We would like to acknowledge Susan Gray and Umadevi Chalasani for their help with technical aspects of the hepatocyte isolation protocol. This work was supported by NIDDK grant 5R01DK089185 (to M.P. Cooper) and the DERC Pilot and Feasibility Program at UMMS (to M.P. Cooper).

כל הניסויים בבעלי החיים צריכים להתבצע בהתאם לתקנות פדרליות ומקומיות ובאישור של ממשל IACUC ובטיחות קרינה מוסדי. 1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמה ימים לפני assay, להפשיר את בקבוק 500 מיליליטר של כבד Digest בינוני (LDM) וrefreeze ~ 35 aliquots מיליליטר ב 50 מיליליטר צינורות חרוטי. חנות ב -20 ° C עד צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני assay, מראש לעקר כלים לנתיחה נקיים על ידי החיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של assay, טיפול הסכום הדרוש של צלחות תרבות 24 גם עם קולגן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים חלק 1 של קולגן זנב חולדה / מיליליטר 3 מ&quot;ג עם 50 חלקים של PBS. להוסיף כ 500 μl היטב בכל צלחת 24 גם דגירה של 3-5 דקות בטמפרטורת חדר (RT). הסר את הקולגן ולאפשר צלחת לייבוש באוויר במכסת מנוע. חזור על לפחות פעם אחת נוספת. הערה: ציפוי קולגן יכול להתבצע עד שבוע במודעהאנס וצלחות מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס אטומות בניילון הנצמד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן LDM עבור assay: LDM הפשירי וחמה עד 37 מעלות צלזיוס ולהתאים את ה- pH 7.4 באמצעות 1 N KOH. מסנן באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר ומקום באמבט מים 42 מעלות צלזיוס הסירקולציה המחודשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 25 מיליליטר חם של כבד זלוף בינוני עד 42 מעלות צלזיוס באמבט מים הסירקולציה המחודשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 90% סיליקה colloidal מצופים פתרון polyvinylpyrrolidone: הוסף 1 מיליליטר של 10x DPBS עד 9 מיליליטר של סיליקה colloidal מצופה polyvinylpyrrolidone. התאם ל- pH 7.4 באמצעות 0.1 N HCl. סנן עם מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר סטרילי. אחסן בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני ציפוי חם עד 37 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. בידוד של יסודי העכבר hepatocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את משאבת peristaltic, צינורות, ושולחן נתיחה: לעקר צינורות על ידי שטיפה עם אתנול 5 מיליליטר 70% במים מזוקקים, ואחריו 10 מיליליטר של מים סטריליים. מניחים צינורות בכבד זלוף בינוני ומשאבה לרוץ למלאלכל אורך צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכבר בשיטה אושרה מוסדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח פתוח חלל הבטן: ספריי בטן העכבר בנדיבות עם אתנול 70%. בעזרת מספריים קהה-סוף, לעשות חתך קו האמצע דרך העור באורך של הבטן ומשקפים רוחבי. לעשות חתך דומה בהצפק לחשוף את הקרביים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במכשיר קהה, בעדינות לעקור את המעיים כדי לחשוף את כלי הדם בבטן אתר את הווריד הנבוב הנחות הבטן (IVC) ומקום תפר מתחת לכלי הדם, דיסטלי לוריד הכליה </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסטלי לתפר, למקם את מחט וצנתר לתוך IVC, קידומה מעבר לרמה של התפר. עם המחט עדיין במקום, לקשור את התפר סביב קטטר להחזיק אותו במקום. מוציא בזהירות את המחט. אם נעשה בצורה נכונה, דם עם זרימה דרך קטטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות pipet, למלא את השטח שנותר בצנתר עם מדיום זלוף, הבטחהשאין אוויר הוא הווה. בזהירות רבה, לצרף את צינורות לקטטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח פתוח חלל הריאות: בעדינות משקף את האונה של הכבד מעולה לחשוף את הסרעפת. לנקב בזהירות הסרעפת במספריים קצה חד, אז לעשות חתך לרוחב כדי לחשוף את חלל פלאורלי, לטפל כדי למנוע כיס המרה וכלי דם פלאורלי. הנח מהדק בולדוג סביב הווריד הנבוב הנחות החזה רק הפרוקסימלי לווריד הכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את וריד השער ולהפעיל את המשאבה ב3 - 4 מיליליטר / דקה. Perfuse את הכבד עם כבד זלוף בינוני במשך 5 דקות באמצעות כ 20 מיליליטר של מדיום זלוף. הערה: הכבד צריך לשנות באופן מיידי מאדום לאפור / שיזוף. אם החלקים של הכבד יישארו אדומים, זה סביר מציין זלוף העני, ואת הסבירות של בידוד מוצלח היא פחת באופן משמעותי. במהלך זלוף, להיות זהיר כדי להבטיח בינוני לא נגמר ושאין בועות להיכנס לצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 5 דקות, לעצורהמשאבה ולהעביר את צינורות לכבד Digest בינוני. הפעל מחדש את המשאבה ותנקב את הכבד לעוד 10 - 15 דקות (עד שהמדיום הוא מותש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של זלוף, לעצור את המשאבה. הכבד צריך להיות גוון ורדרד ומופיע מוגדל במקצת. בלו הכבד על ידי נתיחה זהירה. הסר את כיס המרה ולהעביר את הכבד לצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגית, להוסיף 10 מיליליטר של ציפוי בינוני (טבלה 1) בכבד. בעדינות לגרד את הכבד או באמצעות מלקחיים או אזמל כדי להסיר את hepatocytes. סנן את ההשעיה באמצעות מסננת תא 100 מיקרומטר ולהעביר צינור חרוטי 50 מיליליטר. לשטוף את הצלחת עם תוספת של 10 מיליליטר של ציפוי בינוני ובריכה בצינור חרוטי 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים על ידי צנטריפוגה 5 דקות ב 350 XG, 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני לשאוב וגלול גלולים ב 10 מיליליטר של ציפוי בינוני ולהוסיף 10 מיליליטר של 90% סיליקה colloidal מצופה פוlyvinylpyrrolidone. מערבבים בעדינות וצנטריפוגה כמו בשלב 2.11. לאחר צנטריפוגה, שכבה של תאים מתים תהיה צף על גבי התערובת, בעוד התאים חי גלולה לתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תאים מתים ובינוני. לשטוף 2 פעמים עם 20 מיליליטר של ציפוי בינוני, צנטריפוגות כמו ב2.11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspend ב 10 מיליליטר של ציפוי בינוני. ספירת תאים עם hemocytometer ומקום 9 x 10 4 תאים / גם בתרבות מנות 24 גם טופל קולגן. דגירה בתרבית רקמת חממת 37 ° C עבור שעה 2. כל צלחת יכולה לשמש גם עבור assay חומצות שומן החמצון או assay Lipogenesis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לשנות את הבארות לתחזוקה בינונית (טבלה 1) ותרבות על 37 מעלות צלזיוס. תאים יכולים להיות מתורבת עבור 2 - 3 ימים מבלי להשפיע על תוצאות assay. </li></ol> 3. חומצות שומן החמצון Assay אזהרה: שימוש בקרינה רדיואקטיבית יכול להיות מסוכנת. כל הרכישה, האחסון, הטיפול, ודיsposal של חומר רדיואקטיבי צריכה להתבצע בהתאם למדינה, תקנות מוסדיות, ופדרליות והנחיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 16 - 20 שעות לפני assay, לשטוף תאים 2 פעמים עם PBS החם. לשנות את התאים לסרום רעב בינוני סרום ללא (טבלת 1) עם 20 ננומטר גלוקגון ודגירת הלילה על 37 מעלות צלזיוס. הערה: מאחר בסרום שור עוברי מכיל ריכוז לא ידוע של הורמונים מטבוליים (למשל אינסולין, גלוקגון), סרום להרעיב את התאים כדי להסיר כל תופעות בלבול זה יכול להיות על assay. תאי קיימא בסרום רעב בינוני ל&gt; 24 שעות. טיפול גלוקגון משמש כדי לעורר חמצון של חומצות שומן בתאים הכבדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקרו של assay, להכין טרום דגירה בינונית: Resuspend כמות מתאימה של נתרן Palmitate במי ultrapure לעשות פתרון 100 מ&quot;מ וחום עד 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בינתיים, מכין את הסכום הנדרש (0.5 מיליליטר לכל גם צלחת 24 גם)של DMEM עם 25 HEPES מ&quot;מ, 1% V בר BSA, ו -20 ננומטר גלוקגון. חום עד 37 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שsolubilized, להוסיף Palmitate לריכוז סופי של 250 מיקרומטר עד הבינוני. לשנות hepatocytes מראש דגירה בינונית ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2. שומר כמה טרום דגירה בינונית על 37 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, לייבש כמות מתאימה של 14 C-Palmitate (0.5 μCi / טוב) על ידי אידוי תחת גז חנקן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמה, כדי למדוד 24 דגימות בצלחת 24 גם, להעביר 120 μl של 0.1 μCi / מיליליטר 14 C-Palmitate לצינור 1.5 מיליליטר. לאט להתאדות אתנול הממס על ידי פיצוץ גז חנקן על הפתרון ממרחק של 3-5 סנטימטר במנדף. הממס צריך להתאדות בכ 30 - 40 דקות, והשאיר 14 C-Palmitate היבש בחלק התחתון של הצינור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ -15 דקות לפני תום הדגירה, resuspend 14C-Palmitate ב 0.1 N NaOH (12.5 μl / μCi). לדגור על 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. להוסיף שלושה כרכים של חמה טרום דגירה בינונית ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספייק כל טוב עם 25 μl של דילול 14 C-Palmitate. מערבבים בעדינות על ידי הנדנדה הצלחת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. זהו פלייט Assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, להכין צלחת נייר סינון (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המכסה מצלחת 24 גם סטרילי. הנח סנטימטר אחד 2 פיסת נייר סינון x 2 סנטימטר בחלק התחתון של כל אחד מהבארות. כיסוי הצלחת עם חתיכת 4 &quot;x 7&quot; parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באובייקט מלבני גדול, כגון תיבת קצה micropipettor, לשפשף את parafilm על הבארות ללנקב parafilm בפתחים היטב וליצור חותם על פני יתרת הצלחת. הסר את העיגולים המחוררים של parafilm עכשיו מכסים את הבארות. הצלחת צריכה עכשיו להיות מכוסה היטב עם parafilm בכל התחומים למעט o גםpenings. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 דקות לפני סוף הדגירה, להוסיף 200 μl של 3 N NaOH היטב בכל צלחת נייר הסינון, כדי לוודא שנייר הסינון סופג את כל הנוזלים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין לפני ההקפאה, להעביר את המדיום לצלחת 24 גם טרי. לאחר שטיפת פעם עם PBS, lyse התאים שנותרו ב0.1 N HCl ולחשב את תכולת חלבון על ידי assay BCA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הדגירה, snap-להקפיא פלייט Assay בחנקן נוזלי. להיות זהיר כדי להבטיח היטב כל קפוא לחלוטין לפני שתמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 70% חומצת perchloric 100 μl היטב בכל צלחת Assay. מייד לכסות עם צלחת נייר סינון. מקם את הצלחות בייקר מסלולית ורוק במהירות סיבובית של 80 סל&quot;ד ב RT עבור שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה, לעבד את הדגימות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את חלק CO 2, להעביר את ריבועי נייר סינון 4 מיליליטר נוזל נצנץ נוזלי בנצנץבקבוקון ואות C מידת 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את החומר מסיס החומצה, להעביר 400 μl של מדיום לצינור 1.5 מיליליטר microfuge. צנטריפוגה במהירות המרבית למשך 10 דקות. להוסיף את supernatant וכתוצאה מכך 100 μl 500 μl של 2: 1 כלורופורם-מתנול (V / V), ובקצרה מערבולת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של מים לתערובת, ומערבולת שוב. צנטריפוגה דגימות במשך 10 דקות ב 3000 x גרם. העברה 200 μl של השלב העליון עד 4 מיליליטר נוזל נצנץ נוזלי בבקבוקון נצנץ ולמדוד אות C 14. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Lipogenesis Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערב לפני תחילת assay, לשטוף את התאים 2 פעמים עם PBS החם. לשנות את hepatocytes לסרום רעב בינוני עם 100 ננומטר אינסולין. דגירה הלילה בשעת 37 מעלות צלזיוס. הערה: מאחר בסרום שור עוברי מכיל ריכוז לא ידוע של הורמונים מטבוליים (למשל אינסולין, גלוקגון), סרום להרעיב את התאים כדי להסיר כל תופעות בלבול זה יכול להיות על assay. תאי קיימא בסרום רעב בינוני ל&gt; 24 שעות. אינסולין משמש בassay זה כדי לעורר lipogenesis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך Lipogenesis בינוני: סרום רעב בינוני עם 100 ננומטר אינסולין, אצטט קר 10 מיקרומטר ו-0.5 μCi 3 H-אצטט בכל טוב. לשנות תאים לLipogenesis בינוני ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2. כלול את כל תרכובות של עניין להיבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה, לשטוף תאים 2 פעמים עם PBS. תאי Lyse על ידי גירוד ב120 μl של 0.1 N HCl. שמורת 10 μl עבור assay חלבון (להעריך על ידי assay BCA), והעברה לצינור 1.5 מיליליטר microfuge 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שומני תמצית על ידי תוספת של 500 μl של 2: 1 כלורופורם-מתנול (V / V). בקצרה מערבולת לדגור על RT במשך 5 דקות. הוסף 250 μl מים, מערבולת ולדגור על RT עבור 5 דקות נוספות. דגימות צנטריפוגה 10 דקות ב 3000 XG, RT. זהירותלהעביר שלב נמוך עד 4 מיליליטר נוזל נצנץ נוזלי בבקבוקון נצנץ ולמדוד 3 פעילות H. </li></ol>

<ol>
	<li>Clark, J. M., Brancati, F. L., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+and+etiology+of+elevated+aminotransferase+levels+in+the+United+States.">The prevalence and etiology of elevated aminotransferase levels in the United States.</a> The American journal of gastroenterology. 98, 960-967 (2003).</li><li>Lazo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+nonalcoholic+Fatty+liver+disease+in+the+United+States:+the+third+national+health+and+nutrition+examination+survey,+1988-1994.">Prevalence of nonalcoholic Fatty liver disease in the United States: the third national health and nutrition examination survey, 1988-1994.</a> American journal of epidemiology. 178, 38-45 (2013).</li><li>Angulo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Nonalcoholic fatty liver disease.</a> The New England journal of medicine. 346, 1221-1231 (2002).</li><li>Adams, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+history+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease:+a+population-based+cohort+study.">The natural history of nonalcoholic fatty liver disease: a population-based cohort study.</a> Gastroenterology. 129, 113-121 (2005).</li><li>Feldstein, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+apoptosis+and+fas+expression+are+prominent+features+of+human+nonalcoholic+steatohepatitis.">Hepatocyte apoptosis and fas expression are prominent features of human nonalcoholic steatohepatitis.</a> Gastroenterology. 125, 437-443 (2003).</li><li>Day, C. P., James, O. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steatohepatitis:+a+tale+of+two+'hits'.">Steatohepatitis: a tale of two 'hits'.</a> Gastroenterology. 114, 842-845 (1998).</li><li>Donnelly, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sources+of+fatty+acids+stored+in+liver+and+secreted+via+lipoproteins+in+patients+with+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Sources of fatty acids stored in liver and secreted via lipoproteins in patients with nonalcoholic fatty liver disease.</a> The Journal of clinical investigation. 115, 1343-1351 (2005).</li><li>Lambert, J. E., Ramos-Roman, M. A., Browning, J. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+de+novo+lipogenesis+is+a+distinct+characteristic+of+individuals+with+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Increased de novo lipogenesis is a distinct characteristic of individuals with nonalcoholic fatty liver disease.</a> Gastroenterology. 146, 726-735 (2014).</li><li>Parks, E. J., Hellerstein, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+patient-oriented+research.+Recent+advances+in+liver+triacylglycerol+and+fatty+acid+metabolism+using+stable+isotope+labeling+techniques.">Thematic review series: patient-oriented research. Recent advances in liver triacylglycerol and fatty acid metabolism using stable isotope labeling techniques.</a> Journal of lipid research. 47, 1651-1660 (2006).</li><li>Befroy, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+assessment+of+hepatic+mitochondrial+oxidative+and+anaplerotic+fluxes+in+humans+using+dynamic+13C+magnetic+resonance+spectroscopy.">Direct assessment of hepatic mitochondrial oxidative and anaplerotic fluxes in humans using dynamic 13C magnetic resonance spectroscopy.</a> Nature medicine. 20, 98-102 (2014).</li><li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies.">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malaria journal. 6, 169 (2007).</li></ol>

The authors indicate they have no conflicts of interest.

הזמן מהקרבה לזלוף צריך להיות פחות מ 3 דקות לזלוף אידיאלי ועיכול collagenase של הכבד. ברגע שזלוף עם זלוף בינוני הוא יזם, הכבד צריך לשנות באופן מיידי את מראה למאדום לחיוורים. לאחר כ 10 דקות של דגירה עם LDM, הכבד יופיע נפוח ורודה. במקרה שזלוף אינו מספיק, בכבד לא יכול להציג שינויים א...

Non-alcoholic fatty liver disease is one of the leading causes of liver disease in Westernized cultures1,2. Lipid accumulation within the liver is associated with cell death, fibrosis, and liver failure via yet unknown mechanisms3-6. In fatty liver disease, hepatocyte-mediated &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis are important determinants of net lipid accumulation7,8. This article will, therefore, focus on hepatocyte isolation, followed by quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis.
Numerous methodologies have been developed to interrogate hepatocyte lipid metabolism. Though it is possible to measure metabolism of fat in vivo using stable isotopes9,10, these methods are costly, and require large numbers of animals. Additionally, the ability to investigate the effect of exogenous chemicals is limited due to the nature of in vivo experimentation. In contrast, the isolation of primary hepatocytes from mouse liver provides an affordable avenue to pursue11. Furthermore, studying hepatocytes in culture allows investigators to study the effects of varying chemicals on lipid processing while circumventing the difficulties of in vivo experimentation. Finally, isolated hepatocytes avoid any confounding from varying genetics since they are derived from the liver of a single animal.
Here we isolate and culture of hepatocytes, and we measure &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled palmitate. The protocol detailed below is straight forward, effective, and reproducible.

<table><tbody><tr><td>Liver Perfusion Medium</td><td>Life Technologies</td><td>17701038</td><td></td></tr><tr><td>Liver Digest Medium</td><td>Life Technologies</td><td>17703034</td><td>Aliquot and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10X DPBS</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140079&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Collagen</td><td>Life Technologies</td><td>A1048301&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Colloidal silica coated with polyvinylpyrrolidone</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Cellgro</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D2915-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Albumin (BSA), Fraction V</td><td>MP Biomedicals</td><td>103703</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Culture Dish</td><td>Corning Falcon</td><td>353047&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tygon S3 Tubing&amp;nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td>06460-34</td><td></td></tr><tr><td>Male Leur Lock to 200 Barb Connectors</td><td>Cole Parmer</td><td>45518-00</td><td></td></tr><tr><td>24 G x 3/4&quot; Catheter</td><td>SurFlo</td><td>SROX2419CA</td><td></td></tr><tr><td>Perma-Hand Silk Suture</td><td>Ethicon</td><td>683G</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Corning Falcon</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>IsoTemp 3013HD Recirculating Water Bath</td><td>Fisher</td><td>13-874-3</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex C/L Peristaltic Pump</td><td>MasterFlex</td><td>HV-77122-24</td><td></td></tr><tr><td>Microclamp</td><td>Roboz</td><td>RS-7438</td><td>Pre-sterilize in autoclave</td></tr><tr><td>5&amp;rdquo; Straight, Blunt-Blunt Operating Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-6810</td><td>Pre-sterilize in autoclave</td></tr><tr><td>24 mm Blade Straight, Sharp-point Microdissecting Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>Pre-sterilize in autoclave</td></tr><tr><td>4&amp;rdquo; 0.8 mm Tip Microdissecting Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5130</td><td>Pre-sterilize in autoclave</td></tr><tr><td>4&amp;rdquo; 0.8 mm Tip Full Curve Microdissecting Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td>Pre-sterilize in autoclave</td></tr><tr><td>60 ml Syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>Corning Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;Incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serological pipets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000, 200, 20 &amp;mu;l pipet and tips</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determination of fatty acid oxidation and lipogenesis in mouse primary hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

בידודי Hepatocyte בדרך כלל לגרום 1 - 3 x 10 7 תאים כולל. לאחר דגירה הלילה, התאים יופיעו משושה, שרבים מהם יהיה binucleated (איור 2). תאים בריאים צריכים להיות נטולי granulations או שלפוחיות, אשר מעידים על המוות של תאים. באופן כללי, assay חומצות ...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes at JoVE.com

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

lipogenesis נובו דה וחמצון חומצת β-השומן מהווים מסלולי מפתח חילוף חומרים בhepatocyte, מסלולים המוטרדים בכמה הפרעות מטבוליות, כוללים מחלת כבד שומני. כאן אנו מדגימים בידוד של hepatocytes העיקרי עכבר ולתאר כימות של חמצון חומצת β-השומן וlipogenesis.

קביעת חומצות שומן החמצון וLipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

determination-fatty-acid-oxidation-lipogenesis-mouse-primary

Research

JoVE Journal

Biology

20.2K Views.  University of Massachusetts Medical School.  lipogenesis נובו דה וחמצון חומצת β-השומן מהווים מסלולי מפתח חילוף חומרים בhepatocyte, מסלולים המוטרדים בכמה הפרעות מטבוליות, כוללים מחלת כבד שומני. כאן אנו מדגימים בידוד של hepatocytes העיקרי עכבר ולתאר כימות של חמצון חומצת β-השומן וlipogenesis. 

Video: Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional processes, such as ketogenesis and gluconeogenesis, which are essential to maintain whole-body glucose homeostasis and support extra-hepatic organ function in the fasted state. Fatty acid &#946;-oxidation occurs within the mitochondria and peroxisomes and is regulated through multiple mechanisms, including the uptake and activation of fatty acids, enzyme expression levels, and availability of cofactors such as coenzyme A and NAD+. In assays that measure fatty acid &#946;-oxidation in liver homogenates, cell lysis and the common addition of supraphysiological levels of cofactors mask the effects of these regulatory mechanisms. Furthermore, the integrity of the organelles in the homogenates is hard to control and can vary significantly between preparations. The measurement of fatty acid &#946;-oxidation in intact primary hepatocytes overcomes the above pitfalls. This protocol describes a method for the measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated primary mouse hepatocytes incubated with 14C-labeled palmitic acid. By avoiding hours to days of culture, this method has the advantage of better preserving the protein expression levels and metabolic pathway activity of the original liver, including the activation of fatty acid &#946;-oxidation observed in hepatocytes isolated from fasted mice compared to fed mice.

Fatty acid &#946;-oxidation is an essential metabolic pathway responsible for generating energy in many different cell types, including hepatocytes. Here, we describe a method to measure fatty acid &#946;-oxidation in freshly isolated primary hepatocytes using 14C-labeled palmitic acid.

מדידה של חומצת שומן β-חמצון בהשעיה של הפטוציטים עכברים מבודדים טריים

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

Biochemistry

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

ניתוח אופטימלי של<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; כבדית steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Medicine

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for systemic energy homeostasis. Primary hepatocytes isolated from the murine liver constitute a valuable biological tool to understand the functional properties or alterations occurring in the liver. Herein we describe a method for the isolation and culture of primary mouse hepatocytes by performing a two-step collagenase perfusion technique and discuss their utilization for investigating protein metabolism. The liver of an adult mouse is sequentially perfused with ethylene glycol-bis tetraacetic acid (EGTA) and collagenase, followed by the isolation of hepatocytes with the density gradient buffer. These isolated hepatocytes are viable on culture plates and maintain the majority of endowed characteristics of hepatocytes. These hepatocytes can be used for assessments of protein metabolism including nascent protein synthesis with non-radioactive reagents. We show that the isolated hepatocytes are readily controlled and comprise a higher quality and volume stability of protein synthesis linked to energy metabolism by utilizing the chemo-selective ligation reaction with a Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein detection method and western blotting analyses. Therefore, this method is valuable for investigating hepatic nascent protein synthesis linked to energy homeostasis. The following protocol outlines the materials and methods for the isolation of high-quality primary mouse hepatocytes and detection of nascent protein synthesis.

Here, we present a protocol for the isolation of healthy and functional primary mouse hepatocytes. Instructions for detecting hepatic nascent protein synthesis by non-radioactive labeling substrate were provided to help understand the mechanisms underlying protein synthesis in the context of energy-metabolism homeostasis in the liver.

בידוד של העכבר הראשי Hepatocytes לניתוח סינתזת חלבון Nascent בשיטה תיוג L שאינו רדיואקטיבי-azidohomoalanine

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive fat accumulation leads to non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), &#160;which is potentially reversible and may evolve into non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and eventually cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). The molecular mechanisms linking lipid accumulation in hepatocytes with the progression to NASH, irreversible liver damage, fibrosis, cirrhosis, and even HCC still remains unclear. To this end, several in vitro and in vivo models have been developed to elucidate the pathological processes that cause NAFLD. In the present study, we describe a cellular model for the induction of liver vesicular steatosis that consists of DMSO-differentiated human hepatic HepaRG cells treated with the fatty acid salt sodium oleate. Indeed, sodium oleate-treated HepaRG cells accumulate lipid droplets in the cytoplasm and show typical features of steatosis. This in vitro human model represents a valuable alternative to in vivo mice models as well as to the primary human hepatocytes. We also present a comparison of several methods for the quantification and evaluation of fat accumulation in HepaRG cells, including Oil Red O staining, cytofluorimetric Bodipy measurement, metabolic gene expression analysis by qPCR, and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. CARS imaging combines the chemical specificity of Raman spectroscopy, a chemical analysis technique well-known in materials science applications, with the benefits of high-speed, high-resolution non-linear optical microscopies to allow precise quantification of lipid accumulation and lipid droplet dynamics. The establishment of an efficient in vitro model for the induction of vesicular steatosis, alongside an accurate method for the quantification and characterization of lipid accumulation, could lead to the development of early stage diagnosis of NAFLD via the identification of molecular markers, and to the generation of new treatment strategies.

In this study, we describe a detailed protocol for inducing liver vesicular steatosis in differentiated HepaRG cells with the fatty acid salt sodium oleate and employ methods for detection and quantification of lipid accumulation, including coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy, cytofluorimetric analysis, Oil red O staining, and qPCR.&#160;

גרימת ואפיון שלפוחית הזרע ב הבדיל תאים HepaRG

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive ...

Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a class of many different molecules with many pathways involved in their synthesis and metabolism. A starting point for evaluating lipid hemostasis for nutrition and obesity research is needed. This paper describes three easy and accessible methods that require little expertise or practice to master, and that can be adapted by most labs to screen for lipid-metabolism abnormalities in mice. These methods are (1) measuring several fasting serum lipid molecules using commercial kits (2) assaying for dietary lipid-handling capability through an oral intralipid tolerance test, and (3) evaluating the response to a pharmaceutical compound, CL 316,243, in mice. Together, these methods will provide a high-level overview of lipid handling capability in mice.

This paper provides three easy and accessible assays for assessing lipid metabolism in mice.

הערכת יכולת טיפול בליפידים בכל הגוף בעכברים

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a ...

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver disease worldwide due to its relationship with obesity, diabetes type 2, and dyslipidemia. Hepatic steatosis, the accumulation of lipid droplets in the liver parenchyma, is a key feature of the disease preceding the inflammation observed in steatohepatitis, fibrosis, and end-stage liver disease. Lipid accumulation in hepatocytes might interfere with proper metabolism of xenobiotics and endogenous molecules, as well as to induce cellular processes leading to the advance of the disease. Although the experimental study of steatosis can be performed in vivo, in vitro approaches to the study of steatosis are complementary tools with different advantages. Hepatocyte culture in lipid overload-conditioned medium is an excellent reproducible option for the study of hepatic steatosis allowing the identification of cellular processes related to lipid accumulation, such as oxidative and reticular stresses, autophagia, proliferation, cell death, etcetera, as well as other testing including drug effectiveness, and toxicological testing, among many other possible applications. Here, it was aimed to describe the methodology of hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. HepG2 cells were cultured in RMPI 1640 medium conditioned with sodium palmitate and sodium oleate. Importantly, the ratio of these two lipids is crucial to favor lipid droplet accumulation, while maintaining cell proliferation and a moderate mortality rate, as occurs in the liver during the disease. The methodology, from the preparation of the lipid solution stocks, mixture, addition to the medium, and hepatocyte culture is shown. With this approach, it is possible to identify lipid droplets in the hepatocytes that are readily observable by Oil-red O staining, as well as curves of proliferation/mortality rates.

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

This protocol is intended to be a tool to study steatosis and the molecular, biochemical, cellular changes produced by the over exposure of hepatocytes to lipids in vitro.

מודל של סטאטוזיס ניסיוני במבחנה: תרבית תאי הפטוציט במדיום מותנה בעומס יתר של שומנים

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on different needs, like time, labor, cost, and primary hepatocyte usage, resulting in various primary hepatocyte isolation protocols. However, the numerous steps and time-consuming reagent preparations in primary hepatocyte isolation are major drawbacks for efficiency. After comparing different protocols for their pros and cons, the advantages of each were combined, and a rapid and efficient primary hepatocyte isolation protocol was formulated. Within only ~35 min, this protocol could yield as much, if not more, healthy primary hepatocytes as other protocols. Further, glucose metabolism experiments performed using the isolated primary hepatocytes validated the usefulness of this protocol in in vitro liver metabolism studies. We also extensively reviewed and analyzed the significance and purpose of each step in this study so that future researchers can further optimize this protocol based on needs.

Primary hepatocytes are a valuable tool to study liver response and metabolism in vitro. Utilizing commercially available reagents, an improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation was developed.

פרוטוקול יעיל יותר בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Evaluation of Fatty Acid Oxidation in Cultured Bone Cells

Bone formation by differentiating osteoblasts is expected to require significant energetic input as these specialized cells must synthesize large extracellular matrix proteins that compose bone tissue and then concentrate the ions necessary for its mineralization. Data on the metabolic requirements of bone formation are emerging rapidly. While much remains to be learned, it is expected that derangements in the intermediary metabolism contribute to skeletal disease. Here, a protocol is outlined to assess the capacity of osteoblastic cells to oxidize 14C-labeled fatty acids to 14CO2 and acid-soluble metabolites. Fatty acids represent a rich-energy reserve that can be taken up from the circulation after feeding or after their liberation from adipose tissue stores. The assay, performed in T-25 tissue culture flasks, is helpful for the study of gene gain or loss-of-function on fatty acid utilization and the effect of anabolic signals in the form of growth factors or morphogens necessary for the maintenance of bone mass. Details on the ability to adapt the protocol to assess the oxidation of glucose or amino acids like glutamine are also provided.

<meta charset="utf8"></head><body>הערכת חמצון חומצות שומן בתאי עצם מתורבתים

The present protocol describes an assay to assess the capacity for fatty acid oxidation in cultures of primary bone cells or relevant cell lines.

הערכת חמצון חומצות שומן בתאי עצם מתורבתים

Bone formation by differentiating osteoblasts is expected to require significant energetic input as these specialized cells must synthesize large ...

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

Adipocytes store energy in the form of triglycerides in lipid droplets. This energy can be mobilized via lipolysis, where the fatty acid side chains are sequentially cleaved from the glycerol backbone, resulting in the release of free fatty acids and glycerol. Due to the low expression of glycerol kinase in white adipocytes, glycerol re-uptake rates are negligible, while fatty acid re-uptake is dictated by the fatty acid binding capacity of media components such as albumin. Both glycerol and fatty acid release into media can be quantified by colorimetric assays to determine the lipolytic rate. By measuring these factors at multiple time points, one can determine the linear rate of lipolysis with high confidence. Here, we provide a detailed protocol for the measurement of lipolysis in in vitro differentiated adipocytes and ex vivo adipose tissue from mice. This protocol may also be optimized for other preadipocyte cell lines or adipose tissue from other organisms; considerations and optimization parameters are discussed. This protocol is designed to be useful in determining and comparing the rate of adipocyte lipolysis between mouse models and treatments.

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

Triglyceride lipolysis in adipocytes is an important metabolic process resulting in the liberation of free fatty acids and glycerol. Here, we provide a detailed protocol to measure basal and stimulated lipolysis in adipocytes and ex vivo adipose tissue from mice.

מדידת שיעור הליפוליזה ברקמת השומן Ex Vivo Murine ובפראדיפוציטים ראשוניים מובחנים במבחנה

Adipocytes store energy in the form of triglycerides in lipid droplets. This energy can be mobilized via lipolysis, where the fatty acid side chains are ...

קביעת חומצות שומן החמצון וLipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מדידה של חומצת שומן β-חמצון בהשעיה של הפטוציטים עכברים מבודדים טריים

ניתוח אופטימלי של

בידוד של העכבר הראשי Hepatocytes לניתוח סינתזת חלבון Nascent בשיטה תיוג L שאינו רדיואקטיבי-azidohomoalanine

גרימת ואפיון שלפוחית הזרע ב הבדיל תאים HepaRG

הערכת יכולת טיפול בליפידים בכל הגוף בעכברים

מודל של סטאטוזיס ניסיוני במבחנה: תרבית תאי הפטוציט במדיום מותנה בעומס יתר של שומנים

פרוטוקול יעיל יותר בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים

הערכת חמצון חומצות שומן בתאי עצם מתורבתים

הערכת חמצון חומצות שומן בתאי עצם מתורבתים

מדידת שיעור הליפוליזה ברקמת השומן Ex Vivo Murine ובפראדיפוציטים ראשוניים מובחנים במבחנה