Gli autori desiderano ringraziare C. Roderigo per l&#39;assistenza tecnica di esperti. Ringraziamo S. Köhler (Center of Advanced Imaging, Heinrich Heine università Duesseldorf) per un aiuto nella produzione video. La ricerca in laboratorio dell&#39;autore è stato finanziato dal Research Association tedesco (DFG: Ro 2327 / 8-1 a CRR), l&#39;Università Heinrich Heine Duesseldorf (NH) e dal National Institutes of Health di Grant R01NS032123 (a MC).

<ol>
	<li>Somjen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+regulation+in+the+brain:+implications+for+pathophysiology.">Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology.</a> Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).</li><li>Dietzel, I., Heinemann, U., Hofmeier, G., Lux, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-induced+changes+in+extracellular+Na++and+Cl-+concentration+in+relation+to+changes+in+the+size+of+the+extracellular+space.">Stimulus-induced changes in extracellular Na+ and Cl- concentration in relation to changes in the size of the extracellular space.</a> Exp Brain Res. 46, 73-84 (1982).</li><li>Nicholson, C., ten Bruggencate, G., Stockle, H., Steinberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+potassium+changes+in+extracellular+microenvironment+of+cat+cerebellar+cortex.">Calcium and potassium changes in extracellular microenvironment of cat cerebellar cortex.</a> J Neurophysiol. 41, 1026-1039 (1978).</li><li>Rice, M. E., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate-+and+aspartate-induced+extracellular+potassium+and+calcium+shifts+and+their+relation+to+those+of+kainate,+quisqualate+and+N-methyl-D-aspartate+in+the+isolated+turtle+cerebellum.">Glutamate- and aspartate-induced extracellular potassium and calcium shifts and their relation to those of kainate, quisqualate and N-methyl-D-aspartate in the isolated turtle cerebellum.</a> Neuroscience. 38, 295-310 (1990).</li><li>Prince, D. A., Lux, H. D., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+extracellular+potassium+activity+in+cat+cortex.">Measurement of extracellular potassium activity in cat cortex.</a> Brain Res. 50, 489-495 (1973).</li><li>Deitmer, J. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+regulation+and+proton+signalling+by+glial+cells.">pH regulation and proton signalling by glial cells.</a> Prog Neurobiol. 48, 73-103 (1996).</li><li>Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+modulation+of+pH+in+the+brain.">Regulation and modulation of pH in the brain.</a> Physiol Rev. 83, 1183-1221 (2003).</li><li>Kofuji, P., Newman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Regulation of potassium by glial cells in the central nervous system. , (2009).</li><li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-selective+microelectrodes+and+diffusion+measurements+as+tools+to+explore+the+brain+cell+microenvironment.">Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment.</a> J Neurosci Methods. 48, 199-213 (1993).</li><li>Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+use+of+high-speed,+concentric+h+-+and+Ca2+-selective+microelectrodes+suitable+for+in+vitro+extracellular+recording.">Fabrication and use of high-speed, concentric h+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording.</a> J Neurophysiol. 96, 919-924 (2006).</li><li>Stephan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kir4.1+channels+mediate+a+depolarization+of+hippocampal+astrocytes+under+hyperammonemic+conditions+in+situ.">Kir4.1 channels mediate a depolarization of hippocampal astrocytes under hyperammonemic conditions in situ.</a> Glia. 60, 965-978 (2012).</li><li>Haack, N., Rose, C. R., Lei, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+Calibration+and+Application+of+Potassium-Selective+Microelectrodes.">Preparation, Calibration and Application of Potassium-Selective Microelectrodes.</a> Microelectrodes. , 87-105 (2014).</li><li>Roos, A., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH.">Intracellular pH.</a> Physiol Rev. 61, 296-434 (1981).</li><li>Kleinhans, C., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+Intracellular+Sodium+Imaging+Combined+with+UV-mediated+Focal+Uncaging+of+Glutamate+in+CA1+Pyramidal+Neurons.">Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li><li>Hertz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+astrocytic+Na+,K+-ATPase+and+glycogenolysis+for+K+homeostasis+in+mammalian+brain.">Roles of astrocytic Na ,K -ATPase and glycogenolysis for K homeostasis in mammalian brain.</a> J Neurosci Res. , (2014).</li><li>Pumain, R., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-+and+amino+acid-induced+calcium+and+potassium+changes+in+rat+neocortex.">Stimulus- and amino acid-induced calcium and potassium changes in rat neocortex.</a> J Neurophysiol. 53, 1-16 (1985).</li><li>Vargova, L., Jendelova, P., Chvatal, A., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate,+AMPA,+NMDA+Induced+Changes+in+Extracellular+Space+Volume+and+Tortuosity+in+the+Rat+Spinal+Cord.">Glutamate, AMPA, NMDA Induced Changes in Extracellular Space Volume and Tortuosity in the Rat Spinal Cord.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 21, 1077-1089 (2001).</li><li>Fellin, T., Gomez-Gonzalo, M., Gobbo, S., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+glutamate+is+not+necessary+for+the+generation+of+epileptiform+neuronal+activity+in+hippocampal+slices.">Astrocytic glutamate is not necessary for the generation of epileptiform neuronal activity in hippocampal slices.</a> J Neurosci. 26, 9312-9322 (2006).</li><li>Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+metabolic+networks+sustain+hippocampal+synaptic+transmission.">Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission.</a> Science. 322, 1551-1555 (2008).</li><li>Lux, H. D., Heinemann, U., Dietzel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+changes+and+alterations+in+the+size+of+the+extracellular+space+during+epileptic+activity.">Ionic changes and alterations in the size of the extracellular space during epileptic activity.</a> Adv Neurol. 44, 619-639 (1986).</li><li>Zanotto, L., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartate+and+glutamate+induced+reductions+in+extracellular+free+calcium+and+sodium+concentration+in+area+CA1+of+'in+vitro'+hippocampal+slices+of+rats.">Aspartate and glutamate induced reductions in extracellular free calcium and sodium concentration in area CA1 of 'in vitro' hippocampal slices of rats.</a> Neurosci Lett. 35, 79-84 (1983).</li><li>Borrelli, M. J., Carlini, W. G., Dewey, W. C., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+making+ion-selective+microelectrodes+suitable+for+intracellular+recording+in+vertebrate+cells.">A simple method for making ion-selective microelectrodes suitable for intracellular recording in vertebrate cells.</a> J Neurosci Methods. 15, 141-154 (1985).</li><li>Ammann, D., Anker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutral+carrier+sodium+ion-selective+microelectrode+for+extracellular+studies.">Neutral carrier sodium ion-selective microelectrode for extracellular studies.</a> Neurosci Lett. 57, 267-271 (1985).</li><li>Deitmer, J. W., Schlue, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Na++and+Ca2++in+leech+Retzius+neurones+during+inhibition+of+the+Na+-K++pump.">Intracellular Na+ and Ca2+ in leech Retzius neurones during inhibition of the Na+-K+ pump.</a> Pflugers Arch. 397, 195-201 (1983).</li><li>Schwiening, C. J., Thomas, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+intracellular+calcium+and+its+muffling+measured+by+calcium+iontophoresis+in+snail+neurones.">Relationship between intracellular calcium and its muffling measured by calcium iontophoresis in snail neurones.</a> J Physiol. 491 (Pt 3), 621-633 (1996).</li><li>Chesler, M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+of+astrocytes+increases+rapidly+with+cortical+stimulation.">Intracellular pH of astrocytes increases rapidly with cortical stimulation.</a> Am J Physiol. 253, R666-R670 (1987).</li><li>Ammann, D., Chao, P. S., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valinomycin-based+K++selective+microelectrodes+with+low+electrical+membrane+resistance.">Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance.</a> Neurosci Lett. 74, 221-226 (1987).</li><li>Deitmer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicarbonate-dependent+changes+of+intracellular+sodium+and+pH+in+identified+leech+glial+cells.">Bicarbonate-dependent changes of intracellular sodium and pH in identified leech glial cells.</a> Pflugers Arch. 420, 584-589 (1992).</li><li>Lux, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+recording+ion+specific+microelectrodes:+their+use+in+pharmacological+studies+in+the+CNS.">Fast recording ion specific microelectrodes: their use in pharmacological studies in the CNS.</a> Neuropharmacology. 13, 509-517 (1974).</li><li>Nicholson, C., Phillips, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+diffusion+modified+by+tortuosity+and+volume+fraction+in+the+extracellular+microenvironment+of+the+rat+cerebellum.">Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum.</a> J Physiol. 321, 225-257 (1981).</li><li>Chesler, M., Chan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-induced+extracellular+pH+transients+in+the+in+vitro+turtle+cerebellum.">Stimulus-induced extracellular pH transients in the in vitro turtle cerebellum.</a> Neuroscience. 27, 941-948 (1988).</li><li>Thomas, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+sodium+activity+and+the+sodium+pump+in+snail+neurones.">Intracellular sodium activity and the sodium pump in snail neurones.</a> J Physiol. 220, 55-71 (1972).</li></ol>

The authors declare no competing interests.

Liquido a base porta-elettrodi ionoselettivi sono stati impiegati con successo per decenni e per molti ioni, sensori altamente specifici sono disponibili 22-26. Quando utilizzato nello spazio extracellulare (ECS) di preparazioni cerebrali vertebrati, si deve tenere presente, tuttavia, che questa è una tecnica molto invasiva: mentre la larghezza della ECS è solo circa 20-50 nm, il diametro di ione-selettivo microelettrodi è di circa 1 micron (elettrodi a doppia canna) o più grandi (elettrodi concentrici). Le punte dei microelettrodi ionoselettive saranno quindi non solo danneggiare il tessuto durante la loro impalamento del tessuto, ma anche ingrandire la ECS, favorendo una sottovalutazione dei transitori di ioni. Nonostante queste insidie, transitori ioni extracellulari in risposta all&#39;attività neuronale sono notevolmente coerenti tra i diversi laboratori 7,8, attestanti l&#39;affidabilità di questo metodo. Le prestazioni e l&#39;idoneità di elettrodi ionoselettividipende dalla loro sensibilità e selettività, che è definita dal cocktail sensore (&#39;ionoforo membrana liquida&#39;) utilizzato. Cocktail sensori contengono una speciale molecola carrier, per es valinomicina K + microelettrodi -selettivo che presenta un&#39;elevata selettività per il potassio 27. Nonostante, cross-reattività con altri ioni può avvenire e deve essere testato. Valinomicina presenta una significativa reattività crociata per ammonio, che deve essere considerato quando si interpretano i risultati (ad esempio, 11,12). Inoltre, poiché la tensione di risposta dei ionofori segue un comportamento Nernst (cfr equazione 1), il rapporto segnale-rumore e soglia di rilevamento dipendono dalla concentrazione dello ione da misurare. Così, mentre piccolo [K +] o transienti evocare grandi variazioni di tensione contro la bassa linea di base [K +] o, piccolo [Na +] o transitori sono molto più difficili da individuare contro hibasale gh [Na +] o (vedere la figura 5 e 6). Le prestazioni di elettrodi ionoselettivi è determinato anche dalla risoluzione temporale, che è largamente governata dalla sua costante di tempo elettrica. Quest&#39;ultima è determinata principalmente dalla resistenza assiale del sensore, e dalla capacità distribuita lungo la lunghezza della pipetta, tra le soluzioni interne e il fluido esterno. Nella configurazione a doppia canna, la resistenza è alta, a causa della lunga colonna di sensore ione ripiena. Per un dato dielettrico isolante (in questo caso vetro borosilicato), la capacità è governato dallo spessore dielettrico. In elettrodi a doppia canna, la larghezza dielettrico equivale alla parete di vetro della pipetta. Quando il vetro si assottiglia in prossimità della punta, la larghezza dielettrico cade, e la capacità aumenta. Questi fattori si combinano per produrre elettrodi con tempi di risposta che vanno da alcune centinaia di millisecondi a diversesecondi, come questi fattori sono molteplici. Un importante vantaggio del disegno concentrico è che sia la resistenza assiale e la capacità al bagno sono notevolmente ridotte. I derivatori pipetta concentrici maggior parte della resistenza dello scambiatore di ioni ripiena, lasciando solo un residuo negli ultimi micrometri prima della punta. Inoltre, la soluzione di riempimento all&#39;interno della pipetta concentrica è fisicamente distanziato dal bagno, separato dallo spessore di due pareti di vetro, riducendo notevolmente la capacità. Come illustrato in precedenza 10, l&#39;effetto combinato della ridotta resistenza e capacità è un miglioramento della risoluzione temporale di due ordini di grandezza. In caso di Ca 2+ concentrici e pH microelettrodi, 90% i tempi di risposta erano partire da 10-20 msec 10. Un vantaggio relativo del disegno concentrica è il livello di rumore inferiore (vedi figura 8). Grazie alla resistenza notevolmente ridotto, transitori di tensione da qualsiasi ambienrumore t sono ridotti al minimo. Inoltre, il recupero da tali transitori è rapido, a causa della costante di tempo veloce. Tali manufatti sono quindi piccolo e veloce, e hanno un effetto meno dirompente sulle registrazioni fisiologiche (vedi Figura 8). Ci sono anche degli svantaggi della tecnica concentrica. Innanzitutto, il loro assemblaggio è più complesso e richiede tempo. Un secondo inconveniente è la necessità di posizionare un microelettrodo riferimento separato con la punta, che comporta l&#39;utilizzo della propria micromanipolatore separato o un doppio manipolatore specializzata. Infine, microelettrodi doppia canna possono essere estesi ad un disegno tripla canna, consentendo rilevamento di due specie ioniche differenti allo stesso tempo 28, che non è possibile per elettrodi concentrici. Insidie ​​più comuni Silanizzazione inefficiente. Il passo più importante, e ostacolo principale nella fabbricazione di qualsiasi liquido-senso basate microelettrodo ionoselettivo è la procedura silanizzazione. Quando gli elettrodi non riescono a rispondere ai cambiamenti nella concentrazione di ioni specifici, o di rispondere con una risposta sub-Nernst (vale a dire, ben meno di 58 mV per dieci volte differenza di concentrazione), scarsa efficacia di silanizzazione è in genere la causa. Nella nostra esperienza, questo può verificarsi se l&#39;umidità atmosferica è troppo alto, o troppo basso, tipico delle condizioni piena estate o inverno, rispettivamente. Se è fattibile per esercitare un certo controllo dell&#39;umidità ambientale, questi problemi possono essere superati. Resistenza dell&#39;elettrodo è troppo alta. Se necessario, la resistenza della canna sensibile agli ioni può essere ridotta di bisellatura. A tal fine, esporre la sua punta a un forte getto di abrasivo sospeso in acqua per un paio di secondi. Questo farà sì che la punta upmost per rompere e abbassare la resistenza al valore desiderato. Ponti salini. Saleponti tra le botti di ioni e di riferimento determinano elettrodi scarsamente o niente di rispondere e possono quindi anche confondere notevolmente le loro prestazioni nella calibrazione. Come accennato in precedenza (vedi punto 1.6.), Questo è soprattutto un problema quando si sceglie a doppia canna di vetro theta, ma è un evento raro quando si utilizza l&#39;offset, tecnica botte contorto qui descritto. Con la facilità di fabbricazione in mente, il design a doppia canna originale di Lux 29 può essere spesso utilizzato proficuamente. Questo metodo utilizza pre-riempimento delle botti di ioni e di riferimento con soluzioni saline, un&#39;esposizione veloce per una soluzione di silano con la sua aspirazione e l&#39;espulsione dalla punta, seguendo per incorporazione di scambiatore ionico, anche tramite la punta (vedi 30,31) . Questi elettrodi possono essere realizzati in circa 10 minuti, ma il loro formato di punta è in genere 4 micron o più e sono più inclini a fallire nel corso di un esperimento. Al contrario, i metodi silanizzazione che comportano l&#39;esposizione al vapore silano e caloreing può produrre elettrodi con punte più piccoli che durano giorni, e, a volte settimane. Nel loro insieme, ci sono diversi protocolli e approcci su come prepararsi microelettrodi ionoselettive. Qui, abbiamo descritto due principali procedure per la fabbricazione di microelettrodi due canne e concentrici intrecciati che funzionano bene e affidabile nei nostri laboratori, con un tasso di successo complessivo prossimo al 100%. È importante sottolineare che queste tecniche saranno trasferibili alla misurazione di altri ioni specie, tra cui il pH o di calcio, e sarà anche essere applicabile ad altri preparati che il cervello, comprese le cavità piene di liquido o di fluidi in genere. Ultimo, ma non meno importante, microelettrodi ionoselettive consentono la determinazione delle concentrazioni di ioni all&#39;interno delle cellule. A causa della loro relativamente grandi dimensioni punta (~ 1 micron), tale volontà, però, sarà possibile solo in cellule con un corpo a grandi cellule, quali ad esempio, ha trovato in preparati invertebrati 28,32.

An author's middle initial was omitted from the publication, <a href="http://www.jove.com/video/53058/double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue</a>. The author&#39;s name has been updated to:
Christine R. Rose
from:
Christine Rose

A correction was made to Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.

Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical signaling in the brain is based on the flux of ions across plasma membranes. Major ion movements into and from the extracellular space are not only mediated by passage through voltage-gated ion channels, but also by postsynaptic ionotropic receptors as well as ion transporters. Neuronal activity is thus accompanied by complex changes in the extracellular concentration of all major ions 1. For example, influx of sodium into neurons during excitatory activity has been shown to result in a decrease in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) 2. The same holds true for the extracellular calcium concentration because calcium ions rapidly enter both pre- and postsynaptic structures 3. At the same time, potassium moves the opposite way and this mediates an increase in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in the low mM range 4,5. Synaptic activity also causes changes in extracellular pH that are partly mitigated by concomitant glial membrane fluxes that change intraglial pH 6,7. These activity-related changes in extracellular ion concentrations have significant functional consequences. For example, even small increases in [K+]o depolarize neurons as well as glial cells thereby altering neuronal excitability, and several mechanisms exist to remove excess potassium 8. Failure of these may result in epileptiform activity of neurons or phenomena like spreading depression 1. 
Because of their critical importance, quantitative determination of extracellular ion concentrations is often necessary and required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. For decades, double-barreled ion-selective microelectrodes have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue 9. For many ions, highly specific sensors with low cross-reactivity for other ions are available. In addition to the classical double-barreled electrodes, so-called concentric electrodes were recently introduced. The latter provide a superior time resolution, but take a little more time and effort to construct 10. 
In the following, we will describe the preparation and calibration of these two types of ion-selective microelectrodes. We then show how these electrodes can be employed in brain slice preparations for measurement of changes in [K+]o or [Na+]o induced by excitatory activity following different stimulation paradigms including bath and pressure application of drugs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Abrasive&#160;&#160;</td>
			<td>MicroPolish&#160;</td>
			<td>Buehler GmbH</td>
			<td>Dissolved in A.dest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate-glass capillaries</td>
			<td>1405059</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GC 150 F-15&#160;</td>
			<td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td>
			<td>For the sensor of double-barreled microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GC100-F-15</td>
			<td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td>
			<td>For the reference of double-barreled microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GB-200TF-15&#160;</td>
			<td>Science Products</td>
			<td>Concentric, outer channel. o.d. 2.0 mm&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GB-120TF-10</td>
			<td>Science Products</td>
			<td>Concentric, inner channel. o.d. 1.2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata</td>
			<td>1322A</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrometer amplifier with headstage</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Rin = 10T&#937; and Ibias=50fA-1pA (commercially available&#160; alternatives: e. g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental chamber</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Commercially available from e.g.&#160; Warner Instruments,USA;&#160; Scientifica, UK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Furnace</td>
			<td></td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Must stay constant at 200&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard sticky wax / dental wax&#160;</td>
			<td>Deiberit 502&#160;</td>
			<td>Siladent Dr. Boehme &#38; Schoeps GmbH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Must stay constant at 40&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrodes holder made of plexiglas</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Double-barreled: o.d.&#160; capillaries 1.5 mm, concentric: o.d.&#160; capillaries 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td></td>
			<td>Leitz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>MD4R</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>M205C</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Plan 0.8xLWD</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Concentric microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>Sutter Instruments&#160;</td>
			<td>Sensor of concentric microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic drug ejection system</td>
			<td>Picospritzter Type II</td>
			<td>General Valve TM Corporation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Travel dovetail stage</td>
			<td>DT 25/M</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-component glue</td>
			<td>&#160;Araldite</td>
			<td>Huntsman advanced materials GmbH</td>
			<td>One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silverwire</td>
			<td>99.9%&#160;</td>
			<td>Wieland Edelmetalle</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer / Vibratome</td>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>AxoScope 8.1&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical puller&#160;</td>
			<td>Type PE-2</td>
			<td>Narishige Scientific Instruments</td>
			<td>With a revolvable chuck for&#160; double-barreled microelectrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x/y translational stage</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Compound</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1(S),9(R)-(&#8722;)-Bicuculline methiodide</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>14343</td>
			<td>Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>C-127</td>
			<td>AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-AP5</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64210</td>
			<td>NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td>CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>A9256</td>
			<td>Activates NMDA and non-NMDA and EAATs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid monosodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td>Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R),&#160; mGluRs and EAATs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ionophore I - cocktail B</td>
			<td>Fluka&#160;</td>
			<td>60403</td>
			<td>Based on valinomycin; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ionophore II - cocktail A</td>
			<td>Fluka&#160;&#160;</td>
			<td>71178</td>
			<td>Based on ETH 157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Ascent Scientific</td>
			<td>Asc-055</td>
			<td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, ultra pure</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>W3500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

<html> Per monitorare [K +] o e sue variazioni in risposta all&#39;attività eccitatoria, un microelettrodo doppia canna potassio-selettivo è stato inserito nel radiatum strato dell&#39;area CA1. Pochi minuti dopo impalamento, la canna ionoselettivo dell&#39;elettrodo raggiunto una linea di base stabile (Figura 7A), corrispondente ad un [K +] o di circa 2,8 mm, un valore prossimo al [K +] del ACSF utilizzato ( 2,5 mm). Bagno applicazione di glutammato 0,5 mM per 10 sec indotto un aumento reversibile [K +] o di circa 4 mm, seguito da un undershoot al basale pari a ~ 0,7 mM (Figura 7A). L&#39;abbassamento della concentrazione di glutammato a 0,4, 0,3, e 0,2 mM causato una corrispondente riduzione dell&#39;ampiezza sia l&#39;aumento transitorio e sottomodulazioni [K +] o (Figura 7A). OAD / 53058 / 53058fig7.jpg &quot;/&gt; Figura 7. transitori potassio extracellulari in risposta all&#39;attività eccitatoria. (A) [K +] o transitori, consistente in un aumento seguito da un undershoot inferiore al valore basale, indotta da bagno applicazione di diverse concentrazioni di glutammato per 10 secondi come indicato. (B) L&#39;influenza di una perfusione con bloccanti del recettore del glutammato (CNQX, 100 micron, APV, 100 micron) e tetrodotossina (TTX; 0,5 micron) su [K +] o transienti indotta dalla applicazione bagno di glutammato 0.5 mm per 10 sec. (C) spontaneo [K +] o transienti in presenza di 0 mg 2+ / BIC. Gli esperimenti riportati in AC sono stati eseguiti utilizzando elettrodi a doppia canna. A scopo illustrativo, le tracce sono state levigate con un filtro Sawitzky-Golay (larghezza 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig7large.jpg" target="_blank">Si prega di cl</a>ick qui per vedere una versione più grande di questa figura. Esperimenti precedenti hanno dimostrato che tali [K +] o segnali glutammato indotto non risultano significativamente modificati durante l&#39;applicazione di TTX, e sono quindi in gran parte indipendente sull&#39;apertura dei canali del sodio voltaggio-dipendenti e l&#39;azione neuronale potenziale di generazione di 15,16. Per studiare i meccanismi alla base delle osservati [K +] o cambiamenti in risposta al glutammato, abbiamo applicato bloccanti del recettore del glutammato, cioè CNQX (100 micron; bloccante dei recettori AMPA) e APV (100 micron; bloccante dei recettori NMDA) in presenza di TTX (0,5 mM). Al Bagno perfusione con questi bloccanti, glutammato indotta [K +] o cambiamenti erano praticamente abolito, confermando la loro dipendenza l&#39;apertura di canali recettori del glutammato ionotropi come riportato in precedenza (ad esempio, 17; Figura 7B). Per dimostrare ulteriormente tegli rilevanza di glutamatergico di eccitazione per la generazione di extracellulare [K +] i segnali, le fette sono stati perfusi con nominalmente Mg 2 + -free salina contenente 10 mM bicucullina methiodide (0mg 2+ / BIC). Questo allevia voltaggio-dipendenti Mg 2+ -block dei recettori NMDA e smorza l&#39;inibizione bloccando i recettori GABA A, provocando spontanea attività epilettiforme ricorrente nella rete (ad esempio, 18,19). Come previsto 20, spontanea, ricorrente [K +] o transienti, pari a circa 1,5 mm sono stati rilevati in 0mg 2+ / salina BIC (Figura 7C). Tra queste risposte, più piccolo [K +] o transienti con una ampiezza media di circa 0,2 mM verificato (figura 7C). In una seconda serie di esperimenti, abbiamo utilizzato [Na +] microelettrodi sensitive per determinare [Na +] o cambiamenti evocati mediante l&#39;applicazione diagonisti glutammato. Qui, abbiamo anche confrontato le caratteristiche di risposta di microelettrodi a due canne e concentriche che impiegano due diversi paradigmi di applicazione. [Na +] microelettrodi -sensitive erano posizionati nella radiatum strato a una profondità di circa 50 micron. Dopo una linea di base stabile è stato raggiunto, il glutammato agonista L-aspartato è stato applicato per bagno perfusione (10 mM, 120 sec, bagno perfusione a 2,5 ml / min). Come osservato in precedenza 21, applicazione di aspartato ha causato una lenta diminuzione del [Na +] o di circa 15 mm, che è durato circa 5 minuti e poi ha iniziato a recuperare di nuovo al basale (Figura 8A). In particolare, mentre le ampiezze di picco e cinetica delle [Na +] o segnali determinati da entrambi gli elettrodi erano virtualmente identiche in queste condizioni, elettrodi concentrici mostravano una linea di base stabile e una maggiore rumorosità inferiore (Figura 8A). Per verificare il r<html> esponse caratteristiche dei diversi elettrodi sotto un paradigma un&#39;applicazione più rapida, abbiamo glutammato pressione applicata attraverso una pipetta di vetro fine posizionata nella radiatum strato a una distanza di 20-40 micron dalla punta del microelettrodo ione-selettivo. Come previsto 21, applicazione di glutammato (10 mM) per 200 ms causato un calo nella o [Na +] (Figura 8B). Le ampiezze di picco del o diminuzione [Na +] erano nello stesso intervallo per entrambi i tipi di elettrodi (doppia canna: 4,5 - 13.5 mM, n = 14; concentrici: 2.0 - 19.1 mM, n = 15). Tuttavia, in contrasto con i risultati ottenuti con lenta perfusione vasca (vedi sopra), non solo il rapporto segnale-rumore, ma anche l&#39;andamento temporale dei [Na +] o segnali rilevati dai due tipi di elettrodi differivano significativamente. Il tempo medio di picco è stato 3,5 secondi per la doppia canna e solo 1,3 secondi per i microelettrodi concentrici. controparti ve_content &quot;&gt; Quindi, questi risultati dimostrano e confermano la cinetica di risposta più veloci del concentriche rispetto microelettrodi a doppia canna Na + -selettivo, (vedi Figura 6C e 8B), come è stato anche notato per Ca 2+ e pH-selettivi 10 . A differenza del primo studio, in cui la stimolazione sinaptica breve scoppio è stata effettuata per evocare transitori ioni veloce sinapticamente-indotti, c&#39;era solo una tendenza, ma nessuna differenza significativa nelle ampiezze di picco medie tra elettrodi concentrici e doppia canna con la nostra applicazione paradigma. Questo è probabilmente dovuto al fatto che la distanza della pipetta applicazione dalla punta del microelettrodo ionoselettivo variava di un fattore di due (20-40 micron), e di conseguenza, che la concentrazione glutammato massimo in corrispondenza della zona di destinazione non era la stessa in diversi esperimenti, ostacolando qualsiasi differenza esistente in ampiezze di picco. (A) In alto tracce: Variazione della Voltage delle canne di riferimento (VREF) di una doppia canna elettrodo (nero traccia tratteggiata) ed un elettrodo concentrica (grigio traccia) in risposta ai cambiamenti nella vasca di concentrazione di Na + ([Na +] b) come indicato. Si noti che le risposte tensione di entrambi gli elettrodi sono praticamente identici. Tracce di fondo: variazioni della tensione della Na + -potential (V Na +) di una doppia canna elettrodo (traccia nera) ed un elettrodo concentrica (grigio traccia) in risposta alle variazioni di [Na +] b. (B) trame mezza logaritmiche del [Na +] b rispetto al V Na + di entrambi gli elettrodi. Trame lineare dei dati rivelano una pendenza di circa 48 mV per entrambi gli elettrodi. (C) Reazione del V Na + di una doppia canna (trace nero) e un elettrodo concentrica (grigio trace) ad una variazione rapida della [Na +] b da 152 mM a 70 mM. Si noti che il tempo di risposta dell&#39;elettrodo concentrica è significativamente faster. A scopo illustrativo, le tracce sono state levigate con un filtro Sawitzky-Golay (larghezza 20). <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53058/53058fig8.jpg" /> Figura 8: transitori di sodio extracellulari rilevate tramite elettrodi a doppia canna e concentriche. (A) i cambiamenti transitori V ref e [Na +] o indotta da bagno perfusione con aspartato 10 mm per 120 sec, come indicato dalla barra. Le tracce superiori mostrano una registrazione eseguita con un elettrodo a due canne, le tracce inferiori sono stati registrati utilizzando un elettrodo concentrica. (B) cambiamenti transitori V ref e [Na +] o indotta applicando pressione locale con glutammato 10 mM per 0,2 sec come indicato dalla freccia. Le tracce superiori mostrano una registrazione eseguita con un elettrodo a due canne, le tracce inferiori sono stati registrati utilizzando un elettrodo concentrica.Linee rosse tratteggiate rappresentano attacchi lineari del periodo tra l&#39;inizio del segnale al massimo. Si noti che il tempo di risposta dell&#39;elettrodo concentrica è significativamente più veloce in questa condizione. A scopo illustrativo, le tracce sono state levigate con un filtro Sawitzky-Golay (larghezza 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig8large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue at JoVE.com

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

Microelettrodi doppia canna e concentrico per la misurazione di extracellulare Ion Segnali in tessuto cerebrale

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.3K Views.  Heinrich Heine University Düsseldorf. We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations. 