מחקר זה נתמך על ידי תכנית המחקר ופיתוח לחברה של קרן המחקר הלאומית (NRF), ממומנת על ידי משרד המדע, טכנולוגיות מידע ותקשורת ותכנון עתידי (מענק מס &#39;2013M3C8A1075908).

1. הפקת DNA משורות תאי FFPE ההפניה תקן הערה: הליך זה, מיצוי DNA בוצע מהקווים התייחסות FFPE סטנדרטיים תא (HD598, HD593, HD617, HD273 וwildtype (WT)) באמצעות ערכת בידוד DNA רקמות FFPE כפי שתואר בפרוטוקול בהמשך. מיצוי DNA אוטומטי הושג על ידי ביצוע הוראות היצרן לסך בידוד DNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות microtome ולחסום FFPE המקורי, להכין ידני סעיפים טריים לפני מיצוי DNA וניתוח, בהתאם לנהלים שנקבעו. ודא שקלט המדגם לסעיף הרקמות (ים) ניתח אינו עולה על עובי כולל משולב של 10 מיקרומטר וששטחם אינו עולה על 600 מ&quot;מ 2 לסעיף אחד. </li></ol> 1.2 פרוטוקול תב&quot;ע הערה: הכרכים מוצגים בטבלה 1 מתאים למינימום הנדרש כדי לעבד 48 דגימות, וההליךמוצג הוא בהתאם להנחיות תב&quot;ע. לפני תחילת הניסוי להתיישב דגימות FFPE בדואר הצינור על ידי צנטריפוגה ב 600 XG, כדי למנוע אובדן של דגימות במהלך התכנית האוטומטית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מכשיר בידוד DNA האוטומטי ומחשב. פתח את תוכנת שליטה על הפעלה ולהכניס מגש עומס אוטומטי לאזור טעינת סיפון תב&quot;ע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר ריאגנטים לשקתות המקבילה שלהם כפי שמוצג באיור 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את 4 הדגימות (BRAF WT, BRAF V600E 50%, 5% ו 1%) במדפי ספק מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תיבות קצה בשקתות בעמודות 2 ו -3 ולבדוק את הטיפים לנוכחות של מסנן אחד או יותר לקצה, אשר לקטוע את המסלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבטיח ערבוב נכון של מאגר תמוגה ולשטוף חיץ על ידי היפוכם 3-5 פעמים ולטעון אותם לתוך השקתות המתאימות בעמודה 4 (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר היפוך לכמה פעמים או וארט קלexing, לטעון את חיץ elution, חרוזים מגנטיים, וחיץ FFPE בשקתות הקטנות בעמודה 5, משאיר חריץ 1 ריק שבו הצביע (איור 1, לוח 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון צלחת גם עמוקה 2 מיליליטר (DWP) על נושאת הצלחת (איור 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים הסופיים הבאים לפני שמתחיל לרוץ: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Uncap כל הצינורות ושקתות מגיב. ודא שקיבולת מספקת זמינה בבקבוק הפסולת הנוזלי. ודא שבקבוק הפסולת המוצק הוא ריק ומרופד בשקית Biohazard. ודא שצלחת הוצאת הקצה מרוכזת בהרכבת הפסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את המכסה הקדמי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התוכנה. פתח את קובץ NA_Prep_Main_MLSTARlet.med. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;התחל&quot;. מצב המכשיר יעבור ממצב המתנה להפעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את מספר הדגימות לריצה זו. בחר את השיטה הרצויה לטווח זה (דנ&quot;א = 0). הזן את העמדה הגבוהה כרך הראשוןUme קצה, בחירה &quot;1&quot; אם כל המגשים מלא. הזן את העמדה של קצה הנפח הסטנדרטי הראשון, בחירה &quot;1&quot; אם כל המגשים מלא. הערה: אז המכשיר יפעל באמצעות צעדים אוטומטיים ללא התערבות משתמש. עבודה מפורטת מוצגת באיור 2. ברגע שהניסוי נגמר, פסולת מגיב וטיפים מוזרקים להרכבת הפסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת DNA הגנומי המטוהר באמצעות שיטת fluorometric. הערה: דגימות DNA המכילות ריכוז מינימאלי של 3.3 ng / μl נתונים לניתוח ddPCR (סעיף 2). </li></ol> 2. DNA מוטצית פרופיל: ddPCR פרוטוקול הערה: הפרוטוקול לפרופיל ה- DNA מוטציה כולל 3 שלבים עיקריים: 1) דור אגל, 2) הגברה הקונבנציונלית PCR, 3) קריאת אגל ו4) פרופיל המוטציה בדנ&quot;א. 2.1. דור אגל הערה: Supermix ddPCR הואמומלץ לddPCR, כמו זה תערובת מכילה חומרים כימיים הנדרשים לדור אגל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע זיהום, בצע את אמצעי זהירות סטנדרטית, כגון כפפות, באמצעות מכסה המנוע נקי PCR, pipets הנקי, וצינורות נמוכים מחייב חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהריכוז המינימאלי של דגימת DNA הגנומי אנושית הוא 3.3 ng / μl. הערה: כמות ריכוז דגימת DNA מטוהר תשתנה בהתאם לניתוח של זיהוי תדירות מוטציה%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב תערובות תגובה בצלחות PCR 96-היטב. להפשיר ולאזן את מרכיבי התגובה לRT. הכן PCR תגובות על ידי שילוב של Supermix 2X ddPCR (10 μl) ו -20 פריימרים (קדימה הפוכים, 900 ננומטר) ובדיקה (250 ננומטר) עם כל דגימת DNA מטוהרת (66ng / 2 μl) לעשות עד 20 μl עם מים מזוקקים (כ לגנרטור אגל הפרוטוקול) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת לערבב ביסודיות כדי להבטיח צנטריפוגות הומוגניות ובקצרה לאסוף את התוכן בחלק התחתון של הצינור לפני מחלק. עומס 20 &amp; #181; l על המחסנית להיווצרות טיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבצע של גנרטור אגל, לפרוטוקול המומלץ של היצרן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחסנית לתוך המחזיק עם החריץ במחסנית ממוקמת בצד השמאלי העליון של בעל. הוסף 20 μl של תערובת תגובה המכילה דגימות למרכז הרחבה, ו -70 μl של גנרטור שמן לתוך הבארות התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את האטם לרוחב החלק העליון של המחסנית. ודא שהאטם הוא מאובטח מכור בשני קצותיו של בעל; אחרת, לחץ מספיק לדור אגל לא יושג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את מחולל אגל על ​​ידי לחיצה על הכפתור הירוק בחלק העליון של המכשיר והכנס את המחסנית. כאשר בעל הוא במיקום הנכון, גם את הכח (משמאל מימין) ובעל (מימין באמצע) נוריות חיווי ירוקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור העליון במכשיר שוב כדי לסגור את הדלת וליזום דור אגל. הערה: לאחר הלחיצה על Button, סעפת עמדות על עצמו שוב את הבארות לשקע, ציור שמן ודגימות באמצעות ערוצי microfluidic, שבו טיפות נוצרות. טיפות לזרום לתוך אגל גם, שבו הם צוברים. נורית חיווי אגל (מימין) הבזקים ירוקים לאחר 10 שניות כדי לציין שדור רביב הוא בהתקדמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר דור רביב הוא מלא, כל 3 נוריות החיווי ישתנו לצבע ירוק מוצק; לפתוח את הדלת על ידי לחיצה על הכפתור, ולהסיר את בעל מהיחידה. הסר את האטם חד פעמי מהמחזיק וזורקים אותו. הערה: הבארות העליונה של המחסנית מכילות טיפות, ובארות אמצע ונמוכות הן כמעט ריקות, עם כמות קטנה של שמן שיורי. </li></ol></li></ol> 2.2. הכנה לPCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה, pipet את 40 μl של תוכן הטיפה מהחלק העליון גם המחסניות לתוך באר בודד של צלחת 96-היטב PCR מומלץ כפי שצוין בפרוטוקול המכשיר של היצרן. לאטה: בעזרת פיפטה רב-ערוצים הוא אידיאלי להעברת תחליבי טיפות. שאיפה איטית ועדינה של טיפות מומלץ למזער גז אגל במהלך העברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את צלחת PCR עם רדיד מייד לאחר העברת טיפות, כדי למנוע אידוי. השתמש חותמות צלחת נייר כסף לנקבה שתואמות את אוטם צלחת PCR והמחטים בקורא הטיפה. בצע את ההוראות במדריך הוראות אוטם צלחת PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את טמפרטורת אוטם צלחת 180 ° C וזמן 5 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גע בחץ כדי לפתוח את דלת המגש. מקם את בלוק התמיכה על המגש עם צד 96-גם פונה כלפי מעלה. מניחים את צלחת 96-גם על לחסום את התמיכה ולהבטיח כי כל בארות הצלחת מיושרות עם בלוק התמיכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את צלחת 96-היטב עם גיליון 1 של חותם נייר כסף לנקבה. ברגע שצלחת 96-היטב מאובטחת על בלוק התמיכה ומכוסה בנייר כסף את החותם לנקבה, גע בלחצן החותם. המגש ייסגרואיטום חום ייזום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר איטום חום הוא מלא, הדלת נפתחת באופן אוטומטי; להסיר את הצלחת מהגוש החום לרכיבת תרמית ולאחר מכן להסיר את הגוש החום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שכל הבארות בצלחת חתומות על ידי בדיקה ששקעים בנייר הכסף הם ברורים ממבט על כל טוב. ברגע אטום, הצלחת מוכנה לרכיבת תרמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שטיפין יוסרו, לחץ על התפסים בבעל המחסנית כדי לפתוח אותו. הסר את המחסנית הריקה וזורקים אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הגברה PCR קונבנציונלית על ידי ביצוע הפרמטרים מפורטים בטבלה 2. </li></ol> 2.3 קריאת אגל (לפי הפרוטוקול המומלץ של היצרן) שים לב: בעקבות ההגברה PCR של יעד חומצות גרעין בטיפין, מכשיר טיפת קורא מנתח כל טיפה בנפרד באמצעות מערכת זיהוי 2-צבע 13. אנחנו בדרך כלל להגדיר כדי לזהות FAMfluorophores כתב ד ויק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;מערכת פלאש&quot; לראש קורא הטיפה ולהפוך אותו מוכן לניתוח ddPCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הצלחת לתוך קורא אגל ולחץ על &quot;התחל&quot;. קורא אגל aspirates כל דגימה, singulates הטיפות, ונחליהם בקובץ יחיד עבר גלאי 2-צבע. הגלאי קורא את הטיפות למנות דוגמאות חיוביות ושליליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר קריאת רביב היא מלאה, לפתוח את הדלת ולהוציא את בעל צלחת מהיחידה. הסר את צלחת ה- PCR 96-היטב מהבעל וזורקים אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתחזוקה נאותה, להחליף את שמן טיפת הקורא ורוקן את פח האשפה במידת צורך. להוסיף 50 מיליליטר של אקונומיקה 10% לבקבוק הפסולת כדי למנוע התפתחותם של חיידקים. </li></ol> 2.4 פרופיל מוטציה בדנ&quot;א (לפי הפרוטוקול המומלץ של היצרן) הערה: טיפות PCR חיוביות והשליליות PCR-נספרות לספק quantific המוחלטני של יעד מוטציות BRAF V600E DNA בצורה דיגיטלית, תוך שימוש בתוכנת ניתוח נתונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הגדרה להזין מידע על דגימות, מבחני, וניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון ההתקנה, לטעון צלחת (filename.qlp), לאחר מכן לחץ על ניתוח כדי לפתוח ולנתח את הנתונים. ממשק ניתוח הנתונים מופרד לשלושה חלונות: לוח תוצאות, ובכן בורר ו / תצוגה גרפית עיבודים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון העיבודים, נתונים ריכוז לכל יעד יופיעו בבארות במפת הצלחת ונספרו בטבלת התוצאות. לחץ ריכוז לדמיין נתונים בחלקות ריכוז. </li></ol>

<ol>
	<li>Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+alterations+during+colorectal-tumor+development.">Genetic alterations during colorectal-tumor development.</a> The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417, 949-954 (2002).</li><li>Solit, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutation+predicts+sensitivity+to+MEK+inhibition.">BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition.</a> Nature. 439, 358-362 (2006).</li><li>Wong, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+anti-cancer+agents+targeting+the+Ras/Raf/+MEK/ERK+pathway.">Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway.</a> Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).</li><li>Brose, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+and+RAS+mutations+in+human+lung+cancer+and+melanoma.">BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma.</a> Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutations+in+colon+cancer+are+not+likely+attributable+to+defective+DNA+mismatch+repair.">BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair.</a> Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Droplet+Digital+PCR+System+for+Absolute+Quantitation+of+DNA+Copy+Number.">High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.</a> Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+Droplet+Digital+Polymerase+Chain+Reaction+Format+for+DNA+Copy+Number+Quantification.">Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification.</a> Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).</li><li>Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+copy+target+detection+by+Droplet+Digital+PCR+through+application+of+a+novel+open+access+bioinformatic+pipeline,+'definetherain'.">Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'.</a> Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).</li><li>Strain, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+precise+measurement+of+HIV+DNA+by+droplet+digital+PCR.">Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR.</a> PloS one. 8, e55943 (2013).</li><li>Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+detection+and+quantitation+of+DNA+copy+number+and+single+nucleotide+variants+with+single+color+droplet+digital+PCR.">High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).</li><li>Bizouarn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+using+digital+PCR.">Clinical applications using digital PCR.</a> Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).</li><li>McDermott, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+target+detection+using+DNA-binding+dye+chemistry+in+droplet+digital+PCR.">Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).</li><li>Milbury, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+lower+limits+of+detection+of+digital+PCR+assays+for+cancer-related+gene+mutations.">Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations.</a> Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).</li><li>Zhu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+Droplet+Digital+PCR+Method+for+Detection+of+EGFR+Activating+Mutations+in+Plasma+Cell-Free+DNA+from+Patients+with+Advanced+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer.</a> The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).</li><li>Fan, H., Gulley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+paraffin-embedded+tissues.">DNA extraction from paraffin-embedded tissues.</a> Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).</li><li>Nadauld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+Sensitive+Detection+of+Cancer+Genome+Amplifications+from+Formalin+Fixed+Paraffin+Embedded+Tumors+with+Droplet+Digital+PCR.">Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR.</a> Translational medicine. 2, (2012).</li></ol>

מיונג Ryuri אה, סי יון קים, וצעיר Deug קים הן עובדי מלון האביון CRO.

כאן, אנו מדגישים את תחולתו של ddPCR ובידוד DNA מדגימות שורת תאים סטנדרטי התייחסות FFPE להערכת מוטציה הגנטית ספציפית. במחקר זה, שיטת בידוד תב&quot;ע האוטומטית DNA משמשת שניתן להתאים בקלות, אוטומטי, ויכולה להכיל עד 48 מדגמים שונים בו זמנית, מה שמאפשר לניסויים בקנה מידה גדולים יותר ...

ההצטברות של מוטציות גנטיות בגנים רגולטורי מפתח משנה תיכנות תא נורמליות כמו התפשטות תאים, התמיינות, והישרדות, שמוביל לסרטן 1. מסלול קינאז RAS-RAF-MAP מתווך תגובות הסלולר לאותות צמיחה. מוטציות הסרטניות BRAF יכולות לנבוע ממוטציות נהג בגן BRAF, שעלול לגרום לBRAF oncoprotein להפוך פעיל יתר על המידה 2. מוטציות בגן BRAF גם לגרום לאיתות במורד הזרם פעיל יתר על המידה באמצעות MEK וERK 3, אשר, בתורו, מוביל לצמיחת תאים מופרזת והפצה עצמאית של רגולציה בתיווך גורם גדילת 4-6. מספר כלים זמינים לפרופיל המוטציה בדנ&quot;א, כגון מוטציות V600E BRAF כמותית בזמן אמת ב, קווים קבוע פורמלין מוטבע פרפין התייחסות (FFPE) סטנדרטיים תא על ידי ddPCR. ddPCR היא שיטת PCR מבוסס לכימות מוחלטתמציע דיוק גבוה יותר בהשוואה לזמן האמיתי קונבנציונלי PCR (qPCR) 7,8. ddPCR מספק גם גבוה יותר פתרון כוח ודיוק לגילוי מוטציות נדירות בתבניות DNA, המאפשר חקר סרטן יותר אינפורמטיבי ואבחון 9. יתרונות נוספים של ddPCR על qPCR הקונבנציונלי כוללים רגישות משופרת שלה ודיוק כאשר לומדים מספרי עותק תבנית נמוכה 10-12. במסמך זה, באופן אוטומטי לפרוטוקול חילוץ DNA מהקווים התייחסות FFPE סטנדרטי תא, ואחרי קביעת קיומו או העדרו של מוטציות BRAF V600E ידי ddPCR הוא הוכיח. השימוש בתוכנה לניתוח נתונים וייצוג גרפי של התוצאות גם מתואר. כל ההליך הוא פשוט יחסית ולגמרי תלוי במספר הדגימות שצדודית ומספר מכונות PCR וddPCR קונבנציונליים זמין. הפרוטוקול הבא מתאר נהלים סטנדרטיים לBR<html> קווי AF-V600E חיובי התייחסות FFPE סטנדרטי תא (HD598, HD593, HD617, HD273 וwildtype (WT)) מתבצע במכשיר אוטומטי לחלוטין באמצעות פרוטוקול רקמות הכנת המערכת (תב&quot;ע). בהמשך לכך, דגימות DNA מבודדות מנותחות לנוכחות מוטציות BRAF V600E באמצעות מערכת ddPCR. ניתוח מוטציה ממוקד מתבצע לאחר כל הדגימות כבר צדודית ונתונים כבר נטענו לתוך תוכנת ניתוח נתונים. תלוי במספר דגימות / קבוצות למדו, ניתוח נתונים עשוי לדרוש מאחד לכמה שעות. הרכיב הניסיוני של המתודולוגיה דורש דיוק בטיפול <a href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast" title="בידוד חומצות גרעין משמרים, וידאו חינוך יופיטר המדע להסביר יותר על אודות ההקשר של RNA">ב- DNA</a> ובית דגן מטפטף וPipettors, וידאו חינוך מדע יופיטר להסביר יותר על אודות ההקשר של pipetting &quot;&gt; pipetting לתוך 96 צלחות גם, תוך ניתוח נתונים נעשה באמצעות תוכנה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10701001</td>
			<td>Automated DNA isolation instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>772BR1119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>771BR1497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment</td>
			<td></td>
			<td>621BR17718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR plate sealer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>770BR1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA isolation kit&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10632398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10632399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO-RE tips</td>
			<td>Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR mutation analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-3010</td>
			<td>2X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 cartridge&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator oil</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR-186-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gasket</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet reader oil</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR-186-3004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

employing digital droplet pcr to detect braf v600e mutations in formalin-fixed paraffin-embedded reference standard cell lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

לניתוח ddPCR, למדנו שורות תאי BRAF V600E התייחסות FFPE המוטציה סטנדרטית. קורא הטיפה מתחבר לתוכנת ניתוח נתונים ריצת מחשב נייד. כל טיפה בודדת מוגדרת על הבסיס של משרעת ניאון כמו להיות חיובי או שלילי. התוכנה המסופקת על ידי יצרן גם מאפשרת חיתוך משתמש מוגדר להיות נכנס להגדיר את ...

Watch this Scientific Journal Video about Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines at JoVE.com

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

המטרה של הווידאו הזה היא להדגים כיצד לבצע מיצוי DNA אוטומטי מהקווים קבוע פורמלין מוטבע פרפין התייחסות (FFPE) סטנדרטיים תא וניתוח אגל דיגיטלי PCR (ddPCR) כדי לזהות מוטציות נדירות בסביבה קלינית. זיהוי מוטציות בדגימות FFPE מדגים את התועלת הקלינית של ddPCR בדגימות FFPE.

העסקת דיגיטלי אגל PCR לזיהוי מוטציות V600E BRAF בשורות תאי ההפניה תקן קבוע פורמלין מוטבע-פרפין

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

employing-digital-droplet-pcr-to-detect-braf-v600e-mutations-formalin

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K Views.  Seoul National University.  המטרה של הווידאו הזה היא להדגים כיצד לבצע מיצוי DNA אוטומטי מהקווים קבוע פורמלין מוטבע פרפין התייחסות (FFPE) סטנדרטיים תא וניתוח אגל דיגיטלי PCR (ddPCR) כדי לזהות מוטציות נדירות בסביבה קלינית. זיהוי מוטציות בדגימות FFPE מדגים את התועלת הקלינית של ddPCR...

Video: Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

לדוגמא הכנת proteomic מפורמלין קבועה ורקמות פרפין Embedded

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה לרקמות כליה פורמלין קבועה

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR הוא שיטה רגישה ומהירה לאיתור של Cytomegaloviral DNA בקבועה פורמלין, רקמות ביופסיה מוטבעות פרפין

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

הכין ליבות רקמות פרפין מוטבע פורמלין-קבועות הוא רנ&quot;א הפקת DNA

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

מגנטי תא לפעיל על-מיון אסטרטגיות כדי לבודד ולטהר Synovial נגזר הנוזלים בתאי גזע Mesenchymal ממודל ארנב

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An optimal method of quantification is accurate, has a broad linear dynamic range and maintains the structural integrity of the sample to allow for identification of individual cell types. Current methods such as immunohistochemistry (IHC), mass spectrometry, and immunoblotting each fail to meet these stipulations due to their categorical nature or need to homogenize the sample. As an alternative method, we propose the use of immunofluorescence (IF) and image analysis to determine the relative abundance of a protein of interest in FFPE tissues. Herein we demonstrate that this method is easily optimized, yields a wide dynamic range, and is linearly quantifiable as compared to the gold standard of quantitative immunoblotting. Furthermore, this method permits the maintenance of the structural integrity of the sample and allows for the distinction of various cell types, which may be crucial in diagnostic applications. Overall, this is a robust method for the relative quantification of proteins in FFPE samples and can be easily adapted to suit clinical or research needs.

We describe the use of quantitative immunoblotting to validate immunofluorescence histology coupled with image analysis as a means of quantifying a protein of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples. Our results demonstrate the utility of immunofluorescence histology for ascertaining the relative quantity of biomarker proteins in routine biopsy samples.

Immunoblotting כמותית של שורות תאים כסטנדרט לאימות Immunofluorescence לכימות תנועת סמן חלבונים בדגימות הרקמות שגרתיות

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) is the gold standard for SARS-CoV-2 diagnosis as no permanent solution is available. However effective this technique may be, research has emerged showing its limitations in detection and diagnosis especially when it comes to low abundant targets. In contrast, droplet digital PCR (ddPCR), a recent emerging technology with superior advantages over qPCR, has been shown to overcome the challenges of RT-qPCR in diagnosis of SARS-CoV-2 from low abundant target samples. Prospectively, in this article, the capabilities of RT-ddPCR are further expanded by showing steps on how to develop simplex, duplex, triplex probe mix, and quadruplex assays using a two-color detection system. Using primers and probes targeting specific sites of the SARS-CoV-2 genome (N, ORF1ab, RPP30, and RBD2), the development of these assays is shown to be possible. Additionally, step by step detailed protocols, notes, and suggestions on how to improve the assays workflow and analyze data are provided. Adapting this workflow in future works will ensure that the maximum number of targets can be sensitively detected in a small sample significantly improving on cost and sample throughput.

This work summarizes steps on developing different assays for SARS-CoV-2 detection using a two color ddPCR system. The steps are elaborate and notes have been included on how to improve the assays and experiment performance. These assays may be used for multiple SARS-CoV-2 RT-ddPCR applications.

פרוטוקולי PCR דיגיטליים טיפתיים דו-שלביים של תמלול לאחור לזיהוי וכימות SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...