Los autores desean agradecer a C. Rodrigo para la asistencia técnica de expertos. Damos las gracias a S. Köhler (Centro de Advanced Imaging, Heinrich Heine Universidad Düsseldorf) para ayudar en la producción de vídeo. La investigación en el laboratorio del autor ha sido financiado por la Asociación Alemana de Investigación (DFG: Ro 2327 / 8-1 para CRR), la Universidad Heinrich Heine Düsseldorf (NH) y por los Institutos Nacionales de Salud de subvención R01NS032123 (MC).

<ol>
	<li>Somjen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+regulation+in+the+brain:+implications+for+pathophysiology.">Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology.</a> Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).</li><li>Dietzel, I., Heinemann, U., Hofmeier, G., Lux, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-induced+changes+in+extracellular+Na++and+Cl-+concentration+in+relation+to+changes+in+the+size+of+the+extracellular+space.">Stimulus-induced changes in extracellular Na+ and Cl- concentration in relation to changes in the size of the extracellular space.</a> Exp Brain Res. 46, 73-84 (1982).</li><li>Nicholson, C., ten Bruggencate, G., Stockle, H., Steinberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+potassium+changes+in+extracellular+microenvironment+of+cat+cerebellar+cortex.">Calcium and potassium changes in extracellular microenvironment of cat cerebellar cortex.</a> J Neurophysiol. 41, 1026-1039 (1978).</li><li>Rice, M. E., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate-+and+aspartate-induced+extracellular+potassium+and+calcium+shifts+and+their+relation+to+those+of+kainate,+quisqualate+and+N-methyl-D-aspartate+in+the+isolated+turtle+cerebellum.">Glutamate- and aspartate-induced extracellular potassium and calcium shifts and their relation to those of kainate, quisqualate and N-methyl-D-aspartate in the isolated turtle cerebellum.</a> Neuroscience. 38, 295-310 (1990).</li><li>Prince, D. A., Lux, H. D., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+extracellular+potassium+activity+in+cat+cortex.">Measurement of extracellular potassium activity in cat cortex.</a> Brain Res. 50, 489-495 (1973).</li><li>Deitmer, J. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+regulation+and+proton+signalling+by+glial+cells.">pH regulation and proton signalling by glial cells.</a> Prog Neurobiol. 48, 73-103 (1996).</li><li>Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+modulation+of+pH+in+the+brain.">Regulation and modulation of pH in the brain.</a> Physiol Rev. 83, 1183-1221 (2003).</li><li>Kofuji, P., Newman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Regulation of potassium by glial cells in the central nervous system. , (2009).</li><li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-selective+microelectrodes+and+diffusion+measurements+as+tools+to+explore+the+brain+cell+microenvironment.">Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment.</a> J Neurosci Methods. 48, 199-213 (1993).</li><li>Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+use+of+high-speed,+concentric+h+-+and+Ca2+-selective+microelectrodes+suitable+for+in+vitro+extracellular+recording.">Fabrication and use of high-speed, concentric h+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording.</a> J Neurophysiol. 96, 919-924 (2006).</li><li>Stephan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kir4.1+channels+mediate+a+depolarization+of+hippocampal+astrocytes+under+hyperammonemic+conditions+in+situ.">Kir4.1 channels mediate a depolarization of hippocampal astrocytes under hyperammonemic conditions in situ.</a> Glia. 60, 965-978 (2012).</li><li>Haack, N., Rose, C. R., Lei, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+Calibration+and+Application+of+Potassium-Selective+Microelectrodes.">Preparation, Calibration and Application of Potassium-Selective Microelectrodes.</a> Microelectrodes. , 87-105 (2014).</li><li>Roos, A., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH.">Intracellular pH.</a> Physiol Rev. 61, 296-434 (1981).</li><li>Kleinhans, C., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+Intracellular+Sodium+Imaging+Combined+with+UV-mediated+Focal+Uncaging+of+Glutamate+in+CA1+Pyramidal+Neurons.">Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li><li>Hertz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+astrocytic+Na+,K+-ATPase+and+glycogenolysis+for+K+homeostasis+in+mammalian+brain.">Roles of astrocytic Na ,K -ATPase and glycogenolysis for K homeostasis in mammalian brain.</a> J Neurosci Res. , (2014).</li><li>Pumain, R., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-+and+amino+acid-induced+calcium+and+potassium+changes+in+rat+neocortex.">Stimulus- and amino acid-induced calcium and potassium changes in rat neocortex.</a> J Neurophysiol. 53, 1-16 (1985).</li><li>Vargova, L., Jendelova, P., Chvatal, A., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate,+AMPA,+NMDA+Induced+Changes+in+Extracellular+Space+Volume+and+Tortuosity+in+the+Rat+Spinal+Cord.">Glutamate, AMPA, NMDA Induced Changes in Extracellular Space Volume and Tortuosity in the Rat Spinal Cord.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 21, 1077-1089 (2001).</li><li>Fellin, T., Gomez-Gonzalo, M., Gobbo, S., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+glutamate+is+not+necessary+for+the+generation+of+epileptiform+neuronal+activity+in+hippocampal+slices.">Astrocytic glutamate is not necessary for the generation of epileptiform neuronal activity in hippocampal slices.</a> J Neurosci. 26, 9312-9322 (2006).</li><li>Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+metabolic+networks+sustain+hippocampal+synaptic+transmission.">Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission.</a> Science. 322, 1551-1555 (2008).</li><li>Lux, H. D., Heinemann, U., Dietzel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+changes+and+alterations+in+the+size+of+the+extracellular+space+during+epileptic+activity.">Ionic changes and alterations in the size of the extracellular space during epileptic activity.</a> Adv Neurol. 44, 619-639 (1986).</li><li>Zanotto, L., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartate+and+glutamate+induced+reductions+in+extracellular+free+calcium+and+sodium+concentration+in+area+CA1+of+'in+vitro'+hippocampal+slices+of+rats.">Aspartate and glutamate induced reductions in extracellular free calcium and sodium concentration in area CA1 of 'in vitro' hippocampal slices of rats.</a> Neurosci Lett. 35, 79-84 (1983).</li><li>Borrelli, M. J., Carlini, W. G., Dewey, W. C., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+making+ion-selective+microelectrodes+suitable+for+intracellular+recording+in+vertebrate+cells.">A simple method for making ion-selective microelectrodes suitable for intracellular recording in vertebrate cells.</a> J Neurosci Methods. 15, 141-154 (1985).</li><li>Ammann, D., Anker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutral+carrier+sodium+ion-selective+microelectrode+for+extracellular+studies.">Neutral carrier sodium ion-selective microelectrode for extracellular studies.</a> Neurosci Lett. 57, 267-271 (1985).</li><li>Deitmer, J. W., Schlue, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Na++and+Ca2++in+leech+Retzius+neurones+during+inhibition+of+the+Na+-K++pump.">Intracellular Na+ and Ca2+ in leech Retzius neurones during inhibition of the Na+-K+ pump.</a> Pflugers Arch. 397, 195-201 (1983).</li><li>Schwiening, C. J., Thomas, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+intracellular+calcium+and+its+muffling+measured+by+calcium+iontophoresis+in+snail+neurones.">Relationship between intracellular calcium and its muffling measured by calcium iontophoresis in snail neurones.</a> J Physiol. 491 (Pt 3), 621-633 (1996).</li><li>Chesler, M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+of+astrocytes+increases+rapidly+with+cortical+stimulation.">Intracellular pH of astrocytes increases rapidly with cortical stimulation.</a> Am J Physiol. 253, R666-R670 (1987).</li><li>Ammann, D., Chao, P. S., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valinomycin-based+K++selective+microelectrodes+with+low+electrical+membrane+resistance.">Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance.</a> Neurosci Lett. 74, 221-226 (1987).</li><li>Deitmer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicarbonate-dependent+changes+of+intracellular+sodium+and+pH+in+identified+leech+glial+cells.">Bicarbonate-dependent changes of intracellular sodium and pH in identified leech glial cells.</a> Pflugers Arch. 420, 584-589 (1992).</li><li>Lux, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+recording+ion+specific+microelectrodes:+their+use+in+pharmacological+studies+in+the+CNS.">Fast recording ion specific microelectrodes: their use in pharmacological studies in the CNS.</a> Neuropharmacology. 13, 509-517 (1974).</li><li>Nicholson, C., Phillips, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+diffusion+modified+by+tortuosity+and+volume+fraction+in+the+extracellular+microenvironment+of+the+rat+cerebellum.">Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum.</a> J Physiol. 321, 225-257 (1981).</li><li>Chesler, M., Chan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-induced+extracellular+pH+transients+in+the+in+vitro+turtle+cerebellum.">Stimulus-induced extracellular pH transients in the in vitro turtle cerebellum.</a> Neuroscience. 27, 941-948 (1988).</li><li>Thomas, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+sodium+activity+and+the+sodium+pump+in+snail+neurones.">Intracellular sodium activity and the sodium pump in snail neurones.</a> J Physiol. 220, 55-71 (1972).</li></ol>

The authors declare no competing interests.

Base líquida portadora, electrodos selectivos de iones se han empleado con éxito durante décadas y para muchos iones, sensores altamente específicos están disponibles 22-26 de. Cuando se utiliza en el espacio extracelular (ECS) de preparaciones de cerebro de vertebrados, hay que tener en cuenta, sin embargo, que se trata de una técnica muy invasiva: mientras que el ancho de la ECS sólo alrededor de 20 a 50 nm, el diámetro de ion-selectivo microelectrodos es de aproximadamente 1 m (electrodos de dos cañones) o grandes (electrodos concéntricos). Las puntas de microelectrodos selectivos de iones por lo tanto no sólo dañar el tejido durante su empalamiento del tejido, sino también ampliar el ECS, favoreciendo una subestimación de los transitorios de iones. A pesar de estas dificultades, los transitorios de iones extracelulares en respuesta a la actividad neuronal son notablemente consistente entre diferentes laboratorios 7,8, lo que demuestra la fiabilidad de este método. El rendimiento y la idoneidad de los electrodos selectivos de ionesdepende de su sensibilidad y selectividad, que se define por el cóctel de sensor (&#39;ionóforo de membrana líquida&#39;) utilizado. Cócteles de sensores contienen una molécula transportadora especial, por ejemplo valinomicina para K + microelectrodos selectivos que presenta una alta selectividad para el potasio 27. No obstante, la reactividad cruzada con otros iones puede ocurrir y debe ser probado. Valinomicina exhibe una reactividad cruzada significativa para el amonio, que tiene que tenerse en cuenta al interpretar los resultados (por ejemplo, 11,12). Además, debido a la tensión de respuesta de los ionóforos sigue un comportamiento de Nernst (cf. ecuación 1), la relación señal-ruido y umbral de detección dependen de la concentración del ion a medir. Así, mientras que los pequeños [K +] o transitorios evocar grandes cambios de voltaje contra el bajo de línea de base [K +] o, pequeña [Na +] o transitorios son mucho más difíciles de detectar en contra de la hila línea de base gh [Na +] o (cf. Figura 5 y 6). El rendimiento de los electrodos selectivos de iones también está determinado por la resolución temporal, que se rige en gran medida por su constante de tiempo eléctrica. Esta última está determinada principalmente por la resistencia axial del sensor, y por la capacitancia distribuida a lo largo de la longitud de la pipeta, entre sus soluciones internas y el fluido externo. En la configuración de dos cañones, la resistencia es alta, debido a la larga columna de sensor de iones de rellenado. Para un dieléctrico aislante dado (en este caso de vidrio de borosilicato), la capacitancia se rige por el grosor dieléctrico. En electrodos de doble cañón, la anchura dieléctrica asciende a la pared de vidrio de la pipeta. A medida que el vidrio se adelgaza cerca de la punta, la anchura dieléctrica cae, y la capacitancia aumenta. Estos factores se combinan para producir electrodos con los tiempos de respuesta que van desde varios cientos de milisegundos a variossegundo, ya que estos factores son variados. Una ventaja importante del diseño concéntrico es que tanto la resistencia axial y la capacitancia para el baño están muy disminuido. Las derivaciones de pipeta concéntricos mayoría de la resistencia del intercambiador de iones rellenado, dejando sólo un remanente en los últimos pocos micrómetros antes de la punta. Además, la solución de llenado dentro de la pipeta concéntrico está distanciado físicamente de la bañera, separados por el grosor de dos paredes de cristal, reduciendo en gran medida la capacitancia. Como se muestra anteriormente 10, el efecto combinado de reducción de la resistencia y la capacitancia es una mejora en la resolución temporal de dos órdenes de magnitud. En el caso de concéntricos de Ca2 + y pH microelectrodos, el 90% los tiempos de respuesta fueron tan bajos como 10 a 20 ms 10. Una ventaja relacionada del diseño concéntrico es el nivel de ruido inferior (ver Figura 8). Debido a la resistencia reducido en gran medida, los transitorios de tensión de cualquier ambient el ruido se reduce al mínimo. Por otra parte, la recuperación de dichos transitorios es rápida, debido a la constante de tiempo rápida. Estos artefactos son, por tanto, pequeño y rápido, y tienen un efecto menos perjudicial en las grabaciones fisiológicas (cf. Figura 8). También hay desventajas de la técnica concéntrica. En primer lugar, su montaje es más compleja, y requiere mucho tiempo. Una segunda desventaja es la necesidad de colocar un microelectrodo de referencia independiente con su punta, lo que implica el uso de cualquiera de un micromanipulador separado o un doble manipulador especializada. Finalmente, microelectrodos de doble cañón se pueden extender a un diseño de triple cañón, lo que permite la detección de dos especies de iones diferentes al mismo tiempo 28, que no es posible para los electrodos concéntricos. Trampas más comunes Silanización ineficiente. El paso más importante, y el principal obstáculo en la fabricación de cualquier líquido-senso microelectrodos selectivo de iones a base es el procedimiento silanización. Cuando los electrodos no responden a cambios en la concentración de iones específico, o responder con una respuesta sub-Nernst (es decir, bien menos de 58 mV por diferencia de concentración de diez veces), pobre eficacia de silanización es típicamente la causa. En nuestra experiencia, esto puede ocurrir si la humedad del aire es demasiado alto o demasiado bajo, típico de las condiciones en la temporada de verano o invierno, respectivamente. Si es factible ejercer algún control sobre la humedad ambiente, estos problemas pueden ser superados. La resistencia del electrodo es demasiado alto. Si es necesario, la resistencia del barril sensible a iones puede ser reducido por el biselado. Con este fin, exponer su punta a un fuerte chorro de abrasivo en suspensión en el agua durante un par de segundos. Esto hará que su punta todo lo posible para romper y menor es la resistencia al valor deseado. Puentes de sal. Salpuentes entre los barriles de iones y de referencia como resultado electrodos mal o ninguno-respuesta y por lo tanto también pueden confundir enormemente su desempeño en la calibración. Como se ha mencionado anteriormente (véase el punto 1.6.), Esto es principalmente un problema cuando se elige de dos cañones de vidrio theta, pero es un hecho poco habitual cuando se utiliza la técnica de barril offset, trenzado se describe aquí. Con la facilidad de fabricación en mente, el diseño de doble cañón original de Lux 29 menudo se puede utilizar de forma rentable. Este método utiliza pre-llenado de los barriles de iones y de referencia con soluciones salinas, una exposición rápida a una solución de silano por su aspiración y expulsión de la punta, siguiendo por la incorporación de intercambiador de iones, también a través de la punta (ver 30,31) . Estos electrodos pueden ser fabricados en aproximadamente 10 minutos, pero su tamaño de la punta es típicamente 4 micras o más y son más propensos a fallar durante un experimento. Por el contrario, los métodos de silanización que implican la exposición a vapores de silano y el caloring puede producir electrodos con puntas más pequeñas que duran días, ya veces semanas. En conjunto, hay varios protocolos y enfoques sobre cómo preparar microelectrodos selectivos de iones. Aquí, hemos descrito dos procedimientos principales para la fabricación de microelectrodos de dos cañones, así como concéntricos retorcidas que funcionan bien y fiable en nuestros laboratorios, con una tasa global de éxito de cerca del 100%. Es importante destacar que estas técnicas serán transferibles a la medición de otras especies de iones, incluyendo el pH o calcio, y también será aplicable a otras preparaciones que el cerebro, incluyendo cavidades o fluidos llenos de fluido en general. Por último, pero no menos importante, microelectrodos selectivos de iones permiten la determinación de las concentraciones de iones dentro de las células. Debido a su tamaño relativamente grande de la punta (~ 1 m), esta voluntad, sin embargo, será posible sólo en las células con un cuerpo de células grandes, por ejemplo, tal como se encuentra en los preparativos de invertebrados 28,32.

An author's middle initial was omitted from the publication, <a href="http://www.jove.com/video/53058/double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue</a>. The author&#39;s name has been updated to:
Christine R. Rose
from:
Christine Rose

A correction was made to Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.

Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical signaling in the brain is based on the flux of ions across plasma membranes. Major ion movements into and from the extracellular space are not only mediated by passage through voltage-gated ion channels, but also by postsynaptic ionotropic receptors as well as ion transporters. Neuronal activity is thus accompanied by complex changes in the extracellular concentration of all major ions 1. For example, influx of sodium into neurons during excitatory activity has been shown to result in a decrease in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) 2. The same holds true for the extracellular calcium concentration because calcium ions rapidly enter both pre- and postsynaptic structures 3. At the same time, potassium moves the opposite way and this mediates an increase in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in the low mM range 4,5. Synaptic activity also causes changes in extracellular pH that are partly mitigated by concomitant glial membrane fluxes that change intraglial pH 6,7. These activity-related changes in extracellular ion concentrations have significant functional consequences. For example, even small increases in [K+]o depolarize neurons as well as glial cells thereby altering neuronal excitability, and several mechanisms exist to remove excess potassium 8. Failure of these may result in epileptiform activity of neurons or phenomena like spreading depression 1. 
Because of their critical importance, quantitative determination of extracellular ion concentrations is often necessary and required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. For decades, double-barreled ion-selective microelectrodes have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue 9. For many ions, highly specific sensors with low cross-reactivity for other ions are available. In addition to the classical double-barreled electrodes, so-called concentric electrodes were recently introduced. The latter provide a superior time resolution, but take a little more time and effort to construct 10. 
In the following, we will describe the preparation and calibration of these two types of ion-selective microelectrodes. We then show how these electrodes can be employed in brain slice preparations for measurement of changes in [K+]o or [Na+]o induced by excitatory activity following different stimulation paradigms including bath and pressure application of drugs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Abrasive&#160;&#160;</td>
			<td>MicroPolish&#160;</td>
			<td>Buehler GmbH</td>
			<td>Dissolved in A.dest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate-glass capillaries</td>
			<td>1405059</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GC 150 F-15&#160;</td>
			<td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td>
			<td>For the sensor of double-barreled microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GC100-F-15</td>
			<td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td>
			<td>For the reference of double-barreled microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GB-200TF-15&#160;</td>
			<td>Science Products</td>
			<td>Concentric, outer channel. o.d. 2.0 mm&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GB-120TF-10</td>
			<td>Science Products</td>
			<td>Concentric, inner channel. o.d. 1.2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata</td>
			<td>1322A</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrometer amplifier with headstage</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Rin = 10T&#937; and Ibias=50fA-1pA (commercially available&#160; alternatives: e. g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental chamber</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Commercially available from e.g.&#160; Warner Instruments,USA;&#160; Scientifica, UK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Furnace</td>
			<td></td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Must stay constant at 200&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard sticky wax / dental wax&#160;</td>
			<td>Deiberit 502&#160;</td>
			<td>Siladent Dr. Boehme &#38; Schoeps GmbH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Must stay constant at 40&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrodes holder made of plexiglas</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Double-barreled: o.d.&#160; capillaries 1.5 mm, concentric: o.d.&#160; capillaries 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td></td>
			<td>Leitz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>MD4R</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>M205C</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Plan 0.8xLWD</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Concentric microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>Sutter Instruments&#160;</td>
			<td>Sensor of concentric microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic drug ejection system</td>
			<td>Picospritzter Type II</td>
			<td>General Valve TM Corporation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Travel dovetail stage</td>
			<td>DT 25/M</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-component glue</td>
			<td>&#160;Araldite</td>
			<td>Huntsman advanced materials GmbH</td>
			<td>One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silverwire</td>
			<td>99.9%&#160;</td>
			<td>Wieland Edelmetalle</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer / Vibratome</td>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>AxoScope 8.1&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical puller&#160;</td>
			<td>Type PE-2</td>
			<td>Narishige Scientific Instruments</td>
			<td>With a revolvable chuck for&#160; double-barreled microelectrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x/y translational stage</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Compound</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1(S),9(R)-(&#8722;)-Bicuculline methiodide</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>14343</td>
			<td>Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>C-127</td>
			<td>AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-AP5</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64210</td>
			<td>NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td>CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>A9256</td>
			<td>Activates NMDA and non-NMDA and EAATs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid monosodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td>Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R),&#160; mGluRs and EAATs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ionophore I - cocktail B</td>
			<td>Fluka&#160;</td>
			<td>60403</td>
			<td>Based on valinomycin; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ionophore II - cocktail A</td>
			<td>Fluka&#160;&#160;</td>
			<td>71178</td>
			<td>Based on ETH 157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Ascent Scientific</td>
			<td>Asc-055</td>
			<td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, ultra pure</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>W3500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

<html> Para supervisar [K +] o y los cambios en el mismo en respuesta a la actividad excitatoria, un microelectrodo de dos cañones en potasio selectiva se insertó en el estrato radiado de la zona CA1. Unos pocos minutos después de empalamiento, el barril selectiva de iones del electrodo alcanzó una línea de base estable (Figura 7A), que corresponde a una [K +] o de alrededor de 2,8 mM, un valor cercano a la [K +] de la ACSF utilizado ( 2,5 mM). Bath aplicación de glutamato 0,5 mM durante 10 seg indujo un aumento reversible en [K +] o en aproximadamente 4 mM, seguido de un undershoot debajo del nivel basal que asciende a ~ 0,7 mM (Figura 7A). La reducción de la concentración de glutamato a 0,4, 0,3, y 0,2 mM causado una reducción correspondiente en la amplitud de tanto el aumento transitorio y la undershoot en O (Figura 7A) [K +]. oad / 53058 / 53058fig7.jpg &quot;/&gt; Figura 7. transitorios de potasio extracelular en respuesta a la actividad excitatoria. (A) [K +] o transitorios, que consiste en un aumento seguido por una undershoot debajo del nivel basal, inducida por la aplicación de baño de diferentes concentraciones de glutamato durante 10 s como se indica. (B) influencia de una perfusión con bloqueadores de los receptores de glutamato (CNQX, 100 mM; APV, 100 mM) y la tetrodotoxina (TTX; 0,5 M) en [K +] o transitorios inducidos por la aplicación de baño de glutamato 0,5 mM durante 10 seg. (C) espontánea [K +] o transitorios en presencia de 0mg 2+ / BIC. Los experimentos mostrados en la AC se realizaron con electrodos de dos cañones. Para fines de ilustración, los rastros fueron suavizadas con un filtro de Sawitzky-Golay (ancho 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig7large.jpg" target="_blank">Por favor cl</a>ick aquí para ver una versión más grande de esta figura. Experimentos anteriores han demostrado que este tipo de [K +] o señales inducidas por glutamato no se modifican significativamente durante la aplicación de TTX, por lo que son en gran medida independiente de la apertura de los canales de sodio dependientes de voltaje y la acción neuronal generación potencial de 15,16. Para estudiar los mecanismos subyacentes a los observados [K +] o cambios en respuesta al glutamato, se aplicó bloqueadores de los receptores de glutamato, a saber, CNQX (100 mM; bloqueador de los receptores AMPA) y APV (100 mM; bloqueador de los receptores NMDA) en presencia de TTX (0,5 M). Tras la perfusión baño con estos bloqueadores, inducida por glutamato [K +] o cambios eran prácticamente abolida, lo que confirma su dependencia de la apertura de los canales de los receptores de glutamato ionotrópicos como se informó anteriormente (por ejemplo, 17; Figura 7B). Para demostrar aún más tél relevancia de excitación glutamatérgica para la generación de extracelular [K +] señales, rebanadas fueron perfundidos con solución salina nominalmente Mg 2+ exento que contiene 10 mM metyoduro bicuculina (0 mg 2+ / BIC). Esto alivia la tensión dependiente de Mg 2+ -bloque de los receptores NMDA y amortigua la inhibición por bloqueo de los receptores GABA A, causando actividad epileptiforme recurrente espontánea en la red (por ejemplo, 18,19). Como era de esperar 20, espontáneo, recurrente [K +] o transitorios, que asciende a aproximadamente 1,5 mM fueron detectados en 0mg 2+ / BIC solución salina (Figura 7C). Entre estas respuestas, más pequeño [K +] o transitorios con una amplitud media de aproximadamente 0,2 mM ocurrió (Figura 7C). En una segunda serie de experimentos, se utilizó [Na +] microelectrodos -sensibles para determinar [Na +] o cambios provocados por la aplicación deagonistas de glutamato. Aquí, también comparó las características de respuesta de microelectrodos de dos cañones y concéntricas que emplean dos paradigmas de aplicación diferentes. [Na +] microelectrodos -sensibles se posiciona en el estrato radiatum a una profundidad de alrededor de 50 mM. Después se alcanzó una línea de base estable, el agonista de glutamato L-aspartato se aplicó por perfusión baño (10 mM, 120 seg, la perfusión del baño a 2,5 ml / min). Como se observó anteriormente 21, la aplicación de aspartato provocó una disminución lenta en [Na +] o en aproximadamente 15 mM, que duró unos 5 minutos y luego comenzó a recuperarse de nuevo a la línea de base (Figura 8A). Cabe destacar que, mientras que las amplitudes de pico y la cinética de los [Na +] o señales determinadas por ambos electrodos eran prácticamente idénticas en estas condiciones, los electrodos concéntricos exhibieron una línea de base más estable y un nivel de ruido inferior (Figura 8A). Para probar la r<html> ESPUESTA características de los diferentes electrodos bajo un paradigma aplicación más rápida, glutamato-nos aplica presión a través de una pipeta de vidrio fino colocado en el estrato radiatum a una distancia de un 20-40 micras desde la punta de la microelectrodo selectivo de iones. Como era de esperar 21, la aplicación de glutamato (10 mM) durante 200 ms provocó una caída en el O (Figura 8B) [Na +]. Las amplitudes máximas de la [Na +] o disminución estaban en el mismo rango para ambos tipos de electrodos (dos cañones: 4.5 - 13.5 mM, n = 14; concéntrica: 2,0 - 19,1 mM, n = 15). Sin embargo, en contraste con los resultados obtenidos con baño de perfusión lenta (véase más arriba), no sólo la relación señal-ruido, sino también el curso temporal de los [Na +] o señales detectadas por los dos tipos de electrodos diferían significativamente. El tiempo promedio a pico fue de 3,5 segundos para el sólo el 1,3 seg de dos cañones y de los microelectrodos concéntricos. homólogos ve_content &quot;&gt; Por lo tanto, estos resultados demuestran y confirman la cinética de respuesta más rápidos de Na + concéntricos vs. microelectrodos selectivos de dos cañones, (cf. Figura 6C y 8B), como también se observó para Ca2 + y pH selectivos 10 . En contraste con el estudio anterior, en el que se realizó la estimulación sináptica de corta ráfaga de evocar los transitorios de iones rápidos inducidos sinápticamente-, sólo había una tendencia, pero no hubo diferencias significativas en las amplitudes medias de los picos entre electrodos concéntricos y de dos cañones con nuestra aplicación paradigma. Esto era probablemente debido al hecho de que la distancia de la pipeta aplicación desde la punta del microelectrodo selectiva de iones varió por un factor de dos (20-40 micras), y, en consecuencia, que la concentración de glutamato máxima a la región diana no era el mismo en diferentes experimentos, obstruyendo cualquier diferencia existente en amplitudes de pico. (A) Top traza: Cambio en la voltage de los barriles de referencia (V ref) de un electrodo de dos cañones (trazo punteado negro) y un electrodo concéntrico (traza gris) en respuesta a los cambios en el baño de Na + de concentración ([Na +] b) como se indica. Tenga en cuenta que las respuestas de tensión de ambos electrodos son prácticamente idénticos. Trazas inferiores: Los cambios en el voltaje de la Na +: posible (V Na +) de un electrodo de dos cañones (trazo negro) y un electrodo concéntrico (traza gris) en respuesta a los cambios en [Na +] b. (B) parcelas de media logarítmica de la [Na +] b frente al V Na + de ambos electrodos. Parcelas lineal de los datos revelan una pendiente de aproximadamente 48 mV para ambos electrodos. (C) Respuesta de la V Na + de un (trazo negro) de dos cañones y un electrodo concéntrico (trazo gris) a un cambio rápido en el [Na +] b desde 152 mM a 70 mM. Tenga en cuenta que el tiempo de respuesta del electrodo concéntrico es significativamente faster. Para fines de ilustración, los rastros fueron suavizadas con un filtro de Sawitzky-Golay (ancho 20). <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53058/53058fig8.jpg" /> Figura 8: transitorios sodio extracelular detectada por los electrodos de dos cañones y concéntricos. (A) los cambios transitorios en V ref y [Na +] o inducida por perfusión baño con aspartato 10 mM durante 120 segundos, como se indica en el bar. Las huellas superiores muestran una grabación realizada con un electrodo de dos cañones, las huellas más bajos se registraron usando un electrodo concéntrico. (B) los cambios transitorios en V ref y [Na +] o inducida por la aplicación de presión local con glutamato 10 mM durante 0,2 segundos según lo indicado por la punta de flecha. Las huellas superiores muestran una grabación realizada con un electrodo de dos cañones, las huellas más bajos se registraron usando un electrodo concéntrico.Líneas rojas punteadas representan ajustes lineales del periodo comprendido entre el inicio de la señal a su máximo. Tenga en cuenta que el tiempo de respuesta del electrodo concéntrico es significativamente más rápido bajo esta condición. Con fines ilustrativos, las huellas fueron suavizadas con un filtro Sawitzky-Golay (ancho 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig8large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue at JoVE.com

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

Los microelectrodos de dos cañones y concéntricos para la medición de extracelular Ion señales en el tejido cerebral

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.3K vistas.  Heinrich Heine University Düsseldorf. We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations. 