית על ההשפעות המזיקות האפשריות של שני מינונים נמוכים או נמוכים מאוד של קרינה מייננת ופחד של הציבור של קרינה, מונע על ידי תמונות של ההפצצות האטומיות על הירושימה ונגסקי ותאונות כור גרעיני נדירות (שהוחמרה על ידי תקשורת המונים), הובילה למאוד רגולציה קפדנית הגנה מפני קרינה ותקנים שהם בעלות פוטנציאל לא מדעי מוצדקים. בשלושת העשורים האחרונים, דיווחים רבים תעדו שני חוסר מזיק ואת הנוכחות של השפעות ביולוגיות פוטנציאלי הנגרמות על ידי קרינה מועילות במינון נמוך 1-4. גורם הסיכון בריאותי קרינה העיקרי הוא ההסתברות של סרטן, המוערכת בהתבסס על מחקרים אפידמיולוגיים של ניצולי פצצה אטומיים שקיבלו מינון גבוה או בינוני של קרינה. אקסטרפולציה ליניארית של נתונים אלה (מה שנקרא ליניארי-אין-סף או מודל LNT) משמשת להערכת סיכונים של סרטן במינונים נמוכים. עם זאת, גישה זו לא קיבלה קבלה מדעית ברחבי העולםוהוא דנו בכבדות 5. ניכר כי מחקרים נוספים נדרשים כדי להבהיר סוגיה זו ואולי לשפר את הסטנדרטים להגנה מפני קרינה. מחקרים כאלה צריכים לערב טיפולים כרוניים (הקירוב הטוב ביותר של חשיפות סביבתיות ותעסוקתיות), במודלים של בעלי החיים vivo (הטובים ביותר עבור אקסטרפולציה אפקטים לאדם) ונקודתי קצה כגון שיעורי נזק לדנ&quot;א, תיקון DNA וmutagenesis. זה ידוע שה- DNA הוא היעד העיקרי לפגיעת השפעות קרינה ולא שלמים או אי-תיקון עלול להוביל להתפתחות הסרטן וmutagenesis 6. הפסקות DNA פעמיים גדיל (DSB) הן אחד מהסוגים מזיקים ביותר של נגעי DNA ועלולות להוביל למוות של תאים ויצירת הגידולים 7. זהו, אם כן, חשוב להיות מסוגל אמין ומדויק למדידת הרמה של DSB לאחר חשיפה לקרינה במינון נמוכה ו / או גורמי לחץ אחרים, כגון מזהמים כימיים. אחד מהסמנים הרגישים והספציפיים ביותרשל DNA DSB הוא H2AX היסטון פוספורילציה, נקרא γH2AX 8, עדיין סמנים ושיטות אחרים כבר הציעו 9,10. ההערכה היא כי אלפי מולקולות H2AX, בקרבת DSB מושרה, מעורבים בהיווצרות γH2AX מאפשרת זיהוי של DSB הבודד על ידי תיוג immunofluorescent עם הנוגדן ומיקרוסקופ פלואורסצנטי אנטי γH2AX 11. התגובה היא מהירה מאוד, והגיע המקסימלית שלה בין 30 ל -60 דקות. ראיות לכך שγH2AX מאפשר תיקון של דנ&quot;א DSB ידי משיכת גורמי תיקון אחרים לאתרים של הפסקות ועל ידי שינוי מבנה הכרומטין לעגן קצות DNA השבורים ולספק גישה לחלבונים אחרים תיקון (ביקורת ב -12). עם השלמת התיקון של דנ&quot;א DSB, γH2AX מקבל דה-פוספורילציה ו / או עובר השפלה, ומולקולות H2AX מסונתזים חדש להחליף γH2AX באזורים שנפגעו מהכרומטין 10. ניטור היווצרות ואובדן γH2AX יכול,לכן, לספק הערכה מדויקת של קינטיקה תיקון DNA DSB. גישה זו נעשתה שימוש כדי ללמוד תיקון DSB בשורות תאי גידול שונים אנושיות מוקרנים עם מינונים גבוהים של קרינה ושיעורה ורמות DSB שייר הוכח לתאם עם radiosensitivity 13-15. אנחנו שונה הגישה הניסויית הזה וליישם אותו למחקר עכבר in vivo לבחון את ההשפעות של מינונים נמוכים של γ- הכרוני וβ-קרינה ברמות ה- DNA DSB ותיקון (איור 1). ראשית, אנחנו מדגימים שיטה לביצוע חשיפה כרונית ארוך טווח של עכברים לβ-קרינה הנפלטת באמצעות טריטיום (מימן-3) בצורה של המים tritiated (HTO) או כטריטיום מחויב אורגני (OBT) מומס במי שתייה . שתי הצורות צפויות לצבור ו / או להפיץ בצורה שונה בגוף ולכן, לייצר השפעות ביולוגיות שונות. שני צורות הן סכנות פוטנציאליות בתעשיית גרעין. טיפול זההקביל לחשיפה כרונית לקרינת γ-בשיעור מינון שווה ערך כדי לאפשר השוואה נכונה של שני סוגי הקרינה, שהוא חיוני להערכת היעילות הביולוגית היחסית שלהם. Beta-קרינה מורכבת מאלקטרונים, מה שהופך את שונה מאוד מγ-הקרינה, הפוטונים באנרגיה גבוהים. בשל הבדל זה, Β-קרינה מייצגת סכנה בריאותית בעיקר פנימית ועלולה לייצר השפעות ביולוגיות שונות בהשוואה לγ-קרינה. סיבוך זה הביא מחלוקות משמעותיות על פני הרגולציה של חשיפה לβ-קרינה הנפלטת על ידי HTO. לפיכך, רמות רגולציה של HTO במי שתייה לציבור משתנות מקרל 100 / L באירופה 75,000 בקרל / L באוסטרליה. זהו, אם כן, חשוב להשוות השפעות ביולוגיות של HTO למינונים מקבילים של γ-קרינה. שנית, שיעור ה- DNA DSB נמדד בsplenocytes המבודד עם השלמת חשיפות כרוניות באמצעות כותרת immunofluorescently γH2AX לזהותאד על ידי cytometry זרימה. זה מאפשר ההערכה של מידת נזק שנגרם על ידי ה- DNA in vivo החשיפות. עם זאת, זה הגיוני לצפות שחשיפות כגון רמה נמוכה לא יכולות לייצר כל שיעורי זיהוי של ה- DNA DSB; במקום זאת, כמה שינויים נסתרים / ניתן לצפות תגובות שמשפיעות על היכולת של התאים כדי לתקן נזק ל- DNA. שינויים אלה, אם מצאו, יכולים להיות גם גירוי (ייצור אפקט מועיל) או מעכב (ייצור אפקט מזיק). הפרוטוקול המוצע מאפשר חושף שינויים כאלה על ידי מאתגרים splenocytes חילוץ עם מינון גבוה של קרינה שמייצר כמות משמעותית של נזק (למשל, 2 Gy ייצור כ -50 DNA DSB לכל תא או 3 -. עלייה של 5 לקפל בסך הכל רמת γH2AX) . בהמשך לכך, ההיווצרות ואובדן γH2AX, המשקף את הייזום והשלמת תיקון DSB, מנוטרת על ידי cytometry זרימה. בדרך זו, לא רק בסיס ורמות מושרה טיפול של ה- DNA DSB ניתן למדוד, אבלגם השפעתה הפוטנציאלית על היכולת של התאים להגיב ונזק לדנ&quot;א תיקון הנגרם על ידי רמות לחץ גבוהות בהרבה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HTO: tritiated water, [3H]</td>
			<td>locally obtained from a nuclear reactor&#160;</td>
			<td></td>
			<td>stock activity 3.7 GBq/mL;&#160; can be substituted with HTO from Perkin Elmer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET348005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET004005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET323005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tritiated water, [3H] (HTO)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET001B005MC</td>
			<td>substitute for HTO of local origin&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GammaBeam 150 irradiator</td>
			<td>Atomic Energy of Canada Limited</td>
			<td>locally manufactured</td>
			<td>can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tween-20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3025501</td>
			<td>Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1051-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-gH2AX antibody, clone JBW301</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody</td>
			<td>Life Technologies (formerly Invitrogen)</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4864-10ML</td>
			<td>1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P006-EAAN</td>
			<td>500ml bottles Absolute Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2682550</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td>sterile polypropylene centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td>P110403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 x 75 mm mL uncapped glass tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K60B1496126</td>
			<td>disposable borosilicate glass tubes with plain end</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA15708-120</td>
			<td>nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14068-12</td>
			<td>Wagner scissors 12cm sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps, straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11008-13</td>
			<td>Semken forceps 13cm, straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps, curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11003-12</td>
			<td>Narrow Pattern forceps 12 cm, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA25382-100</td>
			<td>BD Falcon tissue culture dish 60x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainers, 70 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td>Falcon cell strainers 50/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200mL of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS recipe: to make 10X Stock,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30g TRIS HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-1KG</td>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>88g NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Sodium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2g KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Potassium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissolve in 1L of deionized water, adjust pH to 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring dna damage and repair in mouse splenocytes after chronic in vivo exposure to very low doses of beta- and gamma-radiation

חשיפה לקרינה במינון נמוכה עלולה לייצר מגוון רחב של השפעות ביולוגיות שהם שונים בכמות ובאיכות מתופעות המיוצרות על ידי מינוני קרינה גבוהים. התמודדות עם שאלות הקשורות לבטיחות בריאות סביבתית, תעסוקתית וציבורית באופן ראוי ומוצדק מבחינה מדעית מסתמכת במידה רבה על היכולת למדוד במדויק את ההשפעות הביולוגיות של מזהמים במינון נמוכים, כגון חומרים מייננת קרינה וכימיקלים. נזק לדנ&quot;א ותיקון הם הסימנים המוקדמים החשובים ביותר של סיכונים בריאותיים בשל השלכותיהם הפוטנציאליות לטווח ארוך, כגון סרטן. כאן אנו מתארים פרוטוקול ללמוד את ההשפעה של חשיפה כרונית בvivo למינונים נמוכים של קרינת β γ- ועל נזק לדנ&quot;א ותיקון בתאי טחול עכבר. באמצעות סמן מקובל של DNA הפסקות גדיל פעמיים, H2AX היסטון phosphorylated נקרא γH2AX, אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש בו כדי להעריך לא רק את הרמות של נזק לדנ&quot;א, אלא גם משניםביכולת תיקון DNA שהופק על ידי פוטנציאל מינון נמוך בחשיפות vivo. Cytometry זרימה מאפשרת מדידה מהירה, מדויקת ואמינה של γH2AX כותרת immunofluorescently במספר גדול של דגימות. תיקון הפסקה כפול גדיל DNA יכול להיות מוערך על ידי חשיפת splenocytes חילוץ למנה מאתגרת של 2 Gy לייצר כמות מספקת של DNA פורץ להפעלת תיקון ועל ידי המדידה המושרית (לאחר ההקרנה 1 שעה) ונזק לדנ&quot;א שייר (24 שעות לאחר הקרנה). הנזק לדנ&quot;א שיורי יהיה מעיד על תיקון חלקי והסיכון של חוסר יציבות גנומית לטווח ארוך וסרטן. בשילוב עם מבחני אחרים ונקודתי קצה שיכול בקלות להיות נמדדים בכך במחקרי vivo (למשל, סטיות כרומוזומליות, תדרי גרעינונים בreticulocytes מח עצם, ביטוי גנים, וכו &#39;), גישה זו מאפשרת הערכה מדויקת וקונטקסטואלית של ההשפעות הביולוגיות לחצים רמה הנמוכה של.

איור 2 מציג דוגמאות של cytometry זרימת הגרפים הצפויים לsplenocytes מוכנים תוך שימוש בשיטה שתוארה כאן. תאים מגודר ראשון המבוסס על &lt;נפח בצד הפיזור אלקטרוני&gt; עלילת פיזור (איור 2 א ו 2 ד; נפח אלקטרוני הוא שווה ערך לפיזור קדימה). היסטוגרמות יוד FL3 / propidium <str...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation at JoVE.com

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

מדידת נזק לדנ&quot;א ותיקון בSplenocytes העכבר לאחר כרוני<em&gt; In vivo</em&gt; חשיפה למינונים נמוכים מאוד של בטא וגמא-קרינה

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

measuring-dna-damage-repair-mouse-splenocytes-after-chronic-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

11.0K Views.  Canadian Nuclear Laboratories. A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented. 

Video: Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

הדמיה תיקון Mismatch ותגובות נייד נזק לדנ&quot;א Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

ויזואליזציה של תיקון MG53 בתיווך קרום התא באמצעות In vivo ו במבחנה מערכות

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

gDNA העשרה על ידי טכנולוגיה מבוססת Transposase לניתוח NGS של הרצף השלם של<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt;, ו -9 גנים המעורבים בתיקון נזק לדנ&quot;א

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the different aspects of visual, cross-modal and developmental plasticity along the mammalian visual system1-4.
Here, we demonstrate an elegant and straightforward technique for the removal of one or both eyes in the mouse, which is validated in mice of 20 days old up to adults. Briefly, a disinfected curved forceps is used to clamp the optic nerve behind the eye. Subsequently, circular movements are performed to constrict the optic nerve and remove the eyeball. The advantages of this technique are high reproducibility, minimal to no bleeding, rapid post-operative recovery and a very low learning threshold for the experimenter. Hence, a large amount of animals can be manipulated and processed with minimal amount of effort. The nature of the technique may induce slight damage to the retina during the procedure. This side effect makes this method less suitable as compared to Mahajan et al. (2011)5 if the goal is to collect and analyze retinal tissue. Also, our method is limited to post-eye opening ages (mouse: P10 - 13 onwards) since the eyeball needs to be displaced from the socket without removing the eyelids. The in vivo enucleation technique described in this manuscript has recently been successfully applied with minor modifications in rats and appears useful to study the afferent visual pathway of rodents in general.

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

The removal of eyes, also called enucleation, provides a useful strategy to study aspects of visual, cross-modal, and developmental plasticity along the mammalian visual system since it induces irreversible partial (monocular) or complete (binocular) vision loss. Here we describe a highly reproducible and straightforward approach to perform in vivo enucleation.

שיטה מאוד לשחזור וישיר לביצוע<em&gt; בVivo</em&gt; Ocular Enucleation בעכבר לאחר פתיחת העיניים

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

מדידת תגובת האכלה מושרה גלוטתיון בהידרה

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

זיהוי וניתוח של נזק לדנ&quot;א בשרירי שלד עכבר<em&gt; באתר</em&gt; שימוש בשיטת TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

In vivo אלקליין השביט Assay ואנזים-modified אלקליין השביט Assay עבור מדידת Breaks Strand דנ&quot;א נזק חמצוני דנ&quot;א עכברוש הכבד

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles

Nanomaterial exposure can cause replication stress and genomic instability in cells. The degree of instability depends on the chemistry, size, and concentration of the nanomaterials, the time of exposure, and the exposed cell type. Several established methods have been used to elucidate how endogenous/exogenous agents impact global replication. However, replicon-level assays, such as the DNA fiber assay, are imperative to understand how these agents influence replication initiation, terminations, and replication fork progression. Knowing this allows one to understand better how nanomaterials increase the chances of mutation fixation and genomic instability. We used RAW 264.7 macrophages as model cells to study the replication dynamics under graphene oxide nanoparticle exposure. Here, we demonstrate the basic protocol for the DNA fiber assay, which includes pulse labeling with nucleotide analogs, cell lysis, spreading the pulse-labeled DNA fibers onto slides, fluorescent immunostaining of the nucleotide analogs within the DNA fibers, imaging of the replication intermediates within the DNA fibers using confocal microscopy, and replication intermediate analysis utilizing a computer-assisted scoring and analysis (CASA) software.

The methodology assists in the analysis of variation in DNA replication dynamics in the presence of nanoparticles. Different methodologies can be adopted based on the cytotoxicity level of the material of interest. In addition, a description of the image analysis is provided to help in DNA fiber analysis.