We would like to acknowledge Susan Gray and Umadevi Chalasani for their help with technical aspects of the hepatocyte isolation protocol. This work was supported by NIDDK grant 5R01DK089185 (to M.P. Cooper) and the DERC Pilot and Feasibility Program at UMMS (to M.P. Cooper).

כל הניסויים בבעלי החיים צריכים להתבצע בהתאם לתקנות פדרליות ומקומיות ובאישור של ממשל IACUC ובטיחות קרינה מוסדי. 1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמה ימים לפני assay, להפשיר את בקבוק 500 מיליליטר של כבד Digest בינוני (LDM) וrefreeze ~ 35 aliquots מיליליטר ב 50 מיליליטר צינורות חרוטי. חנות ב -20 ° C עד צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני assay, מראש לעקר כלים לנתיחה נקיים על ידי החיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של assay, טיפול הסכום הדרוש של צלחות תרבות 24 גם עם קולגן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים חלק 1 של קולגן זנב חולדה / מיליליטר 3 מ&quot;ג עם 50 חלקים של PBS. להוסיף כ 500 μl היטב בכל צלחת 24 גם דגירה של 3-5 דקות בטמפרטורת חדר (RT). הסר את הקולגן ולאפשר צלחת לייבוש באוויר במכסת מנוע. חזור על לפחות פעם אחת נוספת. הערה: ציפוי קולגן יכול להתבצע עד שבוע במודעהאנס וצלחות מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס אטומות בניילון הנצמד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן LDM עבור assay: LDM הפשירי וחמה עד 37 מעלות צלזיוס ולהתאים את ה- pH 7.4 באמצעות 1 N KOH. מסנן באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר ומקום באמבט מים 42 מעלות צלזיוס הסירקולציה המחודשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 25 מיליליטר חם של כבד זלוף בינוני עד 42 מעלות צלזיוס באמבט מים הסירקולציה המחודשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 90% סיליקה colloidal מצופים פתרון polyvinylpyrrolidone: הוסף 1 מיליליטר של 10x DPBS עד 9 מיליליטר של סיליקה colloidal מצופה polyvinylpyrrolidone. התאם ל- pH 7.4 באמצעות 0.1 N HCl. סנן עם מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר סטרילי. אחסן בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני ציפוי חם עד 37 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. בידוד של יסודי העכבר hepatocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את משאבת peristaltic, צינורות, ושולחן נתיחה: לעקר צינורות על ידי שטיפה עם אתנול 5 מיליליטר 70% במים מזוקקים, ואחריו 10 מיליליטר של מים סטריליים. מניחים צינורות בכבד זלוף בינוני ומשאבה לרוץ למלאלכל אורך צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכבר בשיטה אושרה מוסדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח פתוח חלל הבטן: ספריי בטן העכבר בנדיבות עם אתנול 70%. בעזרת מספריים קהה-סוף, לעשות חתך קו האמצע דרך העור באורך של הבטן ומשקפים רוחבי. לעשות חתך דומה בהצפק לחשוף את הקרביים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במכשיר קהה, בעדינות לעקור את המעיים כדי לחשוף את כלי הדם בבטן אתר את הווריד הנבוב הנחות הבטן (IVC) ומקום תפר מתחת לכלי הדם, דיסטלי לוריד הכליה </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסטלי לתפר, למקם את מחט וצנתר לתוך IVC, קידומה מעבר לרמה של התפר. עם המחט עדיין במקום, לקשור את התפר סביב קטטר להחזיק אותו במקום. מוציא בזהירות את המחט. אם נעשה בצורה נכונה, דם עם זרימה דרך קטטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות pipet, למלא את השטח שנותר בצנתר עם מדיום זלוף, הבטחהשאין אוויר הוא הווה. בזהירות רבה, לצרף את צינורות לקטטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח פתוח חלל הריאות: בעדינות משקף את האונה של הכבד מעולה לחשוף את הסרעפת. לנקב בזהירות הסרעפת במספריים קצה חד, אז לעשות חתך לרוחב כדי לחשוף את חלל פלאורלי, לטפל כדי למנוע כיס המרה וכלי דם פלאורלי. הנח מהדק בולדוג סביב הווריד הנבוב הנחות החזה רק הפרוקסימלי לווריד הכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את וריד השער ולהפעיל את המשאבה ב3 - 4 מיליליטר / דקה. Perfuse את הכבד עם כבד זלוף בינוני במשך 5 דקות באמצעות כ 20 מיליליטר של מדיום זלוף. הערה: הכבד צריך לשנות באופן מיידי מאדום לאפור / שיזוף. אם החלקים של הכבד יישארו אדומים, זה סביר מציין זלוף העני, ואת הסבירות של בידוד מוצלח היא פחת באופן משמעותי. במהלך זלוף, להיות זהיר כדי להבטיח בינוני לא נגמר ושאין בועות להיכנס לצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 5 דקות, לעצורהמשאבה ולהעביר את צינורות לכבד Digest בינוני. הפעל מחדש את המשאבה ותנקב את הכבד לעוד 10 - 15 דקות (עד שהמדיום הוא מותש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של זלוף, לעצור את המשאבה. הכבד צריך להיות גוון ורדרד ומופיע מוגדל במקצת. בלו הכבד על ידי נתיחה זהירה. הסר את כיס המרה ולהעביר את הכבד לצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגית, להוסיף 10 מיליליטר של ציפוי בינוני (טבלה 1) בכבד. בעדינות לגרד את הכבד או באמצעות מלקחיים או אזמל כדי להסיר את hepatocytes. סנן את ההשעיה באמצעות מסננת תא 100 מיקרומטר ולהעביר צינור חרוטי 50 מיליליטר. לשטוף את הצלחת עם תוספת של 10 מיליליטר של ציפוי בינוני ובריכה בצינור חרוטי 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים על ידי צנטריפוגה 5 דקות ב 350 XG, 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני לשאוב וגלול גלולים ב 10 מיליליטר של ציפוי בינוני ולהוסיף 10 מיליליטר של 90% סיליקה colloidal מצופה פוlyvinylpyrrolidone. מערבבים בעדינות וצנטריפוגה כמו בשלב 2.11. לאחר צנטריפוגה, שכבה של תאים מתים תהיה צף על גבי התערובת, בעוד התאים חי גלולה לתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תאים מתים ובינוני. לשטוף 2 פעמים עם 20 מיליליטר של ציפוי בינוני, צנטריפוגות כמו ב2.11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspend ב 10 מיליליטר של ציפוי בינוני. ספירת תאים עם hemocytometer ומקום 9 x 10 4 תאים / גם בתרבות מנות 24 גם טופל קולגן. דגירה בתרבית רקמת חממת 37 ° C עבור שעה 2. כל צלחת יכולה לשמש גם עבור assay חומצות שומן החמצון או assay Lipogenesis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לשנות את הבארות לתחזוקה בינונית (טבלה 1) ותרבות על 37 מעלות צלזיוס. תאים יכולים להיות מתורבת עבור 2 - 3 ימים מבלי להשפיע על תוצאות assay. </li></ol> 3. חומצות שומן החמצון Assay אזהרה: שימוש בקרינה רדיואקטיבית יכול להיות מסוכנת. כל הרכישה, האחסון, הטיפול, ודיsposal של חומר רדיואקטיבי צריכה להתבצע בהתאם למדינה, תקנות מוסדיות, ופדרליות והנחיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 16 - 20 שעות לפני assay, לשטוף תאים 2 פעמים עם PBS החם. לשנות את התאים לסרום רעב בינוני סרום ללא (טבלת 1) עם 20 ננומטר גלוקגון ודגירת הלילה על 37 מעלות צלזיוס. הערה: מאחר בסרום שור עוברי מכיל ריכוז לא ידוע של הורמונים מטבוליים (למשל אינסולין, גלוקגון), סרום להרעיב את התאים כדי להסיר כל תופעות בלבול זה יכול להיות על assay. תאי קיימא בסרום רעב בינוני ל&gt; 24 שעות. טיפול גלוקגון משמש כדי לעורר חמצון של חומצות שומן בתאים הכבדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקרו של assay, להכין טרום דגירה בינונית: Resuspend כמות מתאימה של נתרן Palmitate במי ultrapure לעשות פתרון 100 מ&quot;מ וחום עד 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בינתיים, מכין את הסכום הנדרש (0.5 מיליליטר לכל גם צלחת 24 גם)של DMEM עם 25 HEPES מ&quot;מ, 1% V בר BSA, ו -20 ננומטר גלוקגון. חום עד 37 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שsolubilized, להוסיף Palmitate לריכוז סופי של 250 מיקרומטר עד הבינוני. לשנות hepatocytes מראש דגירה בינונית ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2. שומר כמה טרום דגירה בינונית על 37 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, לייבש כמות מתאימה של 14 C-Palmitate (0.5 μCi / טוב) על ידי אידוי תחת גז חנקן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמה, כדי למדוד 24 דגימות בצלחת 24 גם, להעביר 120 μl של 0.1 μCi / מיליליטר 14 C-Palmitate לצינור 1.5 מיליליטר. לאט להתאדות אתנול הממס על ידי פיצוץ גז חנקן על הפתרון ממרחק של 3-5 סנטימטר במנדף. הממס צריך להתאדות בכ 30 - 40 דקות, והשאיר 14 C-Palmitate היבש בחלק התחתון של הצינור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ -15 דקות לפני תום הדגירה, resuspend 14C-Palmitate ב 0.1 N NaOH (12.5 μl / μCi). לדגור על 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. להוסיף שלושה כרכים של חמה טרום דגירה בינונית ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספייק כל טוב עם 25 μl של דילול 14 C-Palmitate. מערבבים בעדינות על ידי הנדנדה הצלחת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. זהו פלייט Assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, להכין צלחת נייר סינון (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המכסה מצלחת 24 גם סטרילי. הנח סנטימטר אחד 2 פיסת נייר סינון x 2 סנטימטר בחלק התחתון של כל אחד מהבארות. כיסוי הצלחת עם חתיכת 4 &quot;x 7&quot; parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באובייקט מלבני גדול, כגון תיבת קצה micropipettor, לשפשף את parafilm על הבארות ללנקב parafilm בפתחים היטב וליצור חותם על פני יתרת הצלחת. הסר את העיגולים המחוררים של parafilm עכשיו מכסים את הבארות. הצלחת צריכה עכשיו להיות מכוסה היטב עם parafilm בכל התחומים למעט o גםpenings. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 דקות לפני סוף הדגירה, להוסיף 200 μl של 3 N NaOH היטב בכל צלחת נייר הסינון, כדי לוודא שנייר הסינון סופג את כל הנוזלים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין לפני ההקפאה, להעביר את המדיום לצלחת 24 גם טרי. לאחר שטיפת פעם עם PBS, lyse התאים שנותרו ב0.1 N HCl ולחשב את תכולת חלבון על ידי assay BCA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הדגירה, snap-להקפיא פלייט Assay בחנקן נוזלי. להיות זהיר כדי להבטיח היטב כל קפוא לחלוטין לפני שתמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 70% חומצת perchloric 100 μl היטב בכל צלחת Assay. מייד לכסות עם צלחת נייר סינון. מקם את הצלחות בייקר מסלולית ורוק במהירות סיבובית של 80 סל&quot;ד ב RT עבור שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה, לעבד את הדגימות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את חלק CO 2, להעביר את ריבועי נייר סינון 4 מיליליטר נוזל נצנץ נוזלי בנצנץבקבוקון ואות C מידת 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את החומר מסיס החומצה, להעביר 400 μl של מדיום לצינור 1.5 מיליליטר microfuge. צנטריפוגה במהירות המרבית למשך 10 דקות. להוסיף את supernatant וכתוצאה מכך 100 μl 500 μl של 2: 1 כלורופורם-מתנול (V / V), ובקצרה מערבולת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של מים לתערובת, ומערבולת שוב. צנטריפוגה דגימות במשך 10 דקות ב 3000 x גרם. העברה 200 μl של השלב העליון עד 4 מיליליטר נוזל נצנץ נוזלי בבקבוקון נצנץ ולמדוד אות C 14. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Lipogenesis Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערב לפני תחילת assay, לשטוף את התאים 2 פעמים עם PBS החם. לשנות את hepatocytes לסרום רעב בינוני עם 100 ננומטר אינסולין. דגירה הלילה בשעת 37 מעלות צלזיוס. הערה: מאחר בסרום שור עוברי מכיל ריכוז לא ידוע של הורמונים מטבוליים (למשל אינסולין, גלוקגון), סרום להרעיב את התאים כדי להסיר כל תופעות בלבול זה יכול להיות על assay. תאי קיימא בסרום רעב בינוני ל&gt; 24 שעות. אינסולין משמש בassay זה כדי לעורר lipogenesis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך Lipogenesis בינוני: סרום רעב בינוני עם 100 ננומטר אינסולין, אצטט קר 10 מיקרומטר ו-0.5 μCi 3 H-אצטט בכל טוב. לשנות תאים לLipogenesis בינוני ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2. כלול את כל תרכובות של עניין להיבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה, לשטוף תאים 2 פעמים עם PBS. תאי Lyse על ידי גירוד ב120 μl של 0.1 N HCl. שמורת 10 μl עבור assay חלבון (להעריך על ידי assay BCA), והעברה לצינור 1.5 מיליליטר microfuge 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שומני תמצית על ידי תוספת של 500 μl של 2: 1 כלורופורם-מתנול (V / V). בקצרה מערבולת לדגור על RT במשך 5 דקות. הוסף 250 μl מים, מערבולת ולדגור על RT עבור 5 דקות נוספות. דגימות צנטריפוגה 10 דקות ב 3000 XG, RT. זהירותלהעביר שלב נמוך עד 4 מיליליטר נוזל נצנץ נוזלי בבקבוקון נצנץ ולמדוד 3 פעילות H. </li></ol>

<ol>
	<li>Clark, J. M., Brancati, F. L., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+and+etiology+of+elevated+aminotransferase+levels+in+the+United+States.">The prevalence and etiology of elevated aminotransferase levels in the United States.</a> The American journal of gastroenterology. 98, 960-967 (2003).</li><li>Lazo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+nonalcoholic+Fatty+liver+disease+in+the+United+States:+the+third+national+health+and+nutrition+examination+survey,+1988-1994.">Prevalence of nonalcoholic Fatty liver disease in the United States: the third national health and nutrition examination survey, 1988-1994.</a> American journal of epidemiology. 178, 38-45 (2013).</li><li>Angulo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Nonalcoholic fatty liver disease.</a> The New England journal of medicine. 346, 1221-1231 (2002).</li><li>Adams, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+history+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease:+a+population-based+cohort+study.">The natural history of nonalcoholic fatty liver disease: a population-based cohort study.</a> Gastroenterology. 129, 113-121 (2005).</li><li>Feldstein, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+apoptosis+and+fas+expression+are+prominent+features+of+human+nonalcoholic+steatohepatitis.">Hepatocyte apoptosis and fas expression are prominent features of human nonalcoholic steatohepatitis.</a> Gastroenterology. 125, 437-443 (2003).</li><li>Day, C. P., James, O. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steatohepatitis:+a+tale+of+two+'hits'.">Steatohepatitis: a tale of two 'hits'.</a> Gastroenterology. 114, 842-845 (1998).</li><li>Donnelly, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sources+of+fatty+acids+stored+in+liver+and+secreted+via+lipoproteins+in+patients+with+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Sources of fatty acids stored in liver and secreted via lipoproteins in patients with nonalcoholic fatty liver disease.</a> The Journal of clinical investigation. 115, 1343-1351 (2005).</li><li>Lambert, J. E., Ramos-Roman, M. A., Browning, J. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+de+novo+lipogenesis+is+a+distinct+characteristic+of+individuals+with+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Increased de novo lipogenesis is a distinct characteristic of individuals with nonalcoholic fatty liver disease.</a> Gastroenterology. 146, 726-735 (2014).</li><li>Parks, E. J., Hellerstein, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+patient-oriented+research.+Recent+advances+in+liver+triacylglycerol+and+fatty+acid+metabolism+using+stable+isotope+labeling+techniques.">Thematic review series: patient-oriented research. Recent advances in liver triacylglycerol and fatty acid metabolism using stable isotope labeling techniques.</a> Journal of lipid research. 47, 1651-1660 (2006).</li><li>Befroy, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+assessment+of+hepatic+mitochondrial+oxidative+and+anaplerotic+fluxes+in+humans+using+dynamic+13C+magnetic+resonance+spectroscopy.">Direct assessment of hepatic mitochondrial oxidative and anaplerotic fluxes in humans using dynamic 13C magnetic resonance spectroscopy.</a> Nature medicine. 20, 98-102 (2014).</li><li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies.">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malaria journal. 6, 169 (2007).</li></ol>

The authors indicate they have no conflicts of interest.

הזמן מהקרבה לזלוף צריך להיות פחות מ 3 דקות לזלוף אידיאלי ועיכול collagenase של הכבד. ברגע שזלוף עם זלוף בינוני הוא יזם, הכבד צריך לשנות באופן מיידי את מראה למאדום לחיוורים. לאחר כ 10 דקות של דגירה עם LDM, הכבד יופיע נפוח ורודה. במקרה שזלוף אינו מספיק, בכבד לא יכול להציג שינויים אלה, וזה בדרך כלל יגרום לתשואה hepatocyte נמוכה יותר. בעקבות צעדי השטיפה, ניתן לאחסן hepatocytes המבודד במשך כמה שעות בהשעיה על קרח לפני הציפוי. ברגע שמצופה, hepatocytes התרבותי דורש כמה שעות לדבוק ולהתפשט. בעקבות 2 שעות של דגירה בציפוי בינוני, hepatocytes יישאר קטן ועגול. לאחר דגירה לילה, hepatocytes ייקח על מראה משושה אופייני יותר, שרבים מהם יהיה binucleated. אם ההכנה היא לא בריאה, גאמות יפגינו רב granulations ומדי פעם blebbing, מעיד על המוות של תאים. על מנת לשמור על יכולת קיום התרבות הטובה ביותר, צריכה להיות שונה תקשורת בכל שעה 24 וטופלה כדי למזער את החשיפה לאוויר פתוחה. palmitate נתרן הוא מסיס במים ב RT, עם זאת, לאחר דגירה על 70 מעלות צלזיוס זה צריך להתמוסס לחלוטין. חשיפה לRT תגרום השומנים לגבש במהירות, ובכך זה הכרחי לעבוד במהירות. ברגע שpalmitate כבר מומס בטרום דגירה בינונית, זה קריטי כדי לשמור על המדיום על 37 מעלות צלזיוס על מנת לשמור על המסיסות של השומנים. כפי שצוין לעיל, על מנת להבטיח תוצאות מדויקות מassay חומצות שומן החמצון, הבינוני חייבים להיות לגמרי קפוא בחנקן נוזלי. זה מונע כל בריחה של CO 2 בתוספת של חומצת perchloric לבארות. מייד לאחר התוספת של חומצת perchloric לדגימות קפואות, צלחת assay חייבת להיות הדוקה גovered על ידי צלחת נייר הסינון, והקפד ליישר את הצלחות להעברת גז בין הבארות. מאז נייר הסינון ספוג עם עודף של NaOH, ההרכב של התגובה הוא מסוגל ללכוד CO 2 שוחררו כNaHCO 3. הניסויים הבאים פרוטוקול זה יצרו תוצאות לשחזור, עם קורות חיים% משכפל טיפוסי שיש ≤ 10. במידת צורך, חומר מסיס חומצה מחומצות שומן חמצון assay או lysate התא מassay Lipogenesis הם מסוגל להיות מאוחסן ב -80 ° C ומעובד מאוחר יותר ללא כל השפעה משמעותית על תוצאות. מבחני שתוארו לעיל מאפשרים למנגנון יעיל יחסית פשוט וזמן כדי להעריך את חילוף החומרים של שומנים בדם בhepatocytes העיקרי מבודד מהכבד עכבר. באמצעות שימוש בתרבות vivo לשעבר, שיטות אלה מאפשרות בדיקת ההשפעות של מספר תנאים על חמצון של חומצות שומן וlipogenesis. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם על מנת להעריך את התפקיד של שינויים גנטיים בproce אלהsses, עם זאת, בידודה של hepatocytes הוא הגבלת זמן ובכך in vivo מנתח עשוי להיות מתאים יותר לחקירת מודלים של בעלי חיים מהונדסים מסוימים. אם הניתוח של הכנות hepatocyte מרובות הכרחי, נורמליזציה של ערכי assay לרמות חלבון יכולה להתבצע כפי שמתוארת בצעד האופציונלי 3.7.1 ומשמש לנורמליזציה. אנו ממליצים מבחני שבוצעו בהכנות מרובות להשוואה שינויים ביחס לעומת שליטה מתאימה. לבסוף, יש לנו לא בחנו את האפשרות של תקופות ארוכות יותר תרבות, לעומת זאת, hepatocytes עשוי להפגין מאפייני חילוף חומרים שווי ערך לאחר מספר ימים בתרבות. עם שינוי קל, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי לאפשר לטיפולים כמה ימים לפני הערכת ההשפעות של תרכובות בחילוף חומרים של שומנים.

Non-alcoholic fatty liver disease is one of the leading causes of liver disease in Westernized cultures1,2. Lipid accumulation within the liver is associated with cell death, fibrosis, and liver failure via yet unknown mechanisms3-6. In fatty liver disease, hepatocyte-mediated &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis are important determinants of net lipid accumulation7,8. This article will, therefore, focus on hepatocyte isolation, followed by quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis.
Numerous methodologies have been developed to interrogate hepatocyte lipid metabolism. Though it is possible to measure metabolism of fat in vivo using stable isotopes9,10, these methods are costly, and require large numbers of animals. Additionally, the ability to investigate the effect of exogenous chemicals is limited due to the nature of in vivo experimentation. In contrast, the isolation of primary hepatocytes from mouse liver provides an affordable avenue to pursue11. Furthermore, studying hepatocytes in culture allows investigators to study the effects of varying chemicals on lipid processing while circumventing the difficulties of in vivo experimentation. Finally, isolated hepatocytes avoid any confounding from varying genetics since they are derived from the liver of a single animal.
Here we isolate and culture of hepatocytes, and we measure &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled palmitate. The protocol detailed below is straight forward, effective, and reproducible.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liver Perfusion Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17701038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Digest Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17703034</td>
			<td>Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>26140079&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1048301&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colloidal silica coated with polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-001-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2915-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin (BSA), Fraction V</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>103703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Culture Dish</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>353047&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon S3 Tubing&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06460-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Leur Lock to 200 Barb Connectors</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>45518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24G x 3/4&#34; Catheter</td>
			<td>SurFlo</td>
			<td>SROX2419CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perma-Hand Silk Suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>683G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoTemp 3013HD Recirculating Water Bath</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-874-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex C/L Peristaltic Pump</td>
			<td>MasterFlex</td>
			<td>HV-77122-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microclamp</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7438</td>
			<td>Pre-sterilize in autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8221; Straight, Blunt-Blunt Operating Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6810</td>
			<td>Pre-sterilize in autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24mm Blade Straight, Sharp-point Microdissecting Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5912</td>
			<td>Pre-sterilize in autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8221; 0.8mm Tip Microdissecting Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5130</td>
			<td>Pre-sterilize in autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8221; 0.8mm Tip Full Curve Microdissecting Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5137</td>
			<td>Pre-sterilize in autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000, 200, 20 &#956;L pipet and tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of fatty acid oxidation and lipogenesis in mouse primary hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

בידודי Hepatocyte בדרך כלל לגרום 1 - 3 x 10 7 תאים כולל. לאחר דגירה הלילה, התאים יופיעו משושה, שרבים מהם יהיה binucleated (איור 2). תאים בריאים צריכים להיות נטולי granulations או שלפוחיות, אשר מעידים על המוות של תאים. באופן כללי, assay חומצות שומן החמצון מנוהל בשלושה עד ארבעה חזרות למתחם בדיקה. ספירה לCO 2 הדגימות כחמישית מאלה הנגזרים מהחומר מסיס החומצה. אנחנו בדרך כלל לחשב את היחס של CO 2 לחומר מסיס חומצה כמדד לחמצון מלא (כלומר, סכום חמצון באמצעות מעגל החומצה הציטרית). חומרים המקדמים נשימה תאית, כגון ציאניד 4-phenylhydrazone קרבוניל (trifluoromethoxy) (FCCP) יעברו יחס זה כלפי CO 2, המציין יותר חמצון באמצעות מחזור TCA. מעכבים של שרשרת הנשימה יקטנו חמצון בכל(איור 3). כאשר מטיס assay זה, עדיף כולל שליטה לא תאים כדי לאמת את הליך הפקת פעילות תא ספציפי. Lipogenesis assay הוא בהשוואה לרוב לשליטת אפס נקודה זמן (תאים שטופלו עם מצע מייד לפני הקציר). Assay צריך להיות ליניארי לעומת זמן דרך לפחות ארבע שעות של דגירה. תרכובות אשר משפרות חמצון של חומצות שומן, כגון FCCP, או להפחית את סינתזת ATP, כגון oligomycin, תפחית פעילות lipogenic (איור 4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52982/52982fig1.jpg" /> איור 1: הכנת צלחת הסינון כדי להכין את צלחת המסנן כמתואר בשלב 3.6, להסיר את הכיסוי מצלחת 24 גם סטרילי. הנח x 2 חתיכת סנטימטר 2 סנטימטר של נייר סינון בבסיס של כל טוב. כיסוי כל הצלחת עם 7 &quot;x 4&quot; חתיכה של סעיףסרט, ולשפשף את הצלחת לאטום את החלק העליון של הבארות בחוזקה. זה יפיק חוגים מחוררים של parafilm על הפתחים היטב, שיש להסיר. לאחר תוספת של חומצת perchloric בשלב 3.9, מניח את צלחת נייר סינון בחוזקה על צלחת Assay לייצר חותם. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52982/52982fig2.jpg" /> איור 2: היסודי hepatocytes בתרבות שלב ניגוד תמונות של hepatocytes עכבר העיקרי הבריא ולא בריא 16 שעות לאחר ציפוי בלוחות 24 גם קולגן מצופה. בר סולם, 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52982/52982fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52982/52982fig3.jpg" /> איור 3: חומצות שומן חמצון על ידי ראשי<html> העכבר hepatocytes בתרבות 14 חמצון C-Palmitate לCO () 2, חומר חומצה (B) מסיס, ו- (ג) היחס של CO 2 לחומר מסיס חומצה מhepatocytes העיקרי מודגרות עם הרכב, FCCP, או oligomycin. הנתונים הם ממוצעים ± SEM. * P &lt;0.05, ** p &lt;0.01 לעומת רכב על ידי מבחן t-זנב אחד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52982/52982fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52982/52982fig4.jpg" /> איור 4: Lipogenesis בתרבית הראשוני עכבר hepatocytes פעילות Lipogenic לעומת הזמן בhepatocytes העיקרי שטופל עם 3 H-אצטט ופעילות lipogenic (ב &#39;) בנוכחות של רכב, oligomycin, או FCCP (). הנתונים הם ממוצעים ± SEM. *** P &lt;0.001 לעומת רכב על ידי מבחן t-זנב אחד. תוכן &quot;&gt; טבלת 1: הרכב תרבות מדיה של תקשורת בתרבות לבידוד של hepatocytes העיקרי. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> טבלת 1 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> תרבות מדיה </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ציפוי בינוני </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 500 מיליליטר </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> פירובט נתרן </td><td> 2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> פן / סטרפטוקוקוס </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Dexamethasone </td><td> 1 מיקרומטר </td></tr><tr><td> אינסולין </td><td> 0.1 מיקרומטר </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> תחזוקה בינונית </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 500 מיליליטר </td></tr&gt; <tr><td> V שבר BSA </td><td> 0.2% </td></tr><tr><td> פירובט נתרן </td><td> 2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> פן / סטרפטוקוקוס </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Dexamethasone </td><td> 0.1 מיקרומטר </td></tr><tr><td> אינסולין </td><td> 1 ננומטר </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> רעב בינוני </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 500 מיליליטר </td></tr><tr><td> V שבר BSA </td><td> 0.2% </td></tr><tr><td> פירובט נתרן </td><td> 2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> פן / סטרפטוקוקוס </td><td> 2% </td></tr></tbody></table>

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes at JoVE.com

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

lipogenesis נובו דה וחמצון חומצת β-השומן מהווים מסלולי מפתח חילוף חומרים בhepatocyte, מסלולים המוטרדים בכמה הפרעות מטבוליות, כוללים מחלת כבד שומני. כאן אנו מדגימים בידוד של hepatocytes העיקרי עכבר ולתאר כימות של חמצון חומצת β-השומן וlipogenesis.

קביעת חומצות שומן החמצון וLipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

determination-fatty-acid-oxidation-lipogenesis-mouse-primary

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

20.1K Views.  University of Massachusetts Medical School.  lipogenesis נובו דה וחמצון חומצת β-השומן מהווים מסלולי מפתח חילוף חומרים בhepatocyte, מסלולים המוטרדים בכמה הפרעות מטבוליות, כוללים מחלת כבד שומני. כאן אנו מדגימים בידוד של hepatocytes העיקרי עכבר ולתאר כימות של חמצון חומצת β-השומן וlipogenesis. 

Video: Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. Current strategies for microbial analysis include both traditional laboratory culture-dependent techniques and those based on direct extraction and determination of certain biomarkers1, 2. Few among the diversity of microbial species inhabiting soil can be cultured, so culture-dependent methods introduce significant biases, a limitation absent in biomarker analysis.
The glucosamine, mannosamine, galactosamine and muramic acid have been well served as measures of both the living and dead microbial mass, of these the glucosamine (most abundant) and muramic acid (uniquely from bacterial cell) are most important constituents in the soil systems3, 4. However, the lack of knowledge on the analysis restricts the wide popularization among scientific peers. Among all existing analytical methods, derivatization to aldononitrile acetates followed by GC-based analysis has emerged as a good option with respect to optimally balancing precision, sensitivity, simplicity, good chromatographic separation, and stability upon sample storage5.
Here, we present a detailed protocol for a reliable and relatively simple analysis of glucosamine and muramic acid from soil after their conversion to aldononitrile acetates. The protocol mainly comprises four steps: acid digestion, sample purification, derivatization and GC determination. The step-by-step procedure is modified according to former publications6, 7. In addition, we present a strategy to structurally validate the molecular ion of the derivative and its ion fragments formed upon electron ionization. We applied GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS and isotopically labeled reagents to determine the molecular weight of aldononitrile acetate derivatized glucosamine and muramic acid; we used the mass shift of isotope-labeled derivatives in the ion spectrum to investigate ion fragments of each derivatives8. In addition to the theoretical elucidation, the validation of molecular ion of the derivative and its ion fragments will be useful to researchers using &delta;13C or ion fragments of these biomarkers in biogeochemical studies9, 10.

We describe a method protocol for the GC-based analysis of the aldonitrile acetate derivatives of glucosamine and muramic acid extracted from soil. For elucidation of the chemical mechanism, we also present a strategy to confirm the structure of the derivative and the ion fragments formed upon electron ionization.

GC מבוסס זיהוי של אצטט חומצה Aldononitrile גלוקוזאמין Muramic Derivatized לקביעת שאריות מיקרוביאלית בקרקע

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, and participate in various signaling pathways. Caenorhabditis elegans synthesizes all of the enzymes necessary to produce a range of omega-6 and omega-3 fatty acids. This, combined with the simple anatomy and range of available genetic tools, make it an attractive model to study fatty acid function. In order to investigate the genetic pathways that mediate the physiological effects of dietary fatty acids, we have developed a method to supplement the C. elegans diet with unsaturated fatty acids. Supplementation is an effective means to alter the fatty acid composition of worms and can also be used to rescue defects in fatty acid-deficient mutants. Our method uses nematode growth medium agar (NGM) supplemented with fatty acidsodium salts. The fatty acids in the supplemented plates become incorporated into the membranes of the bacterial food source, which is then taken up by the C. elegans that feed on the supplemented bacteria. We also describe a gas chromatography protocol to monitor the changes in fatty acid composition that occur in supplemented worms. This is an efficient way to supplement the diets of both large and small populations of C. elegans, allowing for a range of applications for this method.

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a useful model to explore the functions of polyunsaturated fatty acids in development and physiology. This protocol describes an efficient method of supplementing the C. elegans diet with polyunsaturated fatty acids.

תוספת תזונתית של חומצות שומן רב בלתי רוויות ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

יישום של חומצה הרטינואית לקבל תרבויות Osteocytes מOsteoblasts העכבר העיקרי

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

שיטות לקביעת המחירים של גלוקוז ו חומצות שומן חמצון שבלב עכברוש העבודה המבודד

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or more hepatocytes contribute apical membranes to form a bile canalicular network through which bile is secreted. Hepatocyte polarization is essential for correct canalicular formation and depends on interactions between the hepatocyte cytoskeleton, cell-cell contacts, and the extracellular matrix. In vitro studies of hepatocyte cytoskeleton involvement in canaliculi formation and its response to pathological situations are handicapped by the lack of cell culture, which would closely resemble the canaliculi network structure in vivo. Described here is a protocol for the isolation of mouse hepatocytes from the adult mouse liver using a modified collagenase perfusion technique. Also described is the production of culture in a 3D collagen sandwich setting, which is used for immunolabeling of cytoskeletal components to study bile canalicular formation and its response to treatments in vitro. It is shown that hepatocyte 3D collagen sandwich cultures respond to treatments with toxins (ethanol) or actin cytoskeleton altering drugs (e.g., blebbistatin) and serve as a valuable tool for in vitro studies of bile canaliculi formation and function.

Presented here is a protocol for the isolation of mouse hepatocytes from adult mouse livers using a modified collagenase perfusion technique. Also described is the long-term culture of hepatocytes in a 3D collagen sandwich setting as well as immunolabeling of the cytoskeletal components to study bile canalicular formation and its response to treatment.

בידוד וכריך קולגן 3D תרבות של העכבר הראשי Hepatocytes כדי ללמוד את התפקיד של שלד ציטוזה היווצרות של המרה בתוך מחוץ לגופית

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...