Die Autoren danken C. Rodrigo für erfahrene technische Unterstützung danken. Wir danken S. Köhler (Center of Advanced Imaging, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf) um Hilfe bei der Videoproduktion. Forschung im Laboratorium des Verfassers wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefördert (DFG: Ro 2327 / 8-1 zur CRR), der Heinrich Heine Universität Düsseldorf (NH) und National Institutes of Health gewähren R01NS032123 (MC).

<ol>
	<li>Somjen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+regulation+in+the+brain:+implications+for+pathophysiology.">Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology.</a> Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).</li><li>Dietzel, I., Heinemann, U., Hofmeier, G., Lux, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-induced+changes+in+extracellular+Na++and+Cl-+concentration+in+relation+to+changes+in+the+size+of+the+extracellular+space.">Stimulus-induced changes in extracellular Na+ and Cl- concentration in relation to changes in the size of the extracellular space.</a> Exp Brain Res. 46, 73-84 (1982).</li><li>Nicholson, C., ten Bruggencate, G., Stockle, H., Steinberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+potassium+changes+in+extracellular+microenvironment+of+cat+cerebellar+cortex.">Calcium and potassium changes in extracellular microenvironment of cat cerebellar cortex.</a> J Neurophysiol. 41, 1026-1039 (1978).</li><li>Rice, M. E., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate-+and+aspartate-induced+extracellular+potassium+and+calcium+shifts+and+their+relation+to+those+of+kainate,+quisqualate+and+N-methyl-D-aspartate+in+the+isolated+turtle+cerebellum.">Glutamate- and aspartate-induced extracellular potassium and calcium shifts and their relation to those of kainate, quisqualate and N-methyl-D-aspartate in the isolated turtle cerebellum.</a> Neuroscience. 38, 295-310 (1990).</li><li>Prince, D. A., Lux, H. D., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+extracellular+potassium+activity+in+cat+cortex.">Measurement of extracellular potassium activity in cat cortex.</a> Brain Res. 50, 489-495 (1973).</li><li>Deitmer, J. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+regulation+and+proton+signalling+by+glial+cells.">pH regulation and proton signalling by glial cells.</a> Prog Neurobiol. 48, 73-103 (1996).</li><li>Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+modulation+of+pH+in+the+brain.">Regulation and modulation of pH in the brain.</a> Physiol Rev. 83, 1183-1221 (2003).</li><li>Kofuji, P., Newman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Regulation of potassium by glial cells in the central nervous system. , (2009).</li><li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-selective+microelectrodes+and+diffusion+measurements+as+tools+to+explore+the+brain+cell+microenvironment.">Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment.</a> J Neurosci Methods. 48, 199-213 (1993).</li><li>Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+use+of+high-speed,+concentric+h+-+and+Ca2+-selective+microelectrodes+suitable+for+in+vitro+extracellular+recording.">Fabrication and use of high-speed, concentric h+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording.</a> J Neurophysiol. 96, 919-924 (2006).</li><li>Stephan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kir4.1+channels+mediate+a+depolarization+of+hippocampal+astrocytes+under+hyperammonemic+conditions+in+situ.">Kir4.1 channels mediate a depolarization of hippocampal astrocytes under hyperammonemic conditions in situ.</a> Glia. 60, 965-978 (2012).</li><li>Haack, N., Rose, C. R., Lei, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+Calibration+and+Application+of+Potassium-Selective+Microelectrodes.">Preparation, Calibration and Application of Potassium-Selective Microelectrodes.</a> Microelectrodes. , 87-105 (2014).</li><li>Roos, A., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH.">Intracellular pH.</a> Physiol Rev. 61, 296-434 (1981).</li><li>Kleinhans, C., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+Intracellular+Sodium+Imaging+Combined+with+UV-mediated+Focal+Uncaging+of+Glutamate+in+CA1+Pyramidal+Neurons.">Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li><li>Hertz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+astrocytic+Na+,K+-ATPase+and+glycogenolysis+for+K+homeostasis+in+mammalian+brain.">Roles of astrocytic Na ,K -ATPase and glycogenolysis for K homeostasis in mammalian brain.</a> J Neurosci Res. , (2014).</li><li>Pumain, R., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-+and+amino+acid-induced+calcium+and+potassium+changes+in+rat+neocortex.">Stimulus- and amino acid-induced calcium and potassium changes in rat neocortex.</a> J Neurophysiol. 53, 1-16 (1985).</li><li>Vargova, L., Jendelova, P., Chvatal, A., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate,+AMPA,+NMDA+Induced+Changes+in+Extracellular+Space+Volume+and+Tortuosity+in+the+Rat+Spinal+Cord.">Glutamate, AMPA, NMDA Induced Changes in Extracellular Space Volume and Tortuosity in the Rat Spinal Cord.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 21, 1077-1089 (2001).</li><li>Fellin, T., Gomez-Gonzalo, M., Gobbo, S., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+glutamate+is+not+necessary+for+the+generation+of+epileptiform+neuronal+activity+in+hippocampal+slices.">Astrocytic glutamate is not necessary for the generation of epileptiform neuronal activity in hippocampal slices.</a> J Neurosci. 26, 9312-9322 (2006).</li><li>Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+metabolic+networks+sustain+hippocampal+synaptic+transmission.">Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission.</a> Science. 322, 1551-1555 (2008).</li><li>Lux, H. D., Heinemann, U., Dietzel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+changes+and+alterations+in+the+size+of+the+extracellular+space+during+epileptic+activity.">Ionic changes and alterations in the size of the extracellular space during epileptic activity.</a> Adv Neurol. 44, 619-639 (1986).</li><li>Zanotto, L., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartate+and+glutamate+induced+reductions+in+extracellular+free+calcium+and+sodium+concentration+in+area+CA1+of+'in+vitro'+hippocampal+slices+of+rats.">Aspartate and glutamate induced reductions in extracellular free calcium and sodium concentration in area CA1 of 'in vitro' hippocampal slices of rats.</a> Neurosci Lett. 35, 79-84 (1983).</li><li>Borrelli, M. J., Carlini, W. G., Dewey, W. C., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+making+ion-selective+microelectrodes+suitable+for+intracellular+recording+in+vertebrate+cells.">A simple method for making ion-selective microelectrodes suitable for intracellular recording in vertebrate cells.</a> J Neurosci Methods. 15, 141-154 (1985).</li><li>Ammann, D., Anker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutral+carrier+sodium+ion-selective+microelectrode+for+extracellular+studies.">Neutral carrier sodium ion-selective microelectrode for extracellular studies.</a> Neurosci Lett. 57, 267-271 (1985).</li><li>Deitmer, J. W., Schlue, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Na++and+Ca2++in+leech+Retzius+neurones+during+inhibition+of+the+Na+-K++pump.">Intracellular Na+ and Ca2+ in leech Retzius neurones during inhibition of the Na+-K+ pump.</a> Pflugers Arch. 397, 195-201 (1983).</li><li>Schwiening, C. J., Thomas, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+intracellular+calcium+and+its+muffling+measured+by+calcium+iontophoresis+in+snail+neurones.">Relationship between intracellular calcium and its muffling measured by calcium iontophoresis in snail neurones.</a> J Physiol. 491 (Pt 3), 621-633 (1996).</li><li>Chesler, M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+of+astrocytes+increases+rapidly+with+cortical+stimulation.">Intracellular pH of astrocytes increases rapidly with cortical stimulation.</a> Am J Physiol. 253, R666-R670 (1987).</li><li>Ammann, D., Chao, P. S., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valinomycin-based+K++selective+microelectrodes+with+low+electrical+membrane+resistance.">Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance.</a> Neurosci Lett. 74, 221-226 (1987).</li><li>Deitmer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicarbonate-dependent+changes+of+intracellular+sodium+and+pH+in+identified+leech+glial+cells.">Bicarbonate-dependent changes of intracellular sodium and pH in identified leech glial cells.</a> Pflugers Arch. 420, 584-589 (1992).</li><li>Lux, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+recording+ion+specific+microelectrodes:+their+use+in+pharmacological+studies+in+the+CNS.">Fast recording ion specific microelectrodes: their use in pharmacological studies in the CNS.</a> Neuropharmacology. 13, 509-517 (1974).</li><li>Nicholson, C., Phillips, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+diffusion+modified+by+tortuosity+and+volume+fraction+in+the+extracellular+microenvironment+of+the+rat+cerebellum.">Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum.</a> J Physiol. 321, 225-257 (1981).</li><li>Chesler, M., Chan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-induced+extracellular+pH+transients+in+the+in+vitro+turtle+cerebellum.">Stimulus-induced extracellular pH transients in the in vitro turtle cerebellum.</a> Neuroscience. 27, 941-948 (1988).</li><li>Thomas, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+sodium+activity+and+the+sodium+pump+in+snail+neurones.">Intracellular sodium activity and the sodium pump in snail neurones.</a> J Physiol. 220, 55-71 (1972).</li></ol>

The authors declare no competing interests.

Flüssigträgergestützter, ionenselektiven Elektroden sind seit Jahrzehnten erfolgreich und für viele Ionen eingesetzt werden, sind hochspezifische Sensoren erhältlich 22-26. Wenn sie in den extrazellulären Raum (ECS) des Wirbeltiergehirns Zubereitungen verwendet werden, muss man im Hinterkopf behalten jedoch, daß dies eine sehr invasive Technik: Während die Breite des ECS beträgt nur etwa 20-50 nm, der Durchmesser der ionenselektiven Mikroelektroden ist etwa 1 um (doppelläufige Elektroden) oder größer (konzentrischen Elektroden). Die Spitzen der ionenselektive Mikroelektroden wird das Gewebe während ihrer impalement des Gewebes also nicht nur zerstört, sondern vergrößern auch den ECS, wodurch ein Unterschätzung der Ionen Transienten. Trotz dieser Gefahren sind extrazelluläre Ionen Transienten in Reaktion auf die neuronale Aktivität bemerkenswert konsistent zwischen verschiedenen Labors 7,8, zur Bestätigung der Zuverlässigkeit dieses Verfahrens. Die Leistung und die Eignung von ionenselektiven Elektrodenist abhängig von der Empfindlichkeit und Selektivität, die mit dem Sensor-Cocktail (&quot;Flüssigmembran Ionophor &#39;) verwendet definiert ist. Sensor Cocktails enthalten eine spezielle Trägermolekül, zum Beispiel Valinomycin für K + -selektiven Mikroelektroden, die eine hohe Selektivität für Kalium 27 aufweist. Trotzdem können bei Kreuzreaktivität mit anderen Ionen sind und getestet werden müssen. Valinomycin eine signifikante Kreuzreaktivität für Ammonium, die bei der Interpretation Ergebnisse werden muss (zB 11,12). Da ferner die Spannungsantwort der Ionophoren folgt einer Nernst-Verhalten (siehe Gleichung 1), das Signal-zu-Rausch-Verhältnisses und des Schwellenwertes abhängig von der Konzentration des Ions zu messen. So, während kleine [K +] o Transienten wecken große Spannungsänderungen gegenüber dem niedrigen Ausgangswert [K +] o, klein [Na +] o Transienten sind sehr viel schwieriger, gegen die hallo erkennengh Basis [Na +] o (siehe Figur 5 und 6). Die Leistung von ionenselektiven Elektroden ist auch durch die zeitliche Auflösung, die im Wesentlichen durch seine elektrische Zeitkonstante geregelt bestimmt. Letzteres wird vor allem durch den axialen Widerstand des Sensors ermittelt und durch die verteilte Kapazität entlang der Länge der Pipette zwischen ihren internen Lösungen und des externen Fluids. In der doppelläufigen Konfiguration ist der Widerstand hoch ist, aufgrund der langen Spalte verfüllt Ionensensor. Für eine gegebene isolierendes Dielektrikum (in diesem Fall Borosilikatglas), wird die Kapazität durch die Dicke des Dielektrikums bestimmt. In doppelläufige Elektroden beträgt die dielektrische Breite an der Glaswand der Pipette. Das Glas dünner in der Nähe der Spitze, fällt die dielektrische Breite und die Kapazität ansteigt. Diese Faktoren kombinieren, um Elektroden mit Reaktionszeiten, die von einigen hundert Millisekunden bis zu mehreren nahrungsmittelSekunden, da diese Faktoren variiert. Ein Hauptvorteil des konzentrischen Konstruktion ist, daß sowohl der axiale Widerstand und die Kapazität an das Bad stark gesunken sind. Die konzentrischen Pipetten Shunts meisten der Widerstand des verfüllten Ionenaustauscher, so dass nur ein Rest in dem letzten Mikrometern vor der Spitze. Darüber hinaus wird die Füllung Lösung innerhalb des konzentrischen Pipetten physikalisch aus dem Bad entfernte, getrennt durch die Dicke von zwei Glaswänden, die Kapazität stark reduziert wird. Wie früher gezeigt 10, ist die kombinierte Wirkung der verringerten Widerstand und Kapazität eine Verbesserung der zeitlichen Auflösung von zwei Größenordnungen. Im Fall von konzentrischen Ca 2+ und pH-Mikroelektroden, waren so günstig wie 10-20 msec 10 90% Reaktionszeiten. Ein verwandter Vorteil der konzentrischen Design ist die geringeren Geräuschpegel (siehe Abbildung 8). Aufgrund der stark reduzierten Widerstand, Spannungsspitzen von jedem Ambient Rauschen minimiert. Außerdem ist die Wiederherstellung von solchen schnellen Transienten aufgrund der schnellen Zeitkonstante. Solche Artefakte sind daher klein und schnell und haben eine weniger störend auf physiologische Aufzeichnungen (siehe Abbildung 8). Gibt es auch Nachteile des konzentrischen Technik. Erstens ist ihre Montage komplizierter und zeitraubend. Ein zweiter Nachteil ist die Notwendigkeit, eine separate Referenzmikroelektrode mit seiner Spitze zu platzieren und beinhaltet die Verwendung entweder eines getrennten Mikromanipulators oder eines spezialisierten Dual-Manipulator. Schließlich kann doppelläufige Mikroelektroden zu einer dreirohrige Design erweitert werden, was die Detektion von zwei verschiedenen Ionenspezies gleichzeitig 28, die nicht für die konzentrischen Elektroden möglich. Die häufigsten Fallstricke Ineffiziente Silanisierung. Der wichtigste Schritt, und Haupthindernis bei der Herstellung einer flüssigkeits sensoder auf der Basis ionenselektive Mikroelektroden ist die Silanisierung Verfahren. Wenn die Elektroden nicht auf Änderungen der spezifischen Ionenkonzentration reagieren oder zu antworten, mit einer Unter Nernst-Reaktion (dh, auch weniger als 58 mV pro zehnfacher Konzentrationsunterschied) ist schlechte Wirksamkeit der Silanisierung in der Regel die Ursache. Nach unserer Erfahrung kann dies auftreten, wenn der Luftfeuchtigkeit zu hoch ist, oder zu niedrig ist, typisch für die Bedingungen in der Höhe des Sommers oder Winters auf. Wenn es möglich ist, eine gewisse Kontrolle über Raumfeuchte ausüben können diese Probleme überwunden werden. Elektrodenwiderstand ist zu hoch. Falls nötig, kann der Widerstand des ionensensitiven Trommel durch Abschrägung reduziert werden. Zu diesem Zweck aussetzen seiner Spitze mit einem starken Strahl eines Schleif in Wasser für ein paar Sekunden ausgesetzt. Dies führt dazu, seine oberste Spitze zu brechen und senken Sie den Widerstand auf den gewünschten Wert. Salzbrücken. SalzBrücken zwischen den Ionen und Referenz Barrel führen zu schlecht oder gar nicht reagierenden Elektroden und somit auch stark ihre Leistung bei der Kalibrierung zu verwechseln. Wie bereits erwähnt (siehe Punkt 1.6.), Ist dies vor allem ein Problem, wenn doppelläufige Theta Glas gewählt wird, ist jedoch ein seltenes Ereignis, wenn Sie das hier beschriebene Offset, verdreht Barrel-Technik. Mit Leichtigkeit der Herstellung vor Augen, kann die ursprüngliche doppelläufige Design Lux 29 oft gewinnbringend eingesetzt werden. Dieses Verfahren nutzt Vorbefüllung der Ionen und Referenz Fässer mit Salzlösungen, eine schnelle Einwirkung einer Silanlösung durch sein Ansaugen und Ausstoßen aus der Spitze, gefolgt von der Einarbeitung Ionenaustauscher, auch mittels der Spitze (siehe 30,31) . Diese Elektroden können in etwa 10 Minuten hergestellt werden, aber die Spitzengröße ist typischerweise 4 &amp; mgr; m oder mehr, und sie sind anfälliger für während eines Experiments scheitern. Im Gegensatz dazu Silanisierung Methoden beinhalten Exposition gegenüber Silan Dampf und Wärmeing können Elektroden mit kleineren Tipps, die Tage dauern, und manchmal Wochen zu produzieren. Zusammengenommen gibt es mehrere Protokolle und nähert sich, wie ionenselektive Mikroelektroden vorzubereiten. Hier haben wir zwei Hauptverfahren zur Herstellung von verdrillten Doppelnamen als auch konzentrische Mikroelektroden, die gut und zuverlässig in unseren Labors arbeiten beschrieben, mit einer Erfolgsquote von nahezu 100%. Wichtiger ist, dass diese Techniken zur Messung anderer Ionen Spezies, einschließlich pH oder Calcium übertragbar sein und wird auch auf andere Zubereitungen als das Gehirn, einschließlich flüssigkeitsgefüllten Hohlräumen oder Fluiden im Allgemeinen. Last, but not least, ionenselektiven Mikroelektroden ermöglichen die Bestimmung von Ionenkonzentrationen in den Zellen. Aufgrund ihrer relativ großen Düsengröße (~ 1 &amp; mgr; m), wird dies jedoch nur in Zellen mit einer großen Zellkörper, beispielsweise möglich, wie beispielsweise in wirbellosen Präparate 28,32 gefunden.

An author's middle initial was omitted from the publication, <a href="http://www.jove.com/video/53058/double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue</a>. The author&#39;s name has been updated to:
Christine R. Rose
from:
Christine Rose

A correction was made to Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.

Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical signaling in the brain is based on the flux of ions across plasma membranes. Major ion movements into and from the extracellular space are not only mediated by passage through voltage-gated ion channels, but also by postsynaptic ionotropic receptors as well as ion transporters. Neuronal activity is thus accompanied by complex changes in the extracellular concentration of all major ions 1. For example, influx of sodium into neurons during excitatory activity has been shown to result in a decrease in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) 2. The same holds true for the extracellular calcium concentration because calcium ions rapidly enter both pre- and postsynaptic structures 3. At the same time, potassium moves the opposite way and this mediates an increase in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in the low mM range 4,5. Synaptic activity also causes changes in extracellular pH that are partly mitigated by concomitant glial membrane fluxes that change intraglial pH 6,7. These activity-related changes in extracellular ion concentrations have significant functional consequences. For example, even small increases in [K+]o depolarize neurons as well as glial cells thereby altering neuronal excitability, and several mechanisms exist to remove excess potassium 8. Failure of these may result in epileptiform activity of neurons or phenomena like spreading depression 1. 
Because of their critical importance, quantitative determination of extracellular ion concentrations is often necessary and required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. For decades, double-barreled ion-selective microelectrodes have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue 9. For many ions, highly specific sensors with low cross-reactivity for other ions are available. In addition to the classical double-barreled electrodes, so-called concentric electrodes were recently introduced. The latter provide a superior time resolution, but take a little more time and effort to construct 10. 
In the following, we will describe the preparation and calibration of these two types of ion-selective microelectrodes. We then show how these electrodes can be employed in brain slice preparations for measurement of changes in [K+]o or [Na+]o induced by excitatory activity following different stimulation paradigms including bath and pressure application of drugs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Abrasive&#160;&#160;</td>
			<td>MicroPolish&#160;</td>
			<td>Buehler GmbH</td>
			<td>Dissolved in A.dest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate-glass capillaries</td>
			<td>1405059</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GC 150 F-15&#160;</td>
			<td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td>
			<td>For the sensor of double-barreled microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GC100-F-15</td>
			<td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td>
			<td>For the reference of double-barreled microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GB-200TF-15&#160;</td>
			<td>Science Products</td>
			<td>Concentric, outer channel. o.d. 2.0 mm&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GB-120TF-10</td>
			<td>Science Products</td>
			<td>Concentric, inner channel. o.d. 1.2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata</td>
			<td>1322A</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrometer amplifier with headstage</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Rin = 10T&#937; and Ibias=50fA-1pA (commercially available&#160; alternatives: e. g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental chamber</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Commercially available from e.g.&#160; Warner Instruments,USA;&#160; Scientifica, UK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Furnace</td>
			<td></td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Must stay constant at 200&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard sticky wax / dental wax&#160;</td>
			<td>Deiberit 502&#160;</td>
			<td>Siladent Dr. Boehme &#38; Schoeps GmbH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Must stay constant at 40&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrodes holder made of plexiglas</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Double-barreled: o.d.&#160; capillaries 1.5 mm, concentric: o.d.&#160; capillaries 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td></td>
			<td>Leitz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>MD4R</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>M205C</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Plan 0.8xLWD</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Concentric microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>Sutter Instruments&#160;</td>
			<td>Sensor of concentric microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic drug ejection system</td>
			<td>Picospritzter Type II</td>
			<td>General Valve TM Corporation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Travel dovetail stage</td>
			<td>DT 25/M</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-component glue</td>
			<td>&#160;Araldite</td>
			<td>Huntsman advanced materials GmbH</td>
			<td>One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silverwire</td>
			<td>99.9%&#160;</td>
			<td>Wieland Edelmetalle</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer / Vibratome</td>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>AxoScope 8.1&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical puller&#160;</td>
			<td>Type PE-2</td>
			<td>Narishige Scientific Instruments</td>
			<td>With a revolvable chuck for&#160; double-barreled microelectrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x/y translational stage</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Compound</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1(S),9(R)-(&#8722;)-Bicuculline methiodide</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>14343</td>
			<td>Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>C-127</td>
			<td>AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-AP5</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64210</td>
			<td>NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td>CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>A9256</td>
			<td>Activates NMDA and non-NMDA and EAATs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid monosodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td>Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R),&#160; mGluRs and EAATs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ionophore I - cocktail B</td>
			<td>Fluka&#160;</td>
			<td>60403</td>
			<td>Based on valinomycin; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ionophore II - cocktail A</td>
			<td>Fluka&#160;&#160;</td>
			<td>71178</td>
			<td>Based on ETH 157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Ascent Scientific</td>
			<td>Asc-055</td>
			<td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, ultra pure</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>W3500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

<html> Zur Überwachung von [K +] o und Veränderungen darin im Ansprechen auf exzitatorische Aktivität, eine doppelläufige kaliumselektive Mikroelektroden wurden in das Stratum radiatum von CA1-Bereich eingefügt. Wenige Minuten nach impalement, die ionenselektive Lauf der Elektrode erreicht eine stabile Basislinie (7A), entsprechend einer [K +] o von etwa 2,8 mm, einen Wert nahe dem [K +] des ACSF verwendet ( 2,5 mm). Badanwendung von 0,5 mM Glutamat für 10 sec induzierte eine reversible Zunahme von [K +] o von etwa 4 mm, gefolgt von einer Unterschreitung unter den Ausgangswert in Höhe von ~ 0,7 mM (Abbildung 7A). Absenken der Glutamatkonzentration auf 0,4, 0,3 und 0,2 mM verursacht eine entsprechende Verringerung der Amplitude von sowohl dem vorübergehenden Anstieg und dem Unter in [K +] o (7A). oad / 53.058 / 53058fig7.jpg &quot;/&gt; Figur 7. Die extrazelluläre Kalium Transienten in Reaktion auf exzitatorische Aktivität. (A) [K +] o Transienten, bestehend aus einem Anstieg, gefolgt von einer Unterschreitung unter den Ausgangswert von Badanwendung verschiedener Konzentrationen von Glutamat für 10 sec induziert, wie angegeben. (B) Einfluss einer Perfusion mit Glutamat-Rezeptor-Blocker (CNQX, 100 &amp; mgr; M; APV, 100 &amp; mgr; M) und Tetrodotoxin (TTX; 0,5 &amp; mgr; M) auf [K +] o Transienten von Bad Applikation von 0,5 mM Glutamat für 10 Sekunden ausgelöst. (C) Spontane [K +] o Transienten in Gegenwart von 0 mg 2+ / BIC. Experimente in der AC gezeigt, wurden unter Verwendung von doppelläufigen Elektroden. Zur Veranschaulichung wurden die Spuren mit einem Sawitzky-Golay-Filter (SW 20) geglättet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig7large.jpg" target="_blank">Bitte cl</a>ick hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Frühere Experimente haben gezeigt, dass solche Glutamat induzierte [K +] o-Signale werden nicht signifikant während der Anwendung der TTX verändert und sind damit weitestgehend unabhängig von der Öffnung der spannungsgesteuerten Natriumkanäle und neuronalen Aktionspotential Generation 15,16. Die Mechanismen, die die beobachteten [K +] o Veränderungen als Reaktion auf Glutamat zu untersuchen, verwendeten wir Glutamatrezeptor-Blocker, nämlich CNQX (100 uM; Blocker der AMPA-Rezeptoren) und APV (100 uM; Blocker des NMDA-Rezeptoren) in der Gegenwart von TTX (0,5 uM). Nach Badperfusion mit diesen Blocker, Glutamat induzierte [K +] o Veränderungen waren praktisch abgeschafft, was bestätigt, ihre Abhängigkeit von der Eröffnung des ionotropen Glutamat-Rezeptor-Kanäle wie zuvor berichtet (zB 17; 7B). Um weiter zu zeigen ter Relevanz der glutamatergen Anregung für die Erzeugung von extrazellulären [K +] Signale wurden die Schnitte mit nominal Mg 2+ -freien Salzlösung, die 10 &amp; mgr; M Bicucullin Methiodid (0 mg 2+ / BIC) perfundiert. Dies entlastet spannungsabhängigen Mg 2+ -block von NMDA-Rezeptoren und dämpft die Hemmung durch GABA A -Rezeptoren blockiert, was spontan rezidivierende epileptiforme Aktivität in dem Netzwerk (zB 18,19). Wie erwartet 20, spontan, wiederkehrend [K +] o Transienten, in Höhe von etwa 1,5 mm wurden in 0mg 2+ / BIC Kochsalzlösung (7C) nachgewiesen. Zwischen diesen Antworten kleinere [K +] o Transienten mit einer mittleren Amplitude von etwa 0,2 mm eingetreten ist (7C). In einem zweiten Satz von Experimenten wurden [Na +] -empfindliche Mikroelektroden [Na +] o Änderungen durch die Anwendung der evozierten bestimmenGlutamat Agonisten. Hier haben wir auch im Vergleich das Ansprechverhalten doppelläufige und konzentrische Mikroelektroden, die zwei unterschiedliche Anwendungsparadigmen. [Na +] -empfindliche Mikroelektroden wurden in das Stratum radiatum in einer Tiefe von etwa 50 um angeordnet. Nachdem eine stabile Basislinie erreicht war, wurde die Glutamat-Agonisten L-Aspartat pro Badperfusion (10 mM, 120 sec, Badperfusion bei 2,5 ml / min) aufgetragen. Wie zuvor 21 beobachtet, die Anwendung von Aspartat verursacht eine langsame Abnahme der [Na +] o von etwa 15 mm, was etwa 5 Minuten dauert, und dann gestartet, um wieder auf die Grundlinie zurückzugewinnen (8A). Bemerkenswert ist, während die Spitzenamplituden und Kinetik der [Na +] O-Signale von beiden Elektroden bestimmt waren unter diesen Bedingungen praktisch identisch zeigte konzentrischen Elektroden eine stabilere Basislinie und einen geringeren Geräuschpegel (8A). Um das zu testen r<html> esponse Merkmale der verschiedenen Elektroden unter einer schnelleren Anwendungs ​​Paradigma wir druckbeaufschlagten Glutamat durch einen feinen Glaspipette im Stratum radiatum positioniert in einem Abstand von 20-40 &amp; mgr; m von der Spitze des ionenselektive Mikroelektroden. Wie erwartet 21. Applikation von Glutamat (10 mM) für 200 ms verursacht einen Abfall in der [Na +] o (8B). Die Spitzenamplituden der [Na +] o Rückgang waren im gleichen Bereich für beide Arten von Elektroden (doppelläufige: 4,5-13,5 mM, n = 14; konzentrische: 2,0-19,1 mM, n = 15). Doch im Gegensatz zu den mit langsamen Badperfusion (siehe oben), nicht nur das Signal-zu-Rausch-Verhältnis, sondern auch der zeitliche Verlauf der [Na +] O-Signale von den beiden Arten von Elektroden erfasst erhaltenen Ergebnisse unterschieden sich signifikant. Die durchschnittliche Zeit bis zum Peak betrug 3,5 sec für die doppelläufige und nur 1,3 Sekunden für den konzentrischen Mikroelektroden. ve_content &quot;&gt; Somit zeigen diese Ergebnisse zu bestätigen und die schnellere Reaktion Kinetik konzentrischen vs. doppelläufige Na + -selektiven Mikroelektroden (vgl 6C und 8B), als auch für Ca 2+ und pH merkt selektive Gegen 10 . Im Gegensatz zu der früheren Studie, in der Kurz platzen synaptischen Stimulation durchgeführt, um schnell synaptisch induzierte Ionen Transienten hervorzurufen, gab es nur eine Tendenz, aber keinen signifikanten Unterschied in der mittleren Spitzenamplituden zwischen konzentrischen und doppelläufige Elektroden mit unseren Anwendungs Paradigma. Dies war wahrscheinlich auf die Tatsache, dass der Abstand des Angriffs Pipette von der Spitze der ionenselektiven Mikroelektrode um einen Faktor von zwei (20-40 &amp; mgr; m) variiert wird, und folglich, dass die maximale Glutamatkonzentration im Zielbereich war nicht die gleiche in verschiedenen Experimenten, behindern eine vorhandene Differenz der Spitzenamplituden. (A) Top Spuren: Wechsel im voltage der Referenz Barrel (V ref) einer doppelläufigen Elektrode (schwarze gestrichelte Linie) und einer konzentrischen Elektrode (graue Kurve) als Reaktion auf Änderungen in dem Bad Na + Konzentration ([Na +] b), wie angegeben. Beachten, dass die Spannungsantworten beider Elektroden sind nahezu identisch. Bottom Spuren: Änderungen in der Spannung der Na + -Potential (V Na +) einer doppelläufigen Elektrode (schwarze Kurve) und einer konzentrischen Elektrode (graue Kurve) als Reaktion auf Änderungen in [Na +] b. (B) Half-logarithmischen Graphen der [Na +] b gegenüber dem V Na + beider Elektroden. Linearen Plots der Daten zeigen eine Neigung von etwa 48 mV für beide Elektroden. (C) Reaktion des V Na + aus einer doppelläufigen (schwarze Kurve) und einer konzentrischen Elektrode (graue Kurve) zu einer schnellen Änderung der [Na +] b von 152 mm bis 70 mm. Man beachte, dass die Reaktionszeit des konzentrischen Elektrode bedeutend faster. Zur Veranschaulichung wurden die Spuren mit einem Sawitzky-Golay-Filter geglättet (Breite 20). <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/53058/53058fig8.jpg" /> Abbildung 8: Die extrazelluläre Natrium-Transienten, wie durch Doppelnamen und konzentrischen Elektroden erfasst. (A) Vorübergehende Änderungen im V ref und [Na +] o nach Bad Perfusion mit 10 mM Aspartat 120 Sekunden, wie durch den Balken angezeigt induziert. Die oberen Spuren zeigen eine Aufnahme mit einer doppelläufigen Elektrode durchgeführt, wurden die unteren Spuren unter Verwendung einer konzentrischen Elektrode erfasst. (B) Vorübergehende Änderungen im V ref und [Na +] o durch lokale Druckanwendung mit 10 mM Glutamat für 0,2 s induziert, wie durch den Pfeil angedeutet. Die oberen Spuren zeigen eine Aufnahme mit einer doppelläufigen Elektrode durchgeführt, wurden die unteren Spuren unter Verwendung einer konzentrischen Elektrode erfasst.Gepunktete rote Linien stellen linearen Anpassungen der Zeitraum zwischen dem Beginn des Signals auf seine maximale. Man beachte, dass die Reaktionszeit des konzentrischen Elektrode bedeutend schneller unter dieser Bedingung. Zur Veranschaulichung wurden die Spuren mit einem Sawitzky-Golay-Filter (Breite 20) geglättet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

Doppelläufige und Concentric Mikroelektroden zur Messung der extrazellulären Ionensignale im Hirngewebe

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.4K Aufrufe.  Heinrich Heine University Düsseldorf. We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations. 

Serie: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Vorbereitung von Gehirngewebe der Maus für Immunelektronenmikroskopie

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Forschung

Neurowissenschaften

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Fokussierten Ionenstrahl-Fräs-und Rasterelektronenmikroskopie des Hirngewebes

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

Konstruktion und Montage eines Ultra-light Motorisierte Microdrive für chronische Neural Recordings in Kleintiere

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

Machen, Prüfung und Verwendung von Kalium-Ionen selektive Mikroelektroden im erwachsenen Gehirn Gewebe Scheiben

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

Dissektion der lokalen Ca2 + Signale in kultivierten Zellen durch die Membran-gezielte Ca2 + Indikatoren

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). Therefore, detection of the presence of A&#946; in AD brain tissue is a valuable tool for developing new treatments to prevent the progression of AD. Several classical amyloid binding dyes, fluorochrome, imaging probes, and A&#946;-specific antibodies have been used to detect A&#946; histochemically in AD brain tissue. Use of these compounds for A&#946; detection is costly and time consuming. However, because of its intense fluorescent activity, high-affinity, and specificity for A&#946;, as well as structural similarities with traditional amyloid binding dyes, curcumin (Cur) is a promising candidate for labeling and imaging of A&#946; plaques in postmortem brain tissue. It is a natural polyphenol from the herb Curcuma longa. In the present study, Cur was used to histochemically label A&#946; plaques from both a genetic mouse model of 5x familial Alzheimer&#39;s disease (5xFAD) and from human AD tissue within a minute. The labeling capability of Cur was compared to conventional amyloid binding dyes, such as thioflavin-S (Thio-S), Congo red (CR), and Fluoro-jade C (FJC), as well as A&#946;-specific antibodies (6E10 and A11). We observed that Cur is the most inexpensive and quickest way to label and image A&#946; plaques when compared to these conventional dyes and is comparable to A&#946;-specific antibodies. In addition, Cur binds with most A&#946; species, such as oligomers and fibrils. Therefore, Cur could be used as the most cost-effective, simple, and quick fluorochrome detection agent for A&#946; plaques.

Curcumin is an ideal fluorophore for labeling and imaging of amyloid beta protein plaques in brain tissue due to its preferential binding to amyloid beta protein as well as its structural similarities with other traditional amyloid binding dyes. It can be used to label and image amyloid beta protein plaques more efficiently and inexpensively than traditional methods.

Etikettierung und Bildgebung von Amyloid-Plaques im Gehirngewebe mit dem natürlichen Polyphenol Curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Horizontale Hippocampal Scheiben der Maus Gehirn

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered tissue samples. Traditional immunolabeling procedures require cutting the sample into thin sections, which restricts the ability to label and examine intact structures. However, if brain tissue can remain intact during processing, structures and circuits can remain intact for the analysis. Previously established clearing methods take significant time to completely clear the tissue, and the harsh chemicals can often damage sensitive antibodies. The iDISCO method quickly and completely clears tissue, is compatible with many antibodies, and requires no special lab equipment. This technique was initially validated for the use in mice tissue, but the current protocol adapts this method to image hemispheres of control and transgenic rat brains. In addition to this, the present protocol also makes several adjustments to preexisting protocol to provide clearer images with less background staining. Antibodies for Iba-1 and tyrosine hydroxylase were validated in the HIV-1 transgenic rat and in F344/N control rats using the present hydrophobic tissue clearing method. The brain is an interwoven network, where structures work together more often than separately of one another. Analyzing the brain as a whole system as opposed to a combination of individual pieces is the greatest benefit of this whole brain clearing method.

Here we present a hydrophobic tissue clearing method that allows for the viewing of target molecules as part of intact brain structures. This technique has now been validated for F344/N control and HIV-1 transgenic rats of both sexes.

Eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode für Rattenhirngewebe

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Measurement of the Directional Information Flow in fNIRS-Hyperscanning Data using the Partial Wavelet Transform Coherence Method

Social interaction is of vital importance for human beings. While the hyperscanning approach has been extensively used to study interpersonal neural synchronization (INS) during social interactions, functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) is one of the most popular techniques for hyperscanning naturalistic social interactions because of its relatively high spatial resolution, sound anatomical localization, and exceptionally high tolerance of motion artifacts. Previous fNIRS-based hyperscanning studies usually calculate a time-lagged INS using wavelet transform coherence (WTC) to describe the direction and temporal pattern of information flow between individuals. However, the results of this method might be confounded by the autocorrelation effect of the fNIRS signal of each individual. For addressing this issue, a method termed partial wavelet transform coherence (pWTC) was introduced, which aimed to remove the autocorrelation effect and maintain the high temporal-spectrum resolution of the fNIRS signal. In this study, a simulation experiment was performed first to show the effectiveness of the pWTC in removing the impact of autocorrelation on INS. Then, step-by-step guidance was offered on the operation of the pWTC based on the fNIRS dataset from a social interaction experiment. Additionally, a comparison between the pWTC method and the traditional WTC method and that between the pWTC method and the Granger causality (GC) method was drawn. The results showed that pWTC could be used to determine the INS difference between different experimental conditions and INS's directional and temporal pattern between individuals during naturalistic social interactions. Moreover, it provides better temporal and frequency resolution than the traditional WTC and better flexibility than the GC method. Thus, pWTC is a strong candidate for inferring the direction and temporal pattern of information flow between individuals during naturalistic social interactions.

This protocol describes partial wavelet transform coherence (pWTC) for calculating the time-lagged pattern of interpersonal neural synchronization (INS) to infer the direction and temporal pattern of information flow during social interaction. The effectiveness of pWTC in removing the confounds of signal autocorrelation on INS was proved by two experiments.

Messung des direktionalen Informationsflusses in fNIRS-Hyperscanning-Daten mit der Partial-Wavelet-Transformationskohärenzmethode

Social interaction is of vital importance for human beings. While the hyperscanning approach has been extensively used to study interpersonal neural ...

Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in preparation for detailed downstream analysis such as flow cytometry or single-cell sequencing. Neural dissociation can be conducted via mechanical dissociation (such as using filters, chopping techniques, or pipette trituration), enzymatic digestion, or a combination thereof. The delicate nature of neuronal cells can complicate efforts to obtain the highly viable, true single-cell suspension with minimal cellular debris that is required for single-cell analysis. The data demonstrate that this combination of automated mechanical dissociation and enzymatic digestion consistently yields a highly viable (&gt;90%) single-cell suspension, overcoming the aforementioned difficulties. While a few of the steps require manual dexterity, these steps lessen sample handling and potential cell loss. This manuscript details each step of the process to equip other laboratories to successfully dissociate small quantities of neural tissue in preparation for downstream analysis.

This neural cell dissociation protocol is intended for samples with a low amount of starting material and yields a highly viable single-cell suspension for downstream analysis, with optional fixation and staining steps.

Kombinierte mechanische und enzymatische Dissoziation von Hippocampusgewebe des Gehirns der Maus

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in ...