Bu çalışma kısmen desteklenen Ulusal Bilim Vakfı Hibe MCB-0718846 ve (JDB kadar) Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı Sözleşme N66001-12-C-4020. LAM Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Konseyi doktora sonrası bursu tarafından finanse edildi. Bu yazının yayınlanması Roche tarafından desteklenmektedir.

1. (gDNA) Maya genomik DNA hazırlamak <ol><li> 50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl,% 1 SDS içeren maya Liziz Tamponu 9 bir stok hazırlanması (a / h),% 2 Triton X-100 (v / v), 1 mM EDTA, pH 8.0. </li><li> Tipik BY4741 10 arka plan laboratuar suşları için doymuş kültür 100 ~ için ul karşılık malzeme kullanımı ~ 2 x 10 6 hücre, başlangıç ​​olarak. Kültürlenmiş hücreler, bir 1.5 ml mikrofüj tüpe, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüj ile toplanabilir. Süpernatant aspire. </li><li> Maya Liziz Tampon 200 ul ekleyin ve pipetleme hücre pelletini. </li><li> Asit tanelerin seviyesinin, hücre harç seviyesinin altında yaklaşık 1 mm olacak şekilde cam boncuklar yıkanmış ~ 300 ul ekle. </li><li> Bir çeker ocak içinde izoamil alkol, fenol / kloroform ve 200 ul / ekleme (25: 24: 1). Mikrofuge&#39;ye tüp kap ve bu çalkalama sırasında sızıntı neden olur hiçbir boncuk başlık ve tüp arasında sıkışmış sağlamak(Adım 1.6). Mix ve kapağının sızdırmaz olduğundan emin olmak için 3 kez ters çevirin. </li><li> Bu tür bir Eppendorf 5432 bir tezgah üstü mikser kullanılarak, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile boru çalkalayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 20,800 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Aktarım,% 100 etanol içinde 1 ml içeren yeni bir mikro santrifüj tüpüne sulu fazın 75 ul. Karıştırmak için 10 kez ters çevirin. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 20,800 x g&#39;de santrifüj ile DNA pelleti. </li><li> DNA pelet yerinden oynatmamaya olmadan süpernatant aspire. % 70 etanol içinde 500 ul ile pelet yıkayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 20,800 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> DNA pelet yerinden oynatmamaya ve genellikle yaklaşık 10 dk fazla etanol çekinceye kadar açık mikrofuge&#39;de kapağı ile pelet hava kurumasına olmadan süpernatant aspire. </li><li> 75 10 mM Tris, pH 7.4 ul ve karıştırmak için vorteks DNA pelletini. Belirsiz bir süre -20 ° C&#39;de örnek saklayın. Bir kullanılarak numunedeki DNA konsantrasyonu ölçümüRNA DNA ayıran qubit, gibi fluorimeter tezgah üzeri. GDNA son konsantrasyonu ~ 1-2 ng / ml olduğundan emin olun. </li><li> Karıştırmak için su ve vorteks ile genomik DNA 1:10 seyreltme hazırlayın. </li><li> Kısım nano ölçekli akustik bir sıvı dağıtıcı (aşama 3) ile uyumlu olan bir kaynak plakasının uygun kuyuya seyreltildi gDNA 30 ul. Bir Labcyte Echo 550 kullanıyorsanız, 384 polipropilen plaka (384PP plaka) kullanın. Not: uygun bir sızdırmaz zaman bu plaka, -20 ° C&#39;de, en az bir ay depolanabilir. </li></ol> 2. 1.536 multiwell plaka içine hazırlayın ve Dağıtım qPCR Master Mix <ol><li> Karıştırmak için 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp ve vorteks böyle LightCycler 1536 DNA Yeşil Master olarak QPCR ana karışımı 850 ul, hazırlayın. Herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için oda sıcaklığında 20.800 xg&#39;de 2 dakika süreyle QPCR ana karışımı santrifüjleyin. Tek 1536 çok oyuklu bir plaka için gerekli qPCR ana karışımı bileşenleri aşağıdaki gibidirs: <ol><li> Enzim usta karışımı (konsantre Yeşil Usta Tüp 1, 5x), SYBR 42.5 ul (20x konsantre Yeşil Usta Tüp 4) 170 ul ve su 637,5 ul birleştirin. </li></ol></li><li> Dağıtın iyi böyle Sanat Robbins Cobra gibi dökme sıvı dağıtıcı kullanılarak 1.536 multiwell plaka içine / 500 nl. (2.2.1-2.2.4 Cobra özellikle atıfta adımları Not.) <ol><li> Aşağıdaki ayarlarla bir dağıtım programı oluşturun: Sıvı sınıf, su; aspirat hacmi 800 ul; hacim, 500 nl dağıtmak; süresi, 20 saniye yıkayın. Dağıtım ayarlarında, dağıtım hızı 49.6 mm / sn olarak ayarlanır doğrulayın ofset dağıtım 0,25 mm ve aşırı aspire sıvı de geri kaynağına reçete edilecektir. </li><li> Mikrofuge&#39;de tüp kapağını keserek ya da sadece açık bırakın güverte pozisyonunda 1. bulunur mikrofuge&#39;de tüp tutucu, iyi A1 qPCR ana karışımı içeren mikrofuge&#39;ye tüp yerleştirin. Aspirat düzenleyerek A1 &#39;de aspire&#39; SetE ayarları. </li><li> Önce &#39;koşmak&#39; vurmak sonra adım 2.2.2 kurmak programın ilk de-seçilmesi aspire ve dağıtmak adımlarla QPCR ana karışımı dağıtım ve bir yıkama adımı gerçekleştirmek. Tamamlandığında, aspire yeniden seçin ve qPCR ana karışımı dağıtmak için tam programını çalıştırmadan önce adımları dağıtmak. Cobra Başbakan sisteme hizmet veren az 10 dakika ilk yıkama aşaması, boşta oturan olmuşsa, gereksizdir. </li><li> Her oyuğa QPCR ana karışımı dağıtmak için &#39;koşmak&#39; vur. </li></ol></li><li> Iyi 1536 multiwell plaka (düşük hızda PCR plaka eğiren kullanarak 30 sn) kısa santrifüj her altındaki qPCR ana karışımı toplayın. </li></ol> 3. Dağıtım Şablon DNA ve 1.536 multiwell plaka içine Astarlar <ol><li> Böyle Echo 550 gibi bir akustik sıvı transferi sistemi kullanılarak 1536 multiwell plaka istenen kuyulara seyreltilmiş gDNA 5 nl (adım 1.3) koyun. <ol><li> Ech İçin550 o Plaka Reformat yazılımı kullanmak veya alternatif transferi programlamak için özel bir Excel sağlar. Program fiziksel gDNA (adım 1.3) dağıtılan sahip iyi içine kaynak eşleşir gDNA için iyi seçilmiş bir kaynak olun. 384PP plaka sıvı yüzey aktif olmayan bir tampon olduğunu gösterir kaynak plaka tipi &#39;384PP_AQ_BP2&#39; seçin. </li></ol></li><li> Primerler, öne doğru önceden karıştırılmış ve bu Echo 550 gibi bir akustik sıvı transfer sistemi kullanılarak 1536 çukurlu plakanın arzu edilen kuyulara 50 uM, her biri bir nihai konsantrasyona kadar tersine 10 NL koyun. <ol><li> Sıvı transfer sistemi için, Plaka Reformat yazılımı kullanmak veya alternatif transferi programlamak için özel bir Excel sağlar. NOT: Burada o kolay yani 1,536 multiwell plaka üzerinde düzeni görsel gerçek zamanlı PCR sonuçları incelemek için primerlerin kromozomal sırasını örtüşmesi şeklindedir primerler dağıtmak mümkündürDaha sonra (adım 6). </li><li> Akustik bir sıvı dağıtıcısı ile uyumlu olan bir plaka primerleri karışımlar. Echo 550, bir Labcyte 384LDV (düşük ölü hacim) plaka kullanmak ve kaynak plaka tipi &#39;384LDV_AQ_B&#39; sıvı hiçbir proteinler ile basit bir tampon olduğunu göstermek için Yankı programlama seçin. </li></ol></li></ol> 4. Mühür ve Santrifüj 1536 multiwell plaka <ol><li> Böyle Plateloc Termal Mikroplaka Sealer olarak bir mikroplaka mühürleyen sistemi kullanarak, hemen ısı mühürleyen cihazı ile uyumlu optik net mühür kullanılarak 1.536 çukurlu plaka mühür. Bulaşmaya işaretleri önlemek için mühür yüzeyine dokunmayın. <ol><li> Plateloc Termal Mikroplaka Sealer kullanıyorsanız, aşağıdaki ayarları kullanın: süresi 2.0 sn, mühür sıcaklığı 162 ° C, hava basıncı 82 psi mühür. Bu cihaz ısınmaya ~ 5 dakika sürer ve böylece önceden açık olmalıdır. </li><li> Plateloc Termal Mikroplaka macunu kullanarak ise, adaptöR iyi bir sızdırmazlık sağlamak için bir araç aşamasında 1536 çukurlu plakanın yüksekliğini artırmak için kullanılmalıdır. NOT: Plateloc Termal Mikroplaka Sealer için Sahne Plate satın tercih olmakla birlikte, alternatif bir çözüm 1,536 multiwell plaka yüksekliğini artırmak için köşelere herhangi bir donanım mağazasında mevcut dört ~ 2 mm kalınlığında standart pulları eklemek etmektir. </li></ol></li><li> Hemen her bir altındaki tüm reaktifler toplamak için, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 2000 x g&#39;de sızdırmaz 1536 çukurlu plaka santrifüj. </li></ol> 5. Real Time PCR <ol><li> Program, bir erime eğrisi analizine, ardından iki adımlı bir büyütme protokolüne böyle LightCycler 1536 olarak 1536 qPCR aleti. Aşağıdaki gibi LightCycler 1.536 yazılım programı kurmak kullanma: <ol><li> Ön inkübasyon: 95 ° C, 1 dakika tutun, rampa oranı 4.8 ° C / sn, hiçbir kazanım. </li><li> İki Adım Büyütme: [95 ° C 30 döngü, hiçbir tutma,oranı 4.8 ° C / sn rampa, hiçbir kazanım; 64 ° C, 30 saniye tutun, rampa oranı 2.5 ° C / sn, tek edinme]. </li><li> Eritin eğrisi: 95 ° C, 10 sn, rampa oranı 4.8 ° C / sn, hiçbir kazanım; 60 ° C, 1 dakika, rampa oranı 2.5 ° C / sn, herhangi bir satın alma; 97 ° C, rampa oranı 0.1 ° C / sn, 5 satın almalar / (sürekli) ° C. </li><li> Serin: 40 ° C, 30 saniye, rampa oranı 2.5 ° C / sn, hiçbir kazanım. </li></ol></li><li> Run Tanımı sekmesinde &quot;Yeşil intercalating Boya &#39;olarak algılama biçimi ayarlayın. </li><li> Run Tanımı sekmesinde &#39;Master Control&#39; için pipetleme kontrolünü ayarlayın. Bu özellik, bir iç kontrol olarak hizmet eder ve varsayımsal yanlış negatifler tespit etmek yararlıdır 1536 çok oyuklu bir plaka, her çukuruna qPCR ana karışımı varlığını kontrol eder. </li><li> 1.536 QPCR aracı haline adımlarla 2-4 hazırlanan 1536 çukurlu plaka takın ve programı çalıştırın. </li></ol> 6. Veri Analizi <ol><li> PerfQPCR yazılım içinde verilerin görsel kontrol kapatýnýz. NOT: 1.536 yazılım hem amplifikasyon görüntülenmesini sağlayarak ve çağrısı (pozitif, negatif, geçersiz, N / A, Şekil 2) gösteren bir ısı haritası yanı sıra, eğriler eritin (pozitif ya da gri renk skalası sürgülü, geçiş noktası değeri Negatif için; Şekil 3), ya da bir bitiş noktası floresan (EPF) değeri () renk skalası kayar. </li><li> Ham verilerden veya cihazdan çevrimdışı işleme için hesaplanan verilerde biriyle 1,536 formda Yazılım bir .txt dosyası (sonuç tablosu) veya .xml dosyası İhracat verileri. NOT: Yüksek güven ile olumlu / olumsuz ve Cp değeri aramaları belirlerken 1.536 yazılımı yerleşik özel otomatik geçiş noktası (Cp) çağıran algoritması nispeten düşük düşük alt mikrolitre reaksiyon hacimlerinde dikkate şekil ve amplifikasyon eğrisinin eğimini alır floresan değerleri. </li><li> LightCycler DNA Yeşil Usta kullanımı iseqPCR d, tüm kuyuları &#39;master kontrol&#39; geçti doğrulayın. Bir fail de qPCR ana karışımı ve eksik veri noktası potansiyel bir yanlış negatif kabul edilmelidir almadı gösterir. Tüm kuyuları &#39;master kontrol&#39; geçti doğrulayın. Bir fail de DNA MasterMix almak ve eksik veri noktası potansiyel bir yanlış negatif dikkate almadı gösterir. </li></ol>

<ol>
	<li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome.">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344 (6179), 55-58 (2014).</li><li>Dymond, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+chromosome+arms+function+in+yeast+and+generate+phenotypic+diversity+by+design.">Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design.</a> Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-547 (1996).</li><li>Dymond, J., Boeke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Saccharomyces+cerevisiae+SCRaMbLE+system+and+genome+minimization.">The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization.</a> Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).</li><li>Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign+3.0+is+an+updated+synthetic+biology+toolkit.">GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).</li><li>Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-A-Gene+with+GeneDesign.">Design-A-Gene with GeneDesign.</a> Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).</li><li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+limits+of+genetic+recoding+in+essential+genes.">Probing the limits of genetic recoding in essential genes.</a> Science. 342 (6156), 361-363 (2013).</li><li>Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+eukaryotic+chromosome:+Redesigning+and+SCRaMbLE-ing+yeast.">Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast.</a> Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).</li><li>Dymond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+genomic+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li></ol>

LAM, NAP, REÇEL ve JDB ifşa hiçbir şey yok. RC ve AL, Roche Yaşam Bilimleri tarafından ABD istihdam ve prensip deney bir kanıtı parçası olarak LAM ile uygulama geliştirmeye çalışılır.

Önemli ölçüde daha yüksek verim sağlar gibi PCRTag genotiplemesi tahlil içine gerçek zamanlı PCR algılama Kuruluş Sc2.0 projesi için önemli bir gelişmedir. Bir önceki iş akışı 384 gözlü PCR plakaları, 1.5 saat termal döngü çalışma süresi, agaroz jel elektroforezi ve jel manuel açıklama 2.5 ul reaksiyonlar belirtilmiş. qPCRTag analizi olarak adlandırılan Burada sunulan iş akışı, birkaç büyük darboğazlar üstesinden gelir. İlk olarak, bir qPCRTag çalıştırmak yaklaşık bir saat içinde bitirmek (plaka kurmak artı çalışma süresi) başlar, işlenebilir tek bir deney haline 4 x 384 kuyucuğu yoğunlaşır. Bu qPCRTag analizi için kuyu başına reaktif maliyeti daha düşük verim agaroz jel bazlı yaklaşımla eşit olduğuna dikkat etmek önemlidir. Ancak, jel elektroforezi ve manuel şerhi engellemeyi, qPCRTag iş akışı önemli avantajları zaman ve emek önemli tasarruf, tanıyor. Önemlisi qPCRTag iş akışı tr olduğunuotomasyon ile uyumlu yollarla ortaya çıktığı tam. PCRTag tahlilinde çıktısı olarak gerçek zamanlı saptama kullanımı ile büyük bir endişe yanlış pozitif ve yanlış negatif oran. PCRTag primerler başlangıçta gerçek zamanlı PCR kullanılmak üzere tasarlanmamıştır olduğundan, tüm primer çiftleri, bu çıkışı ile kullanım için uygun olması beklenmektedir. Bu amaçla, ön gerçek zaman bazlı bir deneyde çalışmaz alt kümesini tutmak için tüm PCRTag primer çiftleri fonksiyonu ve özelliğini doğrulamak için önemlidir. Örneğin, kromozom 3 PCRTag yanlış pozitif ve negatif olan by-ve-large PCR verileri (Şekil 2 ve 3) gerçek zamanlı olarak tekrarlanabilir ve bu diğer analizler dışında olabilir. Dahası, başarısız olduğu bilinmektedir primer çiftleri (jel elektroforezi ile değerlendirildi ve Şekiller S6 ve ark. 1 Annaluru arasında S7 gösterilen) de dahil edilebilir. Bu kolayca etkili olmuştur basit yapılırding akustik transfer protokolü hatalı primer çiftleri kurarken. En yüksek kapasiteli deneyleri gibi, biz daha fazla aşağı doğrulama hak transformantların belirlemek için birincil ekran olarak gerçek zamanlı PCRTag algılama kullanmak niyetinde. Daha sonra, ikincil tarama için altın standart okuma olarak jel elektroforezi ile PCRTag analizi kalacaktır. Yüksek verimlilik, gerçek zamanlı PCR teknolojisi ile state-of-the-art nano sıvı taşıma sistemleri birleştirerek Sc2.0 için PCRTag analizi uygulaması, ötesinde hızlı ve otomatik analiz sağlar ve birçok alanda etkileme potansiyeline sahiptir. Örneğin, bu iş akışı yüksek kapasiteli kütüphane taraması, bulaşıcı hastalık tanısı, mikrobiyomları analizi ve üstün genom düzenleme uygulanan olabilir aynı anda birden fazla lokus değiştirmeye teşebbüs yaklaşımları.

Sc2.0 veya Sentetik Maya Genom Projesi ( <a href="http://www.syntheticyeast.org" target="_blank">www.syntheticyeast.org</a> ), tasarımı ve tamamen sentetik ökaryotik genom inşa hedefini belirledi. Bir başlangıç ​​noktası olarak Saccharomyces cerevisiae 3 derece küratörlüğünü genom dizisi kullanarak, onaltı doğrusal kromozomların her biri, hücre zindeliği korumak genom istikrarı geliştirmek ve genetik esnekliğinin artırılması belirttiğiniz tasarım ilkeleri bir dizi karşılamak üzere yeniden tasarlandı. Örneğin, bu gibi tekrarlar olarak destabilize edici elemanlar Sc2.0 kromozom silinir. TAG durdurma kodonunun tüm örnekleri olmayan bir genetik olarak kodlanan amino asidin sokulması için son suşunda bir kodon &#39;serbest&#39; TAA yeniden kodlanır. Ayrıca Cre-lox sistemi tarafından etkin bir uyarılabilir evrim sistemi, Scramble, yeni yapılar 4 türev genomları üretmek için benzersiz kapasite sağlar. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Sc2.0 genomunda başka önemli tasarım öğesi, sentetik ve yabani tip DNA izlemeyi etkinleştirmek için DNA filigran olarak hizmet PCRTags, giriştir. PCRTags sentetik kromozom üzerinde ORF kısa, yeniden kodlanmış segmentler; PCRTag sekansları sentetik, vahşi tip kromozom arasında, DNA seviyesinde farklılık ise, kodlanan proteinlerin amino asit dizisi ve bu nedenle, muhtemelen, işlev olarak aynıdır. PCRTag sekansları, özellikle, seçici amplifikasyon (Şekil 1A) kolaylaştırmak için primer bağlanma bölgeleri olarak tasarlanmıştır. PCRTag tasarımı, tipik olarak 58 ° C ile 60 ° C arasında erime sıcaklıkları olan, doğal dizilerden (en az% 33) daha ~ 60% farklı olan sentetik sekanslar Recoded, sonuçta GeneDesign 5,6 &#39;en farklı&#39; algoritması kullanılarak gerçekleştirilmektedir amplikonu 200-500 baz çifti 2 arasında uzunlukları. Bu bölgeler bildiği gibi Recoding her ORF ilk 100 bp mesafede izin verilmezkodon kullanımının 7 bakımından özel tercihleri ​​vardır. Birlikte, bu tasarım kuralları, sentetik ve yabani tip PCRTag primer çiftleri sadece sentetik ve doğal DNA sırasıyla (Şekil 1B) bağlamak ve yükseltmek sayede PCR koşulları tek bir set altında hemen hemen tüm PCRTags yüksek performansını tercih. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig1.jpg" /> Şekil 1:. PCRTag şematik bir (A), PCRTags Sc2.0 genlerin kromozomlar üzerindeki açık okuma çerçeveleri (ORF) içindeki dizileri yeniden kodlanır. (B) Sentetik (sin) ve yabani tip (WT) PCRTag primerler özel olarak ise, bağlanma ve (gDNA), sentetik ve yabani tip genomik DNA&#39;yı büyütmek. Şablon olarak WT veya yarı synVIL2 gDNA kullanarak onüç PCRTag primer çiftleri test kromozomun altı sol kolunun bir ~ 30 kb segmentinde bir analizi, burada gösterilmektedir. Pek çok durumda, tek bir ORF birden fazla P kodlayanCRTag. PCRTag amplikonlarının varlığı / yokluğu agaroz jel elektroforez ile değerlendirilir. PCRTag amplikonlar 200 bp ila 500 bp uzunluğundadır. Panellerin alt kısmında hızlı göç türler astar dimerleri bulunmaktadır. PCRTag analizi Sc2.0 kromozomların mecliste önemli bir araç olduğunu kanıtlamıştır. 20-30 PCRTags kodlayan sentetik bir DNA Tipik bir deneyde, 30-50 kb, olarak, karşılık gelen vahşi tip DNA 1,2,8 yerine, maya hücreleri içine transforme edilir. PCRTag analizi daha sonra DNA bu segmenti kapsayan sentetik değil vahşi tip PCRTags kodlayan transformantların tanımlamak için kullanılan, ya da &#39;kazananlar&#39; olarak adlandırılan. Bu &#39;kazananları&#39; belirlemek, böylece throughput ve PCRTag analizi maliyeti önemli hususlar şunlardır birden fazla transformantların test genellikle gereklidir. Şu anda iki Sc2.0 kromozom Sc2.0 genomunun% 10&#39;dan az temsil (synIII 1 ve synIXR 2) tamamlanmış, although fazla kalan kromozomların yarısı halen sentezini ve montaj geçiyor. Bu proje için gerekli PCRTag analizi ölçeği, hızlı, sentetik DNA ve yabani tip DNA varlığı veya yokluğunun jeller manuel olarak çalıştırmak ve skor yeteneği aşmıştır. Biz agaroz jel elektroforezi kullanımını engelleyecek şekilde gerçek zamanlı PCR kullanarak bir iş akışı geliştirdik PCRTag tahlil verimini artırmak için. iş akışı 1536 çok oyuklu bir plaka, şablon DNA ve primerler aktarmak için bir nano ölçekli akustik bir sıvı dağıtıcı her oyuğuna qPCR MasterMix dağıtmak için bir sıvı kimyasal dağıtıcı kullanan ve 1536 qPCR termal döngü cihazı, bize 500 nl tepkileri küçültmek izin veren ve verimi en üst düzeye çıkarmak. Ayrıca analiz otomatik hale getirilebilir. Yüksek verimlilik Genotipleme protokolünün Bu tip çoklu loci birçok klonlarının analizi gerektiren herhangi bir proje için genellenebilir olması gerekir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Yeast gDNA prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast gDNA</td>
			<td>custom</td>
			<td>custom</td>
			<td>template for real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-washed glass beads (0.5mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5432 Mixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5432</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621807</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte 384PP plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>P-05525</td>
			<td>gDNA source plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DNA Green Mastermix prep and dispensing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536 DNA Green</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5573092001</td>
			<td>real time PCR mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL Microfuge Tube Holder</td>
			<td>ARI</td>
			<td>EST BD060314-1</td>
			<td>microfuge tube holder for deck of Cobra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536 Multiwell Plate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5358639001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobra liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>630-1000-10</td>
			<td>dispense qPCR master mix into 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Plate Spinner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89184-608</td>
			<td>cenrifugation of 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Template and primer dispensing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRTag primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>custom</td>
			<td>premixed forward and reverse, [50uM] each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempPlate pierceable sealing foil, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2923-0110</td>
			<td>temporary seal for PCRTag primer plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte LDV 384 well plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>LP-0200</td>
			<td>pre-mixed primer source plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550 Liquid Handler</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>transfer 2.5nL drops of primer and template DNA into 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plateloc Thermal Microplate Sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G5402-90001</td>
			<td>heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Permanent Seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24212-001</td>
			<td>optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G5402-20008</td>
			<td>can substitute ~2mm thick washers&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>Thermo Scientfic</td>
			<td>75-004-521</td>
			<td>centrifuge heat sealed 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Industrial Air Compressor</td>
			<td>Jun Air</td>
			<td>1795011</td>
			<td>to run the Echo and Heat Sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Real Time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td>requires 220V outlet</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qpcrtag analysis - a high throughput, real time pcr assay for sc2.0 genotyping

Sentetik Maya Genom Projesi (Sc2.0) 16 tasarımcı maya kromozom oluşturmak ve tek bir maya hücresi bunları birleştirmeyi amaçlamaktadır. Tek sentetik kromozomu, synIII 1, ve bir sentetik kromozom kolu, synIXR 2 Bugüne kadar inşa ve in vivo fonksiyon gelen vahşi tip kromozom yokluğunda onaylanmıştır. Sc2.0 kromozomların önemli tasarım özelliği kendi vahşi tip muadilleri sentetik kromozom farklılaşmasını sağlayan açık okuma çerçeveleri (ORF) kapsamında kısa, yeniden kodlanmış dizileri olan PCRTags, giriştir. PCRTag, sentetik ya da vahşi tip kromozom ve basit bir PCR tahlili kullanılarak test edilebilir DNA her tür varlığı / yokluğu birine seçici olarak yeniden birleşir primerleri. PCRTag tahlilin standart okuma agaroz jel elektroforezi ile amplikonların varlığını / yokluğunu değerlendirmektir. Ancak, 1.5 kb ve ag başına bir ortalama PCRTag amplikon yoğunluğu ile~ 12 Mb enome boyutu tamamlanmış Sc2.0 genomu yaklaşık 8.000 PCRTags kodlamak. Verimlilik artırmak için, biz qPCRTag analizi diyoruz PCRTag genotipleme için gerçek zamanlı PCR-tabanlı algılama tahlil geliştirdik. İş akışı bize tek bir deneyde, sentetik ve yabani tip primer çiftleri hem 768 PCRTags kadar test etmenize olanak sağlayarak, bir 1.536 multiwell plaka 500 nl reaksiyonları belirtir.

Biz dört farklı suşları çıkarılan maya genomik DNA (gDNA) sentetik ve yabani tip kromozom 3 PCRTag primer çiftleri 1 test ettik. Kromozom 3 kromozomun uzunluğu yayılan 186 PCRTag primer çiftleri (synIII olduğunu ~ 270 kb ve yabani tip kromozom 3&#39;tür ~ 315 kb) sahiptir. Her iki primer seti ile dört türünün her test etmek için, alt yarısı, her bir çeyrek daire üst yarısı ve vahşi tip sentetik PCRTag primerleri atama, dört çeyrek, gDNA her türü için içine oyuklu bir plaka ayrılmıştır. Genomik DNA, vahşi tip kromozom 3 (vahşi tip, synIXR 2) kodlayan ikisi maya cinsleri, elde edilen geri kalan iki kodlayan sentetik kromozom 3 (synIII 1, synIII synIXR) iletilir. QPCR ana karışımı olarak aynı şekilde düzenlenmiştir, Eko 550 primerleri kullanılarak gDNA ve PCRTag primerler ardından bir sıvı kimyasal dağıtıcı kullanan bir 1536 çukurlu bir levhanın her bir gözü içerisine edildikolay görsel karşılaştırma için multiwell plakanın her kadranda. çukurlu plaka daha sonra, optik bakımdan saydam bir conta ile sızdırmaz kılınmış ve gerçek zamanlı PCR analizine tabi ısı oldu. Beklendiği gibi, bu qPCRTag deneyde sentetik primerler özel olarak sentetik DNA ve tersi amplifiye sayede, büyük bir kısmı, amplifikasyonu için, gözlenen (Şekil 2 ve Şekil 3). Ancak, biz de veri kümesi içinde yanlış negatifler ve yanlış pozitif düşündüren, beklenen desen birkaç sapmalar görülmüştür. Bu deneyde, ana kontrol başarılı bir plaka üzerindeki her içine MasterMix tevzi dökme sıvı dağıtıcı gösteren kuyuların% 100 olarak tespit edilmiştir (veriler gösterilmemiştir). Bu yanlış negatif bir potansiyel kaynak dışladı. Buna ek olarak, kromozom 3 PCRTags en ​​az 2 sin ve 1 ağırlık dahil olmak üzere, (Şekil S6 gösterilen ve Annaluru et al S7. 1) başarısız bilinmektedirprimer çiftleri; dolayısıyla bu kuyular, her kadranda göz ardı edilebilir. Doğru yanlış negatifler doğru Echo 550 kalibrasyon yanı sıra gDNA hazırlanması ve tarif edildiği gibi primerler verilen, deneyimlerimiz, ancak şablon gDNA&#39;sından veya primer transferi eksikliğinden ortaya çıkabilecek, bu hatanın önemli bir kaynak olmamıştır. Genel olarak, bu deneyde, yanlış negatif oran WT şablonu (~% 2), syn-DNA (~% 8) ile SYN primerler için biraz daha yüksek olmasına rağmen wt primerler için son derece düşüktü. Yanlış pozitif, SYN primerleri WT gDNA (ve tersi) ile karıştırılır kuyularda sinyalin tespiti, çapraz büyütme veya primer dimerleri ortaya çıkabilir. Nitekim, astar dimerleri jel elektroforezi (Şekil 1B) tarafından sıklıkla görülebilir ve hata makul bir kaynak oluşturmaktadır. QPCR uygulanması için, erimiş kitle eğrileri incelenmesi Bu primer dimerler olarak, farklı türlerin, bir sinyale katkıda edilebilir olup olmadığını belirlemek için yararlı olabilir. Bundan başka, perfprimerler dimerize etme eğiliminde olan primerler teşhis edilmesine yardımcı olabilir şablon DNA yokluğunda tevzi sayede bir kontrol deneyini oluşturmayan. Çok sayıda PCR döngüsü gerçekleştirilir veya tavlama sıcaklığı çok düşükse çapraz amplifikasyonu, özellikle de jel elektroforezi ile gözlenebilmektedir. Biz qPCRTag protokolü için bu parametrelerin ikisi optimize ederek nedeniyle çapraz amplifikasyon yanlış pozitiflerin sayısını en aza indirmek için çalıştık. Son olarak, gerçek zamanlı tabanlı algılama için uygun değildir primerler belirlemenize yardımcı olabilir her iyi için geçiş noktası (Cp) değerlerini inceleyerek (örn Şekil 3, BB22, Fb22, Bb46, Fb46). Genel olarak bu deneyde yanlış pozitif oran SYN şablonu (~% 10) ile WT primerleri WT şablonu (~% 5) ve daha yüksek olan SYN primerler için düşüktür. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52941/52941fig2.jpg" /> Şekil 2: varlığı / ab görüntüleyen Plakalı ısı haritasıBir qPCRTag deney için sense arama. SYN ayırmak için, beyaz kesikli çizgiler genomik DNA (kadran beyaz katı çizgiler ile ayrılmış) sentetik (sin) kullanılarak PCRTag analizine tabi tutulmuştur ve vahşi tip (WT) kromozom 3 PCRTag primerleri (dört farklı (üst Her kadranda) ve WT (alt)). WT ve synIXR gDNA. SynIII ve synIII synIXR gDNA SYN PCRTag primerleri ile PCR amplifikasyonu elde edilmiştir sentetik kromozom 3 şifreleyen WT PCRTag primerleri ile PCR amplifikasyonu elde edilmiştir, vahşi tip kromozom 3 kodlar. Astarlar kendi sol-sağ kromozomal konumlandırma göre dizilmiş ve karşılaştırma için dört kadranda aynı konumlandırılmış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52941/52941fig3.jpg" /> Şekil 3: Plakalı ısıBir qPCRTag deney için geçiş noktası (CP) değeri gösteren haritası., Şekil 2 ile aynı veri seti ve plaka yerleşimi dolayısıyla aynıdır. N / A &#39;hayır amplifikasyon&#39; anlamına gelir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping at JoVE.com

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

qpcrtag-analysis-high-throughput-real-time-pcr-assay-for-sc20

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K Görüntüleme.  Institute for Systems Genetics. Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Video: qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Biyoloji

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Emerald Kül Freze Gen İfade Analizi ( Agrilus planipennis) Kullanarak Kantitatif Real Time PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

Lignocellulosic Malzemeler için Yüksek verim Saccharification Testi

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

Wild-tip ve Süs Çeşitler arasında ayırt A PCR tabanlı Genotiplendirme Yöntemi Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: Büyüyen Bir Yöntem Arabidopsis</emYüksek Verim Genotiplendirme için 96-iyi Tabaklar ve Domates Tesisleri>

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Peptid Epitopların Kantitatif Analiz için bir yüksek veri akışı MHC II Bağlanma Deneyi

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...