פרוטוקול זה חל על חקר סטאטוזיס הכבד, כמו גם על הכבד, חילוף החומרים, סינתטי, ואת מסלולי toxification בהקשר של סטאטוזיס. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם רבייה שלה ואת הזמן הקצר הדרוש כדי להשיג תוצאות. הוסף את העובדה כי הוא מציע שתי רמות של סטאטוזיס, מתון, וקשה.
בסטטוזיס המושרה במבחנה עשוי לספק ראיות לזיהוי סמנים פוטנציאליים לאבחון המחלה, כמו גם מטרות טיפוליות. שיטה זו נועדה להיות מיושמת בתוצאת סטאטוזיס. עם זאת, זה יכול להיות מותאם למגוון רחב של תאים שונים מושפעים שומנים יתר חשיפות, כמו במהלך השמנת יתר ולפידמיה.
הכן RPMI 1640 סטנדרטי. תוספת RPMI 1640 תרבות בינוני עם 10% של חום מופעל FBS, ו 1% של פתרון סטרפטומיצין פניצילין. לחטא אותו באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר ולאחסן את תוספת בארבע מעלות צלזיוס.
כדי להכין פתרון מלאי פלמיטט להכין פתרון 50 מילימולר של פלמיטט RPMI 1640 סטנדרטי בתוספת 1% של BSA ללא שומנים. לחטא כחמישה עד עשרה מיליליטר של פתרון המלאי באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס מוגן מפני אור עד חודש אחד. כדי להכין פתרון מלאי oleate להכין פתרון 50 מילימולר של oleate בתוספת RPMI 1640.
ולחטא את פתרון המלאי באמצעות מסנני מיקרומטר 0.22. לאחסן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור עד חודש אחד. כדי להכין מדיום סטטוגני מן המלאי שהוכן בעבר, להכין 100 מילימטרים של תערובת 50 מיקרומולר של חלק אחד palmitate ושני חלק oleate.
עבור רמות קלות, לשפוך תערובת 500 micromolar של חלק אחד palmitate ושני oleate שני חלקים עבור רמות חמורות RPMI סטנדרטי 1640. ולחטא באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע.
לחלופין, כדי להכין פתרונות מלאי עם חומצות שומן בהתאמה באמצעות אלבומין שומנים חינם, להמיס או palmitate או oleate בשני מיליליטר של אתנול מוחלט ולאחר מכן לערבב את הנפח הסופי של RPMI סטנדרטי 1640. להמיס oleate ישירות על ידי אחסון במדיום סטנדרטי RPMI 1640 תרבות. אפשר אידוי של אתנול על ידי דגירה באמבט מים ב 70 מעלות צלזיוס ומערבבים ביסודיות.
עקר את שני פתרונות המלאי באמצעות מסנני מיקרומטר 0.22 ואחסן את תמיסת מלאי הפלמיטט בארבע מעלות צלזיוס. ופתרון מלאי oleate במינוס 20 מעלות צלזיוס. מושב 0.1 מיליון תאי הפ G2 לבאר בצלחת 24-well.
הוסף מיליליטר אחד של RPMI 1640 סטנדרטי. לפני הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות, המאפשר חיבור לתא. לאחר טרום-תרבות, יש להשליך את המדיום הסטנדרטי RPMI 1640.
ולהוסיף את המדיום הסטיטוגני. יש להשליך את הסופר-נט ולהוסיף מדיום סטטוגני טרי כל 24 שעות. כדי לבצע הערכת כדאיות ומורפולוגיה, להשליך את supernatant ולנתק תאים מן הבאר על ידי הוספת 500 microliters של 0.05%טריפסין EDTA.
דגירה במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאסוף את התאים resuspended בצינור מיקרו. וצנטריפוגה ב 300 פעמים G.ואז להשליך את supernatant, להוסיף 200 microliters של RPMI סטנדרטי 1640, ו respend התאים.
הוסף 15 מיקרוליטרים של 0.4% מהפתרון הכחול טריפן בצינור מיקרו טרי. הוסף וערבב 15 מיקרוליטרים של ההשעיה התא הקודם. לספור את התאים מוכתמים ולא מוכתמים בהמוציטומטר ולחשב את שיעורי הכדאיות והתמותה.
שים פתק כיסוי תרבית תא בכל באר בצלחת 24-באר וזרע Hep G2 תאים כמתואר בכתב היד טקסט. לאחר הדגירה המתאימה, לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של PBS ולהשליך את supernatant. מערבבים אותם עם מיליליטר אחד של 4% paraformaldehyde ב PBS ודגרה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
להשליך את paraformaldehyde עודף ולשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של מים מזוקקים. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של 70%איזופרופנול ודגרה במשך חמש דקות. להשליך את איזופרופנול עודף ולהוסיף מיליליטר אחד של פתרון O שמן אדום ודגורה במשך 30 דקות.
יש להשליך את תמיסת עודף שמן אדום O, ולאחר מכן לשטוף עם מיליליטר אחד של מים מזוקקים. שים לב לתאים מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של פי 400. בחר ולכוד באופן אקראי תצלומים של 10 שדות אופטיים מהאזור המלא של הבאר.
חזור על ההדמיה לכל באר. כדי להעריך את אחוז השטח המוכתם באדום, פתח את תוכנת ImageJ וייבוא קבצים נדרשים, ולאחר מכן לחץ על התאם והשתמש בכלי סף הצבעים, הגדר את פרמטר הגוון לזיהוי צבע אדום. לאחר מכן כווננו את הרוויה והבהירות של התמונה.
השווה את האזור המוכתם עם האזור המלא של השדה האופטי, באמצעות הכלי לנתח חלקיקים ולחשב את האחוז הממוצע של כל באר. ישיבה של 0.1 מיליון hepatocytes לבאר בצלחות של 24 בארות מספקת מפגש אופטימלי. הכדאיות פחתה בהדרגה ככל שזמן התרבות גדל, והגיע לנמוך ביותר של 60% בארבעה ימים בסטאטוזיס חמור.
בהתאם, שיעור התמותה היה גבוה יותר בהפטוציטים בתרבית בתנאים הסטיטוגניים. וזה גדל בהדרגה עם הזמן של חשיפה שומנים. מספר התאים גדל בהדרגה כתוצאה מהתפשטות.
עם זאת, שיעור ההתפשטות היה נמוך יותר בסטאטוזיס קל בשלושה וארבעה ימים. לעומת זאת, סטאטוזיס חמור היה קשור עם התפשטות נמוכה יותר על ידי 24 שעות. כתמי תאים עם שמן אדום O הפגינו לפחות עלייה כפולה של טיפות שומנים בדם בתאים בתרבית בתנאים סטטוגניים.
שומן תאי גדל על פי זמן החשיפה של התרבות במדיום steatogenic. בסטאטוזיס קל, תכולת השומנים הוגדלה מהיום השני, ואילו בסטאטוזיס חמור הם היו גבוהים באופן משמעותי החל מ 24 שעות. תרבית התא דורשת ניסיון קודם.
פולחן תאי Hep G2 במצב סטנדרטי לפני השימוש בפרוטוקול זה יכול להיות מועיל. הכנת מלאי חומצות השומן היא גם נקודה מכרעת. חומצה פלמיטית מוצקה בטמפרטורת החדר, ויש לחמם אותה לפני ניהולה.
שיטה זו אמורה לאפשר ניתוח מולקולרי של מסלולים שונים, כולל, אך לא רק להתפשטות, אפופטוזיס, אוטופגיה, סטרס חמצוני וניתוח פרמקולוגי ו טוקסיקולוגי.
