وأيد هذا العمل في جزء من المؤسسة الوطنية للعلوم منح MCB-0718846 وزير الدفاع وكالة مشاريع البحوث المتقدمة العقد N66001-12-C-4020 (لمجلس الدفاع المشترك). وقد تم تمويل LAM من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا. برعاية نشر هذا المقال من قبل شركة روش.

1. إعداد الحمض النووي الجيني الخميرة (gDNA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مخزون من الخميرة الاحتياطي تحلل 9 يحتوي على 50 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 100 مم كلوريد الصوديوم، 1٪ SDS (ث / ت)، 2٪ تريتون X-100 (V / V)، 1 ملم EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما تبدأ استخدام المواد ~ 2 × 10 6 خلايا، والتي تتطابق عادة إلى ~ 100 ميكرولتر من ثقافة مشبعة لسلالات مختبر للBY4741 10 الخلفية. وينبغي جمع الخلايا المستزرعة بواسطة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة في أنبوب 1.5 مل microfuge. نضح طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من الخميرة الاحتياطي تحلل و resuspend بيليه الخلية بواسطة pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ~ 300 ميكرولتر من حمض غسلها الخرز الزجاجي مثل أن مستوى الخرز حوالي 1 ملم دون مستوى الطين الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غطاء الدخان إضافة 200 ميكرولتر من الفينول / كلوروفورم / كحول أيزو أميلي (25: 24: 1). سقف لmicrofuge أنبوب وضمان عدم وجود حبات عالقون بين الغطاء وأنبوب لأن ذلك سيؤدي إلى تسرب خلال الهز(الخطوة 1.6). عكس 3 مرات لخلط والتحقق من اغلاق الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هز أنبوب لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام خلاط الفوق مثل إيبندورف 5432. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 20800 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 75 ميكرولتر من المرحلة المائية لأنبوب microfuge جديدة تحتوي على 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪. عكس 10 مرات لخلط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي في 20800 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف دون طرد بيليه DNA. غسل بيليه مع 500 ميكرولتر من الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 20800 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف دون طرد بيليه DNA والهواء الجاف بيليه مع غطاء microfuge مفتوحة حتى تبخرت الايثانول الزائد، الذي هو عادة حوالي 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وبيليه الحمض النووي في 75 ميكرولتر من 10MM تريس 7.4 درجة الحموضة ودوامة لخلط. تخزين العينة في -20 ° C إلى أجل غير مسمى. قياس تركيز الحمض النووي في العينة باستخدامالفوق مقياس التألق مثل و qubit، والذي يميز الحمض النووي RNA من. تأكد من أن تركيز النهائي من gDNA هو ~ 1-2 نانوغرام / ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1:10 تخفيف من الحمض النووي الجيني باستخدام المياه ودوامة لخلط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 30 ميكرولتر من المخفف gDNA في البئر المناسب لوحة مصدر متوافق مع موزع السائل الصوتية النانو (الخطوة 3). في حالة استخدام Labcyte صدى 550، استخدم لوحة البولي بروبلين 384 بئر (384PP لوحة). ملاحظة: عندما مختومة بشكل مناسب هذه اللوحة يمكن تخزينها لمدة شهر واحد على الأقل في -20 ° C. </li></ol> 2. إعداد والاستغناء QPCR ميكس ماجستير في 1536 لوحة Multiwell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 850 ميكرولتر من QPCR مزيج الرئيسي، مثل LightCycler 1536 DNA الأخضر الماجستير، في أنبوب 1.5 مل microfuge ودوامة لخلط. أجهزة الطرد المركزي لمزيج الرئيسي QPCR لمدة 2 دقيقة على 20800 XG في درجة حرارة الغرفة لإزالة أي فقاعات. مكونات مزيج الرئيسي QPCR اللازمة لواحد 1536 لوحة multiwell هي على النحو التاليالصورة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين 170 ميكرولتر من مزيج الرئيسي انزيم (ماجستير الأخضر أنبوب 1، 5X تتركز)، 42.5 ميكرولتر من SYBR (ماجستير الأخضر الأنبوبة 4، 20x ومركزة)، و637.5 ميكرولتر من الماء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن 500 NL / جيد في 1536 لوحة multiwell باستخدام موزع السائل بكميات كبيرة مثل فن روبنز كوبرا. (لاحظ أن الخطوات 2.2.1-2.2.4 تشير تحديدا إلى كوبرا). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء برنامج صرف بالإعدادات التالية: فئة السائلة، والمياه. حجم نضح، 800 ميكرولتر. الاستغناء عن حجم، 500 NL. غسل الوقت، و 20 ثانية. في إعدادات الاستغناء، تحقق من تعيين سرعة الاستغناء إلى 49.6 ملم / ثانية، والاستغناء الإزاحة 0.25 ملم، وسيتم الاستغناء السائل يستنشق الزائدة إلى مصدر جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع microfuge أنبوب يحتوي على مزيج الرئيسي QPCR بشكل جيد A1 من صاحب microfuge أنبوب، والذي يقع في موقف سطح السفينة 1. قطع الغطاء من microfuge أنبوب أو ببساطة تركه مفتوحا. مجموعة &#39;نضح جيدا&#39; لA1 طريق تحرير Aspiratضبط البريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء خطوة غسل قبل الاستغناء QPCR مزيج الرئيسي كتبها الخطوات الأولى لنضح والاستغناء-اختيار دي البرنامج بإعدادها في الخطوة 2.2.2 ثم ​​ضرب &#39;تشغيل&#39;. مرة واحدة كاملة، وإعادة تحديد نضح والاستغناء عن الخطوات السابقة لتشغيل البرنامج الكامل للاستغناء QPCR مزيج الرئيسي. إذا كان كوبرا كان يجلس خاملا لمدة أقل من 10 دقيقة الخطوة غسل الأولية، والذي يعمل على رئيس النظام، لا لزوم لها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضرب &#39;تشغيل&#39; للاستغناء QPCR مزيج الرئيسي إلى كل بئر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع مزيج الرئيسي QPCR في الجزء السفلي من كل بئر بواسطة الطرد المركزي وجيزة من 1536 لوحة multiwell (30 ثانية باستخدام سرعة منخفضة PCR لوحة الدوار). </li></ol> 3. الاستغناء عن قالب DNA والاشعال في 1536 Multiwell اللوحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن 5 NL المخفف gDNA (الخطوة 1.3) في الآبار المرجوة من 1536 لوحة multiwell باستخدام نظام نقل السائل الصوتية، مثل صدى 550. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للالشروقس 550، استخدام البرنامج لوحة إعادة صياغة أو بدلا من ذلك توفير مخصص جداول البيانات إكسل لبرنامج نقل. ضمان المصدر المحدد جيدا للgDNA في يطابق برنامج المصدر كذلك إلى الذي قمت الاستغناء جسديا gDNA (الخطوة 1.3). اختر نوع لوحة المصدر &#39;384PP_AQ_BP2 &quot;، مما يدل على السائل في لوحة 384PP هو عازلة دون السطحي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن 10 NL الاشعال، ويخلط مسبقا إلى الأمام وعكس إلى تركيز النهائي من 50 ميكرومتر لكل منهما، في الآبار المرجوة من 1536 لوحة multiwell باستخدام نظام نقل السائل الصوتية، مثل صدى 550. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لنظام نقل السائل، استخدام البرنامج لوحة إعادة صياغة أو بدلا من ذلك توفير مخصص جداول البيانات إكسل لبرنامج نقل. ملاحظة: وهنا من الممكن الاستغناء الاشعال مثل هذا التخطيط على 1536 لوحة multiwell يطابق ترتيب الكروموسومات من الاشعال لذلك فمن السهل أن تفقد البصر النتائج في الوقت الحقيقي PCRفي وقت لاحق (الخطوة 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلائط جاهزة الاشعال في لوحة والتي تتوافق مع موزع السائل الصوتية. لصدى 550، استخدم Labcyte 384LDV (انخفاض حجم القتلى) لوحة واختيار نوع لوحة المصدر &#39;384LDV_AQ_B &quot;عندما برمجة صدى للدلالة على السائل حاجز بسيط مع عدم وجود البروتينات. </li></ol></li></ol> 4. ختم وأجهزة الطرد المركزي في 1536 Multiwell اللوحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام نظام سداده صفيحة ميكروسكوبية مثل Plateloc صفيحة ميكروسكوبية الحرارية السدادة، وختم على الفور 1536 لوحة multiwell باستخدام الختم واضح بصريا متوافق مع الصك السداده الحرارة. لا تلمس سطح الختم لتجنب علامات طخة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة استخدام Plateloc الحرارية صفيحة ميكروسكوبية السدادة، واستخدام الإعدادات التالية: ختم الوقت 2.0 ثانية، ودرجة الحرارة ختم 162 ° C، وضغط الهواء 82 رطل. هذا الصك يأخذ ~ 5 دقائق لتسخين ولذا يجب أن يكون قيد التشغيل مسبقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة استخدام Plateloc صفيحة ميكروسكوبية الحرارية السدادة، وهو adapteيجب استخدام r لرفع ذروة لوحة multiwell 1536 على المسرح من أداة لضمان ختم جيدة. ملاحظة: على الرغم من أنه من الأفضل لشراء المرحلة لوحة لPlateloc صفيحة ميكروسكوبية الحرارية السدادة، حلا بديلا هو لإدراج أربعة ~ 2 مم غسالات مستوى سميكة المتاحة في أي متجر لاجهزة الكمبيوتر في الزوايا لرفع ذروة 1536 لوحة multiwell. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي على الفور مختومة لوحة 1536 multiwell في 2000 x ج لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لجمع كل الكواشف في الجزء السفلي من كل بئر. </li></ol> 5. في الوقت الحقيقي PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البرنامج 1536 QPCR الصك، مثل LightCycler 1536، مع بروتوكول التضخيم من خطوتين يعقبه تحليل منحنى ذوبان. عن طريق تعيين LightCycler 1536 برنامج برنامجا على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرحلة ما قبل الحضانة: 95 ° C، عقد 1 دقيقة، ومعدل منحدر 4.8 ° C / ثانية، أي الاستحواذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اثنين الخطوة التضخيم: 30 دورات من [95 ° C، لا الانتظار،المنحدر معدل 4.8 ° C / ثانية، أي اكتساب؛ 64 ° C، 30 ثانية الانتظار، معدل زيادة 2.5 ° C / ثانية، واقتناء واحد]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذوب منحنى: 95 ° C، 10 ثانية، ومعدل منحدر 4.8 ° C / ثانية، أي الاستحواذ. 60 ° C، 1 دقيقة، ومعدل منحدر 2.5 ° C / ثانية، أي الاستحواذ. 97 ° C، ومعدل منحدر 0.1 ° C / ثانية، 5 الاستحواذ / ° C (مستمر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باردة: 40 ° C، 30 ثانية، ومعدل منحدر 2.5 ° C / ثانية، أي الاستحواذ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين تنسيق كشف أن &#39;الأخضر الإقحام صبغ &quot;في علامة التبويب تشغيل الوضوح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين تحكم pipetting لل&quot;التحكم الرئيسية&quot; في علامة التبويب تشغيل الوضوح. تخدم هذه الميزة باعتبارها الرقابة الداخلية وبالكشف عن وجود QPCR مزيج الرئيسي في كل بئر من 1536 لوحة multiwell، وهو أمر مفيد للتعرف على السلبيات كاذبة المفترضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج 1536 لوحة multiwell أعد في الخطوات 2-4 في QPCR صك 1536 وتشغيل البرنامج. </li></ol> تحليل 6. البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأداء الإقتصادي الأداءاسندت الفحص البصري من البيانات داخل البرنامج QPCR. ملاحظة: البرنامج 1536 يمكن تصور كل من التضخيم وتذوب منحنيات، فضلا عن حرارة خريطة تظهر المكالمة (الإيجابية والسلبية، غير صالحة، N / A؛ الشكل 2)، وقيمة معبر (انزلاق مقياس اللون لإيجابية أو الرمادي لسلبية؛ الشكل 3)، أو مضان نقطة النهاية (EPF) بقيمة (انزلاق مقياس اللون). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير البيانات من البرنامج 1536 في شكل ملف. txt (جدول النتائج) أو ملف. xml مع أي من البيانات الخام أو البيانات المحسوبة لتجهيز حاليا من الصك. ملاحظة: الملكية معبر الآلي (اف ب) خوارزمية الدعوة في صلب البرامج 1536 تأخذ بعين الاعتبار الشكل والمنحدر من منحنى التضخيم مع تحديد / دعوات قيمة السلبية والإيجابية حزب المحافظين بثقة عالية، في مجلدات رد فعل ميكروليتر منخفض الباطن مع منخفضة نسبيا قيم مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان LightCycler DNA الأخضر ماستر استخدامد لQPCR، تحقق من أن جميع الآبار مرت &quot;التحكم الرئيسية&quot;. تفشل يشير لم البئر لا تتلقى QPCR مزيج الرئيسي وينبغي النظر في نقطة البيانات المفقودة سلبية كاذبة المحتملة. تحقق من أن جميع الآبار مرت &quot;التحكم الرئيسية&quot;. تفشل يشير لم البئر لا تتلقى mastermix DNA والنظر في نقطة البيانات المفقودة سلبية كاذبة المحتملة. </li></ol>

<ol>
	<li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome.">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344 (6179), 55-58 (2014).</li><li>Dymond, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+chromosome+arms+function+in+yeast+and+generate+phenotypic+diversity+by+design.">Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design.</a> Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-547 (1996).</li><li>Dymond, J., Boeke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Saccharomyces+cerevisiae+SCRaMbLE+system+and+genome+minimization.">The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization.</a> Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).</li><li>Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign+3.0+is+an+updated+synthetic+biology+toolkit.">GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).</li><li>Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-A-Gene+with+GeneDesign.">Design-A-Gene with GeneDesign.</a> Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).</li><li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+limits+of+genetic+recoding+in+essential+genes.">Probing the limits of genetic recoding in essential genes.</a> Science. 342 (6156), 361-363 (2013).</li><li>Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+eukaryotic+chromosome:+Redesigning+and+SCRaMbLE-ing+yeast.">Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast.</a> Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).</li><li>Dymond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+genomic+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li></ol>

LAM، NAP، JAM ومجلس الدفاع المشترك ليس لديهم ما يكشف. ويعمل الصليب الأحمر و آل روش علوم الحياة والولايات المتحدة وعملت على تطوير التطبيق مع LAM كجزء من دليل على التجربة المبدأ.

التأسيس في الوقت الحقيقي الكشف PCR في التنميط الجيني فحص PCRTag هو تطور مهم للمشروع Sc2.0، لأنها تتيح أعلى بكثير الإنتاجية. سير العمل السابق المحدد 2.5 ميكرولتر ردود الفعل في 384 لوحات PCR بشكل جيد، 1.5 ساعة الوقت الحراري المدى ركوب الدراجات، الاغاروز الكهربائي للهلام، والشرح المختصر من هلام. سير العمل المعروضة هنا، ودعا تحليل qPCRTag، يتغلب على العديد من العقبات الرئيسية. أولا، تشغيل qPCRTag يتكثف 4 × 384 لوحات جيدة في تجربة واحدة التي يمكن معالجتها، البداية وحتى النهاية (لوحة انشاء بالإضافة إلى تشغيل الوقت)، في حوالي ساعة. ومن المهم أن نلاحظ أن تكلفة كاشف لكل بئر لتحليل qPCRTag على قدم المساواة مع النهج القائم على هلام الاغاروز الخرج أقل. ومع ذلك، من خلال التحايل الكهربائي جل والشرح اليدوي، وسير العمل qPCRTag يتيح تحقيق وفورات كبيرة في الوقت والعمل، والتي هي أهم مزايا. الأهم سير العمل qPCRTag هو ENمتوافق مع tirely الأتمتة. ومصدر القلق الرئيسي مع استخدام الكشف في الوقت الحقيقي والإخراج للمقايسة PCRTag هو معدل كاذبة ايجابيات وسلبيات كاذبة. منذ الاشعال PCRTag لم تكن مصممة أصلا للاستخدام في الوقت الحقيقي PCR، فمن المتوقع أن ليس كل أزواج التمهيدي سوف تكون مناسبة للاستخدام مع هذا الناتج. تحقيقا لهذه الغاية من المهم التحقق من صحة وظيفة وخصوصية جميع أزواج التمهيدي PCRTag استبعاد فرعية التي لا تعمل في مقايسة على أساس الوقت الحقيقي في خط الهجوم. على سبيل المثال، كروموسوم 3 PCRTag كاذبة ايجابيات وسلبيات هي كل وكبيرة استنساخه في الوقت الحقيقي البيانات PCR (أرقام 2 و 3) وهذه يمكن استبعادها من إجراء المزيد من التحليلات. وعلاوة على ذلك، أزواج التمهيدي المعروف أن تفشل (المقررة من قبل الكهربائي للهلام ويظهر في أرقام S6 و S7 من Annaluru آخرون 1) يمكن أن تستبعد أيضا. ويتم إنجاز هذا بسهولة ببساطة excluقرع أزواج التمهيدي الخاطئة عند إعداد بروتوكول نقل الصوت. مثل معظم فحوصات إنتاجية عالية، ونحن نعتزم استخدام الوقت الحقيقي كشف PCRTag كشاشة الأولية لتحديد transformants التي تستحق مزيدا من التحقق من صحة المصب. وفي وقت لاحق، فإن المعيار الذهبي لفحص ثانوي تبقى تحليل PCRTag مع هلام الكهربائي كما قراءات. ما وراء تطبيق تحليل PCRTag لSc2.0، والجمع بين دولة من بين الفن أنظمة مناولة النانو السائل مع إنتاجية عالية في الوقت الحقيقي تكنولوجيا PCR تمكن من تحليل السريع والآلي، ولها القدرة على التأثير العديد من المجالات. على سبيل المثال، يمكن تطبيق هذا العمل إلى ارتفاع الإنتاجية فحص مكتبة، تشخيص الأمراض المعدية، وتحليل microbiome، والمتطورة الجينوم التحرير النهج محاولة لتعديل مواضع متعددة في وقت واحد.

<html> Sc2.0، أو مشروع الجينوم الخميرة الاصطناعية ( <a href="http://www.syntheticyeast.org" target="_blank">www.syntheticyeast.org</a> )، وقد وضعت هدف تصميم وبناء جينوم وحيد الخلية الاصطناعية تماما. باستخدام تسلسل الجينوم برعاية عالية من خميرة الخباز 3 كنقطة انطلاق، وقد تم إعادة تصميم كل واحد من الكروموسومات الخطية ستة عشر لقاء مجموعة من مبادئ التصميم التي تحدد الحفاظ على اللياقة البدنية الخلية، وتحسين الاستقرار الجينوم، وزيادة المرونة الوراثية. على سبيل المثال، يتم حذف العناصر المزعزعة للاستقرار مثل يكرر من الكروموسومات Sc2.0. كلها حالات TAG كودونات توقف إعادة ترميز إلى TAA إلى &quot;تحرير&quot; كودون في سلالة النهائي لإدخال حمض أميني غير المشفرة وراثيا. بالإضافة إلى نظام تطور محرض، والتدافع، مكن من قبل النظام جنة المساواة العرقية، السلمون المدخن، يسمح قدرة غير مسبوقة لتوليد الجينوم مشتقة مع هياكل جديدة 4. &quot;jove_content&quot;&gt; عنصر تصميم رئيسي آخر في الجينوم Sc2.0 هو إدخال PCRTags، التي تكون بمثابة علامات مائية DNA لتمكين تتبع الحمض النووي نوع الاصطناعية والبرية. PCRTags هي قصيرة، تلوينها إعادة قطاعات في ORFS على الكروموسومات الاصطناعية. في حين تختلف تسلسل PCRTag على مستوى الحمض النووي بين نوع الكروموسومات الاصطناعية والبرية، والبروتينات المشفرة متطابقة في تسلسل الأحماض الأمينية وبالتالي، يفترض، وظيفة. صممت خصيصا تسلسل PCRTag كمواقع ملزمة التمهيدي لتسهيل التضخيم الانتقائي (الشكل 1A). ويتم تصميم PCRTag خارج باستخدام &#39;معظم مختلفة &quot;الخوارزمية في GeneDesign 5،6، مما أسفر عن تكبد تسلسل الاصطناعية التي عادة ما تكون ~ 60٪ يختلف عن تسلسل الأم (الحد الأدنى 33٪) مع درجات حرارة انصهار بين 58 درجة مئوية و 60 درجة مئوية، و amplicon أطوال بين 200-500 أزواج قاعدة 2. لا يجوز إعادة ترميز داخل BP 100 الأول من كل ORF، كما تعرف هذه المناطق للدينا أفضليات خاصة من حيث استخدام كودون 7. معا، وهذه قواعد التصميم لصالح الأداء العالي من PCRTags كلها تقريبا تحت مجموعة واحدة من الشروط PCR حيث نوع PCRTag أزواج التمهيدي الاصطناعية والبرية ربط حصرا وتضخيم DNA الاصطناعية والأصلي، على التوالي (الشكل 1B). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig1.jpg" /> الشكل 1: PCRTag التخطيطي (A) PCRTags وتسلسل ضمن أطر القراءة المفتوحة (ORF) من الجينات على الكروموسومات Sc2.0 إعادة تلوينها. (B) الاصطناعية (SYN) والنوع البري (WT) الاشعال PCRTag ربط حصرا وتضخيم نوع الاصطناعية والبرية الحمض النووي الجيني (gDNA)، على التوالي. المبين هنا هو تحليل لشريحة كيلوبايت ~ 30 من الذراع الأيسر من كروموسوم ستة، واختبار ثلاثة عشر PCRTag أزواج التمهيدي باستخدام WT أو شبه synVIL2 gDNA كقالب. في كثير من الحالات ORF واحد يشفر أكثر من واحد PCRTag. ويتم تقييم وجود / غياب amplicons PCRTag عبر الاغاروز الكهربائي للهلام. amplicons PCRTag تتراوح في حجمها من 200 نقطة أساس إلى 500 نقطة أساس. أسرع الأنواع المهاجرة في الجزء السفلي من لوحات هي dimers التمهيدي. وقد ثبت تحليل PCRTag أن تكون أداة هامة في التجمع من الكروموسومات Sc2.0. في نموذجي التجربة 30-50 كيلو بايت من الحمض النووي الاصطناعي، ترميز 20-30 PCRTags، تتحول إلى خلايا الخميرة لتحل محل النوع البري المقابلة DNA 1،2،8. ثم يتم استخدام تحليل PCRTag لتحديد transformants التي تكود الاصطناعية ولكن لا البرية نوع PCRTags يمتد هذا الجزء من الحمض النووي، أو ما يسمى ب &quot;الفائزين&quot;. فإنه عادة ما يكون ضروريا لاختبار transformants متعددة لتحديد &quot;الفائزين&quot;، لذلك الإنتاجية وتكلفة التحليل PCRTag اعتبارات هامة. حاليا تم الانتهاء من اثنين من الكروموسومات Sc2.0 (synIII 1 وsynIXR 2)، وهو ما يمثل أقل من 10٪ من الجينوم Sc2.0، بديلهوغ أكثر من نصف الكروموسومات المتبقية يخضعون حاليا التوليف والتجمع. مقياس التحليل PCRTag المطلوبة لهذا المشروع يفوق بسرعة القدرة على تشغيل المواد الهلامية ويدويا يسجل وجود الحمض النووي الاصطناعي وعدم وجود DNA النوع البري. لتحسين الإنتاجية للمقايسة PCRTag قمنا بتطوير العمل في الوقت الحقيقي باستخدام PCR للتحايل على استخدام الاغاروز الكهربائي للهلام. سير العمل يجعل من استخدام موزع السائل بكميات كبيرة لتوزيع QPCR mastermix في كل بئر من 1536 لوحة multiwell، والنانو موزع السائل الصوتية لنقل الحمض النووي قالب والاشعال، وcycler الحرارية 1536 QPCR، مما يسمح لنا تصغير ردود الفعل على 500 NL و تحقيق أقصى قدر من الإنتاجية. يمكن أن تكون آلية تحليل وعلاوة على ذلك. وينبغي أن يكون هذا النوع من إنتاجية عالية بروتوكول التنميط الجيني للتعميم على أي مشروع يتطلب تحليل العديد من الحيوانات المستنسخة في مواضع متعددة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Yeast gDNA prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast gDNA</td>
			<td>custom</td>
			<td>custom</td>
			<td>template for real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-washed glass beads (0.5mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5432 Mixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5432</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621807</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte 384PP plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>P-05525</td>
			<td>gDNA source plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DNA Green Mastermix prep and dispensing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536 DNA Green</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5573092001</td>
			<td>real time PCR mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL Microfuge Tube Holder</td>
			<td>ARI</td>
			<td>EST BD060314-1</td>
			<td>microfuge tube holder for deck of Cobra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536 Multiwell Plate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5358639001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobra liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>630-1000-10</td>
			<td>dispense qPCR master mix into 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Plate Spinner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89184-608</td>
			<td>cenrifugation of 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Template and primer dispensing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRTag primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>custom</td>
			<td>premixed forward and reverse, [50uM] each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempPlate pierceable sealing foil, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2923-0110</td>
			<td>temporary seal for PCRTag primer plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte LDV 384 well plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>LP-0200</td>
			<td>pre-mixed primer source plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550 Liquid Handler</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>transfer 2.5nL drops of primer and template DNA into 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plateloc Thermal Microplate Sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G5402-90001</td>
			<td>heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Permanent Seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24212-001</td>
			<td>optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G5402-20008</td>
			<td>can substitute ~2mm thick washers&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>Thermo Scientfic</td>
			<td>75-004-521</td>
			<td>centrifuge heat sealed 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Industrial Air Compressor</td>
			<td>Jun Air</td>
			<td>1795011</td>
			<td>to run the Echo and Heat Sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Real Time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td>requires 220V outlet</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qpcrtag analysis - a high throughput, real time pcr assay for sc2.0 genotyping

مشروع الجينوم الخميرة الاصطناعية (Sc2.0) يهدف إلى بناء 16 مصمم الكروموسومات الخميرة والجمع بينهما في خلية الخميرة واحدة. حتى الآن كروموسوم واحد الاصطناعية، synIII 1، وذراع واحدة كروموسوم اصطناعي، synIXR 2، وقد تم بناؤها وظيفتها في الجسم الحي التحقق في غياب المقابلة الكروموسومات نوع البرية. ميزة تصميم هامة من الكروموسومات Sc2.0 هو إدخال PCRTags، والتي هي، تلوينها إعادة تسلسل قصيرة ضمن أطر القراءة المفتوحة (ORFS) التي تمكن التفريق بين الكروموسومات الاصطناعية من نظرائهم نوع البرية. PCRTag الاشعال يصلب بشكل انتقائي إما الاصطناعية أو البرية الكروموسومات نوع وحضور / غياب كل نوع من الحمض النووي يمكن اختبارها باستخدام فحص PCR بسيط. قراءات القياسية لفحص PCRTag هي لتقييم وجود / غياب amplicons بواسطة agarose هلام الكهربائي. ومع ذلك، مع متوسط ​​كثافة PCRTag amplicon واحد لكل 1.5 كيلوبايت وAGenome حجم ~ 12 ميغابايت، فإن الجينوم Sc2.0 الانتهاء ترميز ما يقرب من 8000 PCRTags. لتحسين الإنتاجية، قمنا بتطوير فحص الكشف PCR القائم في الوقت الحقيقي لPCRTag التنميط الجيني الذي نسميه تحليل qPCRTag. يحدد سير العمل 500 ردود الفعل نيكولا لانغ في 1536 لوحة multiwell، مما يسمح لنا لاختبار ما يصل الى 768 PCRTags مع كل من أزواج نوع التمهيدي الاصطناعية والبرية في تجربة واحدة.

اختبرنا الاصطناعية والبرية نوع كروموسوم 3 أزواج التمهيدي PCRTag 1 مع الخميرة الحمض النووي الجيني (gDNA) المستخرجة من أربع سلالات مختلفة. كروموسوم 3 لديه 186 PCRTag أزواج التمهيدي التي تمتد على طول الكروموسوم (synIII هو ~ 270 كيلوبايت والنوع البري كروموسوم 3 غير ~ 315 كيلو بايت). لاختبار كل من السلالات الأربع مع كل من مجموعتي الاشعال، قسمنا لوحة multiwell إلى أربعة أجزاء، واحد لكل نوع من gDNA، وتكليف الاشعال PCRTag الاصطناعية إلى النصف العلوي من كل رباعي والنوع البري إلى النصف السفلي. تم استخراج DNA الجينومية من سلالات الخميرة، اثنان منها ترميز النوع البري كروموسوم 3 (النوع البري، synIXR 2)، في حين أن اثنين من رموز كروموسوم اصطناعي المتبقية 3 (synIII 1، synIII synIXR). تم الاستغناء QPCR مزيج الرئيسي في كل بئر من 1536 لوحة multiwell باستخدام موزع السائل بالجملة، تليها gDNA وPCRTag الاشعال باستخدام الاشعال صدى 550. تم المحتشدة مماثل فيكل رباعي من لوحة multiwell للمقارنة بصرية سهلة. ثم ختم الحرارة لوحة multiwell مع ختم واضح بصريا وتخضع في الوقت الحقيقي تحليل PCR. في هذه التجربة qPCRTag لاحظنا، بالنسبة للجزء الأكبر، والتضخيم، كما هو متوقع، حيث الاشعال الاصطناعية تضخيم حصرا DNA الاصطناعية والعكس بالعكس (أرقام 2 و 3). ومع ذلك، ونحن أيضا لاحظ العديد من الانحرافات من النمط المتوقع، مما يشير إلى السلبيات الكاذبة والمغلوطة في ورقة العمل. في هذه التجربة، تم الكشف عن التحكم الرئيسية في 100٪ من الآبار، مما يدل على موزع السائل بالجملة الاستغناء بنجاح mastermix في كل جانب على لوحة (لا تظهر البيانات). هذا يستبعد احد مصدرا محتملا للسلبيات واهية. بالإضافة إلى ذلك، ومن المعروف أن بعض كروموسوم 3 PCRTags أن تفشل (كما هو موضح في الشكلين S6 و S7 من Annaluru آخرون 1)، بما في ذلك على الأقل 2 SYN و 1 WTأزواج التمهيدي. وبالتالي يمكن تجاهل هذه الآبار في كل رباعي. السلبيات كاذبة حقيقية يمكن أن تنشأ من نقص في نقل قالب gDNA أو الاشعال، ولكن في تجربتنا، نظرا لمعايرة الصحيحة للصدى 550 وكذلك إعداد gDNA والاشعال كما وصفها، لم يكن هذا مصدرا رئيسيا للخطأ. عموما في هذه التجربة كان معدل سلبي كاذبة منخفضة للغاية لالاشعال WT مع قالب WT (~ 2٪) على الرغم من أعلى إلى حد ما عن الاشعال SYN مع SYN الحمض النووي (~ 8٪). ايجابيات كاذبة، والكشف عن إشارة في الآبار حيث يتم خلط الاشعال SYN مع WT gDNA (والعكس بالعكس)، يمكن أن تنشأ عن التضخيم أو عبر dimers التمهيدي. في الواقع، dimers التمهيدي وغالبا ما تكون مرئية من قبل الكهربائي للهلام (الشكل 1B) وتمثل مصدرا معقول من الخطأ. لتطبيق QPCR، وفحص منحنيات ذوبان يمكن أن تكون مفيدة لتحديد ما إذا كانت أنواع مختلفة، مثل dimers التمهيدي، قد تسهم في إشارة. وعلاوة على ذلك، الأداء الإقتصادي الأداءorming تجربة السيطرة حيث يتم الاستغناء الاشعال في غياب قالب الحمض النووي قد تساعد في تحديد الاشعال مع الميل إلى dimerize. التضخيم عبر ويمكن ملاحظة من قبل الكهربائي للهلام، ولا سيما إذا يتم تنفيذ العديد من دورات PCR أو إذا كانت درجة الحرارة الصلب منخفض جدا. حاولنا التقليل من عدد من ايجابيات كاذبة بسبب التضخيم عبر طريق تحسين كل من هذه المعلمات لبروتوكول qPCRTag. أخيرا، النظر في معبر (اف ب) القيم لكل بئر يمكن أن تساعد في تحديد الاشعال التي لا تتناسب مع الكشف على أساس الوقت الحقيقي (الشكل 3، على سبيل المثال، BB22، Fb22، Bb46، Fb46). عموما في هذه التجربة كان معدل ايجابية كاذبة منخفضة لالاشعال SYN مع قالب WT (~ 5٪) وأعلى لالاشعال WT مع قالب SYN (~ 10٪). <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig2.jpg" /> الشكل 2: لوحة خريطة الحرارة التي تظهر وجود / ABدعوة العمالي لتجربة qPCRTag أربعة أنواع مختلفة من الحمض النووي الجيني (الأرباع مفصولة خطوط بيضاء صلبة) تعرضوا للتحليل PCRTag باستخدام الاصطناعية (SYN) والنوع البري (WT) كروموسوم 3 الاشعال PCRTag (متقطع خطوط بيضاء لفصل SYN (أعلى ) وWT (القاع) في كل رباعي). WT وsynIXR gDNA ترميز النوع البري كروموسوم 3، مما أسفر عن تضخيم مع الاشعال WT PCRTag. synIII وsynIII synIXR gDNA ترميز كروموسوم اصطناعي 3، مما أسفر عن تضخيم مع الاشعال SYN PCRTag. والمحتشدة الاشعال وفقا لمن اليسار إلى اليمين المواقع الكروموسومات ووضع مماثل في الأرباع الأربعة للمقارنة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig3.jpg" /> الرقم 3: حرارة اللوحةخريطة تبين معبر (اف ب) قيمة لتجربة qPCRTag، وهذا هو نفس مجموعة البيانات كما في الشكل (2) وتخطيط لوحة بالتالي فهو متطابقة. N / A يشير إلى &quot;عدم التضخيم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping at JoVE.com

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

تحليل qPCRTag - إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي PCR الفحص لSc2.0 التنميط الجيني

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

qpcrtag-analysis-high-throughput-real-time-pcr-assay-for-sc20

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K Views.  Institute for Systems Genetics. Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Video: qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

الكمية في الوقت الحقيقي باستخدام PCR العلمية الحرارية سولاريس qPCR الفحص

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

تحليل التعبير الجيني في الحفار الرماد الزمرد ( Agrilus planipennis) عن طريق ريال الكمية من الزمن - PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

من التنميط المسبق الجزئي الرناوات و microRNAs باستخدام الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qPCR) صالحة

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

الإنتاجية العالية للمواد الفحص تسكر Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

والطريقة انماط PCR القائم على التمييز بين الأنواع البرية من نوع والزينة لل Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

الايس كاب : منهج في تزايد Arabidopsis الطماطم والنباتات في لوحات 96 - جيدا لالرفيع المناولة التنميط الجيني

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

سريعة وفعالة الزرد التنميط الجيني باستخدام PCR عالية الدقة مع تحليل نذوب

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

A تجليد الفحص إنتاجية عالية MHC II لتحليل الكمي لالببتيد الحواتم

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...