גברת אלסטר, מר Honrath וד&quot;ר ג&#39;יאנג זוכים להערכה לקבלת סיוע טכני יוצא מן הכלל שלהם. כמו כן העריך ד&quot;ר Volz ואת קבוצת המחקר של ד&quot;ר Dandri למתן גישה למכשיר דיגיטלי PCR שלהם.

1. הכנת תרבות מיקס המכילה גם תאים סרטניים ותאים שאינם סרטניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתאים סרטניים מקו תא הוקם MPNST S462 5. השתמש פיברובלסטים כמו התאים שאינם סרטניים 6,7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים פיברובלסטים תרבות הן הגידול במדיום תקן DMEM עם 10% בסרום שור העובר (BSA), 3 גלוטמין מ&quot;מ, 0.1 מ&quot;מ 2-mercaptoethanol, 500 U / פניצילין מ&quot;ל, 500 גר &#39;/ מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין ו פירובט סודיום 1 מ&quot;מ ב 37 ° C ו -5% CO 2 5-7. At-מפגש משנה, למסוק את התאים עם טריפסין 0.05% ו לספור אותם באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 400 תאים סרטניים ו -1,600 תאים שאינם סרטניים יחד היטב בכל צלחת תרבות 96-היטב 0.2 מ&quot;ל בינוני. בהתחשב צמיחה מהירה יותר של תאים סרטניים לאורך תקופת הטיפול של 5 ימים, חלקם הראשוני של תאים סרטניים נקבע ל 25%. הגדרת 4 משכפל עבור כל ריכוז התרופה. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 O / N. </li></ol> 2. דרוטיפול g <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש nilotinib כמו תרופת הבדיקה. הכינו פתרונות המניות של 0, 2, 4 ו -20 מ&quot;מ nilotinib ב DMSO. לדלל כל אחד מהם על ידי 200 של פי 5 מ&quot;ל DMEM בינוני, מתן פתרונות תרופתיים מרוכז פי 2 של 0, 10, 20 ו -100 מיקרומטר 6.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 0.1 מ&quot;ל בינוני מבאר כל ולהוסיף 0.1 מ&quot;ל של המכיל תרופה בינוני. הריכוזים הסופיים הם 0, 5, 10 ו -50 מיקרומטר. המשך דוגרי תאי תרופה המכילה בינונית במשך 5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הטיפול, לבדוק התאים המצורפים באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד ולצלם. לשאוב את המדיום משם, לשטוף את התאים דבקים שרד פעם עם 0.2 מיליליטר PBS. </li></ol> 3. הכנת DNA עבור PCR הדיגיטלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תאים באמצעות מאצ 8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl פתרון תמוגה אלקליין (25 מ&quot;מ NaOH, 0.2 mM EDTA) זה טוב. חותם את הבארות עם רדיד. דגירה את הצלחת על 95 מעלות צלזיוס בתנור או על צלחת חימום למשך 30 דקות. בדוק תחת microscope לוודא שאף תאים שלמים יותר נשארים על פני השטח של הבארות. במקרה התאים לא lyse לחלוטין, להגדיל את זמן החימום או להוסיף חומר ניקוי. להקפיא אותם פעם ב -20 מעלות צלזיוס גם משפר שביר תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl נטרול פתרון (40 מ&quot;מ טריס-HC, pH 4.0) היטב כל אחד. להעביר את כל lysates לתוך בארות U-בצורת צלחת PCR ויבש בתוך Cycler PCR ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 30 דקות. מחדש את lysates עם 20 μl מים מזוקקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Desalt באמצעות Drop-דיאליזה 9 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במסנני קרום עם גודל הנקבובי ממוצע 0.025 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Float את המסנן במים מזוקקים עם למעלה בצד מבריק בבארות של צלחת 12-היטב. להרטיב את המסנן במשך 5 דקות. שים לב, כדי למנוע בועות אוויר בין המסנן והמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את lysates מחדש של כל דגימת משלב 3.1.4 בזהירות על על כל אחת מ -4 תחומי המסנן. מכסים את הצלחת ואת dialyze למשך 30 עד 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצוץ את המים תחת המסנן בלי לדפדף על המסנן ולא להפריע את הטיפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את lysate-טיפות לתוך הבארות של PCR-צלחת חדשה. לייבש את טיפות DNA על ידי חימום על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 30 דקות בתוך Cycler PCR. מחדש את lysates ב 10 מי μl. </li></ol></li></ol> 4. PCR דיגיטלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכיבים קפוא להפשיר כגון DNA, חיץ לערבב assay ב RT, ספין למטה במשך 10 שניות לעבר כוח מקסימלית של כל צנטריפוגות זמין (למשל, VWR מיני צנטריפוגות) ולאחר מכן לשמור אותם על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת מאסטר המכיל את כל המרכיבים למעט DNA (טבלה 1). שקול נפח מת ולחשב מאסטר תערובת כ 10% יותר מהסכום הנדרש. הערה: השתמש primers ו בדיקות בשימוש בערכה המסחרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס את התערובת אב, ספין למטה במשך 10 שניות לעבר כוח מקסימלית של צנטריפוגות כל זמין (למשל, צנטריפוגות מיני VWR) ולחלק 15 μl לכלגם צלחת 96-PCR. הוסף את כל lysate (המכיל DNA) של כל דגימה כדי הבארות המכילות תערובת מאסטר. העברת 20 μl של כל תערובת התגובה לתוך באר בצד מדגם של מחסנית ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 70 μl של שמן גנרטור אגל לבאר כל בצד שמן של מחסנית. סגור את המחסנית עם האטם ולמקם את התפאורה כולה למחולל רביב. התחל דור אגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 40 μl אגל-פתרון לתוך בארות צלחת PCR 96-היטב. חותם את הצלחת עם בנייר כסף ומניחים בצלחת לתוך Cycler PCR. הגדר את הטמפרטורה המכסה ל -105 מעלות צלזיוס, כבש שער ב -2 מעלות צלזיוס / sec. לבצע PCR תוך שימוש בהגדרות בטבלה 2. לאחר PCR, להעביר את הצלחת לקורא אגל ולהתחיל לקרוא. לחלופין, אחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 24 שעות. </li></ol> 5. חישוב שיעור של תאים סרטניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טענו את נתוני PCR הדיגיטליים ולבצע analys האוטומטיהוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שליטה בתוצאות של כל assay באופן ידני על ידי בוחן את ההתפלגות חד ממדית ו -2 ממדים של הטיפין החיוביות ושליליות, ואת בטוח שהם מופרדים היטב ואת קווי הסף היו בעמדות הנכונות. אל תכלול תוצאות שלא עמדו בקריטריונים, למשל, אין הפרדה ברורה של טיפות חיוביות ושליליות, בניתוחים נוספים. העתק את RPP30 NF1 / יחס שנוצר לתוך גיליון Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבת את חלקם של תאים סרטניים כמו: 2 x (1 NF1 / RPP30). </li></ol> 6. שינוי תלוי מינון פרופורציה של תאים סרטניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל-ריכוז תרופה, לחשב את הממוצע ואת סטיית התקן מ -4 המשכפל. מגרש את האמצעים ואת סטיות התקן נגד-ריכוזי התרופה. </li></ol>

<ol>
	<li>Caponigro, G., Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+preclinical+testing+of+cancer+therapeutic+hypotheses.">Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).</li><li>McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tumour-stromal+interactions+in+modifying+drug+response:+challenges+and+opportunities.">The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).</li><li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development.">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li><li>Edwards, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+target+validation+using+patient-derived+cells.">Preclinical target validation using patient-derived cells.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).</li><li>Frahm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+phenotypic+characterization+of+tumor+cells+derived+from+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+of+neurofibromatosis+type+1+patients.">Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients.</a> Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+selectivity+of+nilotinib+on+NF1-associated+tumors+in+vitro.">Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro.</a> J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).</li><li>Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+assessment+of+the+anticancer+drug+response+of+plexiform+neurofibroma+tissue+using+primary+cultures.">Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures.</a> J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).</li><li>Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+an+inexpensive+and+high-throughput+genomic+DNA+extraction+method+for+the+molecular+ecology+of+zooplanktonic+diapausing+eggs.">Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs.</a> Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).</li><li>Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desalting+DNA+by+drop+dialysis+increases+library+size+upon+transformation.">Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).</li><li>Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+head+and+neck+cancer+oncogenome:+widespread+PI3K-mTOR+pathway+alterations+and+novel+molecular+targets.">Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets.</a> Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).</li></ol>

The procedure is patent-protected (10 2013 221 452, Germany)

צעד מפתח כלי genetic- ו מבוסס תא זו להערכת סגוליות תרופה במבחנה הוא קביעת שיעור של תאים סרטניים באמצעות אחד או יותר מאפיינים גנטיים ספציפי גידול. בניגוד לתכונות פנוטיפי קונבנציונליות 7, מאפיינים גנטיים ספציפיים, יציבים וקלים לכמת. לדוגמא, וריאצית מספר מוטציה או עותק ספציפי גידול קיימת אך ורק בתאים הסרטניים אך לא בתאים שאינם סרטניים. כזה הסטיגמה גנטי ניתן באופן מהימן ומדויק לכמת, למשל, באמצעות PCR הדיגיטלי כפי שמודגם במחקר זה. לקבלה הדיגיטלי PCR, טוהר גבוה של DNA אינו הכרחי. עם זאת, Desalting והסרת מולקולות מעכבות נחוצים אשר יכולה להיות מושגת על ידי א-דיאליזה ירידה באמצעות מסנן מתאים. תמוגה בשילוב טיפה-הדיאליזה היא פשוט ומהירה, לא דורשת מכשירים מיוחדים ולכן יכולה להתבצע בכל מעבדה סטנדרטית. אם התאים אינם בריk היטב, יכול להיחשב טיפול נוסף כגון הקפאת התאים ב -20 ° C, הוספת חומר ניקוי ו / או באמצעות פרוטאז. במחקר הנוכחי, את המחיקה הטרוזיגוטיים של גן NF1 שמשה תכונה מסוימת גידולים עבור כימות. באופן דומה, מחיקות של גנים או לוקוסים אחרים יכולות לשמש גם. יתר על כן, מוטציות יכולות לשמש גם לכימות תאים סרטניים. במקרה כזה, מבחני PCR דיגיטליים עבור המוטציה ואת אללים הנורמלי צריכים להיות מאומתים נרחב כדי להבטיח הספציפיות שלהם עבור כל אחד מהם. תלוי מינון פרופורציה של תאים סרטניים מספקת אינדיקציה-סגולי סמים או סלקטיביות. יתר על כן, הוא גם מאפשר בתגובה לחילוץ של תאים סרטניים מן התגובה של תאים כוללים של תרבות מעורבת לתרופה (איור 4). מיצוי אסטרטגיה זו מספקת פתרון עבור הבעיה הטכנית באמצעות תרבויות עיקריות (המכיל הוא גידול ולאn-גידול תאים) עבור בדיקות סמים. Genetic- ותא מבוסס בכלי במבחנה הראה במחקר הנוכחי עשויים ולכן יש פוטנציאל יישום (1) ב-גילוי תרופות שבה היא מספקת פלטפורמה להערכה סגולי סמים או סלקטיביות במבחנה (2) בטיפול בסרטן אישית איפה זה מאפשר תרופות בדיקות בתרבויות עיקריות וכתוצאה מכך עשוי לתרום בחירת התרופה אדג&#39;ובנט כימותרפיה 4. יתר על כן, מנגנון תרופתי של תרופה ניתן ללמוד באמצעות הכלי הזה, מאז שינוי גנטי מסוים או שינויים גנטיים מרובים ניתן בעקבות במהלך-הטיפול התרופתי. קושי בשימוש תרבויות עיקריות אישיות הוא חוסר תכונה גנטית אוניברסלית עבור כימות של התאים הסרטניים. עם זאת, עם מקדמה בשיעור היום רצף שלם של הגנום, הגנים ואזורים שינו בתדירות הגבוהה ביותר ידועים גידולים נפוצים. לדוגמה, בין הראש והצווארגידולים, 71%, 23% ו -22% יש מוטציות TP53, FAT1 וגנים CDKN2A, ו -60%, 34% ו -26% יש מחיקות באזורי הגן של CDKN2A, STK11 ו PTEN, בהתאמה 10. הקרנת 5 עד 10 גנים או / ואזורים כגון באמצעות-רצף ממוקד ו / או דיגיטלי PCR יהיה ולכן סביר לזהות אחד או יותר שינויים גנטיים אשר ניתן להשתמש בהם עבור כימות של תאים סרטניים בתרבות העיקרי נגזר. מגבלה נוספת היא הכמות המספיקה של גידולי כריתה להקמת תרבויות עיקריות. למרות תכונות יתרון ופוטנציאל יישום מבטיח של genetic- ותא מבוסס בכלי במבחנה, מגבלותיו צריכים להישמר נפש שלה בטבע במבחנה יודגש. לדוגמא, ההשפעות השונות או הרעיל של תרופה על תאים סרטניים רשאי למדי בשל הבדל בסוגי תאים (פיברובלסטים לעומת בתאי שוואן) או שלהםמקורות שונים (מאנשים שונים). ההשפעה החזקה יותר של תרופה על תאים סרטניים מאשר תאים שאינם סרטניים עשויה גם להיות מוסברת על ידי העובדה כי לשעבר לגדול מהר יותר מאשר האחרון. והחשוב מכל, תאים בהתנהגות במבחנה שונה מאשר תאים בגוף האדם וכתוצאה מכך, תוצאות הערכה במבחנה לעתים קרובות לא או רק חלקית לשקף את המצב קליני האמיתי. לכן, יעילה, cytotoxicity וספציפית של תרופות שהתקבלו עבור תאים בתרבית הם די טבע סמן ביולוגי, אך אין להם את האמינות של יעילות preclinically הנמדד של אנטיביוטיקה. אף על פי כן, נע שורות תאים לתרבויות מעורבות ו / או תרבויות עיקריות הוא צעד קדימה בהערכה ותוצאת תרופה וספציפית / סלקטיביות במבחנה. עם מאמצים רבים, בתנאים במבחנה ניתן למצוא האפשר מתאם סביר של נתונים במבחנה עם תגובות אמיתיות של חולים, לפחות עבור חלק מתרופות.

Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios. 
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated. 
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.

<table><tbody><tr><td>Membrane filter of 25 mm diameter</td><td>Merk-Millipore</td><td>VSWP 02500</td><td>For drop-dialysis</td></tr><tr><td>ddPCR assay for NF1</td><td>BioRad</td><td>dHsaCP1000177</td><td>FAM-labelled</td></tr><tr><td>ddPCR assay for RPP30</td><td>BioRad</td><td>dHsaCP2500350</td><td>HEX-labelled</td></tr><tr><td>QX200</td><td>BioRad</td><td>186-4001</td><td>The previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200</td></tr><tr><td>Droplet oil</td><td>BioRad</td><td>186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Cartriges&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>186-3004</td><td></td></tr><tr><td>Gaskets</td><td>BioRad</td><td>186-3009</td><td></td></tr><tr><td>Cartrige holder</td><td>BioRad</td><td>186-3051</td><td></td></tr><tr><td>Pierceble foil</td><td>BioRad</td><td>181-4040</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing specificity of anticancer drugs in vitro

הליך להערכה ספציפי של תרופות נגד הסרטן במבחנה באמצעות תרביות המכילות גם תאים סרטניים ולא-סרטניים מודגם. אלמנט המפתח הוא נחישות כמותי של שינוי גנטי ספציפי גידול ביחס רצף אוניוורסלי באמצעות assay PCR דיגיטלי כפולה חללית לבין חישוב בדיעבד של הפרופורציה של תאים סרטניים. את assay מתבצעת על תרבות המכילה תאים סרטניים של קו הוקם ומשובץ-בתאים שאינם סרטניים. התרבות המעורבת מטופל בתרופת מבחן בריכוזים שונים. לאחר הטיפול, ה- DNA הוא מוכן ישירות מתאי הדבק שרדו בבארות של צלחות 96-היטב באמצעות שיטה פשוטה וזולה, ועברתי assay PCR הדיגיטלי כפולה בדיקת למדידת שינוי גנטי ספציפי גידול רצף ייחוס אוניוורסלי . בהפגנה הנוכחית, במחיקה הטרוזיגוטיים של הגן NF1 משמש שינוי גנטי ספציפי הגידולגן RPP30 כמו גן ההתייחסות. באמצעות יחס NF1 / RPP30, חלקם של תאים סרטניים חושב. מאז השינוי תלוי במינון של הפרופורציה של תאים סרטניים מספק אינדיקציה במבחנה עבור סגוליות של התרופה, גנטי מבוסס תאים זה assay במבחנה סביר להניח כי יש פוטנציאל יישום של גילוי תרופות. יתר על כן, עבור סרטן טיפול אישית, כלי genetic- ו מבוסס תאים זה עשוי לתרום לאופטימיזציה של כימותרפיה אדג&#39;ובנטי באמצעות יעילויות בדיקות וספציפיות של תרופות מועמדות באמצעות תרבויות עיקריות של גידולים בודדים.

איכות DNA הוכן באמצעות מאצ משולב / Drop-דיאליזה מספיקה עבור PCR דיגיטלי משביע רצון (איור 1B). עבור 2,000 פיברובלסטים, כ -3,000 ± 500 טיפות חיוביות התקבלו, המקביל ל 75% של 4,000 עותקים הצפויים (שני עותקים בתא אחד). במחקר זה, התאים הסרטניים היו מקו הוקם MPNST S462 אשר ידוע כבעלי מחיקת heterozygotic של גן NF1 5. 50% זה הפחתת מינון הגן זוהתה בבירור על ידי assay PCR הדיגיטלי הכפול (האיור 1B). לעומת זאת, שני עותקים של הגן הזה נמדדו פיברובלסטים. הבדל גנטי בין גידול ותאי שאינו סרטני מאפשר חישוב השיעור של תאים סרטניים בתרביות מעורבות (איור 2). באמצעות מדידת מינון הגנים היחסי של NF1 כדי RPP30, חלקם של תאים סרטניים ב תרבות מעורבת ניתן לקבועבכל-ריכוז התרופה (איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig1.jpg" /> איור 1. דיגיטלי PCR. (א) איור של העיקרון. (ב) assay כפול בדיקה מגלה כמות מופחתת של גן המטרה (NF1) בתאי הגידול MPNST S462 ביחס גן הפניה (RPP30). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig2.jpg" /> איור 2. שיעור מחושב של תאים סרטניים. תאים סרטניים ותאים שאינם סרטניים היו מעורבים ב יחסים שונים זורעים לתוך היטב בכל צלחת 96. לאחר מצורף O / N, התאים היו שנינות lysedמאצ h / Drop-דיאליזה ואת lysates desalted היו נתונים PCR דיגיטלי אשר נתן יחס של NF1 / RPP30. על בסיס יחס זה, חלקם של תאים סרטניים בכל טוב חושב. ממוצע וסטיית תקן של פרופורציה של תאים סרטניים חושבו מתוך 4 משכפל בכל פרופורציה הגדרת. הפרופורציות המחושבות של תאים סרטניים (ציר ה- Y) היו זממו נגד פרופורציות הגדרה (ציר ה- X). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig3.jpg" /> איור 3. תלויי מנת שינוי פרופורציה של תאים סרטניים. (א) תלוי במינון ההפחתה של תאים חיוניים גלויים. (ב) חלקם של תאים סרטניים (ממוצע וסטיית תקן של 4 משכפל) שנמדד<html> יחס של NF1: RPP30, ירד בטווח של 10 - 0 מיקרומטר. באותו מיקרומטר הגבוה ביותר 50 מנה, כמה תאים חיוניים נותרו, כנראה עקב השפעה רעילה לכל התאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig4.jpg" /> . איור 4. תגובת הפרדה של תאים סרטניים מזו של תאים שאינם סרטניים (א) כדאיות או / ו תרבות תאים כוללים ניתן למדוד באמצעות מבחנים קונבנציונליים; שיעור של תאים סרטניים ניתן לקבוע באמצעות ההליך הפגין במחקר הנוכחי. (ב) באמצעות שני פרמטרים, תגובה של תאים הכוללים בתרבות מעורבת לתרופה ניתן לחלק התגובה של התאים הסרטניים והתגובה של התאים שאינם סרטניים..com / קבצים / ftp_upload / 53,752 / 53752fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"></td><td style="width:171px;"> תגובה 1 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> 2 x ddPCR Supermix </td><td style="width:171px;"> 12 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> תמהיל Assay עבור NF1 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> תמהיל Assay עבור RPP30 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> HaeIII </td><td style="width:171px;"> 0.6 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> סיכום ביניים </td><td style="width:171px;"> 15 </td><td style="width:99px;"> תערובת מאסטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> DNA </td><td style="width:171px;"> 9 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> סה&quot;כ </td><td style="width:171px;"> 24 </td><td style="width:99px;"> תערובת PCR סופית </td></tr></tbody></table> טבלה 1 הגדרת התגובה Dual ddPCR <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שָׁלָב </td><td> פעולה </td><td> טֶמפֶּרָטוּרָה </td><td> זְמַן </td><td> מחזורים </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Polymלמחוק הפעלה </td><td> 95 ° C </td><td> 10 דק &#39; </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> denaturation DNA </td><td> 94 ° C </td><td> 30 שניות </td><td rowspan="2"> 40 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> חישול / exetension </td><td> 60 ° C </td><td> דקה 1 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> שחרור משרות פולימראז </td><td> 98 ° C </td><td> 10 דק &#39; </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> המתנה (אופציונלי) </td><td> 4 ° C </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 2 הגדרות Cycler PCR

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro at JoVE.com

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

מטרת פרוטוקול זה היא להעריך ספציפי של תרופות נגד סרטן במבחנה באמצעות תרבויות מעורבות המכילות הוא גידול ותאי שאינו סרטני.

הערכה ספציפית של תרופות נגד הסרטן<em&gt; במבחנה</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

assessing-specificity-of-anticancer-drugs-in-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

9.4K Views.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf.  מטרת פרוטוקול זה היא להעריך ספציפי של תרופות נגד סרטן במבחנה באמצעות תרבויות מעורבות המכילות הוא גידול ותאי שאינו סרטני. 

Video: Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; therefore their preparation should be conducted under an inert atmosphere. Evaluation of the anticancer activity of these complexes can be achieved by the MTT assay.
The MTT assay is a colorimetric viability assay based on enzymatic reduction of the MTT molecule to formazan when it is exposed to viable cells. The outcome of the reduction is a color change of the MTT molecule. Absorbance measurements relative to a control determine the percentage of remaining viable cancer cells following their treatment with varying concentrations of a tested compound, which is translated to the compound anticancer activity and its IC50 values. The MTT assay is widely common in cytotoxicity studies due to its accuracy, rapidity, and relative simplicity.
Herein we present a detailed protocol for the synthesis of air sensitive metal based drugs and cell viability measurements, including preparation of the cell plates, incubation of the compounds with the cells, viability measurements using the MTT assay, and determination of IC50 values.

A method for synthesis of air-sensitive titanium and vanadium anticancer agents is described, along with the evaluation of their cytotoxic activity towards human cancer cell line by the MTT Assay.

מכלולים נגד סרטן מתכת: סינתזה וCytotoxicity הערכה על ידי assay MTT

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

Chemistry

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines respond to therapeutic compounds in 2D (dimensional) monolayer cell cultures, 3D culture systems were developed to understand the efficacy of drugs in more physiologically relevant models. In recent years, a paradigm shift was observed in pre-clinical research to validate the potency of new molecules in 3D culture systems, more precisely mimicking the tumor microenvironment. These systems characterize the disease state in a more physiologically relevant manner and help to gain better mechanistic insight and understanding of the pharmacological potency of a given molecule. Moreover, with the current trend in improving in vivo cancer models, zebrafish has emerged as an important vertebrate model to assess in vivo tumor formation and study the effect of therapeutic agents. Here, we investigated the therapeutic efficacy of hydroxycoumarin OT48 alone or in combination with BH3 mimetics in lung cancer cell line A549 by using three different 3D culture systems including colony formation assays (CFA), spheroid formation assay (SFA) and in vivo zebrafish xenografts.

Here, we present the preclinical screening of anticancer coumarins using 3D culture and zebrafish.

הערכת פרה Bioactivity של OT48 נגד סרטן קומרין Spheroids, מבחני היווצרות המושבה ועל דג זברה Xenografts

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Cancer Research

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy against cancer. Here we provide a protocol to identify a rational combination at the preclinical step. First, we describe a cell-based assay to assess the synergism between anticancer mAb and cytotoxic drugs, that uses the combination index equation of Chou and Talalay1. This includes the measurement of tumor cell drug- and antibody-sensitivity using an MTT assay, followed by an automated computer analysis to calculate the combination index (CI) values. CI values of &lt;1 indicate synergism between tested mAbs and cytotoxic agents1. To corroborate the in vitro findings in vivo, we further describe a method to assess the combination regimen efficacy in a xenograft tumor model. In this model, the combined regimen significantly delays tumor growth, which results in a significant extended survival in comparison to single-agent controls. Importantly, the in vivo experimentation reveals that the combination regimen is well tolerated. This protocol allows the effective evaluation of anticancer drug combinations in preclinical models and the identification of rational combination to evaluate in clinical trials.

This protocol describes how to assess synergism between an anticancer antibody and antineoplastic drugs in preclinical models by using the combination index equation of Chou and Talalay.

Potentiation של נוגדנים נגד סרטן יעילות על-ידי סמים Antineoplastic: זיהוי של נוגדן תרופתיים הסינרגטיות באמצעות המשוואה אינדקס שילוב

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture models. PDOs have been successfully generated from a variety of human tumors to recapitulate the architecture and function of tumor tissue accurately and efficiently. However, PDOs are unsuitable for an in vitro high-throughput assay system (HTS) or cell analysis using 96-well or 384-well plates when evaluating anticancer drugs because they are heterogeneous in size and form large clusters in culture. These cultures and assays use extracellular matrices, such as Matrigel, to create tumor tissue scaffolds. Therefore, PDOs have a low throughput and high cost, and it has been difficult to develop a suitable assay system. To address this issue, a simpler and more accurate HTS was established using PDOs to evaluate the potency of anticancer drugs and immunotherapy. An in vitro HTS was created that uses PDOs established from solid tumors cultured in 384-well plates. An HTS was also developed for assessment of antibody-dependent cellular cytotoxicity activity to represent the immune response using PDOs cultured in 96-well plates.

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

A highly accurate in vitro high-throughput assay system was developed to evaluate anticancer drugs using patient-derived tumor organoids (PDOs), similar to cancer tissues but are unsuitable for in vitro high-throughput assay systems with 96-well and 384-well plates.

תפוקה גבוהה במבחנה במבחנה באמצעות organoids גידול נגזר המטופל

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target protein. Due to its several advantages over monoclonal antibodies, aptamer development has gained enormous popularity among cancer researchers. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) is the most common method of developing aptamers specific for proteins of interest. Following SELEX, a quick and efficient binding assay accelerates the process of identification, confirming the selectivity and specificity of the aptamer. 
This paper explains a step-by-step flow cytometric-based binding assay of an aptamer specific for epithelial cellular adhesion molecule (EpCAM). The transmembrane glycoprotein EpCAM is overexpressed in most carcinomas and plays roles in cancer initiation, progression, and metastasis. Therefore, it is a valuable candidate for targeted drug delivery to tumors. To evaluate the selectivity and specificity of the aptamer to the membrane-bound EpCAM, EpCAM-positive and -negative cells are required. Additionally, a non-binding EpCAM aptamer with a similar length and 2-dimensional (2D) structure to the EpCAM-binding aptamer is required. The binding assay includes different buffers (blocking buffer, wash buffer, incubation buffer, and FACS buffer) and incubation steps. 
The aptamer is incubated with the cell lines. Following the incubation and washing steps, the cells will be evaluated using a sensitive flow cytometry assay. Analysis of the results shows the binding of the EpCAM-specific aptamer to EpCAM-positive cells and not the EpCAM-negative cells. In EpCAM-positive cells, this is depicted as a band shift in the binding of the EpCAM aptamer to the right compared to the non-binding aptamer control. In EpCAM-negative cells, the corresponding bands of EpCAM-binding and -non-binding aptamers overlap. This demonstrates the selectivity and specificity of the EpCAM aptamer. While this protocol is focused on the EpCAM aptamer, the protocol is applicable to other published aptamers.

A necessary step in anticancer aptamer development is to test its binding to the target. We demonstrate a flow cytometric-based assay to study this binding, emphasizing the importance of including a negative control aptamer and cancer cells that are positive or negative for that particular protein.&#160;

בדיקת קשירה של חלבון פני התא המבוסס על ציטומטריה של זרימה להערכת סלקטיביות וספציפיות של אפטמר אנטי-סרטני

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

רקמת 3D משולב תכנון הנדסי<em&gt; במבחנה</em&gt; /<em&gt; סיליקו</em&gt; דגם גידול ריאות לניבוי יעילות טיפול תרופתי רקעים מוטציוני ספציפיים

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Bioengineering

Quantifying Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in a Tumor Spheroid Model: Application for Drug Discovery

Monoclonal antibody-based immunotherapy targeting tumor antigens is now a mainstay of cancer treatment. One of the clinically relevant mechanisms of action of the antibodies is antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), where the antibody binds to the cancer cells and engages the cellular component of the immune system, e.g., natural killer (NK) cells, to kill the tumor cells. The effectiveness of these therapies could be improved by identifying adjuvant compounds that increase the sensitivity of the cancer cells or the potency of the immune cells. In addition, undiscovered drug interactions in cancer patients co-medicated for previous conditions or cancer-associated symptoms may determine the success of the antibody therapy; therefore, such unwanted drug interactions need to be eliminated. With these goals in mind, we created a cancer ADCC model and describe here a simple protocol to find ADCC-modulating drugs. Since 3D models such as cancer cell spheroids are superior to 2D cultures in predicting in vivo responses of tumors to anticancer therapies, spheroid co-cultures of EGFP-expressing HER2+ JIMT-1 breast cancer cells and the NK92.CD16 cell lines were set up and induced with Trastuzumab, a monoclonal antibody clinically approved against HER2-positive breast cancer. JIMT-1 spheroids were allowed to form in cell-repellent U-bottom 96-well plates. On day 3, NK cells and Trastuzumab were added. The spheroids were then stained with Annexin V-Alexa 647 to measure apoptotic cell death, which was quantitated in the peripheral zone of the spheroids with an automated microscope. The applicability of our assay to identify ADCC-modulating molecules is demonstrated by showing that Sunitinib, a receptor tyrosine kinase inhibitor approved by the FDA against metastatic cancer, almost completely abolishes ADCC. The generation of the spheroids and image acquisition and analysis pipelines are compatible with high-throughput screening for ADCC-modulating compounds in cancer cell spheroids.

Here, we present a method to identify compounds that modulate the ADCC mechanism, an important cancer cell-killing mechanism of antitumor antibodies. The cytotoxic effect of NK cells is measured in breast cancer cell spheroids in the presence of Trastuzumab. Image analysis identifies live and dead killer and target cells in spheroids.

כימות ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים במודל ספרואידי גידול: יישום לגילוי תרופות

Monoclonal antibody-based immunotherapy targeting tumor antigens is now a mainstay of cancer treatment. One of the clinically relevant mechanisms of ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

הערכת היעילות של תרופות למלחמה בסרטן רגישות<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

ניצול של assay כינונה רך אגר מושבה לזיהוי מעכבי tumorigenicity בתאי סרטן השד

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

הערכה ספציפית של תרופות נגד הסרטן

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video