This work was supported by National Institutes of Health (NIH) Grant number: NIH P50DC00422 (H.L.); NIH R01DC12058 (H.L.). This work also benefitted from the South Carolina Clinical and Translational Research Institution (SCTR) Clinical and Translational Science Award (NIH/NCRR UL1RR029882). The funders had no role in study design, data collection, and/or analysis. The authors would like to thank Lonnie E. Brown Jr. for his artistic and graphic contributions.

<ol>
	<li>Kimura, R. S., Iverson, N. A., Southard, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+lesions+of+the+vestibular+labyrinth.">Selective lesions of the vestibular labyrinth.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 97, 577-584 (1988).</li><li>Dodson, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+and+survival+of+spiral+ganglion+neurons+in+the+guinea+pig+after+intracochlear+perfusion+with+aminoglycosides.">Loss and survival of spiral ganglion neurons in the guinea pig after intracochlear perfusion with aminoglycosides.</a> Journal of neurocytology. 26, 541-556 (1997).</li><li>Wanamaker, H. H., Gruenwald, L., Damm, K. J., Ogata, Y., Slepecky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-related+vestibular+and+cochlear+effects+of+transtympanic+gentamicin.">Dose-related vestibular and cochlear effects of transtympanic gentamicin.</a> The American journal of otology. 19, 170-179 (1998).</li><li>Lee, K. S., Kimura, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ototoxic+drug+administration+to+the+endolymphatic+sac.">Effect of ototoxic drug administration to the endolymphatic sac.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 100, 355-360 (1991).</li><li>Schmiedt, R. A., Okamura, H. O., Lang, H., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ouabain+application+to+the+round+window+of+the+gerbil+cochlea:+a+model+of+auditory+neuropathy+and+apoptosis.">Ouabain application to the round window of the gerbil cochlea: a model of auditory neuropathy and apoptosis.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 3, 223-233 (2002).</li><li>Schmiedt, R. A., Lang, H., Okamura, H. O., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+furosemide+applied+chronically+to+the+round+window:+a+model+of+metabolic+presbyacusis.">Effects of furosemide applied chronically to the round window: a model of metabolic presbyacusis.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 9643-9650 (2002).</li><li>Suzuki, M., Kikuchi, T., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocochlear+potential+and+endolymphatic+K++changes+induced+by+gap+junction+blockers.">Endocochlear potential and endolymphatic K+ changes induced by gap junction blockers.</a> Acta oto-laryngologica. 124, 902-906 (2004).</li><li>Chen, Z., Mikulec, A. A., McKenna, M. J., Sewell, W. F., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+intracochlear+drug+delivery+in+the+mouse.">A method for intracochlear drug delivery in the mouse.</a> Journal of neuroscience methods. 150, 67-73 (2006).</li><li>Husmann, K. R., Morgan, A. S., Girod, D. A., Durham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+administration+of+gentamicin:+a+new+method+for+the+study+of+ototoxicity+of+cochlear+hair+cells.">Round window administration of gentamicin: a new method for the study of ototoxicity of cochlear hair cells.</a> Hearing research. 125, 109-119 (1998).</li><li>Heydt, J. L., Cunningham, L. L., Rubel, E. W., Coltrera, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+gentamicin+application:+an+inner+ear+hair+cell+damage+protocol+for+the+mouse.">Round window gentamicin application: an inner ear hair cell damage protocol for the mouse.</a> Hearing research. 162, 65-74 (2004).</li><li>Palmgren, B., Jin, Z., Ma, H., Jiao, Y., Olivius, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Bungarotoxin+application+to+the+round+window:+an+in+vivo+deafferentation+model+of+the+inner+ear.">beta-Bungarotoxin application to the round window: an in vivo deafferentation model of the inner ear.</a> Hearing research. 265, 70-76 (2010).</li><li>Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chronic+furosemide+treatment+and+age+on+cell+division+in+the+adult+gerbil+inner+ear.">Effects of chronic furosemide treatment and age on cell division in the adult gerbil inner ear.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 4, 164-175 (2003).</li><li>Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ouabain+induces+apoptotic+cell+death+in+type+I+spiral+ganglion+neurons,+but+not+type+II+neurons.">Ouabain induces apoptotic cell death in type I spiral ganglion neurons, but not type II neurons.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 6, 63-74 (2005).</li><li>Lang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+mouse+embryonic+stem+cells+into+the+cochlea+of+an+auditory-neuropathy+animal+model:+effects+of+timing+after+injury.">Transplantation of mouse embryonic stem cells into the cochlea of an auditory-neuropathy animal model: effects of timing after injury.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 9, 225-240 (2008).</li><li>Stevens, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heptanol+application+to+the+mouse+round+window:+a+model+for+studying+cochlear+lateral+wall+regeneration.">Heptanol application to the mouse round window: a model for studying cochlear lateral wall regeneration.</a> Otolaryngology--head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 150, 659-665 (2014).</li><li>Zheng, Q. Y., Johnson, K. R., Erway, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+hearing+in+80+inbred+strains+of+mice+by+ABR+threshold+analyses.">Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses.</a> Hearing research. 130, 94-107 (1999).</li><li>Hequembourg, S., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiral+ligament+pathology:+a+major+aspect+of+age-related+cochlear+degeneration+in+C57BL/6+mice.">Spiral ligament pathology: a major aspect of age-related cochlear degeneration in C57BL/6 mice.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 2, 118-129 (2001).</li><li>Ohlemiller, K. K., Gagnon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical-to-basal+gradients+in+age-related+cochlear+degeneration+and+their+relationship+to+'primary'+loss+of+cochlear+neurons.">Apical-to-basal gradients in age-related cochlear degeneration and their relationship to 'primary' loss of cochlear neurons.</a> The Journal of comparative neurology. 479, 103-116 (2004).</li><li>Tadros, S. F., D'Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-related+genes+change+their+expression+with+age+and+hearing+loss+in+the+mouse+cochlea.">Apoptosis-related genes change their expression with age and hearing loss in the mouse cochlea.</a> Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 13, 1303-1321 (2008).</li><li>Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+to+select+genes+from+RMA+normalized+microarray+data+using+functional+hearing+tests+in+aging+mice.">Novel approach to select genes from RMA normalized microarray data using functional hearing tests in aging mice.</a> Journal of neuroscience. 171, 279-287 (2008).</li><li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+hearing+loss:+GABA,+nicotinic+acetylcholine+and+NMDA+receptor+expression+changes+in+spiral+ganglion+neurons+of+the+mouse.">Age-related hearing loss: GABA, nicotinic acetylcholine and NMDA receptor expression changes in spiral ganglion neurons of the mouse.</a> Neuroscience. 259, 184-193 (2014).</li><li>Borkholder, D. A., Zhu, X., Frisina, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+membrane+intracochlear+drug+delivery+enhanced+by+induced+advection.">Round window membrane intracochlear drug delivery enhanced by induced advection.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 174, 171-176 (2014).</li><li>Tadros, S. F., D'Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+changes+for+antioxidants+pathways+in+the+mouse+cochlea:+relations+to+age-related+hearing+deficits.">Gene expression changes for antioxidants pathways in the mouse cochlea: relations to age-related hearing deficits.</a> PloS one. 9, e90279 (2014).</li><li>Lang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+up-regulation+and+glial+cell+proliferation+following+degeneration+of+spiral+ganglion+neurons+in+the+adult+mouse+inner+ear.">Sox2 up-regulation and glial cell proliferation following degeneration of spiral ganglion neurons in the adult mouse inner ear.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 12, 151-171 (2011).</li></ol>

לא מתחרה אינטרסים כלכליים. יש המחברים אין לחשוף.

תוצאות הפרוטוקול והנציג שתוארו לעיל התקבלו במודל של עכברי CBA / CaJ כולל שני המינים. זן טהור זה מבוסס היטב כסטנדרט &quot;שמיעה טובה&quot; ומודל &quot;הזדקנות נורמלית&quot; בשמיעת מחקר. 16-23 תיאור של שימוש בפרוטוקול זה במודלים של יונקים אחרים הוא מעבר להיקף של הטקסט הזה. הקורא צריך לציין, עם זאת, כי יישום טכניקת RWN מציעה מספר יתרונות ללימוד האוזן הפנימית היונקים. מבין אלה, הבולטים ביותר הוא שזה ימנע שיבוש ישיר של המבנה האנטומי העדין והדרגתיות ביוכימיים שקיימים בתוך הקירות של הקפסולה otic. יש נהלים כגון cochleostomy וההשתלה של משאבות עירוי הנטייה להפר ישירות מבני אוזן פנימיים מובילים למשמרות סף קבועות; עובדה שיש לקחת בחשבון בעת ​​ניתוח תוצאות. שיבוש של מבני קיר לרוחב שבלול ידי metho פולשניתDS יכול גם להגביל את השימוש בסוכני ototoxic כגון פורוסמיד או heptanol, שספציפי אזור של השפעה מוגבלת למיקום זה. 15,24 גישות לא פולשנית אלטרנטיביות כגון הזרקת טרנס-התוף והזרקת parenteral כבר סובלים מתוצאות ולא אמינות / או רעילות מערכתית למודל החיה. שיטת יישום זה הוכיחה את עצמו להימנע משני חסרונות אלה, להשגת רמה של עקביות מתקרבת לזה של השיטות פולשניות יותר שנדונו לעיל. יתרונות נוספים של שיטה זו כוללים היא התחולה רחבה שלה למספר מודלים של בעלי חיים וההיתכנות לשלב תשתיות מעבדה קיימות. לגבי האחרון, אין חומרים כימיים או כימיקלים מיוחדים נדרשים מלבד הסוכנים, ההרדמה ומשככי כאבי ototoxic בחרו. סוכני ototoxic מנוצלים בדרך כלל בריכוז קבוע ומעורבים במספיק נפח גדול של פתרון (5 מיליליטר) ליימשכו זמן רב לשקולing כל יישום משתמש כ -10 μl (בעכברים). לפיכך, לאחר הרכש הראשוני של ציוד ומכשירים, חוקרים חופשיים יחסית מהכנת פתרון זמן רב או החלפה תכופה של חומרים. טכניקה זו מציעה גם הפחתה בזמן ניתוח, אשר עשוי להיות משמעותיים בהשוואה להליכים הכרוכים בהשתלה של משאבות עירוי perilymphatic או cochleostomies. עם הגיע לרמה של מיומנות טכנית, זמן הסיום הממוצע שלנו מחתך ראשוני לסגירה היה בדרך כלל 20 דקות לשעה 1.5 תלוי באורך של החשיפה הרצויה לסוכן ototoxic. שלושה או ארבעה ניתוחים עשויים בקלות להסתיים ביום אחד, ומאפשרים להתייעלות ופוטנציאל גבוה להשגת תוצאות מוצלחות. כפי שתואר לעיל, טכניקה זו יכולה גם להיות מיושמת בקלות למגוון רחב של מודלים של מכרסמים הכוללים עכברים, חולדות, חזירי ים וגרבילים. מגבלות של שיטה זו מרוכזות עלבינוני עקומה למידה תלולה דרושה כדי לשלוט בה וירידה בתוצאות הצפויות עד למיומנות טכנית. כפי שנדונו ביתר פירוט בהמשך, טעויות קטנות בגישה הניתוחית או ההדמיה מספקת של התחום כירורגית כמעט תמיד יובילו לתוצאה גרועה. ממצאים עדינים שטירון עלול להיכשל להכיר, כגון גישה תת מילימטר עבה בועת אוויר חסימה של סוכן הקרום העגול חלון או נוזל ביניים דילול הסוכן, לקחת את הזמן כדי להעריך ולפתח את כישורי פסיכו נדרשו לתקן אותם. עם זאת, עם ביצועים חוזרים ונשנים של ההליך המכשולים הללו בקלות להתגבר ומהווים אתגר טכני פחות מרתיע לחוקרים מחלק מהשיטות חודרניות האמורות. לבסוף, טכניקה זו קשורה למגבלה ביחס שפציעת שבלול יכולה להיגרם רק בנקודה אחת בזמן במהלך החשיפה כירורגית. זה ניתן להתגבר במידה מסוימת, על ידי מילוי RWN עם ספוג ג&#39;לטין נספג ספוג בסוכן כפי שתואר על ידי Heydt et al. 10 ספוג ג&#39;לטין נספג יהיה ממחזר לאורך זמן, אך יכול לאפשר לתקופה ארוכה יותר מהחשיפה הוא בר השגה באמצעות יישום של תמיסה מימית לבד. על מנת לממש את חוקר היתרונות מלאים של טכניקה זו ולהימנע מכל מלכודות, זה קריטי להכיר את שני אלמנטים קריטיים של טכניקה זו: 1) לשמור על ההדמיה של חלל האוזן התיכון וRWN באופן עקבי; ו 2) יכולת לשמור תחום כירורגית חופשי של נוזל ו / או דם ביניים. בהשגת לשעבר של אלה, חשיבותו של ראש-בעל נכון לא יכולה להיות הדגישה-על. קיבעון מאובטח של הראש של החיה מבטיח נוף יציב מתחת למיקרוסקופ; החשיבות שהופכת להיות ברורה בקלות כאשר מכשור עדין בצורה קיצונית משנה את מיקומם של מבנים בהגדלה. שעות טובותבעל EAD שניתן לסובב על הציר מקורי, הזנב של החיה גם מאפשר שינויים דינמיים חשובים בקו של החוקר של אתר. לעתים קרובות, כמה מילימטרים של סיבוב על ציר זה יכול להיות ההבדל בין ההדמיה של RWN ויזואליזציה של רק עצם כמוסת otic. היכולת לשנות את התצוגה כל הזמן היא גם בעל חשיבות עליונה להבטחת נוזל ביניים הוסר כראוי ממעמקי הנישה וגם כי סוכן ototoxic הוסר באופן מלא בין יישומים כפי שנדון בחלק 5. בניסיון, הדם, ההתעבות, או נוזל ביניים שלנו שנכנס לחלל האוזן התיכון היכולת להתערב בניסוי כולו. הדבר אינו מפתיע, שכן הכמות הקטנה של סוכן ototoxic להחיל חלון העגול (~ 10 μl) בקלות יכולה להיות מדוללת על ידי באים במגע עם אף כמויות קטנות של נוזל זר. מסיבה זו, לנתיחה כירורגית מוקפדת, פתיחה וכלת טיפין טיפין של הבולה התוף וpreservat זהירהיון של עורק stapedial הוא בבחינת תוצאות ניסוי מוצלחות. אם השלבים הקריטיים מעל הם נצפו ותוצאות צפויות עדיין לא הושגו, פתרון בעיות צריכה להתחיל. מניסיוננו, הוא לעתים קרובות מועיל לבצע וריאציות משפטם של שני אלמנטים פרוצדורליים. הראשון הוא לשנות את התדירות שבה סוכן ototoxic מתחדש בחלון העגול. בהתאם לסוכן בשימוש, הכולל זמן חשיפה הוא בין 30 דקות ושעה 1, עם הפתילה מלאה והחלפה הבאה של הסוכן כל 10 דקות. אם חשיפה לתקופות קצרות יותר, להגדיל את החשיפה כוללת עשוי לאפשר הסוכן יותר זמן כדי לפזר על פני חלון הקרום העגול. חשיפה וreplenishing נוספים עשויות גם לעזור כדי למנוע דילול רצוי של סוכן ototoxic על ידי דם, התעבות, או ביניים כפי שפורטו לעיל. זהירות יש לשמור בעת שימוש בגישה זו, עם זאת, כפי שהוא נוטה להגדיל את הסיכון של היסח דעתly נפגע עורק stapedial ו / או החדרת נוזל ביניים לRWN. טכניקה זו היא משמעותית במה שהיא מציעה לחקירות של פיזיולוגיה ופתופיזיולוגיה שבלול. טכניקה זעיר פולשנית מאפשרת מחקר מפורט של תהליכים ביוכימיים עדינים והייתה בבחינת בקידום המחקר שלנו במטרה להעריך פוטנציאל התחדשות שבלול. 12,24 גישה ניתוחית זו וחשיפה גם הוא לשחזר פני מגוון רחב של טכניקות שלוחה אחרות, ותוצאות מוצלחות באמצעות זה שיטה דווחו במחקרים של השתלת תאי גזע שבלול. 14 רבים נותר עלומה על השבלול, עם זאת, טכניקה זו, יחד עם הארסנל הרחב יותר זמין לחוקרים, תסייע בצמצום פער הידע הזה.

חוקרים השתמשו במגוון רחב של מודלים של בעלי חיים כדי ללמוד את התפקוד התקין של מערכת השמיעה, כמו גם את הפתופיזיולוגיה של אובדן שמיעה. מודלים אלה הם גם מאוד שימושיים לביצוע מחקרי התערבות נגד תהליכים פתולוגיים שונים ומשמשים כבסיס ליישומי translational בבני אדם. עבור רוב המחקר מעורב השבלול והמסלולים השמיעתיים הקשורים אליו, במידה מסוימת של נזק או שיבוש חייבת להיות הציגה את המערכת. לעתים קרובות, הנזק מכוון בכוונה כדי ליצור נגע ספציפי, המאפשר לחוקרים לבחון את ההשפעה של נגע שעל תפקוד תקין, כמו גם את יכולת השבלול להתאושש מזה. בעת בחירת דגם מסוים של בעלי חיים ו / או טכניקה (ים) להחדרת נזק, מספר גורמים יש לקחת בחשבון על מנת להשיג את התוצאות הטובות ביותר האפשרית. מודלים של בעלי חיים שונים עשויים להגיב באופן שונה להתערבויות, ואילו השפעות הישירות ועקיפות של טכניקה יכולות להיותלחלוטין מזיק לתוצאה הרצויה. ברוב המקרים, פרוטוקול הנזק באוזן הפנימי האידיאלי יהיה למנוע רעילות מערכתית, במהירות ובאופן אמין לייצר נזק, ליצור נגע מדויק ועקבי, ולהיות לשרוד כדי לאפשר מחקר נוסף של שינויים תפקודיים, תאיים ומולקולריים. באופן אידיאלי, שיטות אלה היו גם לשמר את שיפועי מייקרו-ארכיטקטורה ואלקטרוכימיים העדינים של השבלול למידה המרבית האפשרית. עד כה, חוקרים הצליחו בהקמת מספר הטכניקות כדי לגרום לפגיעה באוזן פנימית. רוב אלה כרוכים חושפים את השבלול לסוכן ototoxic או מערכתי או באמצעות גישה ניתוחית. טכניקות כוללות הזרקת parenteral, הזרקה תוך הצפק, הזרקת טרנס-התוף, הזרקת שק endolymphatic, וcochleostomy עם זלוף perilymphatic. טכניקות אלה היו בשימוש כדי להציג מגוון רחב של סוכני ototoxic, כגון פורוסמיד, גנטמיצין, ouabain, וheptanol. 1-5בעוד מוצלח ביצירת נגעי שבלול ספציפיים, הטכניקות לעיל גם הכירו את מגבלות. זריקות מערכתיות יכולות להיות רעילות מאוד לבעלי החיים ועשויות להיות קשורה עם עלבונות שבלול לא מכוון ותוצאות לא עקביות. החסרון האחרון גם נקשר עם זריקות טרנס-התוף. טכניקות כגון cochleostomy וזלוף perilymphatic, בעוד מסוגל גרימת נגעים מהירים ואמינים ביותר, הן באופן ישיר פולשנית למבנה אוזן פנימי ותפקוד. רבים מהגישות הכירורגיות קשורים גם עם רמה גבוהה של קושי טכני ועשויים לדרוש עוזבים חפצים זרים בבעלי החיים, כגון infuser micropump. 2-4,6-8 אין טכניקה אחת היא ללא חסרונות, וחוקרים צריכים לבחור שיטות בזהירות כדי שיתאימו לצרכימים הניסיוניים שלהם. כאן אנו מתארים, בפירוט, טכניקת יישום חלון הנישה העגולה (RWN) למסירה אקטואלית של סוכני ototoxic בעכברים בוגרים. אינטרנט אלחוטיתיארו ראשון על ידי אח הוזמן אל בשנת 1998 בזמן לימודי ההשפעה של גנטמיצין על ניוון תא שיער חושי במודל עופות, טכניקה זו נמצאה מסוגלת לייצר נגעים באופן משמעותי יותר אמין יותר מאשר יישום גנטמיצין מערכתי, תוך הימנעות הרעילויות כרוכות בכך. 9 מאז, מספר חוקרים אחרים, כוללים המעבדה שלנו, ניצל את הטכניקה הזו להצלחה גדולה. בשנת 2004, Heydt et al. התאים אותו למודל של עכברים ותיארו יכולת משופרת לשלוט בגודל נגע על ידי מילוי RWN עם ספוג ג&#39;לטין נספג ספוג בריכוזים שונים של גנטמיצין. 10 Palmgren et al., בשנת 2010, חקרו את השפעות ototoxic של בטא-bungarotoxin, חזק אלמנט בארס של הטיוואנית התאגדו ארגז, על ידי יישום צורה מימית שלו לRWN של חולדות מבוגרות. 11 בנוסף, מספר המחקרים קודמים מהמעבדה שלנו ניצל את גישת חלון העגולה כדי לחקור את ההשפעות של ototoxic furosemidדואר, ouabain, וheptanol. 5,6,12-15 תוצאות של מחקרים אלה הוכיחו את החשיבות של נוזל שבלול והומאוסטזיס יון בשמיעה נורמלית, גילה יכולת שגשוג תאים בגנגליון הספירלה וקיר לרוחב שבלול, וקדם את ההבנה שלנו הקשורות לגיל אובדן שמיעה. הגישה הבאה כרוכה בניתוח בגישה לאוזן התיכונה דרך חתך postauricular וunroofing החלקי של הבולה התוף הגרמית. זה מאפשר לחשיפה מצוינת של RWN והקרום שסוכן ototoxic נבחר ניתן להחיל באופן ישיר. הסוכן הנוזלי אז בריכות בחלולות כמו הכוס-של RWN (או לאט מנקז מנישא ספוג ג&#39;לטין רווי נספג ארוז בתוך RWN) ומפזר דרך הממברנה החלון העגולה לתוך חלל perilymphatic של פרוזדור השבלול. אין cochleostomy הישיר נעשה בגישה זו. יתרונות של שיטה זו כוללים שימור של אוזן הפנימית מייקרו-ארכיטקטורה, הימנעותרעילות מערכתית, קצבה של אוזן שליטת הפנים-חיה, הופעה מהירה של השפעה, ניוון סלקטיבית בסוגים מסוימים של תאי שבלול (למשל., סוג אני ספירלה נוירונים גנגליון עם חשיפת ouabain וסוג השבלול השני fibrocytes הנגרם על ידי הטיפול בheptanol), ותוצאות לשחזור / אמינות. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת עם כמה שינויים בין מיני מכרסמים אחרים, כוללים חולדות, חזירי ים, וגרבילים. חסרונות כוללים עקומה תלולה טכנית למידה וההגבלה היחסית של עלבון ototoxic שמוגבלת לנקודה אחת בזמן.

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">1-Heptanol 98%</td>
			<td rowspan="2">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2805&#160;</td>
			<td rowspan="2"><a>PubChem Substance ID 24895536</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250ML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset Injectable&#160;</td>
			<td rowspan="2">Patterson Veterinary</td>
			<td>07-803-6637&#160;</td>
			<td>Concentrate 100mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Ketamine HCl)</td>
			<td>10ml</td>
			<td>Schedule CIII controlled substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anased Injectable</td>
			<td rowspan="2">Lloyd Laboratories</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td rowspan="2">Concentrate 20mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Xylazine)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenex Injectable&#160;</td>
			<td rowspan="2">Patterson Veterinary</td>
			<td>07-850-2280&#160;</td>
			<td>Concentrate 0.3mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Buprenorphine HCl)</td>
			<td>5 ampules per box</td>
			<td>Schedule CIII controlled substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Skin Prep Solution</td>
			<td rowspan="2">Medline</td>
			<td><a href="http://www.medline.com/sku/item/MDPMDS093941;ecomsessionid=1UZWKxhkYkuy9vK2NXBaBA__">MDS093941&#160;</a></td>
			<td rowspan="2">1 Quart screw top bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Povidone-Iodine)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sterile Saline</td>
			<td>Variable</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For mixing solutions and injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table of Equipment, Surgical Instruments, and Specific Techniques</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>32192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controlled Acoustics Environment Sound Booth</td>
			<td>Industrial Acoustics Company</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Surgical Head Holder</td>
			<td>Custom Made &#8211;&#160;</td>
			<td rowspan="2">Please see Figure 3</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical University of South Carolina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Neck Soft-Tissue Retractor (Wire Speculum, Titanium) 1.75inch</td>
			<td rowspan="3">World Precision Instruments</td>
			<td rowspan="3">555801L</td>
			<td>Maximum spread 20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedded in disposable putty to affix dynamically to head holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90N Dental Belt Driven Hand Drill&#160;</td>
			<td>Emesco</td>
			<td>N/A (Vintage Item)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle Size6</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>MEDC-011990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">#15c Stainless Steel Surgical Scalpel Blade&#160;</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td rowspan="2">SKU: 097-7215</td>
			<td rowspan="2">50 Blades/Box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Via ACE Surgical Supply Code</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Tip Jewelers Forceps&#160;</td>
			<td>Bernell</td>
			<td>MIL17304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors Curved</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="https://www.medline.com/sku/item/MDPDYND04026;ecomsessionid=ozXzkfIx-tj0MIi8FkGQ0A__">DYND04026&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors Straight</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="http://www.medline.com/sku/item/MDPDYND04025;ecomsessionid=+43JREOby+Mfz6IIgoSg5A__">DYND04025&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stevens Tenotomy Scissors Straight</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="http://www.medline.com/sku/item/MDPMDG3222111">MDG3222111&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosen Ear Needle Straight Shaft, Lightly Curved Tip</td>
			<td>MytaMed</td>
			<td>Item# 6.56.00</td>
			<td>Figure 1 demonstrates angled shaft picks. This was later substituted for the Rosen picks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosen Ear Needle Straight Shaft, Strongly Curved Tip</td>
			<td>MytaMed</td>
			<td>Item# 6.56.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Kimwipes Delicate Task Wipers&#160;</td>
			<td rowspan="2">Kimtech Science</td>
			<td rowspan="2">CODE 34155&#160;</td>
			<td rowspan="2">White, Size 4.4x8.4 Inch. Cut to triangles and rolled into fine tip wicks.</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>House Ear Curette, 6&#8221; shaft, light angle</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="https://www.medline.com/sku/item/MDPMDG0396486">MDG0396486&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam (absorbable gelatin sponge) Size 100</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="https://www.medline.com/sku/item/MDPIIS34201">IIS34201&#160;</a></td>
			<td>Substitutions may be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton pellets #3 4mm</td>
			<td>Richmond</td>
			<td>Manufacturer Code 100108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroSurgical Unit 100 E M/M</td>
			<td>Elmed</td>
			<td>List No. 52-5770</td>
			<td>Bipolar and Monopolar Capable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc U-100 Insulin Syringe 28G, 0.5&#8221; length needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>Product Number: 329410</td>
			<td>Optional for delivery of Ototoxic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G, blunt tip, 1&#8221; length needle</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>Product Code 8881202397</td>
			<td>For controlled delivery of Ototoxic agent with less risk of damaging stapedial artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Mask</td>
			<td>U-line</td>
			<td>S-10478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exam Grade Nitrile Surgical Gloves</td>
			<td>U-line</td>
			<td><a href="http://www.uline.com/Product/Detail/S-12549/Nitrile-Gloves/Nitrile-Exam-Gloves-Powder-Free">S-12549</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Hair Clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Multiple models may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Nylon black monofilament suture on PC-1&#160;13mm 3/8 circle needle</td>
			<td>Ethilon</td>
			<td>1855G</td>
			<td>Substitutions may be made.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Instant Sealing Sterilization Pouch</td>
			<td rowspan="2">Fisher</td>
			<td rowspan="2">01-812054</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Dry Sterilizer</td>
			<td rowspan="3">ROBOZ</td>
			<td rowspan="3">Germinator TM 500</td>
			<td rowspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mouse round-window approach for ototoxic agent delivery: a rapid and reliable technique for inducing cochlear cell degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

במחקר שנערך לאחרונה על ידי סטיבנס et al ניצול הפרוטוקול לעיל, עכברי CBA / CaJ מבוגרים משני המינים נחשפו באמצעות חלון דיפוזיה העגולה לheptanol. 15 Heptanol הוא בלתי-מצמד צומת פער ידוע לייצר ממוקדים, פגיעת ההשבה לתאים של קיר לרוחב שבלול. מטרת המחקר הייתה לייצר מודל אמין לנזק שבלול ממוקד, המאפשר לחקירה של התחדשות לאחר ניתוח של כל גורמים שנפגעו. ספי שמיעה ניתוחי פוסט טרום ניתוחיים ושימשו כנקודת קצה פונקציונלית. מיקרוסקופית וטכניקות צביעת immunohistochemical שמשו ללמוד שינויים מורפולוגיים. עליות משמעותיות בסף ABR נצפו בעכברים שטופל heptanol (איור 9). בעלי החיים שליטת קבלת ניתוח דמה, עם משלוח של תמיסת מלח במקום heptanol, לא הפגינו משמרות סף משמעותיות בכל תדרים נבדקים. Immunostaining נגד תיקון כלפי פניםערוץ אשלגן (Kir) 4.1 שימשו כשיטת עקיפה להמחשת נזק / התאוששות של מבני שבלול. זה הוכיח הבדלים מאוד לשחזור בין אוזני טיפול ושליטה. עוצמת צביעה בסך הכל הייתה במידה ניכרת ירד בvascularis stria (STV) ובין fibrocytes של רצועת הספירלה (SLF) 1-3 ימים לאחר חשיפת heptanol, המציין כמויות גדולות של נזק ממוקד לאזורים אלה. חלה ירידה מסוימת בעוצמת 4.1 צביעת קיר, באזורים מהסוג השני והסוג הרביעי SLFs (איור 10) וSTV (איור 11). עדות לשלמות שיבשו גרעינית ועיבוי כרומוזומליות / שלפוחיות אופייניות לאפופטוזיס הסלולרי נתפסה גם על counterstains הגרעיני באזורים אלה שבלול (איור 10). אזורי Vacuolated של קיר, 4.1 מכתימים נפתרו במידה ניכרת ב7 ימים ונעדרו לחלוטין בגיל 14 ימים. כאשר 4.1 עוצמת צביעת הקיר, הייתה לכמת בתחומי STV, אוזניים טופלו הפגינו initiשוקת אל ואחרי שינוי משמעותי (p &lt;0.05) חזרה לכיוון עוצמת שליטה 7 ימים לאחר חשיפת heptanol (איור 12). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig1.jpg" /> מכשיר 1. איור להגדיר. תיאור של הגדרה טרום ניתוחית של מכשור. כל הציוד צריך להיות נגיש בקלות בתחום ניתוח סטרילי. מכשור טיפוסי כולל 2 מספריים חדים לנתיחה, 2-3 ישר ו / או מלקחיים של Jeweler קצה המעוגל עם מגרדות אוזן, מרים otologic פיר מעוגל (מאוחר יותר הוחלף עם רוזן מרים - לא מוצג), ויחידת אלקטרו-כויה עם המלקחיים של Jeweler קצה המעוגל בסדר כיסוי ראש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img aLT = &quot;איור 2&quot; src = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 53,131 / 53131fig2.jpg&quot; /&gt; איור 2. אספקה ​​כירורגי. אספקה ​​נוסף לשמירה על איכות סביבת RWN. מגזרות labwipe מעוקרות להיווצרות פתיל נייר (משמאל), נייר בנוי היטב פתילות עשויים ממגבונים מעוקרים מעבדה (במרכז), ו -4 כדורי כותנה מ&quot;מ (מימין) משמש כדי לנגב את נוזלים עודפים והצפת דם בחלון הנישה העגולה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig3.jpg" /> איור 3. בעל ראש בעלי חיים. תמונה המתארת ​​את בעל הראש ובלוק נשיכה. החורים בבלוק להתאים ולאבטח את השיניים החותכות העליונות המרכזיות. מהדק מתהדק בעדינות על חוטם הגב כדי לאבטח את בעלי החיים במקום. שימוש בבעל ראש הוא קריטי עבור outc כירורגית מוצלחשת. באופן אידיאלי, זה צריך להיות מסוגל לסובב על הציר מקורי, הזנב של החיה כדי לייעל צפיות כירורגית של הבולה במהלך ההליך. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig4.jpg" /> איור 4. מ &#39;Cleidomastoideus.. גרף סכמטי המתאר את האנטומיה הבסיסית של שרירי צוואר רחם המכרסמים והקשר שלה עם וריד הצוואר החיצוני. שריר cleidomastoideus הוא השריר הכי המזוהה בקלות בגישה הניתוחית. שחרורו של fascia העוטף אחרי נסיגה אחורית / גב של גוף השריר ינחה נתיחה כירורגית כלפי הבולה התוף (העיגול שחור). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה באל</a>גרסת arger של נתון זה. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig5.jpg" /> איור 5. אזור חשיפה כירורגית. מתאר את החשיפה לאחר הנתיחה דרך שכבות שומן תת עורי עורי ו. ציוני דרך מבניות של פתק כוללים סניף של XI עצב גולגולת שמעל שריר cleidomastoideus (), וריד הצוואר החיצוני (B), ורקמה חשופה הפרוטיד (C). סניף XI עצב הגולגולת קשור לעתים קרובות עם כלי שיט קטנים וחייב להיות מחולק לפני ההליך. מימין לשמאל בתמונה מתאימה לציר מקורי, הזנב של החיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig6.jpg" /> איור 6. חשיפת buLLA. חשיפה של הבולה התוף לאחר נסיגה של cleidomastoideus ומבנים סמוכים. ציוני דרך בולטים ניתן למנות גוף שריר cleidomastoideus () בא לידי ביטוי בדיעבד / dorsally, עצב הפנים (ב &#39;), והכיפה המבריקה של periosteum התוף הבולה (C). כמו כן, שים לב לכניסה של שריר sternomastoideus בהיבט הזנב השמאלי של הבולה התוף (הכוכבית). נוכחותו של עצב הפנים בהיבט הגב ומקורי של הבולה היא ציון דרך קריטית לזיהוי נכון של הבולה. מימין לשמאל בתמונה מתאימה לציר מקורי, הזנב של החיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig7.jpg" /> איור 7. חשיפת חלון נישה עגולה אני. תמונה המתארת ​​את tympaהבולה NIC נחשפה במלואו לאחר הנתיחה של periosteum שמעליה. חור הטייס ממוקם הטוב ביותר בנקודה באמצע הדרך בין קצה הזנב של כיפת הבולה וקו עדין אטום דמיין בתוך ההיבט מקורי הבולה (המייצגת את התוף). חור טייס שני, סמוך עשוי להקל בלתי קירוי קל יותר של עצם הבולה. הימנעות מקידוח עמוק יש לנקוט כדי לא לפגוע בעורק stapedial הבסיסי. האובייקט בחלק התחתון של התמונה הכהה, המתכתי הוא מפשק רקמות רכות טיטניום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig8.jpg" /> איור 8. חשיפת חלון עגול נישה השנייה. בולה הסירה את מכסת התוף עם חשיפה של הנישה העגולה חלון (חץ) ועורק stapedial (מבנה אדום1-2 מ&quot;מ לרוחב הנישה) כפי שנצפה בהגדלה 20x. הנישה לעתים קרובות מטילה תחובה מתחת לזווית החדה שהוקמה על ידי כיפת הבולה עם הקפסולה otic בהיבט הזנב של הכיפה. זה הכרחי כי הדמיה מלאה של הנישה תושג לפני היישום של סוכן ototoxic או הפתילה. הסרת עצם מופרזת במהלך היא פתחה גם יש להימנע כנוזל / דם ביניים נטה להציף את החלל כאשר חורים גדולים נוצרו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig9.jpg" /> איור 9. נציגי תוצאות -. ספים (ABR) הפסד Heptanol מושרה שמיעה והתאוששות ממוצעות הבדיקה ABR (dB SPL) זממו כפונקציה של PIP הטוןתֶדֶר. מדידות מקובצים לפי מראש חשיפה (שחורה-בקרה) ויום שלאחר ניתוח (POD) 1, 7, ו -14 (אדום). ברים שגיאה מייצגים SEM. איור מחדש זמם מאל סטיבנס et. 2014. 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 10" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig10.jpg" /> איור 10. נציגי תוצאות - ממוקדות נזק שבלול לאחר חשיפת חלק heptanol I. שינויים באשלגן פנימי מיישר (Kir) ערוץ 4.1 צביעה בתוך vascularis stria (STV) של אוזניים שטופלו בheptanol ולשלוט אוזניים. () רגיל Kir 4.1 מכתים אופייניים לאוזני שליטה עם זיקה חזקה לתא strial Kir 4.1 (ירוק). אוזן (ב) טיפול בPOD1. אזורי vacuolized הגדולים של decrזיקה הקלה Kir 4.1 נתפסות בתוך STV (ראשי חץ), יחד עם ירידה הכוללת בעצמה 4.1 מכתימה STV Kir. גרעינים counterstained עם יוד propidium (אדום) (ב). בר סולם = 15 מיקרומטר. איור מחדש זמם מסטיבנס et al, 2014 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig10large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 11" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig11.jpg" /> איור 11. נציגי תוצאות - ממוקדות נזק שבלול לאחר חשיפת חלק heptanol השנייה שינויים ברצועת הספירלה (SL) של אוזן טופלה heptanol לעומת שליטת אוזן.. הכתמה () רגיל Kir 4.1 (ירוק) בתוך SL הטיפוסי של אוזן שליטה בשנייה fibrocytes סוג המופיע נורמלי ספירלת רצועה (II). (ב) לא Heptanolאוזן reated עם ירידה ניכר בעוצמת 4.1 צביעת קיר, באזור של השני fibrocytes סוג ספירלת רצועה, שיבוש גרעיני ועיבוי כרומוזומליות / שלפוחיות בקנה אחד עם אפופטוזיס (חיצים). גרעינים counterstained עם יוד propidium (אדום). בר סולם = 15 מיקרומטר. איור מחדש זמם מסטיבנס et al, 2014 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig11large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 12" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig12.jpg" /> 12. תוצאות איור נציג -. שחזור של עוצמת מכתים שבלול בעקבות חשיפת heptanol ממוצעת בהירות היחסית של קיר, 4.1 מכתים זממה כפונקציה של יום לאחר החשיפה. בהירות יחסית תחושב כקיר, 4.1 בעוצמה רעיוני תחת מיקרוסקופ confocal בפינוק heptanolאוזני אד נלקחו כאחוז מאותו הדבר באוזני שליטה. נתונים POD14-28 הערה הם אספו כנקודה אחת על העקומה. חוגים מוצקים מייצגים ערכים ממוצעים ואילו ברים שגיאה מייצגים סטיית התקן של הממוצע. התאוששות משמעותית של בהירות ביחס הודגמה בין 7 POD ומועדים מאוחרים יותר (עמ &#39;מבחן t של הסטודנט &lt;0.05, כוכבית). איור מחדש זמם מסטיבנס et al., 2014 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig12large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration at JoVE.com

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

גישת העכבר עגול החלון לototoxic סוכן משלוח: מהיר וטכניקה אמינה גרימת ניוון תא שבלול

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

the-mouse-round-window-approach-for-ototoxic-agent-delivery-rapid

Research

JoVE Journal

Medicine

17.0K Views.  Medical University of South Carolina. Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible. 

Video: The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

מבחן הלחץ החברתי טרייר פרוטוקול גרימת לחץ פסיכולוגי

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time and temperature restrictions, technical sophistication, and cost of reagents, in particular monoclonal antibodies to measure CD4 on blood cells, the only currently acceptable method. A commonly used cost-saving and time-saving laboratory strategy is to calculate, rather than measure certain blood values. For example, LDL levels are calculated using the measured levels of total cholesterol, HDL, and triglycerides1. Thus, identification of cell-free correlates that directly regulate the number of CD4+ T cells could provide an accurate method for calculating CD4 counts due to the physiological relevance of the correlates.
The number of stem cells that enter blood and are destined to become circulating CD4+ T cells is determined by the chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 due to their influence on locomotion2. The process of stem cell locomotion into blood is additionally regulated by cell surface human leukocyte elastase (HLECS) and the HLECS-reactive active &alpha;1proteinase inhibitor (&alpha;1PI, &alpha;1antitrypsin, SerpinA1)3. In HIV-1 disease, &alpha;1PI is inactivated due to disease processes 4. In the early asymptomatic categories of HIV-1 disease, active &alpha;1PI was found to be below normal in 100% of untreated HIV-1 patients (median=12 &mu;M, and to achieve normal levels during the symptomatic categories4, 5. This pattern has been attributed to immune inactivation, not to insufficient synthesis, proteolytic inactivation, or oxygenation. We observed that in HIV-1 subjects with &gt;220 CD4 cells/&mu;l, CD4 counts were correlated with serum levels of active &alpha;1PI (r2=0.93, p&lt;0.0001, n=26) and inactive &alpha;1PI (r2=0.91, p&lt;0.0001, n=26) 5. Administration of &alpha;1PI to HIV-1 infected and uninfected subjects resulted in dramatic increases in CD4 counts suggesting &alpha;1PI participates in regulating the number of CD4+ T cells in blood 3.
With stimulation, whole saliva contains sufficient serous exudate (plasma containing proteinaceous material that passes through blood vessel walls into saliva) to allow measurement of active &alpha;1PI and the correlation of this measurement is evidence that it is an accurate method for calculating CD4 counts. Briefly, sialogogues such as chewing gum or citric acid stimulate the exudation of serum into whole mouth saliva. After stimulating serum exudation, the activity of serum &alpha;1PI in saliva is measured by its capacity to inhibit elastase activity. Porcine pancreatic elastase (PPE) is a readily available inexpensive source of elastase. PPE binds to &alpha;1PI forming a one-to-one complex that prevents PPE from cleaving its specific substrates, one of which is the colorimetric peptide, succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA3NA). Incubating saliva with a saturating concentration of PPE for 10 min at room temperature allows the binding of PPE to all the active &alpha;1PI in saliva. The resulting inhibition of PPE by active &alpha;1PI can be measured by adding the PPE substrate SA3NA. (Figure 1). Although CD4 counts are measured in terms of blood volume (CD4 cells/&mu;l), the concentration of &alpha;1PI in saliva is related to the concentration of serum in saliva, not to volume of saliva since volume can vary considerably during the day and person to person6. However, virtually all the protein in saliva is due to serum content, and the protein content of saliva is measurable7. Thus, active &alpha;1PI in saliva is calculated as a ratio to saliva protein content and is termed the &alpha;1PI Index. Results presented herein demonstrate that the &alpha;1PI Index provides an accurate and precise physiologic method for calculating CD4 counts.

The &amp;#945;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

A CD4 enumeration method, the &#x03B1;-test, is described which uses whole saliva to provide rapid and accurate CD4 counts. The &alpha;-test costs pennies and eliminates the need for technical training, costly reagents such as monoclonal antibodies, instrumentation, refrigeration, transport of samples, as well as collection and handling of blood.

Α-מבחן: ראפיד נייד ללא ספירת CD4 באמצעות הרוק שלם

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

This is a compact visual description of a combination of surgical technique and device for the delivery of (gene and cell) therapies into the spinal cord. While the technique is demonstrated in the animal, the procedure is FDA-approved and currently being used for stem cell transplantation into the spinal cords of patients with ALS. While the FDA has recognized proof-of-principle data on therapeutic efficacy in highly characterized rodent models, the use of large animals is considered critical for validating the combination of a surgical procedure, a device, and the safety of a final therapy for human use. The size, anatomy, and general vulnerability of the spine and spinal cord of the swine are recognized to better model the human. Moreover, the surgical process of exposing and manipulating the spinal cord as well as closing the wound in the pig is virtually indistinguishable from the human. We believe that the healthy pig model represents a critical first step in the study of procedural safety.

Short visual description of the surgical technique and device used for the delivery of (gene and cell) therapies into the spinal cord. The technique is demonstrated in the animal but is entirely translatable and currently being used for human application.

טכניקה כירורגית למשלוח חוט שדרה של טיפולים: הפגנה של הנוהל בגטינגן Minipigs

This is a  compact visual description of a combination of surgical technique and device  for the  delivery of (gene and cell) therapies into the spinal ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

תפוקה אפיון גבוה של תאי גזע בוגרי תכנון הנדסי למשלוח גורמים טיפוליים לאסטרטגיה הגנה עצבית

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

טכניקות לעיני עיבוד מושתלים בתותב רשתית למותאם למקום Histopathological ניתוח: חלק 2 Epiretinal שתלים עם נעצי רשתית

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

A Surgical Procedure for Resecting the Mouse Rib: A Model for Large-Scale Long Bone Repair

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation of the animal for surgery, opening the thoracic body wall, exposing the desired rib from the surrounding intercostal muscles, excising the desired section of rib without inducing a pneumothorax, and closing the incisions. Compared to the bones of the appendicular skeleton, the ribs are highly accessible. In addition, no internal or external fixator is necessary since the adjacent ribs provide a natural fixation. The surgery uses commercially available supplies, is straightforward to learn, and well-tolerated by the animal. The procedure can be carried out with or without removing the surrounding periosteum, and therefore the contribution of the periosteum to repair can be assessed. Results indicate that if the periosteum is retained, robust repair occurs in 1 - 2 months. We expect that use of this protocol will stimulate research into rib repair and that the findings will facilitate the development of new ways to stimulate bone repair in other locations around the body.

The overall goal of this procedure is to successfully resect a portion of bone from the rib of a mouse. The procedure was developed as a model to study large-scale long bone repair.

הליך כירורגי לResecting צלעות העכבר: מודל לתיקון עצם ארוך בקנה מידה גדולה

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

This protocol describes the induction of an ischemia-reperfusion (IR) model on mouse ear skin using magnet clamping. Using a custom-built intravital imaging model, we study in vivo inflammatory responses post-reperfusion. The rationale behind the development of this technique is to extend the understanding of how leukocytes respond to skin IR injury.

פגיעה איסכמיה reperfusion התרמה בעור האוזן עכבר Intravital multiphoton הדמיה של המערכת החיסונית

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of inner ear gene therapy is to find a delivery method which results in consistent transduction efficiency of targeted cell types while minimizing hearing loss. In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a viable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear. The easy anatomic identification of the posterior semicircular canal, as well as minimal manipulation of the temporal bone required, make this surgical approach an attractive option for inner ear gene delivery.

In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a reliable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear.

גישה תעלת Semicircular אחורי האוזן הפנימית המסירה הגן עכבר Neonatal

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Updated Technique for Reliable, Easy, and Tolerated Transcranial Electrical Stimulation Including Transcranial Direct Current Stimulation

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive method of neuromodulation using low-intensity direct electrical currents. This method of brain stimulation presents several potential advantages compared to other techniques, as it is noninvasive, cost-effective, broadly deployable, and well-tolerated provided proper equipment and protocols are administered. Even though tDCS is apparently simple to perform, correct administration of the tDCS session, especially the electrode positioning and preparation, is vital for ensuring reproducibility and tolerability. The electrode positioning and preparation steps are traditionally also the most time consuming and error-prone. To address these challenges, modern tDCS techniques, using fixed-position headgear and pre-assembled sponge electrodes, reduce complexity and setup time while also ensuring that the electrodes are consistently placed as intended. These modern tDCS methods present advantages for research, clinic, and remote-supervised (at home) settings. This article provides a comprehensive step-by-step guide for administering a tDCS session using fixed-position headgear and pre-assembled sponge electrodes. This guide demonstrates tDCS using commonly applied montages intended for motor cortex and dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC) stimulation. As described, selection of the head size and montage-specific headgear automates electrode positioning. Fully assembled pre-saturated snap-electrodes are simply affixed to the set position snap-connectors on the headgear. The modern tDCS method is shown to reduce setup time and reduce errors for both novice and expert operators. The methods outlined in this article can be adapted to different applications of tDCS as well as other forms of transcranial electrical stimulation (tES) such as transcranial alternating current stimulation (tACS) and transcranial random noise stimulation (tRNS). However, since tES is application specific, as appropriate, any methods recipe is customized to accommodate subject, indication, environment, and outcome specific features.

When administering transcranial direct current stimulation (tDCS), reproducible electrode preparation and placement are vital for a tolerated and effective session. The purpose of this article is to demonstrate updated modern setup procedures for the administration of tDCS and related transcranial electrical stimulation techniques, such as transcranial alternating current stimulation (tACS).

טכניקה מעודכנת עבור אמין, קל, ונסבל גירוי חשמלי Transcranial כולל Transcranial גירוי נוכחי ישיר

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive method of neuromodulation using low-intensity direct electrical currents. This method of ...

A Revised Method for Inducing Secondary Lymphedema in the Hindlimb of Mice

Animal models are of paramount importance in the research of lymphedema in order to understand the pathophysiology of the disease but also to explore potential treatment options. This mouse model allows researchers to induce significant lymphedema lasting at least 8 weeks. Lymphedema is induced using a combination of fractioned radiotherapy and surgical ablation of lymphatics. This model requires that the mice get a dose of 10 Gray (Gy) radiation before and after surgery. The surgical part of the model involves ligation of three lymph vessels and extraction of two lymph nodes from the mouse hindlimb. Having access to microsurgical tools and a microscope is essential, due to the small anatomical structures of mice. The advantage of this model is that it results in statistically significant lymphedema, which provides a good basis for evaluating different treatment options. It is also a great and easily available option for microsurgical training. The limitation of this model is that the procedure can be time consuming, especially if not practiced in advance. The model results in objectively quantifiable lymphedema in mice, without causing severe morbidity and has been tested in three separate projects.

This animal model enables researchers to induce statistically significant secondary lymphedema in the hindlimb of mice, lasting at least 8 weeks. The model can be used to study the pathophysiology of lymphedema and to investigate novel treatment options.

שיטה מתוקנת לגרימת ימפתית משנית בתוך הגפיים של עכברים

Animal models are of paramount importance in the research of lymphedema in order to understand the pathophysiology of the disease but also to explore ...