המחברים מבקשים להודות ג רודריגו לקבלת סיוע טכני מומחה. אנו מודים ס קוהלר (מרכז של הדמיה מתקדמות, היינריך היה דיסלדורף האוניברסיטה) לעזרה בהפקת וידאו. מחקר במעבדה של המחבר כבר במימון הגרמני לחקר האגוד (DFG: 2,327 Ro / 8-1 לCRR), היינריך היה אוניברסיטת דיסלדורף (לNH) ועל ידי המכון הלאומי לבריאות להעניק R01NS032123 (לMC).

<ol>
	<li>Somjen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+regulation+in+the+brain:+implications+for+pathophysiology.">Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology.</a> Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).</li><li>Dietzel, I., Heinemann, U., Hofmeier, G., Lux, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-induced+changes+in+extracellular+Na++and+Cl-+concentration+in+relation+to+changes+in+the+size+of+the+extracellular+space.">Stimulus-induced changes in extracellular Na+ and Cl- concentration in relation to changes in the size of the extracellular space.</a> Exp Brain Res. 46, 73-84 (1982).</li><li>Nicholson, C., ten Bruggencate, G., Stockle, H., Steinberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+potassium+changes+in+extracellular+microenvironment+of+cat+cerebellar+cortex.">Calcium and potassium changes in extracellular microenvironment of cat cerebellar cortex.</a> J Neurophysiol. 41, 1026-1039 (1978).</li><li>Rice, M. E., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate-+and+aspartate-induced+extracellular+potassium+and+calcium+shifts+and+their+relation+to+those+of+kainate,+quisqualate+and+N-methyl-D-aspartate+in+the+isolated+turtle+cerebellum.">Glutamate- and aspartate-induced extracellular potassium and calcium shifts and their relation to those of kainate, quisqualate and N-methyl-D-aspartate in the isolated turtle cerebellum.</a> Neuroscience. 38, 295-310 (1990).</li><li>Prince, D. A., Lux, H. D., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+extracellular+potassium+activity+in+cat+cortex.">Measurement of extracellular potassium activity in cat cortex.</a> Brain Res. 50, 489-495 (1973).</li><li>Deitmer, J. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+regulation+and+proton+signalling+by+glial+cells.">pH regulation and proton signalling by glial cells.</a> Prog Neurobiol. 48, 73-103 (1996).</li><li>Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+modulation+of+pH+in+the+brain.">Regulation and modulation of pH in the brain.</a> Physiol Rev. 83, 1183-1221 (2003).</li><li>Kofuji, P., Newman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Regulation of potassium by glial cells in the central nervous system. , (2009).</li><li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-selective+microelectrodes+and+diffusion+measurements+as+tools+to+explore+the+brain+cell+microenvironment.">Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment.</a> J Neurosci Methods. 48, 199-213 (1993).</li><li>Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+use+of+high-speed,+concentric+h+-+and+Ca2+-selective+microelectrodes+suitable+for+in+vitro+extracellular+recording.">Fabrication and use of high-speed, concentric h+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording.</a> J Neurophysiol. 96, 919-924 (2006).</li><li>Stephan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kir4.1+channels+mediate+a+depolarization+of+hippocampal+astrocytes+under+hyperammonemic+conditions+in+situ.">Kir4.1 channels mediate a depolarization of hippocampal astrocytes under hyperammonemic conditions in situ.</a> Glia. 60, 965-978 (2012).</li><li>Haack, N., Rose, C. R., Lei, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+Calibration+and+Application+of+Potassium-Selective+Microelectrodes.">Preparation, Calibration and Application of Potassium-Selective Microelectrodes.</a> Microelectrodes. , 87-105 (2014).</li><li>Roos, A., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH.">Intracellular pH.</a> Physiol Rev. 61, 296-434 (1981).</li><li>Kleinhans, C., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+Intracellular+Sodium+Imaging+Combined+with+UV-mediated+Focal+Uncaging+of+Glutamate+in+CA1+Pyramidal+Neurons.">Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li><li>Hertz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+astrocytic+Na+,K+-ATPase+and+glycogenolysis+for+K+homeostasis+in+mammalian+brain.">Roles of astrocytic Na ,K -ATPase and glycogenolysis for K homeostasis in mammalian brain.</a> J Neurosci Res. , (2014).</li><li>Pumain, R., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-+and+amino+acid-induced+calcium+and+potassium+changes+in+rat+neocortex.">Stimulus- and amino acid-induced calcium and potassium changes in rat neocortex.</a> J Neurophysiol. 53, 1-16 (1985).</li><li>Vargova, L., Jendelova, P., Chvatal, A., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate,+AMPA,+NMDA+Induced+Changes+in+Extracellular+Space+Volume+and+Tortuosity+in+the+Rat+Spinal+Cord.">Glutamate, AMPA, NMDA Induced Changes in Extracellular Space Volume and Tortuosity in the Rat Spinal Cord.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 21, 1077-1089 (2001).</li><li>Fellin, T., Gomez-Gonzalo, M., Gobbo, S., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+glutamate+is+not+necessary+for+the+generation+of+epileptiform+neuronal+activity+in+hippocampal+slices.">Astrocytic glutamate is not necessary for the generation of epileptiform neuronal activity in hippocampal slices.</a> J Neurosci. 26, 9312-9322 (2006).</li><li>Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+metabolic+networks+sustain+hippocampal+synaptic+transmission.">Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission.</a> Science. 322, 1551-1555 (2008).</li><li>Lux, H. D., Heinemann, U., Dietzel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+changes+and+alterations+in+the+size+of+the+extracellular+space+during+epileptic+activity.">Ionic changes and alterations in the size of the extracellular space during epileptic activity.</a> Adv Neurol. 44, 619-639 (1986).</li><li>Zanotto, L., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartate+and+glutamate+induced+reductions+in+extracellular+free+calcium+and+sodium+concentration+in+area+CA1+of+'in+vitro'+hippocampal+slices+of+rats.">Aspartate and glutamate induced reductions in extracellular free calcium and sodium concentration in area CA1 of 'in vitro' hippocampal slices of rats.</a> Neurosci Lett. 35, 79-84 (1983).</li><li>Borrelli, M. J., Carlini, W. G., Dewey, W. C., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+making+ion-selective+microelectrodes+suitable+for+intracellular+recording+in+vertebrate+cells.">A simple method for making ion-selective microelectrodes suitable for intracellular recording in vertebrate cells.</a> J Neurosci Methods. 15, 141-154 (1985).</li><li>Ammann, D., Anker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutral+carrier+sodium+ion-selective+microelectrode+for+extracellular+studies.">Neutral carrier sodium ion-selective microelectrode for extracellular studies.</a> Neurosci Lett. 57, 267-271 (1985).</li><li>Deitmer, J. W., Schlue, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Na++and+Ca2++in+leech+Retzius+neurones+during+inhibition+of+the+Na+-K++pump.">Intracellular Na+ and Ca2+ in leech Retzius neurones during inhibition of the Na+-K+ pump.</a> Pflugers Arch. 397, 195-201 (1983).</li><li>Schwiening, C. J., Thomas, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+intracellular+calcium+and+its+muffling+measured+by+calcium+iontophoresis+in+snail+neurones.">Relationship between intracellular calcium and its muffling measured by calcium iontophoresis in snail neurones.</a> J Physiol. 491 (Pt 3), 621-633 (1996).</li><li>Chesler, M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+of+astrocytes+increases+rapidly+with+cortical+stimulation.">Intracellular pH of astrocytes increases rapidly with cortical stimulation.</a> Am J Physiol. 253, R666-R670 (1987).</li><li>Ammann, D., Chao, P. S., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valinomycin-based+K++selective+microelectrodes+with+low+electrical+membrane+resistance.">Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance.</a> Neurosci Lett. 74, 221-226 (1987).</li><li>Deitmer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicarbonate-dependent+changes+of+intracellular+sodium+and+pH+in+identified+leech+glial+cells.">Bicarbonate-dependent changes of intracellular sodium and pH in identified leech glial cells.</a> Pflugers Arch. 420, 584-589 (1992).</li><li>Lux, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+recording+ion+specific+microelectrodes:+their+use+in+pharmacological+studies+in+the+CNS.">Fast recording ion specific microelectrodes: their use in pharmacological studies in the CNS.</a> Neuropharmacology. 13, 509-517 (1974).</li><li>Nicholson, C., Phillips, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+diffusion+modified+by+tortuosity+and+volume+fraction+in+the+extracellular+microenvironment+of+the+rat+cerebellum.">Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum.</a> J Physiol. 321, 225-257 (1981).</li><li>Chesler, M., Chan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-induced+extracellular+pH+transients+in+the+in+vitro+turtle+cerebellum.">Stimulus-induced extracellular pH transients in the in vitro turtle cerebellum.</a> Neuroscience. 27, 941-948 (1988).</li><li>Thomas, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+sodium+activity+and+the+sodium+pump+in+snail+neurones.">Intracellular sodium activity and the sodium pump in snail neurones.</a> J Physiol. 220, 55-71 (1972).</li></ol>

The authors declare no competing interests.

נוזל מבוסס ספק, אלקטרודות יון סלקטיבי כבר מועסקות בהצלחה במשך עשרות שנים וליונים רבים, חיישנים מאוד ספציפיים זמינים 22-26. כאשר נעשה שימוש במרחב תאי (ECS) של הכנות מוח חוליות, יש לזכור, עם זאת, כי מדובר בטכניקה די פולשנית: בעוד הרוחב של ECS הוא רק סביב 20-50 ננומטר, בקוטר של יון סלקטיבי microelectrodes היא כ 1 מיקרומטר (אלקטרודות הכפולה קנה) או (אלקטרודות קונצנטריים) גדולה יותר. הטיפים של microelectrodes יון סלקטיבי יהיו כך לא רק לפגוע ברקמות במהלך impalement של הרקמה, אלא גם להגדיל את ECS, העדפת הערכה נמוכה מדי של העוברים יון. למרות חסרונות אלה, ארעיים יון תאי בתגובה לפעילות עצבית בקנה אחד להפליא בין מעבדות שונות 7,8, המעידות על אמינותה של שיטה זו. ביצועים וההתאמה של אלקטרודות יון סלקטיביתלוי ברגישות שלהם וסלקטיביות, אשר מוגדרת על ידי קוקטייל החיישן (&quot;ionophore קרום הנוזלי&quot;) משמש. קוקטיילים חיישן מכילים מולקולה מיוחדת ספק, למשל valinomycin לmicroelectrodes -selective K + אשר מציגה סלקטיביות גבוהה לאשלגן 27. עם זאת, תגובה צולבת עם יונים אחרים יכולה להתרחש וחייבת להיבדק. Valinomycin מציג תגובתיות צולבת משמעותית עבור אמוניום, אשר יש לשקול בעת פירוש תוצאות (למשל 11,12). יתר על כן, בגלל המתח-התגובה של יונופורים כדלקמן התנהגות Nernstian (משוואה השווה 1), היחס וסף גילוי אות לרעש תלוי בריכוז של היון להימדד. וכך, בעוד [K +] הקטנה o ארעיים לעורר גדולים שינויי מתח נגד הבסיס הנמוך [K +] o, קטנה [Na +] o עוברת בו הרבה יותר קשה לזהות נגד הייo תחילת המחקר GH [Na +] (איור השווה 5 ו -6). הביצועים של אלקטרודות יון סלקטיבי נקבע גם על ידי ההחלטה הזמנית, הנשלטת במידה רבה על ידי קבוע זמן החשמל שלה. האחרון הוא בעיקר שנקבע על ידי ההתנגדות הצירית של החיישן, ועל ידי הקיבול המופץ לאורכו של פיפטה, בין הפתרונות הפנימיים שלה והנוזל החיצוני. בתצורה הכפולה קנה, ההתנגדות היא גבוהה, בשל הטור של חיישן יון backfilled הארוך. לדיאלקטרי נתון בידוד (בזכוכית בורוסיליקט מקרה זה), הקיבול נשלט על ידי עובי דיאלקטרי. באלקטרודות כפולות קנה, רוחב דיאלקטרי מסתכם בקיר הזכוכית של פיפטה. כזכוכית מדללת קרובה לקצה, רוחב דיאלקטרי נופל, ועליות הקיבול. גורמים אלה משלבים לייצר אלקטרודות עם זמני תגובה שנעה בין כמה מאה לכמה אלפיות השניהשניות, כגורמים אלה הם מגוונים. יתרון עיקרי של העיצוב קונצנטריים הוא ששתי ההתנגדות הצירית והקיבול לאמבטיה הינן הצטמצמו מאוד. Shunts קונצנטריים פיפטה ביותר של ההתנגדות של מחליף היונים backfilled, ומשאיר רק שריד בכמה מיקרומטרים האחרונים לפני טיפ. בנוסף, פתרון המילוי בתוך פיפטה קונצנטריים הוא הרחיק פיזי מהאמבטיה, מופרד על ידי העובי של שני קירות זכוכית, מקטין מאוד את הקיבול. כפי שניתן לראות בתחילת 10, את ההשפעה המשולבת של התנגדות וקיבול מופחתים הוא שיפור בהחלטה זמנית של שני סדרי הגודל. במקרה של Ca 2 + ו- pH microelectrodes קונצנטריים, זמני תגובה של 90% היו נמוך כמו 10-20 msec 10. יתרון נלווה של העיצוב קונצנטריים הוא הרמה נמוכה יותר רעש (איור השווה 8). בשל ההתנגדות המופחתת במידה הניכרת, ארעיים מתח מכל Ambienרעש לא הם מזערי. יתר על כן, התאוששות מארעית כזה היא מהיר, בגלל קבוע הזמן המהיר. חפצים כאלה הם אפוא קטנים ומהירים, ויש להם השפעה פחות מפריעה בהקלטות פיסיולוגיות (איור השווה 8). ישנם גם חסרונות של הטכניקה קונצנטריים. ראשית, הרכבתם היא מורכבת יותר, וזמן רב. חסרון שני הוא את הצורך בהצבה microelectrode התייחסות נפרד עם הקצה שלה, ובכך גם שימוש בmicromanipulator נפרד או מניפולטור הכפול מיוחד. לבסוף, ניתן להרחיב microelectrodes הכפולה קנה לעיצוב קנה משולש, המאפשר זיהוי של שני מיני יון שונים באותו הזמן 28, הדבר שאינו אפשרי עבור אלקטרודות קונצנטריים. מכשולים הנפוצים ביותר silanization לא יעיל. הצעד החשוב ביותר, ומכשול עיקרי בייצור של כל נוזל-sensאו microelectrode יון סלקטיבי מבוסס הוא הליך silanization. כאשר האלקטרודות אינן מגיבות לשינויים בריכוז יון ספציפי, או להגיב בתגובה תת-Nernstian (כלומר, גם פחות מ 58 mV להבדל ריכוז של פי עשרה), יעילות ירודה של silanization היא בדרך כלל הגורם. מניסיוננו, זה יכול להתרחש אם לחות באטמוספרה היא גבוהה מדי, או נמוכה מדי, אופייני לתנאים בשיאו של הקיץ, או בחורף, בהתאמה. אם זה אפשרי להפעיל שליטה מסוימת על לחות בחדר, בעיות אלה ניתן להתגבר. התנגדות האלקטרודה היא גבוהה מדי. במידת צורך, את ההתנגדות של חבית היון רגיש יכולה להיות מופחתת על ידי bevelling. לשם כך, לחשוף את הקצה שלה למטוס חזק של שוחק תלוי במים במשך כמה שניות. זה יגרום קצה עֶלִיוֹן לשבור ולהפחית את ההתנגדות לערך הרצוי. גשרי מלח. מלחגשרים בין חביות היון והתייחסות לגרום אלקטרודות גרועים או להגיב-אף ובכך יכולים גם לבלבל את הביצועים שלהם בכיול מאוד. כפי שצוין לעיל (ראה נקודה 1.6.), זה בעיקר עניין כאשר הזכוכית כפולה קנה תטא נבחרה, אך הוא תופעה נדירה בעת השימוש בטכניקת קיזוז החבית, המעוות המתוארת כאן. בקלות של ייצור במוח, העיצוב כפול קנה המקורי של Lux 29 יכול לשמש לעתים קרובות רווחי. שיטה זו מנצלת מראש מילוי חביות יון והתייחסות עם פתרונות מלח, חשיפה מהירה לפתרון silane על ידי יניקתה וגירוש מהקצה, הבאה על ידי שילוב של יון-מחליף, גם באמצעות הקצה (ראה 30,31) . יכולות להיות מפוברקות אלקטרודות אלה בכ -10 דקות, אבל גודל הקצה שלהם הוא בדרך כלל 4 מיקרומטר או יותר והם נוטים יותר להיכשל במהלך ניסוי. לעומת זאת, שיטות silanization שכרוכות בחשיפה לאדים וחום silaneING יכול לייצר אלקטרודות עם טיפים קטנים שיימשכו ימים, ולפעמים שבועות. יחדיו, יש כמה פרוטוקולים וגישות על איך להכין microelectrodes יון סלקטיבי. הנה, יש לנו תארנו שני הליכים עיקריים לייצור של microelectrodes הכפולה קנה, כמו גם קונצנטריים המעוות שפועלות היטב ובאמינות במעבדות שלנו, עם שיעור הצלחה כולל של קרוב ל 100%. חשוב לציין, בטכניקות אלה יהיו להעברה למדידה של מיני יונים אחרים, כוללים pH או סידן, וגם תהיה ישים לתכשירים אחרים מהמוח, כוללים חללים המלאים בנוזל או נוזלים באופן כללי. אחרון, אך לא פחות חשוב, microelectrodes יון סלקטיבי לאפשר קביעת ריכוזי יון בתוך תאים. בגלל גודל טיפ הגדול יחסית שלהם (~ מיקרומטר 1), רצון זה, עם זאת, יתאפשר רק בתאים עם גוף תא גדול, למשל כמו שנמצא בהכנות חוליות 28,32.

An author's middle initial was omitted from the publication, <a href="http://www.jove.com/video/53058/double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue</a>. The author&#39;s name has been updated to:
Christine R. Rose
from:
Christine Rose

A correction was made to Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.

Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical signaling in the brain is based on the flux of ions across plasma membranes. Major ion movements into and from the extracellular space are not only mediated by passage through voltage-gated ion channels, but also by postsynaptic ionotropic receptors as well as ion transporters. Neuronal activity is thus accompanied by complex changes in the extracellular concentration of all major ions 1. For example, influx of sodium into neurons during excitatory activity has been shown to result in a decrease in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) 2. The same holds true for the extracellular calcium concentration because calcium ions rapidly enter both pre- and postsynaptic structures 3. At the same time, potassium moves the opposite way and this mediates an increase in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in the low mM range 4,5. Synaptic activity also causes changes in extracellular pH that are partly mitigated by concomitant glial membrane fluxes that change intraglial pH 6,7. These activity-related changes in extracellular ion concentrations have significant functional consequences. For example, even small increases in [K+]o depolarize neurons as well as glial cells thereby altering neuronal excitability, and several mechanisms exist to remove excess potassium 8. Failure of these may result in epileptiform activity of neurons or phenomena like spreading depression 1. 
Because of their critical importance, quantitative determination of extracellular ion concentrations is often necessary and required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. For decades, double-barreled ion-selective microelectrodes have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue 9. For many ions, highly specific sensors with low cross-reactivity for other ions are available. In addition to the classical double-barreled electrodes, so-called concentric electrodes were recently introduced. The latter provide a superior time resolution, but take a little more time and effort to construct 10. 
In the following, we will describe the preparation and calibration of these two types of ion-selective microelectrodes. We then show how these electrodes can be employed in brain slice preparations for measurement of changes in [K+]o or [Na+]o induced by excitatory activity following different stimulation paradigms including bath and pressure application of drugs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Abrasive&#160;&#160;</td>
			<td>MicroPolish&#160;</td>
			<td>Buehler GmbH</td>
			<td>Dissolved in A.dest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate-glass capillaries</td>
			<td>1405059</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GC 150 F-15&#160;</td>
			<td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td>
			<td>For the sensor of double-barreled microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GC100-F-15</td>
			<td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td>
			<td>For the reference of double-barreled microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GB-200TF-15&#160;</td>
			<td>Science Products</td>
			<td>Concentric, outer channel. o.d. 2.0 mm&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GB-120TF-10</td>
			<td>Science Products</td>
			<td>Concentric, inner channel. o.d. 1.2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata</td>
			<td>1322A</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrometer amplifier with headstage</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Rin = 10T&#937; and Ibias=50fA-1pA (commercially available&#160; alternatives: e. g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental chamber</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Commercially available from e.g.&#160; Warner Instruments,USA;&#160; Scientifica, UK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Furnace</td>
			<td></td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Must stay constant at 200&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard sticky wax / dental wax&#160;</td>
			<td>Deiberit 502&#160;</td>
			<td>Siladent Dr. Boehme &#38; Schoeps GmbH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Must stay constant at 40&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrodes holder made of plexiglas</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Double-barreled: o.d.&#160; capillaries 1.5 mm, concentric: o.d.&#160; capillaries 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td></td>
			<td>Leitz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>MD4R</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>M205C</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Plan 0.8xLWD</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Concentric microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>Sutter Instruments&#160;</td>
			<td>Sensor of concentric microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic drug ejection system</td>
			<td>Picospritzter Type II</td>
			<td>General Valve TM Corporation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Travel dovetail stage</td>
			<td>DT 25/M</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-component glue</td>
			<td>&#160;Araldite</td>
			<td>Huntsman advanced materials GmbH</td>
			<td>One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silverwire</td>
			<td>99.9%&#160;</td>
			<td>Wieland Edelmetalle</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer / Vibratome</td>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>AxoScope 8.1&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical puller&#160;</td>
			<td>Type PE-2</td>
			<td>Narishige Scientific Instruments</td>
			<td>With a revolvable chuck for&#160; double-barreled microelectrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x/y translational stage</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Compound</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1(S),9(R)-(&#8722;)-Bicuculline methiodide</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>14343</td>
			<td>Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>C-127</td>
			<td>AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-AP5</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64210</td>
			<td>NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td>CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>A9256</td>
			<td>Activates NMDA and non-NMDA and EAATs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid monosodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td>Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R),&#160; mGluRs and EAATs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ionophore I - cocktail B</td>
			<td>Fluka&#160;</td>
			<td>60403</td>
			<td>Based on valinomycin; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ionophore II - cocktail A</td>
			<td>Fluka&#160;&#160;</td>
			<td>71178</td>
			<td>Based on ETH 157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Ascent Scientific</td>
			<td>Asc-055</td>
			<td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, ultra pure</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>W3500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

<html> כדי לפקח [K +] o ושינויים החלימו בי בתגובה לפעילות מעוררת, microelectrode כפול קנה אשלגן סלקטיבי היה מוכנסים לתוך radiatum השכבה של אזור CA1. כמה דקות אחרי impalement, חבית יון סלקטיבי של האלקטרודה הגיעה בסיס יציב (איור 7 א), המקביל ל[ K +] o של כ -2.8 מ&quot;מ, ערך קרוב ל[ K +] של ACSF משמש ( 2.5 מ&quot;מ). יישום אמבט של גלוטמט 0.5 מ&quot;מ ל- 10 שניות גרם לעלייה הפיכה ב[ K +] o בכ -4 מ&quot;מ, ואחריו החטאה מתחת בסיס בסך של ~ 0.7 מ&quot;מ (איור 7 א). הורדת ריכוז הגלוטמט 0.4, 0.3, 0.2 מ&quot;מ וגרם לירידה מקבילה במשרעת של שתי העלייה החולפת וההחטאה ב[ K +] o (איור 7 א). OAD / 53,058 / 53058fig7.jpg &quot;/&gt; איור 7. ארעיים אשלגן תאי בתגובה לפעילות מעוררת. () [K +] o ארעיים, הכולל עלייה ואחרי החטאה מתחת תחילת המחקר, הנגרמת על ידי יישום אמבטיה של ריכוזים שונים של גלוטמט במשך 10 שניות כפי שצוין. השפעה (ב) לזלוף עם חוסמי הקולטן גלוטמט (CNQX, 100 מיקרומטר; APV, 100 מיקרומטר) וtetrodotoxin (TTX; 0.5 מיקרומטר) על [K +] o ארעיים הנגרם על ידי יישום אמבטיה של גלוטמט 0.5 מ&quot;מ ל- 10 שניות. [K +] ספונטנית (C) o ארעיים בנוכחות 0Mg 2 + / BIC. ניסויים הראו בAC בוצעו באמצעות אלקטרודות כפולות קנה. להמחשה, עקבות הוחלקו עם מסנן Sawitzky-Golay (20 מ &#39;רוחב). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig7large.jpg" target="_blank">אנא CL</a>איכס כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. ניסויים קודמים הראו כי [K +] o אותות מושרה גלוטמט כאלה לא שינו באופן משמעותי במהלך היישום של TTX, ולכן הם עצמאיים במידה רבה על פתיחת תעלות נתרן מתח מגודרת ופעולה עצבית דור פוטנציאל 15,16. כדי לחקור את המנגנונים שנצפו [K +] o השינויים בתגובה לגלוטמט, אנחנו מוחלים חוסמי הקולטן גלוטמט, כלומר CNQX (100 מיקרומטר; חוסם קולטני AMPA של) וAPV (100 מיקרומטר; חוסם של קולטני NMDA) בנוכחות TTX (0.5 מיקרומטר). על זלוף אמבטיה עם חוסמי אלה, הנגרם על-גלוטמט [K +] o שינויים היו כמעט בוטל, המאשר את תלותם בפתיחת ערוצי קולט גלוטמט ionotropic כפי שדווח בעבר (למשל 17; איור 7). כדי להדגים t נוסףהוא רלוונטי של עירור glutamatergic לדור של תאית [K +] אותות, פרוסות היו perfused עם ההלכה Mg 2 + מלח -חינם המכיל 10 מיקרומטר methiodide bicuculline (0Mg 2 + / BIC). זה מקל על Mg -block מתח תלוי 2 + של קולטני NMDA ומרטיב עיכוב על ידי חסימה קולטני GABA, גורם פעילות epileptiform חוזרת ספונטנית ברשת (למשל 18,19). כצפוי 20 [K +], ספונטנית, חוזרת ונשנית o ארעיים, בסך של כ -1.5 מ&quot;מ אותר ב0Mg 2 + / מלוח BIC (איור 7 ג). בין התגובות הללו, [K +] קטנה o ארעיים עם משרעת ממוצעת של כ 0.2 מ&quot;מ התרחש (איור 7 ג). בסט שני של ניסויים, שנהגנו [Na +] microelectrodes -sensitive לקבוע [Na +] o שינויים עוררו על ידי יישום שלאגוניסטים גלוטמט. הנה, אנחנו גם בהשוואה מאפייני התגובה של microelectrodes הכפולה קנה וקונצנטריים העסקת שתי פרדיגמות יישום שונות. [Na +] microelectrodes -sensitive הוצבו לradiatum השכבה בעומק של כ -50 מיקרומטר. לאחר תחילת המחקר יציבה הושגה, L-aspartate אגוניסט גלוטמט יושם לזלוף אמבטיה (10 מ&quot;מ, 120 שניות, זלוף אמבטיה על 2.5 מיליליטר / דקה). כפי שנצפה קודם לכן 21, יישום של aspartate גרם לירידה איטית ב[ Na +] o בכ -15 מ&quot;מ, שנמשך כ -5 דקות ולאחר מכן החל להתאושש חזרה לנקודת התחלה (8A איור). יש לציין, בזמן שאמפליטודות וקינטיקה השיא של האותות [Na +] o נקבעו על ידי שני אלקטרודות היו כמעט זהות בתנאים אלה, אלקטרודות קונצנטריים הציגו בסיס יציב יותר ורמה נמוכה יותר רעש (8 א &#39;איור). כדי לבדוק את r<html> esponse מאפיינים של אלקטרודות השונות תחת הפרדיגמה יישום מהירה יותר, אנחנו לחץ להחיל גלוטמט דרך טפטפת זכוכית עדינה ממוקם בradiatum השכבה במרחק של 20-40 מיקרומטר מקצה microelectrode יון סלקטיבי. כצפוי 21, יישום של גלוטמט (10 מ&quot;מ) עבור 200 אלפיות גרם לירידה בo [Na +] (איור 8 ב). אמפליטודות השיא של [Na +] o הירידה היו באותו הטווח לשני הסוגים של אלקטרודות (כפול-קנה: 4.5-13.5 מ&quot;מ, n = 14; קונצנטריים: 2.0-19.1 מ&quot;מ, n = 15). עם זאת, בניגוד לתוצאות שהושגו עם זלוף האיטי אמבטיה (ראה לעיל), לא רק את יחס אות לרעש, אלא גם במהלך האותות [Na +] o זוהו על ידי שני סוגים של אלקטרודות הזמן שונה משמעותי. הזמן הממוצע לשיא היה 3.5 שניות לקנה כפולות והשניות רק 1.3 לmicroelectrodes קונצנטריים. עמיתי ve_content &quot;&gt; לכן, תוצאות אלו מראות ולאשר את קינטיקה התגובה מהירה יותר של microelectrodes הכפולה קנה קונצנטריים לעומת Na + -selective, (ראה איור 6 ג ו8B), כפי שגם ציין לCa 2 + ו- pH סלקטיבי 10 . בניגוד למחקר לשעבר, שבו גירוי הסינפטי קצר פרץ בוצע לעורר ארעיים יון מהיר synaptically-induced, היה רק ​​נטייה, אבל אין הבדל משמעותי באמפליטודות שיא ממוצעת בין האלקטרודות קונצנטריים וקנה כפולים עם היישום שלנו הפרדיגמה. זה היה כנראה בשל העובדה שהמרחק של פיפטה היישום מקצה microelectrode יון סלקטיבי מגוון על ידי גורם משני (20-40 מיקרומטר), וכתוצאה מכך, שריכוז הגלוטמט המקסימאלי באזור היעד לא היה אותו הדבר בניסויים שונים, משבש כל הבדל קיימים בשיא. (א) למעלה עקבות: שינוי בוולטהGE של חביות ההתייחסות (נ&quot;צ V) של האלקטרודה כפולה קנה (זכר מנוקד שחור) ואלקטרודה קונצנטריים (זכר אפור) בתגובה לשינויים באמבטיה ריכוז Na + ([Na +] ב) כפי שצוין. שים לב שתגובות המתח של שני אלקטרודות הן כמעט זהות. עקבות תחתונה: שינויים במתח של Na -potential + (V Na +) של האלקטרודה כפולה קנה (זכר שחור) ואלקטרודה קונצנטריים (זכר אפור) בתגובה לשינויים ב[ Na +] ב. (ב) מגרשים חצי-לוגריתמים של [Na +] ב לעומת V Na + של שני אלקטרודות. מגרשים ליניארי של נתונים לחשוף שיפוע של כ -48 mV עבור שני אלקטרודות. תגובה (C) של V Na + של (זכר שחור) כפול קנה ואלקטרודה קונצנטריים (זכר אפור) לשינוי מהיר ב[ Na +] ב 152 מ&quot;מ מל -70 מ&quot;מ. שים לב שזמן התגובה של האלקטרודה קונצנטריים הוא משמעותי FASter. להמחשה, עקבות הוחלקו עם מסנן Sawitzky-Golay (רוחב 20). <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/53058/53058fig8.jpg" /> איור 8: ארעיים נתרן תאי כפי שזוהה על ידי אלקטרודות כפולות קנה וקונצנטריים. (א) שינויי חלוף נ&quot;צ V ו[ Na +] o הנגרם על ידי זלוף אמבטיה עם 10 aspartate מ&quot;מ עבור 120 שניות כפי שצוין על ידי בר. העקבות העליונות מראות הקלטה שבוצעה עם אלקטרודה כפולה קנה, העקבות הנמוכות נרשמו באמצעות אלקטרודה קונצנטריים. (ב) שינויי חלוף נ&quot;צ V ו[ Na +] o הנגרמת על ידי יישום לחץ מקומי עם גלוטמט 10 מ&quot;מ 0.2 שניות כפי שצוין על ידי ראש החץ. העקבות העליונות מראות הקלטה שבוצעה עם אלקטרודה כפולה קנה, העקבות הנמוכות נרשמו באמצעות אלקטרודה קונצנטריים.קווים אדומים מנוקדים מייצגים המתאימים ליניארית של התקופה שבין תחילת האות למקסימום שלה. שים לב שזמן התגובה של האלקטרודה קונצנטריים הוא באופן משמעותי מהר יותר בתנאי זה. להמחשה, עקבות הוחלקו עם מסנן Sawitzky-Golay (רוחב 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue at JoVE.com

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

Microelectrodes כפולה קנה וקונצנטריים עבור אותות המדידה של תאי יון ברקמת המוח

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.4K Views.  Heinrich Heine University Düsseldorf. We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations. 

Video: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

הכנת רקמות מוח עכבר מיקרוסקופית Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

אלומת יונים ממוקדת כרסום מיקרוסקופיית אלקטרונים של רקמת המוח

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

ביצוע, בדיקות ושימוש Microelectrodes סלקטיבית של יון אשלגן בפרוסות רקמת המוח למבוגרים

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

דיסקציה של Ca מקומי2 + אותות בתאים בתרבית על ידי קרום, ממוקדות Ca2 + אינדיקטורים

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של זיהום וירוס כלבת ברקמת המוח נקי ממס

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). Therefore, detection of the presence of A&#946; in AD brain tissue is a valuable tool for developing new treatments to prevent the progression of AD. Several classical amyloid binding dyes, fluorochrome, imaging probes, and A&#946;-specific antibodies have been used to detect A&#946; histochemically in AD brain tissue. Use of these compounds for A&#946; detection is costly and time consuming. However, because of its intense fluorescent activity, high-affinity, and specificity for A&#946;, as well as structural similarities with traditional amyloid binding dyes, curcumin (Cur) is a promising candidate for labeling and imaging of A&#946; plaques in postmortem brain tissue. It is a natural polyphenol from the herb Curcuma longa. In the present study, Cur was used to histochemically label A&#946; plaques from both a genetic mouse model of 5x familial Alzheimer&#39;s disease (5xFAD) and from human AD tissue within a minute. The labeling capability of Cur was compared to conventional amyloid binding dyes, such as thioflavin-S (Thio-S), Congo red (CR), and Fluoro-jade C (FJC), as well as A&#946;-specific antibodies (6E10 and A11). We observed that Cur is the most inexpensive and quickest way to label and image A&#946; plaques when compared to these conventional dyes and is comparable to A&#946;-specific antibodies. In addition, Cur binds with most A&#946; species, such as oligomers and fibrils. Therefore, Cur could be used as the most cost-effective, simple, and quick fluorochrome detection agent for A&#946; plaques.

Curcumin is an ideal fluorophore for labeling and imaging of amyloid beta protein plaques in brain tissue due to its preferential binding to amyloid beta protein as well as its structural similarities with other traditional amyloid binding dyes. It can be used to label and image amyloid beta protein plaques more efficiently and inexpensively than traditional methods.

תיוג והדמיה של שלטי עמילואיד ברקמת המוח באמצעות פוליפנול טבעי כורכומין

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

פרוסות היפוקמפוס אופקיות של מוח העכבר

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered tissue samples. Traditional immunolabeling procedures require cutting the sample into thin sections, which restricts the ability to label and examine intact structures. However, if brain tissue can remain intact during processing, structures and circuits can remain intact for the analysis. Previously established clearing methods take significant time to completely clear the tissue, and the harsh chemicals can often damage sensitive antibodies. The iDISCO method quickly and completely clears tissue, is compatible with many antibodies, and requires no special lab equipment. This technique was initially validated for the use in mice tissue, but the current protocol adapts this method to image hemispheres of control and transgenic rat brains. In addition to this, the present protocol also makes several adjustments to preexisting protocol to provide clearer images with less background staining. Antibodies for Iba-1 and tyrosine hydroxylase were validated in the HIV-1 transgenic rat and in F344/N control rats using the present hydrophobic tissue clearing method. The brain is an interwoven network, where structures work together more often than separately of one another. Analyzing the brain as a whole system as opposed to a combination of individual pieces is the greatest benefit of this whole brain clearing method.

Here we present a hydrophobic tissue clearing method that allows for the viewing of target molecules as part of intact brain structures. This technique has now been validated for F344/N control and HIV-1 transgenic rats of both sexes.

שיטת ניקוי רקמות הידרופובית לרקמת מוח חולדה

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in monoamine neurotransmitter release and uptake dynamics. Technically complex methods such as electrophysiology, Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV), imaging, in vivo&#160;microdialysis, optogenetics, or use of radioactivity are required to study monoamine function. The method presented here is an optimized two-step approach for detecting monoamine release in acute brain slices using a 48-well plate containing tissue holders for examining monoamine release, and high-performance liquid chromatography coupled with electrochemical detection (HPLC-ECD) for monoamine release measurement. Briefly, rat brain sections containing regions of interest, including prefrontal cortex, hippocampus, and dorsal striatum were obtained using a tissue slicer or vibratome. These regions of interest were dissected from the whole brain and incubated in an oxygenated physiological buffer. Viability was examined throughout the experimental time course, by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. The acutely dissected brain regions were incubated in varying drug conditions that are known to induce monoamine release through the transporter (amphetamine) or through the activation of exocytotic vesicular release (KCl). After incubation, the released products in the supernatant were collected and analyzed through an HPLC-ECD system. Here, basal monoamine release is detected by HPLC from acute brain slices. This data supports previous in vivo and in vitro results showing that AMPH and KCl induce monoamine release. This method is particularly useful for studying mechanisms associated with monoamine transporter-dependent release and provides an opportunity to screen compounds affecting monoamine release in a rapid and low-cost manner.

This method introduces a simple technique for the detection of endogenous monoamine release using acute brain slices. The setup uses a 48-well plate containing a tissue holder for monoamine release. Released monoamine is analyzed by HPLC coupled with electrochemical detection. Additionally, this technique provides a screening method for drug discovery.

בסיס בסיס צלחת למדידת שחרור מונואמין אנדוגני בפרוסות מוח חריפות

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...

Measurement of the Directional Information Flow in fNIRS-Hyperscanning Data using the Partial Wavelet Transform Coherence Method

Social interaction is of vital importance for human beings. While the hyperscanning approach has been extensively used to study interpersonal neural synchronization (INS) during social interactions, functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) is one of the most popular techniques for hyperscanning naturalistic social interactions because of its relatively high spatial resolution, sound anatomical localization, and exceptionally high tolerance of motion artifacts. Previous fNIRS-based hyperscanning studies usually calculate a time-lagged INS using wavelet transform coherence (WTC) to describe the direction and temporal pattern of information flow between individuals. However, the results of this method might be confounded by the autocorrelation effect of the fNIRS signal of each individual. For addressing this issue, a method termed partial wavelet transform coherence (pWTC) was introduced, which aimed to remove the autocorrelation effect and maintain the high temporal-spectrum resolution of the fNIRS signal. In this study, a simulation experiment was performed first to show the effectiveness of the pWTC in removing the impact of autocorrelation on INS. Then, step-by-step guidance was offered on the operation of the pWTC based on the fNIRS dataset from a social interaction experiment. Additionally, a comparison between the pWTC method and the traditional WTC method and that between the pWTC method and the Granger causality (GC) method was drawn. The results showed that pWTC could be used to determine the INS difference between different experimental conditions and INS's directional and temporal pattern between individuals during naturalistic social interactions. Moreover, it provides better temporal and frequency resolution than the traditional WTC and better flexibility than the GC method. Thus, pWTC is a strong candidate for inferring the direction and temporal pattern of information flow between individuals during naturalistic social interactions.

This protocol describes partial wavelet transform coherence (pWTC) for calculating the time-lagged pattern of interpersonal neural synchronization (INS) to infer the direction and temporal pattern of information flow during social interaction. The effectiveness of pWTC in removing the confounds of signal autocorrelation on INS was proved by two experiments.

מדידת זרימת המידע הכיווני בנתוני fNIRS-Hyperscanning באמצעות שיטת הקוהרנטיות של התמרת גלים חלקית

Social interaction is of vital importance for human beings. While the hyperscanning approach has been extensively used to study interpersonal neural ...