We would like to acknowledge Susan Gray and Umadevi Chalasani for their help with technical aspects of the hepatocyte isolation protocol. This work was supported by NIDDK grant 5R01DK089185 (to M.P. Cooper) and the DERC Pilot and Feasibility Program at UMMS (to M.P. Cooper).

Tüm hayvan deneyleri yerel ve federal düzenlemelere uygun ve kurumsal IACUC ve radyasyon güvenliği yönetiminin onayı ile yapılmalıdır. 1. Hazırlık <ol><li> Birkaç gün önce tahlil için, Karaciğer Digest Medium (LDM) 500 ml şişe çözülme ve 50 ml konik tüpler içinde ~ 35 ml alikotları dondurursam. Kadar gerekli -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Bir gün önce tahlil için, otoklav ile temiz diseksiyon araçları önceden sterilize edin. </li><li> Analiz gününde, kollajen ile 24 oyuklu kültür plakaları gerekli miktarda muamele. <ol><li> PBS ile 50 kısım, 3 mg / ml fare kuyruk kolajeni 1 kısım karıştırın. Bir 24-yuvalı plakanın her oyuğuna yaklaşık 500 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 3-5 dakika boyunca (RT) enkübe edilir. Kollajen çıkarın ve plaka kaput kuru hava için izin verir. En az bir ek tekrarlayın. Not: Kollajen kaplama reklamda bir haftaya kadar yapılabilirvance ve plakalar plastik sargı mühürlü 4 ° C&#39;de saklandı. </li></ol></li><li> 37 ° C&#39;ye kadar çözülme LDM ve sıcak ve 1 N KOH kullanılarak 7.4&#39;e pH ayarlamak: deney için LDM hazırlayın. Bir çevrimli 42 ° C su banyosunda 0.2 mikron şırınga filtresi ve yer kullanarak Filtre. </li><li> Su banyosu çevrimli 42 ° C&#39;ye kadar Karaciğer Perfüzyon Orta Sıcak 25 mi. </li><li> Polivinilpirolidon çözeltisi ile kaplanmış% 90 kolloidal silika hazırlayın: polivinilpirrolidon ile kaplanmış koloidal silika 9 ml 10x DPBS 1 ml ilave edilir. 0.1 N HCI kullanılarak pH 7.4&#39;e ayarlayın. Steril 0.2 um şırınga filtresi ile filtre. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> 37 ° C sıcak bir orta kaplama. </li></ol> İlköğretim Fare Hepatositlerin 2. izolasyonu <ol><li> Peristaltik pompa, boru ve diseksiyon tablo ayarlama: steril su, 10 ml, ardından damıtılmış su içinde 5 mi,% 70 etanol ile yıkama ile boru sterilize edin. Doldurmak için Karaciğer Perfüzyon Ortamında boru ve koşmak pompayı yerleştirinborunun tüm uzunluğu. </li><li> Kurumsal onaylı yöntem ile fare Kurban. </li><li> Karın boşluğuna açık parçalara ayır:% 70 etanol ile liberal fare karın püskürtün. Künt uç makas kullanarak, dermis yoluyla karın uzunluğunu orta hat kesi yapmak ve yanal yansıtır. Iç organları maruz periton benzer bir kesi yapmak. <ol><li> Yavaşça bağırsak yerinden, künt aleti kullanarak karın damarlanma karın inferior vena kava (IVC) bulun ve renal ven distal damar altına bir dikiş, koyun ortaya çıkarmak için </li></ol></li><li> Distal sütür için, dikiş düzeyde ötesine ilerleyen, IVC içine bir iğne ve kateter yerleştirin. Hala yerinde iğne ile yerde tutmak için kateter etrafında dikiş kravat. Dikkatlice iğneyi çıkartın. Eğer kateter yoluyla akışı ile, doğru bir şekilde kan yapılır. </li><li> Bir pipet kullanarak, sağlanması, perfüzyon ortamına kateter kalan alanı doldurmakBu hava mevcut. Büyük bir özenle, kateter tüp takmak. </li><li> Akciğer boşluğuna açık parçalara ayır: hafifçe diyaframa maruz üstün karaciğer lobları yansıtmaktadır. Dikkatle sonra keskin uçlu makas ile diyafram delinme safra kesesi ve plevra damarsal önlemek için özen, plevra boşluğu maruz yanal kesi yapmak. Hepatik ven sadece proksimal torasik inferior vena kava etrafında bir bulldog kelepçe yerleştirin. </li><li> Portal ven kesin ve 3 pompa açmak - / dk 4 ml. Perfüzyon ortamı, yaklaşık 20 ml ile 5 dakika boyunca karaciğer Perfüzyon Ortamı ile karaciğer serpmek. Not: Karaciğer hemen tan / gri kırmızı değişmelidir. Karaciğer bölümleri kırmızı kalırsa, bu büyük olasılıkla kötü perfüzyon gösterir ve başarılı izolasyon olasılığı büyük ölçüde azalır. Perfüzyon sırasında dışarı çalışmaz ortamı sağlamak için dikkatli olun ve hiçbir kabarcıklar tüp girmek söyledi. </li><li> 5 dakika inkübasyondan sonra, stopPompa ve Karaciğer Digest Orta boru aktarın. (Orta tükenene kadar) 15 dakika - pompayı yeniden başlatın ve başka bir 10 için karaciğer serpmek. </li><li> Perfüzyon sonunda pompayı durdurun. Karaciğer pembemsi renge sahip ve biraz genişlemiş görünmelidir. Dikkatli diseksiyon ile karaciğer tüketim. Safra kesesi çıkarın ve 10 cm doku kültürü çanak karaciğer aktarmak. </li><li> Bir biyogüvenlik kabini, karaciğere Kaplama Orta 10 ml (Tablo 1) ekleyin. Yavaşça hepatositler kaldırmak ya forseps veya neşter kullanılarak karaciğer kazıyın. 50 ml&#39;lik konik tüp 100 mikron hücre süzgeç ve transfer kullanarak süspansiyon Filtre. 50 ml konik tüp ek bir 10 Kaplama Orta ml ve havuzlu plaka yıkayın. </li><li> 350 xg, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj hücreleri Pelet. </li><li> % 90 koloidal silika, 10 mi po ile kaplanmış Kültür ortamı basınçla Kaplama Orta 10 ml tekrar süspansiyon pelet ekleyinlyvinylpyrrolidone. Adım 2.11 gibi yavaşça ve santrifüj karıştırın. Canlı hücreler, alt pelet ise santrifüjlemeden sonra, ölü hücreleri bir tabakası, karışımın üzerinde yüzen olacaktır. </li><li> Aspire ölü hücreler ve orta. Kaplama Medium, 2.11 gibi santrifüj 20 ml 2 kez yıkayın. </li><li> Kaplama Orta 10 ml süspanse hücreleri. Bir hemasitometre ile hücre sayımı ve kollajen ile tedavi edilmiş 24 oyuklu kültür tabaklarında 9 x 10 4 hücre / çukur yerleştirin. 2 saat boyunca 37 ° C&#39;lik bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde inkübe edin. Her plaka, yağ asidi oksidasyon deneyi TD lipogenesis tahlilinde biri için kullanılabilir. </li><li> İsteğe bağlı olarak, 37 ° C &#39;de, muhafaza edici ortam (Tablo 1) ve kültür kuyularının değiştirin. Deney sonuçları etkilemeden 3 gün - Hücreler 2 kültürlenebilir. </li></ol> 3. Yağ Asidi Oksidasyonu Deneyi Uyarı: radyoaktivite kullanılması tehlikeli olabilir. Tüm satın alma, depolama, elleçleme, ve diRadyoaktif maddenin sposal kurumsal, eyalet ve federal düzenlemeler ve kurallara uygun olarak yapılmalıdır. <ol><li> 16 - 20 saat önce tahlil için, ılık PBS ile hücreler 2 kez yıkayın. 20 nM glukagon ile serumsuz serum açlık Ortamı (Tablo 1) hücreleri değiştirme ve gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Not: fetal sığır serumu metabolik hormonların bilinmeyen bir konsantrasyon (örneğin insülin, glukagon) içerdiğinden, serum bu tahlilde üzerinde sahip olabileceği herhangi karıştırıcı etkileri ortadan kaldırmak için hücreleri açlıktan. Hücreler&gt; 24 saat serum Açlık Ortamda yaşayabilir. Glukagon işleme hepatositlerde yağlı asit oksidasyonunu teşvik etmek için kullanılır. </li><li> Tahlilinde sabahı, ön inkübasyon ortamı, hazırlanması: 10 dakika boyunca 70 ° C&#39;ye kadar, bir 100 mM çözelti ve ısı yapmak için, aşırı saf su içinde sodyum-palmitat, uygun bir miktarda yeniden süspanse edin. Bu arada, gerekli miktarda (24-iyi levha başına 0.5 mi) hazırlanması25 mM HEPES,% 1 BSA fraksiyonu V, ve 20 nM glukagon ile DMEM. 37 ° C&#39;ye ısıtın. <ol><li> Çözündürülmüş sonra, ortama 250 uM nihai konsantrasyona kadar palmitat ekleyin. Orta-Kuluçka öncesi ve 2 saat 37 ° C&#39;de inkübe hepatositlerin değiştirin. Daha sonra kullanılmak üzere 37 ° C &#39;de, bazı ön inkübasyon ortamı, ayırın. </li></ol></li><li> İnkübasyon sırasında, nitrojen gazı altında buharlaştırma ile 14 C-palmitat, uygun bir miktarda (0,5 uCi / oyuk) kurutun. <ol><li> Örneğin, bir 24-çukurlu plaka içinde 24 örnekleri ölçmek için 1,5 ml&#39;lik bir tüpe 0.1 uCi / ml 14 C-palmitat 120 ul transfer. Yavaş yavaş bir duman başlığı içinde 3-5 cm uzaklıktan çözelti üzerinden bir nitrojen gazı püskürtülerek solvent etanol buharlaştırılır. Tüpün alt kuru 14C-Palmitat bırakarak, 40 dakika - çözücü içinde yaklaşık 30 buharlaşır gerekir. </li></ol></li><li> Yaklaşık 15 dakika süreyle inkübe edildikten sona ermeden önce, 14 tekrar süspansiyon0,1 N NaOH içerisinde C = Palmitat (12.5 ul / uCi). 10 dakika boyunca 70 ° C&#39;de inkübe edin. Sıcak ön inkübasyon ortamı, üç hacim ekleyin ve aşağı yukarı pipetleme karıştırılır. </li><li> Seyreltilmiş 14 C-palmitat 25 ul her bir başak. Hafifçe plaka sallanmasıyla karıştırın ve 90 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Bu deney, bir plakadır. </li><li> İnkübasyon sırasında, Filtre Kağıdı Plate (Şekil 1) hazırlar. <ol><li> Steril 24 plaka kapağı çıkarın. Kuyucuğun alt filtre kağıdı, bir 2 cm x 2 cm parçası yerleştirin. 4 &quot;x 7&quot; parafilm bir parça ile plaka Yerleşimi. </li><li> Böyle bir mikropipet ucu kutusu gibi, büyük dikdörtgen bir nesne kullanarak, iyi açılışlarında parafilm perfore ve plaka geri kalanı üzerinde bir mühür oluşturmak için kuyular üzerinde parafilm ovalayın. Şimdi kuyuları kapsayan parafilm delikli çevreleri çıkarın. Plaka şimdi sıkı sıra o hariç tüm alanlarda parafilm ile kaplanmış olmalıdırpenings. </li></ol></li><li> 10 dakika süreyle inkübe edildikten sona ermeden önce, bir filtre kağıdı tüm sıvı absorbe emin olarak, filtre kağıdı bir levhanın her çukuruna 3 N NaOH 200 ul ilave edin. <ol><li> Donmaya karşı isteğe bağlı olarak önceden bir taze 24-yuvalı plakaya orta aktarın. Bir kez PBS ile yıkandıktan sonra, 0.1 N HCI kalan hücreler lize edildi ve bir BCA aracıyla protein içeriğini hesaplar. </li></ol></li><li> İnkübasyonun sonunda, sıvı nitrojen içinde Deney Plakası ek dondurularak. Tamamen geçmeden önce dondurulur her iyi sağlamak için dikkatli olun. </li><li> Deney plakası, her sıra için% 70 perklorik asit, 100 ul ekle. Hemen Filtre Kağıt Plate ile kaplayın. 2 st için oda sıcaklığında 80 rpm&#39;de yörüngesel hızda bir orbital çalkalayıcı ve kaya plakaları yerleştirin. </li><li> İnkübasyondan sonra, örnekler işlem: <ol><li> Bir sintilasyon 4 ml sıvı sintilasyon sıvısına filtre kağıdı kareler transfer CO 2 fraksiyonu ölçmek içinŞişe ve ölçü 14 C sinyali. </li><li> Asit çözünebilir malzeme ölçen 1.5 ml mikrofüj tüpe orta 400 ul aktarma. 10 dakika süreyle maksimum hızda santrifüjleyin. Kısaca 1 kloroform-metanol (h / h) ve girdap: 2 500 ul Elde edilen üstte yüzere, 100 ul ekle. <ol><li> Yine karışımına su 250 ul ekleyin ve vorteks. 3,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj örnekleri. Transfer sintilasyon şişesine 4 ml sıvı sintilasyon sıvısı üst fazın 200 ul 14 C sinyali ölçer. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. lipogenez Deneyi <ol><li> Akşam önce tahlil başlamadan, ılık PBS ile hücreler 2 kez yıkayın. 100 nM insülin Serum Açlık Orta hepatositler değiştirin. 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. Not: fetal sığır serumu bir metabolik hormonların bilinmeyen konsantrasyonu (örneğin insülin içerdiğinden, glukagon), Serum Bu testte üzerinde sahip olabileceği herhangi karıştırıcı etkileri ortadan kaldırmak için hücreleri açlıktan. Hücreler&gt; 24 saat serum Açlık Ortamda yaşayabilir. İnsülin lipogenez uyarmak için bu deneyde kullanılır. </li><li> 100 nM insülin, 10 uM soğuk asetat ve 0.5 uCi 3H-asetat başına iyi Serum Açlık Orta: lipogenezi Orta olun. Lipogenez Ortama hücreleri değiştirmek ve 2 saat süre ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. Çıkar bileşiklerin, test edilecek içerir. </li><li> İnkübasyon süresinden sonra, hücreler PBS ile 2 kez yıkayın. 0.1 N HCI içinde 120 ul kazınarak Hücreleri,. Rezerv 10 protein tayini için ul (BCA tahlili ile değerlendirilmesi), ve transfer 1,5 ml mikrofüj tüpüne 100 ul. </li><li> 2 500 ul ilave edilerek özü lipidler: 1 kloroform-metanol (h / h). Vorteks kısa ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Su, girdap 250 ul ekleyin ve ek 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Santrifüj örnekleri 3000 x g&#39;de oda sıcaklığında 10 dakika. ÖzenleBir sintilasyon şişesine 4 ml sıvı sintilasyon sıvısına alt faz transferi ve 3 H aktivitesini ölçmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Clark, J. M., Brancati, F. L., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+and+etiology+of+elevated+aminotransferase+levels+in+the+United+States.">The prevalence and etiology of elevated aminotransferase levels in the United States.</a> The American journal of gastroenterology. 98, 960-967 (2003).</li><li>Lazo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+nonalcoholic+Fatty+liver+disease+in+the+United+States:+the+third+national+health+and+nutrition+examination+survey,+1988-1994.">Prevalence of nonalcoholic Fatty liver disease in the United States: the third national health and nutrition examination survey, 1988-1994.</a> American journal of epidemiology. 178, 38-45 (2013).</li><li>Angulo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Nonalcoholic fatty liver disease.</a> The New England journal of medicine. 346, 1221-1231 (2002).</li><li>Adams, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+history+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease:+a+population-based+cohort+study.">The natural history of nonalcoholic fatty liver disease: a population-based cohort study.</a> Gastroenterology. 129, 113-121 (2005).</li><li>Feldstein, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+apoptosis+and+fas+expression+are+prominent+features+of+human+nonalcoholic+steatohepatitis.">Hepatocyte apoptosis and fas expression are prominent features of human nonalcoholic steatohepatitis.</a> Gastroenterology. 125, 437-443 (2003).</li><li>Day, C. P., James, O. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steatohepatitis:+a+tale+of+two+'hits'.">Steatohepatitis: a tale of two 'hits'.</a> Gastroenterology. 114, 842-845 (1998).</li><li>Donnelly, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sources+of+fatty+acids+stored+in+liver+and+secreted+via+lipoproteins+in+patients+with+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Sources of fatty acids stored in liver and secreted via lipoproteins in patients with nonalcoholic fatty liver disease.</a> The Journal of clinical investigation. 115, 1343-1351 (2005).</li><li>Lambert, J. E., Ramos-Roman, M. A., Browning, J. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+de+novo+lipogenesis+is+a+distinct+characteristic+of+individuals+with+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Increased de novo lipogenesis is a distinct characteristic of individuals with nonalcoholic fatty liver disease.</a> Gastroenterology. 146, 726-735 (2014).</li><li>Parks, E. J., Hellerstein, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+patient-oriented+research.+Recent+advances+in+liver+triacylglycerol+and+fatty+acid+metabolism+using+stable+isotope+labeling+techniques.">Thematic review series: patient-oriented research. Recent advances in liver triacylglycerol and fatty acid metabolism using stable isotope labeling techniques.</a> Journal of lipid research. 47, 1651-1660 (2006).</li><li>Befroy, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+assessment+of+hepatic+mitochondrial+oxidative+and+anaplerotic+fluxes+in+humans+using+dynamic+13C+magnetic+resonance+spectroscopy.">Direct assessment of hepatic mitochondrial oxidative and anaplerotic fluxes in humans using dynamic 13C magnetic resonance spectroscopy.</a> Nature medicine. 20, 98-102 (2014).</li><li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies.">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malaria journal. 6, 169 (2007).</li></ol>

The authors indicate they have no conflicts of interest.

Perfüzyon kurban gelen zaman ideal bir perfüzyon ve karaciğer kollajenaz sindirimi için en az 3 dakika olmalıdır. Perfüzyon Orta ile perfüzyon başlatılır sonra, karaciğer hemen kırmızı soluk ila görünümünü değiştirmek gerekir. LDM inkübasyonu yaklaşık 10 dakika sonra, karaciğer, şişmiş ve pembe görünür. Perfüzyon yetersiz olması halinde, karaciğer, bu değişiklikler göstermezler olabilir ve bu, tipik olarak daha düşük bir hepatosit verimle sonuçlanır. Yıkama adımlarının ardından, izole edilmiş hepatositler önce kaplama buz üzerinde süspansiyon birkaç saat saklanabilir. Kaplama sonra, kültürlü hepatositler yapışır ve yaymak için birkaç saat gerektirir. Kaplama Orta inkübasyon 2 saat sonra, hepatositler, küçük ve yuvarlak kalacaktır. Bir gecelik inkübasyondan sonra, hepatositler, binükleer olacak çoğu bir daha karakteristik altıgen görünüm alacak. Hazırlık sağlıksız ise, carşın hücre ölümünün bir göstergesi sayıda granülasyonların ve zaman zaman kabarmasıyla, arzedecektir. En iyi kültür canlılığını korumak için, medya her 24 saat değiştirilmesi gerekir ve açık havaya maruziyeti en aza indirmek için alınan bakım. Sodyum palmitat tamamen erimesi gerekir 70 ° C&#39;de inkübasyondan sonra, ancak oda sıcaklığında su içinde çözünmez. Oda sıcaklığına maruz kalma bu nedenle hızlı bir şekilde çalışması için şart, lipid hızla katılaşmasına sebep olur. Palmitat ön inkübasyon ortamı içinde çözüldü sonra, bu lipidlerin çözünürlüğünün muhafaza edilmesi amacıyla, 37 ° C&#39;de orta korumak için önemlidir. Yukarıda belirtildiği gibi, yağ asit oksidasyonu tahlilinden doğru sonuçlar sağlamak için orta sıvı nitrojen içinde tamamen donmuş olmalıdır. Bu çukurlara perklorik asit ilavesi sırasında CO2 herhangi kaçmasını önler. Hemen Dondurulmuş örnekler perklorik asit ilave edildikten sonra, bir deney plakası sıkı c olmalıdırFiltre Kağıt Tabak tarafından overed, kuyular arasındaki gaz transferi için plakaları hizalamak için emin olun. Filtre kağıdı NaOH fazlası ile ıslatılır için, reaksiyonun orantılar hesabına göre NaHCO 3 olarak piyasaya CO 2 yakalama yeteneğine sahiptir. Bu protokol deneyler, tipik çoğaltır olan% CV, yeniden üretilebilir sonuçlar elde var ≤ Gerekirse 10., yağ asit oksidasyonu deneyi ya da lipogenesis tahlilinden hücre lizatından asit-aktif çözünür malzeme -80 ° C&#39;de saklanan ve işlenmiş olma yeteneğine sahip Daha sonra sonuçlar üzerinde kayda değer herhangi bir etkisi yoktur. Yukarıda tarif edilen deneyler, fare karaciğerinden izole edilen primer hepatositlerinde lipid metabolizmasını değerlendirmek için nispeten basit ve etkili bir mekanizma süresi sağlar. Ex vivo kültür kullanımı sayesinde, bu yöntemler, yağ asidi oksidasyon ve lipogenez çeşitli koşulların etkilerini test izin verir. Bu protokol, bu prosedürü ile ilgili genetik değişiklikler rolünü değerlendirmek için adapte edilebilirD eğ Bununla birlikte, hepatositlerin yalıtım zamanı sınırlayıcı değildir ve bu nedenle, in vivo olarak belirli bir transgenik hayvan modelleri araştırmak için daha uygun olabilir analiz eder. Birden çok hepatosit preparatların analizi gerekli ise isteğe bağlı aşama 3.7.1 açıklanmıştır ve normalleştirilmesi için kullanıldığı haliyle protein seviyeleri test değerleri normale gerçekleştirilebilir. Biz birden hazırlıkları yapılan deneyler, uygun bir kontrole karşı göreceli değişiklikler olarak karşılaştırılabilir öneririz. Son olarak, daha uzun kültür dönemleri seçeneği araştırılmalıdır değil, ancak, hepatositlerin kültür içinde birkaç gün sonra eş metabolik özellikleri sergileyebilir. Küçük bir değişiklik, bu protokol lipid metabolizması üzerinde bileşiklerin etkisini değerlendirmek önce birkaç günlük tedaviler için izin vermek için adapte edilmiş olabilir.

Non-alcoholic fatty liver disease is one of the leading causes of liver disease in Westernized cultures1,2. Lipid accumulation within the liver is associated with cell death, fibrosis, and liver failure via yet unknown mechanisms3-6. In fatty liver disease, hepatocyte-mediated &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis are important determinants of net lipid accumulation7,8. This article will, therefore, focus on hepatocyte isolation, followed by quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis.
Numerous methodologies have been developed to interrogate hepatocyte lipid metabolism. Though it is possible to measure metabolism of fat in vivo using stable isotopes9,10, these methods are costly, and require large numbers of animals. Additionally, the ability to investigate the effect of exogenous chemicals is limited due to the nature of in vivo experimentation. In contrast, the isolation of primary hepatocytes from mouse liver provides an affordable avenue to pursue11. Furthermore, studying hepatocytes in culture allows investigators to study the effects of varying chemicals on lipid processing while circumventing the difficulties of in vivo experimentation. Finally, isolated hepatocytes avoid any confounding from varying genetics since they are derived from the liver of a single animal.
Here we isolate and culture of hepatocytes, and we measure &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled palmitate. The protocol detailed below is straight forward, effective, and reproducible.

<table><tbody><tr><td>Liver Perfusion Medium</td><td>Life Technologies</td><td>17701038</td><td></td></tr><tr><td>Liver Digest Medium</td><td>Life Technologies</td><td>17703034</td><td>Aliquot and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10X DPBS</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140079&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Collagen</td><td>Life Technologies</td><td>A1048301&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Colloidal silica coated with polyvinylpyrrolidone</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Cellgro</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D2915-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Albumin (BSA), Fraction V</td><td>MP Biomedicals</td><td>103703</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Culture Dish</td><td>Corning Falcon</td><td>353047&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tygon S3 Tubing&amp;nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td>06460-34</td><td></td></tr><tr><td>Male Leur Lock to 200 Barb Connectors</td><td>Cole Parmer</td><td>45518-00</td><td></td></tr><tr><td>24 G x 3/4&quot; Catheter</td><td>SurFlo</td><td>SROX2419CA</td><td></td></tr><tr><td>Perma-Hand Silk Suture</td><td>Ethicon</td><td>683G</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Corning Falcon</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>IsoTemp 3013HD Recirculating Water Bath</td><td>Fisher</td><td>13-874-3</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex C/L Peristaltic Pump</td><td>MasterFlex</td><td>HV-77122-24</td><td></td></tr><tr><td>Microclamp</td><td>Roboz</td><td>RS-7438</td><td>Pre-sterilize in autoclave</td></tr><tr><td>5&amp;rdquo; Straight, Blunt-Blunt Operating Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-6810</td><td>Pre-sterilize in autoclave</td></tr><tr><td>24 mm Blade Straight, Sharp-point Microdissecting Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>Pre-sterilize in autoclave</td></tr><tr><td>4&amp;rdquo; 0.8 mm Tip Microdissecting Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5130</td><td>Pre-sterilize in autoclave</td></tr><tr><td>4&amp;rdquo; 0.8 mm Tip Full Curve Microdissecting Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td>Pre-sterilize in autoclave</td></tr><tr><td>60 ml Syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>Corning Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;Incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serological pipets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000, 200, 20 &amp;mu;l pipet and tips</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determination of fatty acid oxidation and lipogenesis in mouse primary hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

3 x 10 7 toplam hücre - hepatosıt izolasyonlar genellikle 1 ile sonuçlanır. Gece boyunca inkübasyondan sonra, hücreler (Şekil 2), binükleer olacak birçoğu altıgen görünür. Sağlıklı hücreler, hücre ölümü göstergesidir granülasyon veya kabarcıkların, yoksun olmalıdır. Genel olarak, yağ asidi oksidasyon deneyi, test bileşiği başına üç ila dört kez tekrarlanmış çalıştırılır. CO2 numune için sayımlar asit çözünür malzeme elde edilenler yaklaşık beşte biri olan. Genellikle (diğer bir deyişle, sitrik asit döngüsü yoluyla okside miktardır) tam oksidasyon ölçüsü olarak asitte çözünür malzemeye CO2 oranı hesaplanır. Böyle Karbonil siyanür-4- (triflorometoksi) fenilhidrazonun (FCCP) olarak hücresel solunum teşvik maddeler, TCA döngüsü üzerinden daha fazla oksidasyon belirten CO 2 doğru bu oranı kayacak. Solunum zinciri inhibitörleri bütün oksidasyonu azalacak(Şekil 3). Bu tahlil pilot, bu prosedür, hücre spesifik aktivitesinin üretilmesi olduğunu doğrulamak için bir no-hücresi kontrolü de en iyi yoldur. Lipogenez Deneyi en çok sıfır zaman noktası kontrol (hemen önce, alt-tabaka hasat ile tedavi edilen hücreler) ile karşılaştırılır. Deney kuluçkalama en az dört saat boyunca zamana karşı doğrusal olmalıdır. Örneğin oligomycin gibi FCCP gibi yağlı asit oksidasyonunun geliştirilmesi, ATP sentezi azaltan bileşikler, lipojenik aktivitesi (Şekil 4) azaltacaktır. <img alt="Figür 1" src="/files/ftp_upload/52982/52982fig1.jpg" /> Şekil 1: Adım 3.6 açıklandığı gibi filtre plakasını hazırlamak için Filtre Plate hazırlanması, steril bir 24 plaka kapağı çıkarın. Her bir gözün tabanında bir filtre kağıdı 2 cm x 2 cm parçası yerleştirin. Para bir 7 &quot;x 4&quot; parçası ile tüm plaka YerleşimiFilm ve sıkıca kuyu üst mühür plaka ovalayın. Bu kaldırılması gerektiğini de açıklıklar, üzerinde parafilm perfore çevreler üretecektir. Aşama 3.9 perklorik asit ilave edildikten sonra, bir yalıtım elde etmek için deney plakası üzerinde sıkı bir biçimde Filtre Kağıdı plaka yerleştirin. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52982/52982fig2.jpg" /> Şekil 2: Kültür fazında birincil hepatositler 16 saat kollajen kaplı 24 oyuklu plakalar içerisinde kaplama sonrası, sağlıklı ve sağlıksız primer fare hepatositlerinin görüntü kontrast. Ölçek çubuğu, 200 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52982/52982fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52982/52982fig3.jpg" /> Şekil 3: Primer tarafından Yağ Asidi Oksidasyonu<html> Kültür 14 (A), CO 2, (B) asit-aktif çözünür malzeme ve (C) bir araç, FCCP veya oligomycin kullanılarak inkübe edilmiş primer hepatosit asitte çözünür malzeme CO2 oranı C-Palmitat oksidasyonu Fare Hepatositler. Veriler ortalama ± SEM. * p &lt;0.05, tek kuyruklu Student t-testi ile aracın vs ** p &lt;0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52982/52982fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52982/52982fig4.jpg" /> Şekil 4: lipogenez kültürlenmiş birincil fare Hepatositler (A) 3 &#39;H-asetat ve araç, oligomycin veya FCCP mevcudiyetinde (B) lipojenik aktivitesi ile tedavi edilen primer hepatositlerinde zamana karşı lipojenik aktivitesi. Veriler ortalama ± SEM. *** p &lt;tek kuyruklu Student t-testi ile 0.001 vs. araç. İçerik &quot;&gt; Tablo 1: primer hepatositlerinde izolasyonu için kültür ortamı Kültür Ortamı Bileşimi. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tablo 1 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Kültür Medya </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Kaplama Orta </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 500 mi </td></tr><tr><td> FBS </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> Sodyum piruvat </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Kalem / Strep </td><td> % 2 </td></tr><tr><td> Deksametazon </td><td> 1 uM </td></tr><tr><td> İnsülin </td><td> 0,1 uM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Bakım Orta </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 500 mi </td></tr&gt; <tr><td> BSA Fraksiyon V </td><td> % 0.2 </td></tr><tr><td> Sodyum piruvat </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Kalem / Strep </td><td> % 2 </td></tr><tr><td> Deksametazon </td><td> 0,1 uM </td></tr><tr><td> İnsülin </td><td> 1 nM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Açlık Orta </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 500 mi </td></tr><tr><td> BSA Fraksiyon V </td><td> % 0.2 </td></tr><tr><td> Sodyum piruvat </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Kalem / Strep </td><td> % 2 </td></tr></tbody></table>

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes at JoVE.com

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

De novo lipogenez ve β-yağ asidi oksidasyon hepatosit kilit metabolik, yağlı karaciğer hastalığı da dahil olmak üzere birçok metabolik bozukluklar, içinde tedirgin olan yollar oluşturmaktadır. Burada fare primer hepatositlerin izolasyonu göstermek ve β-yağ asidi oksidasyon ve lipogenez ölçümü açıklar.

Fare İlköğretim Hepatositlerde Yağ Asidi Oksidasyon ve lipogenez Belirlenmesi

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

determination-fatty-acid-oxidation-lipogenesis-mouse-primary

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

20.2K Görüntüleme.  University of Massachusetts Medical School.  De novo lipogenez ve β-yağ asidi oksidasyon hepatosit kilit metabolik, yağlı karaciğer hastalığı da dahil olmak üzere birçok metabolik bozukluklar, içinde tedirgin olan yollar oluşturmaktadır. Burada fare primer hepatositlerin izolasyonu göstermek ve β-yağ asidi oksidasyon ve lipogenez ölçümü açıklar. 

Video: Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional processes, such as ketogenesis and gluconeogenesis, which are essential to maintain whole-body glucose homeostasis and support extra-hepatic organ function in the fasted state. Fatty acid &#946;-oxidation occurs within the mitochondria and peroxisomes and is regulated through multiple mechanisms, including the uptake and activation of fatty acids, enzyme expression levels, and availability of cofactors such as coenzyme A and NAD+. In assays that measure fatty acid &#946;-oxidation in liver homogenates, cell lysis and the common addition of supraphysiological levels of cofactors mask the effects of these regulatory mechanisms. Furthermore, the integrity of the organelles in the homogenates is hard to control and can vary significantly between preparations. The measurement of fatty acid &#946;-oxidation in intact primary hepatocytes overcomes the above pitfalls. This protocol describes a method for the measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated primary mouse hepatocytes incubated with 14C-labeled palmitic acid. By avoiding hours to days of culture, this method has the advantage of better preserving the protein expression levels and metabolic pathway activity of the original liver, including the activation of fatty acid &#946;-oxidation observed in hepatocytes isolated from fasted mice compared to fed mice.

Fatty acid &#946;-oxidation is an essential metabolic pathway responsible for generating energy in many different cell types, including hepatocytes. Here, we describe a method to measure fatty acid &#946;-oxidation in freshly isolated primary hepatocytes using 14C-labeled palmitic acid.

Yeni İzole Edilmiş Fare Hepatositlerinin Süspansiyonunda Yağ Asidi β-Oksidasyonunun Ölçülmesi

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

Biyokimya

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

Optimize Analizi<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Karaciğer Steatoz

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Tıp

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for systemic energy homeostasis. Primary hepatocytes isolated from the murine liver constitute a valuable biological tool to understand the functional properties or alterations occurring in the liver. Herein we describe a method for the isolation and culture of primary mouse hepatocytes by performing a two-step collagenase perfusion technique and discuss their utilization for investigating protein metabolism. The liver of an adult mouse is sequentially perfused with ethylene glycol-bis tetraacetic acid (EGTA) and collagenase, followed by the isolation of hepatocytes with the density gradient buffer. These isolated hepatocytes are viable on culture plates and maintain the majority of endowed characteristics of hepatocytes. These hepatocytes can be used for assessments of protein metabolism including nascent protein synthesis with non-radioactive reagents. We show that the isolated hepatocytes are readily controlled and comprise a higher quality and volume stability of protein synthesis linked to energy metabolism by utilizing the chemo-selective ligation reaction with a Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein detection method and western blotting analyses. Therefore, this method is valuable for investigating hepatic nascent protein synthesis linked to energy homeostasis. The following protocol outlines the materials and methods for the isolation of high-quality primary mouse hepatocytes and detection of nascent protein synthesis.

Here, we present a protocol for the isolation of healthy and functional primary mouse hepatocytes. Instructions for detecting hepatic nascent protein synthesis by non-radioactive labeling substrate were provided to help understand the mechanisms underlying protein synthesis in the context of energy-metabolism homeostasis in the liver.

Birincil fare tetkikine yalıtım doğmakta olan Protein sentez analiz radyoaktif L-azidohomoalanine etiketleme yöntemi tarafından için

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive fat accumulation leads to non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), &#160;which is potentially reversible and may evolve into non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and eventually cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). The molecular mechanisms linking lipid accumulation in hepatocytes with the progression to NASH, irreversible liver damage, fibrosis, cirrhosis, and even HCC still remains unclear. To this end, several in vitro and in vivo models have been developed to elucidate the pathological processes that cause NAFLD. In the present study, we describe a cellular model for the induction of liver vesicular steatosis that consists of DMSO-differentiated human hepatic HepaRG cells treated with the fatty acid salt sodium oleate. Indeed, sodium oleate-treated HepaRG cells accumulate lipid droplets in the cytoplasm and show typical features of steatosis. This in vitro human model represents a valuable alternative to in vivo mice models as well as to the primary human hepatocytes. We also present a comparison of several methods for the quantification and evaluation of fat accumulation in HepaRG cells, including Oil Red O staining, cytofluorimetric Bodipy measurement, metabolic gene expression analysis by qPCR, and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. CARS imaging combines the chemical specificity of Raman spectroscopy, a chemical analysis technique well-known in materials science applications, with the benefits of high-speed, high-resolution non-linear optical microscopies to allow precise quantification of lipid accumulation and lipid droplet dynamics. The establishment of an efficient in vitro model for the induction of vesicular steatosis, alongside an accurate method for the quantification and characterization of lipid accumulation, could lead to the development of early stage diagnosis of NAFLD via the identification of molecular markers, and to the generation of new treatment strategies.

In this study, we describe a detailed protocol for inducing liver vesicular steatosis in differentiated HepaRG cells with the fatty acid salt sodium oleate and employ methods for detection and quantification of lipid accumulation, including coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy, cytofluorimetric analysis, Oil red O staining, and qPCR.&#160;

Farklılaşmış HepaRG hücrelerinde veziküler steatozu indükleyen ve karakterize etme

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive ...

Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a class of many different molecules with many pathways involved in their synthesis and metabolism. A starting point for evaluating lipid hemostasis for nutrition and obesity research is needed. This paper describes three easy and accessible methods that require little expertise or practice to master, and that can be adapted by most labs to screen for lipid-metabolism abnormalities in mice. These methods are (1) measuring several fasting serum lipid molecules using commercial kits (2) assaying for dietary lipid-handling capability through an oral intralipid tolerance test, and (3) evaluating the response to a pharmaceutical compound, CL 316,243, in mice. Together, these methods will provide a high-level overview of lipid handling capability in mice.

This paper provides three easy and accessible assays for assessing lipid metabolism in mice.

Farelerde Tüm Vücut Lipid Taşıma Kapasitesinin Değerlendirilmesi

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a ...

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver disease worldwide due to its relationship with obesity, diabetes type 2, and dyslipidemia. Hepatic steatosis, the accumulation of lipid droplets in the liver parenchyma, is a key feature of the disease preceding the inflammation observed in steatohepatitis, fibrosis, and end-stage liver disease. Lipid accumulation in hepatocytes might interfere with proper metabolism of xenobiotics and endogenous molecules, as well as to induce cellular processes leading to the advance of the disease. Although the experimental study of steatosis can be performed in vivo, in vitro approaches to the study of steatosis are complementary tools with different advantages. Hepatocyte culture in lipid overload-conditioned medium is an excellent reproducible option for the study of hepatic steatosis allowing the identification of cellular processes related to lipid accumulation, such as oxidative and reticular stresses, autophagia, proliferation, cell death, etcetera, as well as other testing including drug effectiveness, and toxicological testing, among many other possible applications. Here, it was aimed to describe the methodology of hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. HepG2 cells were cultured in RMPI 1640 medium conditioned with sodium palmitate and sodium oleate. Importantly, the ratio of these two lipids is crucial to favor lipid droplet accumulation, while maintaining cell proliferation and a moderate mortality rate, as occurs in the liver during the disease. The methodology, from the preparation of the lipid solution stocks, mixture, addition to the medium, and hepatocyte culture is shown. With this approach, it is possible to identify lipid droplets in the hepatocytes that are readily observable by Oil-red O staining, as well as curves of proliferation/mortality rates.

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

This protocol is intended to be a tool to study steatosis and the molecular, biochemical, cellular changes produced by the over exposure of hepatocytes to lipids in vitro.

Deneysel Steatoz İn VitroModeli : Lipid Aşırı Yük Şartlandırılmış Ortamda Hepatosit Hücre Kültürü

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on different needs, like time, labor, cost, and primary hepatocyte usage, resulting in various primary hepatocyte isolation protocols. However, the numerous steps and time-consuming reagent preparations in primary hepatocyte isolation are major drawbacks for efficiency. After comparing different protocols for their pros and cons, the advantages of each were combined, and a rapid and efficient primary hepatocyte isolation protocol was formulated. Within only ~35 min, this protocol could yield as much, if not more, healthy primary hepatocytes as other protocols. Further, glucose metabolism experiments performed using the isolated primary hepatocytes validated the usefulness of this protocol in in vitro liver metabolism studies. We also extensively reviewed and analyzed the significance and purpose of each step in this study so that future researchers can further optimize this protocol based on needs.

Primary hepatocytes are a valuable tool to study liver response and metabolism in vitro. Utilizing commercially available reagents, an improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation was developed.

Fare Primer Hepatosit İzolasyonu için Geliştirilmiş Zaman ve İş Gücü Verimli Protokolü

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Biyoloji

Evaluation of Fatty Acid Oxidation in Cultured Bone Cells

Bone formation by differentiating osteoblasts is expected to require significant energetic input as these specialized cells must synthesize large extracellular matrix proteins that compose bone tissue and then concentrate the ions necessary for its mineralization. Data on the metabolic requirements of bone formation are emerging rapidly. While much remains to be learned, it is expected that derangements in the intermediary metabolism contribute to skeletal disease. Here, a protocol is outlined to assess the capacity of osteoblastic cells to oxidize 14C-labeled fatty acids to 14CO2 and acid-soluble metabolites. Fatty acids represent a rich-energy reserve that can be taken up from the circulation after feeding or after their liberation from adipose tissue stores. The assay, performed in T-25 tissue culture flasks, is helpful for the study of gene gain or loss-of-function on fatty acid utilization and the effect of anabolic signals in the form of growth factors or morphogens necessary for the maintenance of bone mass. Details on the ability to adapt the protocol to assess the oxidation of glucose or amino acids like glutamine are also provided.

<meta charset="utf8"></head><body>Kültürlenmiş Kemik Hücrelerinde Yağ Asidi Oksidasyonunun Değerlendirilmesi

The present protocol describes an assay to assess the capacity for fatty acid oxidation in cultures of primary bone cells or relevant cell lines.

Kültürlenmiş Kemik Hücrelerinde Yağ Asidi Oksidasyonunun Değerlendirilmesi

Bone formation by differentiating osteoblasts is expected to require significant energetic input as these specialized cells must synthesize large ...

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

Adipocytes store energy in the form of triglycerides in lipid droplets. This energy can be mobilized via lipolysis, where the fatty acid side chains are sequentially cleaved from the glycerol backbone, resulting in the release of free fatty acids and glycerol. Due to the low expression of glycerol kinase in white adipocytes, glycerol re-uptake rates are negligible, while fatty acid re-uptake is dictated by the fatty acid binding capacity of media components such as albumin. Both glycerol and fatty acid release into media can be quantified by colorimetric assays to determine the lipolytic rate. By measuring these factors at multiple time points, one can determine the linear rate of lipolysis with high confidence. Here, we provide a detailed protocol for the measurement of lipolysis in in vitro differentiated adipocytes and ex vivo adipose tissue from mice. This protocol may also be optimized for other preadipocyte cell lines or adipose tissue from other organisms; considerations and optimization parameters are discussed. This protocol is designed to be useful in determining and comparing the rate of adipocyte lipolysis between mouse models and treatments.

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

Triglyceride lipolysis in adipocytes is an important metabolic process resulting in the liberation of free fatty acids and glycerol. Here, we provide a detailed protocol to measure basal and stimulated lipolysis in adipocytes and ex vivo adipose tissue from mice.

Lipoliz Oranının Ex Vivo Murin Yağ Dokusu ve İn Vitro Diferansiye Primer Preadipositlerin Ölçülmesi

Adipocytes store energy in the form of triglycerides in lipid droplets. This energy can be mobilized via lipolysis, where the fatty acid side chains are ...

Fare İlköğretim Hepatositlerde Yağ Asidi Oksidasyon ve lipogenez Belirlenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yeni İzole Edilmiş Fare Hepatositlerinin Süspansiyonunda Yağ Asidi β-Oksidasyonunun Ölçülmesi

Optimize Analizi

Birincil fare tetkikine yalıtım doğmakta olan Protein sentez analiz radyoaktif L-azidohomoalanine etiketleme yöntemi tarafından için

Farklılaşmış HepaRG hücrelerinde veziküler steatozu indükleyen ve karakterize etme

Farelerde Tüm Vücut Lipid Taşıma Kapasitesinin Değerlendirilmesi

Deneysel Steatoz İn VitroModeli : Lipid Aşırı Yük Şartlandırılmış Ortamda Hepatosit Hücre Kültürü

Fare Primer Hepatosit İzolasyonu için Geliştirilmiş Zaman ve İş Gücü Verimli Protokolü

Kültürlenmiş Kemik Hücrelerinde Yağ Asidi Oksidasyonunun Değerlendirilmesi

Kültürlenmiş Kemik Hücrelerinde Yağ Asidi Oksidasyonunun Değerlendirilmesi

Lipoliz Oranının Ex Vivo Murin Yağ Dokusu ve İn Vitro Diferansiye Primer Preadipositlerin Ölçülmesi