עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע גרנט MCB-0718846 וביטחון לפרויקטי מחקר מתקדם סוכנות חוזה N66001-12-C-4020 (לJDB). לאם מומנה על ידי מענק דוקטורט ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה. פרסומו של מאמר זה הוא בחסות רוש.

1. הכן את ה- DNA הגנומי שמרים (gDNA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מלאי של שמרי תמוגה הצפת 9 המכיל 50 מ&quot;מ טריס pH 8.0, 100 מ&quot;מ NaCl, 1% SDS (w / v), 2% Triton X-100 (V / V), 1 mM EDTA pH 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כהחל שימוש בחומרים ~ 2 x 10 6 תאים, אשר בדרך כלל מתאים ל~ 100 μl של תרבות רוויה למעבדת זנים של הרקע BY4741 10. תאים בתרבית צריכים להיות שנאספו על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 3 דקות בטמפרטורת חדר בצינור 1.5 מיליליטר microfuge. לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של שמרי תמוגה הצפת וresuspend התא גלולה על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ~ 300 μl של החומצה שטפה חרוזי זכוכית כך שהרמה של חרוזים היא כ 1 מ&quot;מ מתחת לרמה של תרחיף התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף להוסיף 200 μl של פנול / כלורופורם / isoamyl אלכוהול (25: 24: 1). שווי צינור microfuge ולהבטיח כי לא חרוזים תקועים בין הכובע והצינור כמו זה יגרום הדלפות במהלך רועד(שלב 1.6). הפוך 3 פעמים כדי לערבב ולאמת את הכובע אטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער את הצינור במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר בעזרת מערבל benchtop כגון אפנדורף 5432. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 20,800 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 75 μl של השלב המימי לצינור microfuge חדש המכיל 1 מיליליטר של 100% אתנול. הפוך 10 פעמים כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה DNA על ידי צנטריפוגה ב20,800 XG במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ללא פירוק גלולה DNA. שטוף את הכדור עם 500 μl של 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 20,800 XG במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ללא פירוק גלולה DNA ואוויר יבש גלולה עם כובע microfuge הפתוח עד אתנול עודף התאדה, שהיא בדרך כלל סביב 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה DNA ב -75 μl של 10mm טריס pH 7.4 ו מערבולת לערבב. חנות המדגם ב -20 ° C ללא הגבלת זמן. למדוד את הריכוז של ה- DNA במדגם באמצעותbenchtop fluorimeter כגון קיוביט, אשר מבדיל את ה- DNA מRNA. ודא שהריכוז הסופי של gDNA הוא ~ 1-2 ng / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול 1:10 של הדנ&quot;א הגנומי שימוש במים ומערבולת לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 30 μl של gDNA המדולל לתוך הבאר המתאימה צלחת מקור שתואמת עם מתקן ננו אקוסטית נוזלי (שלב 3). אם באמצעות Labcyte אקו 550, השתמש בצלחת 384 גם פוליפרופילן (צלחת 384PP). הערה: כאשר אטום כראוי צלחת זה יכול להיות מאוחסן במשך חודש אחד לפחות ב -20 ° C. </li></ol> 2. הכן ולוותר qPCR מיקס מאסטר לצלחת multiwell 1,536 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 850 μl של תערובת אמן qPCR, כגון LightCycler 1,536 DNA ירוק הורים, בצינור 1.5 מיליליטר microfuge ומערבולת לערבב. צנטריפוגה תערובת אמן qPCR 2 דקות ב20,800 XG בטמפרטורת חדר כדי להסיר כל בועות. הרכיבים של מיקס מאסטר qPCR נדרש לצלחת multiwell אחת 1,536 הם כדלקמןS: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב 170 μl של תערובת אמן אנזים (Tube מאסטר הירוק 1, 5x מרוכז), 42.5 μl של SYBR (Tube מאסטר הירוק 4, 20x המרוכז), ו637.5 μl של מים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 500 NL / גם לתוך צלחת multiwell 1,536 באמצעות מתקן נוזל בתפזורת כגון אמנות רובינס קוברה. (שים לב שצעדים 2.2.1-2.2.4 מתייחסים באופן ספציפי לקוברה.) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור תכנית מחלק עם ההגדרות הבאות: כיתת נוזל, מים; לשאוב נפח, 800 μl; לוותר נפח, NL 500; לשטוף זמן, 20 שניות. בהגדרות לוותר, לאמת את המהירות לוותר מוגדרת 49.6 מ&quot;מ / שנייה, לוותר על הקיזוז הוא 0.25 מ&quot;מ, ונוזל aspirated עודף להימכר חזרה למקור גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינור microfuge המכיל תערובת אמן qPCR היטב A1 של בעל צינור microfuge, הנמצא בעמדת סיפון 1. חותך את הכובע של צינור microfuge או פשוט להשאיר את זה פתוח. הגדר את &#39;לשאוב גם&#39; לA1 על ידי עריכת Aspiratהגדרות דואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע צעד לשטוף לפני ניפוק תערובת אמן qPCR על ידי צעדים לשאוב ולוותר בחירה-דה הראשונים של התכנית להקים בשלב 2.2.2 ואז להכות &quot;לרוץ&quot;. ברגע מלא, לבחור מחדש לשאוב ולוותר צעדים לפני הפעלת התכנית המלאה לוותר תערובת אמן qPCR. אם קוברה כבר יושב פעיל במשך פחות מ -10 דקות השלב לשטוף הראשוני, המשמשת לראש המערכת, הוא מיותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכה &#39;ריצה&#39; לוותר תערובת אמן qPCR היטב כל אחד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את תערובת אמן qPCR בחלק התחתון של כל טוב על ידי צנטריפוגה הקצרה של 1,536 צלחת multiwell (סעיף 30 באמצעות טווה צלחת במהירות נמוכה PCR). </li></ol> 3. לוותר תבנית ה- DNA ויחל לצלחת multiwell 1,536 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 5 NL של gDNA המדולל (שלב 1.3) לתוך הבארות הרצויות של צלחת multiwell 1,536 באמצעות מערכת העברת נוזל אקוסטית, כגון אקו 550. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל&quot;איכסo 550, להשתמש בתוכנה לאתחל מחדש פלייט או לחלופין לספק גיליון אלקטרוני Excel מותאם אישית לתכנת את ההעברה. להבטיח המקור שנבחר גם לgDNA בתכנית תואמת את המקור טוב שליש לך לוותר פיזי gDNA (שלב 1.3). בחר את סוג צלחת המקור &#39;384PP_AQ_BP2&#39;, אשר מציין את הנוזל בצלחת 384PP הוא חיץ ללא חומרים פעילי שטח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 10 NL של פריימרים, מעורב מראש קדימה הפוך לריכוז סופי של 50 מיקרומטר כל, לתוך הבארות הרצויות של צלחת multiwell 1,536 באמצעות מערכת העברת נוזל אקוסטית, כגון אקו 550. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למערכת ההעברה הנוזלית, השתמש בתוכנה לאתחל מחדש פלייט או לחלופין לספק גיליון אלקטרוני Excel מותאם אישית לתכנת את ההעברה. הערה: כאן אפשר לוותר פריימרים כך שהפריסה על צלחת multiwell 1,536 תואמת את סדר כרומוזומליות של פריימרים כל כך קל לבדוק חזותי את תוצאות PCR בזמן אמתמאוחר יותר (שלב 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Premix פריימרים בצלחת שתואמת את מתקן הנוזל אקוסטית. לאקו 550, השתמש בצלחת Labcyte 384LDV (נפח מת נמוך) ולבחור את סוג צלחת המקור &#39;384LDV_AQ_B&#39; בעת תכנות אקו כדי לציין את הנוזל הוא חיץ פשוט ללא חלבונים. </li></ol></li></ol> 4. חותם וצנטריפוגה צלחת multiwell 1,536 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במערכת אוטם microplate כגון אוטם microplate התרמי Plateloc, לאטום מייד את צלחת multiwell 1,536 באמצעות חותם ברור אופטי שתואם למכשיר אוטם חום. אל תגעה בשטח החותם כדי למנוע סימני מריחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם באמצעות microplate אוטם התרמי Plateloc, להשתמש בהגדרות הבאות: לאטום זמן 2.0 שניות, טמפרטורת חותם 162 מעלות צלזיוס, לחץ אוויר 82 psi. מכשיר זה לוקח ~ 5 דקות להתחמם וכך צריך להיות מופעל מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם משתמש באוטם microplate התרמי Plateloc, adapter יש להשתמש כדי להעלות את גובה צלחת multiwell 1,536 על הבמה של המכשיר כדי לוודא איטום טוב. הערה: למרות שזה עדיף לרכוש צלחת שלב לאוטם microplate התרמי Plateloc, פתרון חלופי הוא להכניס ארבעה ~ 2 מ&quot;מ מכונות כביסה סטנדרטית עבה זמינה בכל חנות לחומרי בניין בפינות להעלות את הגובה של צלחת multiwell 1,536. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד צנטריפוגות צלחת 1,536 multiwell אטומה XG ב 2000 במשך 3 דקות בטמפרטורת חדר כדי לאסוף את כל חומרים כימיים בחלק התחתון של כל טוב. </li></ol> 5. Real Time PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכנית מכשיר 1,536 qPCR, כגון 1,536 LightCycler, עם פרוטוקול הגברה שני שלבים אחרי ניתוח עקום להמיס. שימוש בתוכנת LightCycler 1,536 להגדיר תכנית כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום דגירה: 95 מעלות צלזיוס, אחיזת 1 דקות, שיעור רמפה 4.8 מעלות צלזיוס / sec, אין רכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני שלב הגברה: 30 מחזורים של [95 ° C, אין לו אחיזה,רמפה 4.8 מעלות צלזיוס / sec שיעור, אין רכישה; 64 מעלות צלזיוס, אחיזת 30 שניות, קצב רמפה 2.5 מעלות צלזיוס / sec, רכישה אחת]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקום להמס: 95 ° C, 10 שניות, קצב רמפה 4.8 מעלות צלזיוס / sec, אין רכישה; 60 מעלות צלזיוס, 1 דקות, שיעור רמפה 2.5 מעלות צלזיוס / sec, אין רכישה; 97 מעלות צלזיוס, קצב רמפה 0.1 מעלות צלזיוס / sec, 5 רכישות / ° C (הרציף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגניב: 40 מעלות צלזיוס, 30 שניות, קצב רמפה 2.5 מעלות צלזיוס / sec, אין רכישה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את פורמט איתור ל&#39;גרין דיי intercalating &#39;בכרטיסיית הגדרת הפעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את שליטת pipetting ל&#39;מאסטר בקרה &#39;בכרטיסיית הגדרת הפעלה. תכונה זו משמשת כבקרה פנימית ומזהה את הנוכחות של תערובת אמן qPCR בכל טוב של צלחת multiwell 1,536, אשר היא שימושי כדי לזהות שליליים שווא משוער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את צלחת multiwell 1,536 הוכנה בשלבי 2-4 למכשיר qPCR 1,536 ולהפעיל את התכנית. </li></ol> ניתוח 6. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PerfORM בדיקה ויזואלית של נתונים בתוך תוכנת qPCR. הערה: תוכנת 1,536 מאפשרת הדמיה של שתי ההגברה ולהמס עקומות, כמו גם מפת חום מציגה את השיחה (N / חיובי, שלילי, לא חוקי,; איור 2), ערך נקודת מעבר (הזזה בקנה מידה צבע לחיובי או אפור לשלילי; איור 3), או ערך הקרינה נקודות קצה (EPF) (הזזה בקנה מידה צבע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני יצוא מהתוכנה 1,536 בצורת קובץ txt (טבלת תוצאות) או קובץ XML עם או נתונים הגולמיים או נתונים מחושבים לעיבוד מחובר מהמכשיר. הערה: נקודת הקניינית האוטומטית מעבר אלגוריתם קורא (CP) שנבנתה לתוך תוכנת 1,536 לוקחת בחשבון את הצורה ושיפוע העקום ההגברה תוך קביעת שיחות חיוביות / שליליות וCp ערך עם ביטחון גבוה, בהיקפים נמוכים תת תגובת microliter עם נמוך יחסית ערכי הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם LightCycler DNA הירוק מאסטר היה שימושד לqPCR, לוודא שכל הבארות עברו &#39;בקרת ההורים&#39;. Fail מציין גם לא קיבלו תערובת אמן qPCR ונקודת נתונים החסרה, צריכה להיחשב שלילית כוזב פוטנציאלית. ודא שכל הבארות עברו &#39;בקרת ההורים&#39;. Fail מציין גם לא קיבל mastermix DNA ולשקול את נקודת הנתונים החסרה שלילי כוזב פוטנציאלית. </li></ol>

<ol>
	<li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome.">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344 (6179), 55-58 (2014).</li><li>Dymond, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+chromosome+arms+function+in+yeast+and+generate+phenotypic+diversity+by+design.">Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design.</a> Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-547 (1996).</li><li>Dymond, J., Boeke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Saccharomyces+cerevisiae+SCRaMbLE+system+and+genome+minimization.">The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization.</a> Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).</li><li>Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign+3.0+is+an+updated+synthetic+biology+toolkit.">GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).</li><li>Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-A-Gene+with+GeneDesign.">Design-A-Gene with GeneDesign.</a> Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).</li><li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+limits+of+genetic+recoding+in+essential+genes.">Probing the limits of genetic recoding in essential genes.</a> Science. 342 (6156), 361-363 (2013).</li><li>Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+eukaryotic+chromosome:+Redesigning+and+SCRaMbLE-ing+yeast.">Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast.</a> Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).</li><li>Dymond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+genomic+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li></ol>

יש לאם, NAP, JAM וJDB מה למסור. RC וAL מועסקים על ידי חברת רוש מדעי חיים, בארה&quot;ב ועבדו על פיתוח היישום עם אם כחלק מהוכחה של ניסוי עיקרון.

התאגדות של זיהוי PCR בזמן אמת לassay genotyping PCRTag היא התפתחות חשובה עבור פרויקט Sc2.0 שכן הוא מאפשר תפוקה גבוהה יותר באופן משמעותי. העבודה הקודמת שצוינה 2.5 תגובות μl ב384 צלחות גם PCR, זמן 1.5 שעות ריצת רכיבה תרמית, ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose, וביאור במדריך של ג&#39;ל. העבודה שהוצגה כאן, נקראת ניתוח qPCRTag, מתגברת על כמה צווארי בקבוק גדולים. ראשית, ריצת qPCRTag מתעבה 4 x 384 צלחות גם לניסוי יחיד שיכול להיות מעובד, כדי להתחיל לסיים (צלחת להגדיר בתוספת זמן ריצה), כבשעה. זה משמעותי לציין כי העלות מגיב לכל גם לניתוח qPCRTag היא באחידות עם הגישה מבוססת ג&#39;ל הנמוך תפוקת agarose. עם זאת, על ידי עקיפת ג&#39;ל אלקטרופורזה וביאור ספר, העבודה qPCRTag מאפשרת חיסכון משמעותי בזמן ובעבודה, המהווים את היתרונות הגדולים. חשוב לציין את העבודה qPCRTag היא entirely תואם עם אוטומציה. חשש עיקרי בשימוש בזיהוי בזמן אמת כפלט של assay PCRTag הוא השיעור של תוצאות חיוביות שגויות ותשלילי שווא. מאז פריימרים PCRTag לא נועדו במקור לשימוש בזמן אמת PCR, צפוי כי לא כל זוגות פריימר יהיו מתאימים לשימוש עם פלט זה. לשם כך חשוב לאמת את הפונקציה וספציפיות של כל זוגות פריימר PCRTag להוציא משנה שלא עובד בassay מבוסס זמן אמת מלפנים. לדוגמא, תוצאות חיוביות שגויות כרומוזום 3 PCRTag ותשלילים הם על ידי-ו-גדול לשחזור בזמן אמת נתונים PCR (איורים 2 ו -3) וניתן לשלול אלה מניתוח נוסף. יתר על כן, זוגות פריימר הידועים להיכשל (הוערך על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה ומוצגים בS6 דמויות וS7 של Annaluru et al. 1) יכול גם להיות שלילי. מטרה זו מושגת בקלות פשוט excluדינג זוגות פריימר הפגומים בעת הגדרת פרוטוקול ההעברה אקוסטית. כמו רוב מבחני תפוקה גבוהה, בכוונתנו להשתמש בזיהוי PCRTag זמן אמת כמסך עיקרי לזהות transformants שיזכה אימות נוספת במורד הזרם. בהמשך לכך, תקן הזהב להקרנה משנית יישאר ניתוח PCRTag עם ג&#39;ל אלקטרופורזה כקריאת הנתונים. מעבר ליישום של ניתוח PCRTag לSc2.0, שילוב מערכות טיפול נוזל ננו המדינה של האמנות עם טכנולוגית ה- PCR בזמן אמת תפוקה גבוהה מאפשר ניתוח מהיר ואוטומטי ויש לו פוטנציאל להשפיע בתחומים רבים. לדוגמא, זרימת עבודה זו יכולה להיות מיושמת על הקרנת תפוקה גבוהה ספרייה, אבחון מחלות זיהומיות, ניתוח Microbiome, ועריכת הגנום חדשני גישות מנסה לשנות לוקוסים מרובים בו זמנית.

<html> Sc2.0, או פרויקט הגנום סינטטי שמרים <a href="http://www.syntheticyeast.org" target="_blank">(www.syntheticyeast.org),</a> יש להגדיר את המטרה של תכנון ובניית הגנום סינטטי אוקריוטים לחלוטין. באמצעות רצף הגנום אצר ביותר של cerevisiae Saccharomyces 3 כנקודת התחלה, כל אחד מהכרומוזומים יניארי שש עשרה כבר מחדש נועד לענות סט של עקרונות עיצוב שיציינו שמירה על כושר תא, שיפור יציבות הגנום, והגדלת גמישות גנטית. לדוגמא, אלמנטים כגון חוסר יציבות חוזר נמחקים מהכרומוזומים Sc2.0. כל המופעים של קודונים תחנת TAG מחדש מקודדים לTAA ל&#39;לפנות &#39;קודון במתח הסופי לכניסתה של חומצת אמינו שאינו מקודדת גנטי. בנוסף מערכת מושרה אבולוציה, מירוץ, מופעלת על ידי מערכת Cre-לקס, מאפשרת יכולת חסרת תקדים ליצירת הגנום נגזר עם מבני רומן 4. &quot;Jove_content&quot;&gt; אלמנט עיצוב מרכזי נוסף בגנום Sc2.0 הוא המבוא של PCRTags, המשמש כסימני מי DNA כדי לאפשר מעקב של ה- DNA הסינתטי והפראי הסוג. PCRTags הם מגזרים בORFs על כרומוזומים סינטטיים קצרים, בקידוד מחדש; בעוד רצפי PCRTag שונים ברמת ה- DNA בין כרומוזומים סינטטיים ופראיים סוג, החלבונים המקודדים זהים ברצף חומצות אמינו ולכן, ככל הנראה, תפקיד. רצפי PCRTag נועדו במיוחד כאתרי קישור פריימר כדי להקל על הגברה סלקטיבית (איור 1 א). עיצוב PCRTag מתבצע באמצעות האלגוריתם &quot;רוב שונה&quot; בGeneDesign 5,6, מניב recoded רצפים סינטטיים שהם בדרך כלל ~ 60% שונים מרצפי ילידים (33% מינימום) עם טמפרטורות התכה בין 58 ° C ו 60 ° C ו amplicon אורכים בין 200-500 זוגות בסיסים 2. Recoding אינו מותר בכל ORF 100 נ&quot;ב הראשון, כאזורים אלה ידועיםיש העדפות מיוחדות במונחים של שימוש קודון 7. יחד, כללי עיצוב אלה מעדיפים ביצועים גבוהים של כמעט כל PCRTags תחת קבוצה אחת של תנאי PCR לפי זוגות פריימר PCRTag הסוג סינטטיים ופראיים באופן בלעדי לאגד ולהגביר DNA הסינתטי וילידים, בהתאמה (איור 1). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig1.jpg" /> איור 1:. סכמטי PCRTag PCRTags () מחדש מקודד רצפים בתוך מסגרות פתוחות קריאה (ORF) של גנים על כרומוזומים Sc2.0. סינטטי (ב) (SYN) ופריימרים PCRTag סוג בר (WT) באופן בלעדי לאגד ולהגביר הדנ&quot;א הגנומי סוג סינטטי ופראי (gDNA), בהתאמה. מוצג כאן הוא ניתוח של קטע KB ~ 30 של הזרוע השמאלית של כרומוזום שש, בודק שלוש עשרה זוגות פריימר PCRTag או באמצעות WT או חצי synVIL2 gDNA כתבנית. במקרים רבים ORF אחד מקודד P יותר מאחדCRTag. נוכחות / היעדר amplicons PCRTag נבחנים באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. amplicons PCRTag הטווח בגודל מ 200 נ&quot;ב ל -500 נ&quot;ב. המינים הנודדים מהר יותר בחלק התחתון של הפנלים הם הדימרים פריימר. ניתוח PCRTag הוכיח להיות כלי חשוב בהרכבה של כרומוזומים Sc2.0. בניסוי 30-50 קילו טיפוסי של ה- DNA הסינתטי, קידוד 20-30 PCRTags, הופך לתאי שמרים להחליף את הסוג בר המקביל DNA 1,2,8. ניתוח PCRTag לאחר מכן נעשה שימוש כדי לזהות transformants שלקודד PCRTags הסוג סינטטי אבל לא פראי פורש קטע זה של ה- DNA, או מה שנקרא &quot;מנצחים&quot;. זה בדרך כלל צורך לבדוק transformants מרובה כדי לזהות זוכי &quot;, כך תפוקה ועלות של ניתוח PCRTag הן שיקולים חשובים. נכון לעכשיו שני כרומוזומים Sc2.0 הושלמו (synIII 1 וsynIXR 2), המייצגים פחות מ -10% מהגנום Sc2.0, altהאף יותר ממחצית הכרומוזומים שנותרו כעת בתהליך סינתזה והרכבה. הסולם של ניתוח PCRTag הנדרש לפרויקט זה outpacing מהר את היכולת להפעיל ג&#39;לי וידני להבקיע את נוכחותו של ה- DNA והעדר DNA סוג בר סינטטיים. על מנת לשפר את התפוקה של assay PCRTag פיתחנו זרימת עבודה באמצעות PCR בזמן אמת לעקוף את השימוש בג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. העבודה עושה שימוש במתקן נוזל בכמות גדולה להפצת mastermix qPCR לבאר כל צלחת multiwell 1,536, מנפק נוזל אקוסטית ננו להעביר תבנית ה- DNA ופריימרים, וCycler תרמית 1,536 qPCR, ומאפשרת לנו למזער תגובות 500 NL ו למקסם את התפוקה. יכול להיות אוטומטי ניתוח יתר על כן. סוג זה של פרוטוקול genotyping תפוקה גבוהה צריכה להיות להכליל לכל פרויקט הדורש ניתוח של שיבוטים רבים בלוקוסים מרובים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Yeast gDNA prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast gDNA</td>
			<td>custom</td>
			<td>custom</td>
			<td>template for real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-washed glass beads (0.5mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5432 Mixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5432</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621807</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte 384PP plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>P-05525</td>
			<td>gDNA source plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DNA Green Mastermix prep and dispensing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536 DNA Green</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5573092001</td>
			<td>real time PCR mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL Microfuge Tube Holder</td>
			<td>ARI</td>
			<td>EST BD060314-1</td>
			<td>microfuge tube holder for deck of Cobra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536 Multiwell Plate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5358639001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobra liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>630-1000-10</td>
			<td>dispense qPCR master mix into 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Plate Spinner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89184-608</td>
			<td>cenrifugation of 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Template and primer dispensing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRTag primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>custom</td>
			<td>premixed forward and reverse, [50uM] each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempPlate pierceable sealing foil, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2923-0110</td>
			<td>temporary seal for PCRTag primer plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte LDV 384 well plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>LP-0200</td>
			<td>pre-mixed primer source plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550 Liquid Handler</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>transfer 2.5nL drops of primer and template DNA into 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plateloc Thermal Microplate Sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G5402-90001</td>
			<td>heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Permanent Seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24212-001</td>
			<td>optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G5402-20008</td>
			<td>can substitute ~2mm thick washers&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>Thermo Scientfic</td>
			<td>75-004-521</td>
			<td>centrifuge heat sealed 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Industrial Air Compressor</td>
			<td>Jun Air</td>
			<td>1795011</td>
			<td>to run the Echo and Heat Sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Real Time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td>requires 220V outlet</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qpcrtag analysis - a high throughput, real time pcr assay for sc2.0 genotyping

פרויקט הגנום סינטטי השמרים (Sc2.0) שמטרתו לבנות 16 שמרי הכרומוזומים מעצב ולשלב אותם לתוך שמרי תא בודד. עד כה כרומוזום אחד סינטטי, 1 synIII, וזרוע כרומוזום סינתטית אחד, synIXR 2, נבנה ותפקודם בvivo תוקף בהעדר כרומוזומים מהסוג בר המקביל. תכונת עיצוב חשובה של כרומוזומים Sc2.0 היא המבוא של PCRTags, שהם רצפים בתוך מסגרות פתוחות קריאה (ORFs) המאפשרות בידול של כרומוזומים סינטטיים מעמיתי הסוג הברים קצרים, בקידוד מחדש. PCRTag פריימרים לחשל סלקטיבי לשני כרומוזומים מסוג סינטטיים או פראיים ונוכחות / היעדרות של כל סוג של DNA ניתן לבדוק באמצעות assay PCR פשוט. את ההודעה סטנדרטית של assay PCRTag הוא להעריך נוכחות / היעדר amplicons ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. עם זאת, עם צפיפות amplicon PCRTag ממוצעת של אחת ל1.5 kb וAGenome גודל ~ 12 Mb, הגנום Sc2.0 הושלם יהיה לקודד כ -8,000 PCRTags. כדי לשפר את התפוקה, פיתחנו assay זיהוי מבוסס PCR בזמן אמת עבור genotyping PCRTag שאנו מכנים ניתוח qPCRTag. העבודה מציינת 500 תגובות NL בצלחת multiwell 1,536, ומאפשר לנו לבדוק עד 768 PCRTags עם שני זוגות פריימר הסוג סינטטיים ופראיים בניסוי יחיד.

בדקנו כרומוזום סינטטי ופראי סוג 3 זוגות פריימר PCRTag 1 עם DNA הגנומי שמרים (gDNA) המופק מארבעה זנים שונים. יש כרומוזום 3 186 זוגות PCRTag פריימר כי היקף אורכו של כרומוזום (synIII הוא ~ 270 KB וכרומוזום מסוג בר 3 הוא ~ 315 KB). כדי לבדוק כל אחד מהזנים ארבעה עם שני הסטים של פריימרים, חילקנו את צלחת multiwell לארבעה רבעים, אחד לכל סוג של gDNA, הקצאת פריימרים PCRTag סינטטיים למחצית העליונה של כל רבע והסוג בר למחצית התחתונה. הדנ&quot;א הגנומי הופק מזני השמרים, שניים מהם לקודד סוג בר כרומוזום 3 (סוג בר, synIXR 2), ואילו כרומוזום נותר שני לקודד הסינתטי 3 (1 synIII, synIII synIXR). תערובת אמן qPCR הייתה לוותר לבאר כל צלחת multiwell 1,536 באמצעות מתקן נוזל בכמות גדולה, ואחריו פריימרים gDNA וPCRTag באמצעות אקו 550. Primers היו ערוכים באופן זהה בכל רבע של צלחת multiwell להשוואה ויזואלית קלה. צלחת multiwell אז חום אטום עם חותם ברור אופטי ונתונים לניתוח PCR בזמן אמת. בניסוי זה אנו qPCRTag נצפו, לחלק, ההגברה ביותר כצפוי, לפי פריימרים סינטטיים באופן בלעדי מוגברים DNA סינטטי ולהיפך (איורים 2 ו -3). עם זאת, אנחנו גם נצפו מספר חריגות מהתבנית הצפויה, מה שמרמז שליליים שווא וחיובי שגויים בבסיס הנתונים. בניסוי זה, יחידת הבקרה התגלתה בבארות 100%, המצביעה על מתקן נוזל בכמות גדולה לוותר בהצלחה mastermix לכל גם על הצלחת (מידע לא מוצג). זה פוסל את המקור פוטנציאלי אחד נגטיבים שווא. בנוסף, חלק 3 PCRTags כרומוזום ידוע להיכשל (מוצג בS6 דמויות וS7 של Annaluru et al. 1), ובם לפחות 2 SYN ו1 WTזוגות פריימר; כך ניתן להתעלם מן הבארות אלה בכל רבע. שליליים שווא אמיתי יכול לנבוע ממחסור בהעברת gDNA תבנית או פריימרים, אולם בחוויה שלנו, בהתחשב בכיול הנכון של אקו 550, כמו גם הכנת gDNA ופריימרים כפי שתואר, זה לא היה מקור עיקרי לשגיאה. בסך הכל בניסוי זה השיעור השלילי הכוזב היה נמוך מאוד לפריימרים WT עם תבנית WT (~ 2%) אם כי מעט גבוה יותר עבור פריימרים SYN SYN עם DNA (~ 8%). תוצאות חיוביות שגויות, זיהוי של אות בבארות בי פריימרים SYN מעורבבים עם WT gDNA (ולהיפך), יכול לנבוע מהגברת צלב או הדימרים פריימר. ואכן, הדימרים פריימר הם לעתים קרובות גלויים על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה (איור 1) ומהווים מקור סביר של טעות. ליישום של qPCR, הבדיקה של עקומות להמיס יכולה להיות שימושית כדי לקבוע אם מינים שונים, כגון הדימרים פריימר, עשויים לתרום לאות. יתר על כן, Performing ניסוי שליטה בי פריימרים מנופקים בהעדר תבנית ה- DNA עשוי לסייע בזיהוי פריימרים עם נטייה לdimerize. הגברה צלב ניתן להבחין על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה, בפרט אם מחזורי PCR יותר מדי מבוצעים או אם טמפרטורת חישול נמוכה מדי. יש לנו ניסיתי לצמצם את מספר התוצאות החיוביות שגויות בגלל ההגברה צלב על ידי אופטימיזציה של שני פרמטרים אלה לפרוטוקול qPCRTag. לבסוף, בוחן את ערכי נקודת מעבר (CP) לכל אחד גם יכול לסייע בזיהוי צבעי יסוד שאינם מתאימים לאיתור מבוסס זמן אמת (איור 3, למשל, Bb22, Fb22, Bb46, Fb46). בסך הכל בניסוי זה השיעור החיובי הכוזב היה נמוך לפריימרים SYN עם תבנית WT (~ 5%) וגבוה יותר לפריימרים WT עם תבנית SYN (~ 10%). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig2.jpg" /> איור 2: מפת חום פלייט בו מוצגות נוכחות / abשיחת היגיון לניסוי qPCRTag. ארבעה סוגים שונים של DNA גנומי (רביעים מופרדים על ידי קווים לבנים מוצקים) היו נתונים לניתוח PCRTag באמצעות סינטטי (SYN) וסוג בר כרומוזום 3 פריימרים PCRTag (WT) (קווים מקווקווים לבנים להפריד SYN (למעלה ) וWT (למטה) בכל רבע). WT וsynIXR gDNA לקודד כרומוזום מהסוג בר 3, מניב הגברה עם פריימרים WT PCRTag. SynIII וsynIII synIXR gDNA לקודד כרומוזום סינטטי 3, מניב הגברה עם פריימרים SYN PCRTag. Primers הם ערוכים בהתאם למיצוב כרומוזומליות מהשמאל לימין ואת מיקומו באופן זהה בארבעת רביעים להשוואה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig3.jpg" /> איור 3: חום פלייטמפת מוצגות מעבר ערך (CP) לניסוי qPCRTag. זהה אותו בסיס הנתונים כמו באיור 2 ופריסת הצלחת לכן זהה. N / מתייחס ל&#39;לא הגברה &#39;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping at JoVE.com

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

qpcrtag-analysis-high-throughput-real-time-pcr-assay-for-sc20

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K Views.  Institute for Systems Genetics. Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Video: qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

כמותי Real-Time PCR באמצעות המדעית Thermo Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

ניתוח של ביטוי גנים בורר אש אמרלד ( Agrilus planipennis) באמצעות Real Time-PCR כמותי

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

PCR מבוסס genotyping שיטה להבחין בין זנים wild-type ו נוי של Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice יתר: שיטה גידול ארבידופסיס צמחים עגבניות ב 96-פלטות היטב genotyping תפוקה גבוהה

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

מהירה ויעילה דג הזברה Genotyping באמצעות PCR עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...