גברת אלסטר, מר Honrath וד&quot;ר ג&#39;יאנג זוכים להערכה לקבלת סיוע טכני יוצא מן הכלל שלהם. כמו כן העריך ד&quot;ר Volz ואת קבוצת המחקר של ד&quot;ר Dandri למתן גישה למכשיר דיגיטלי PCR שלהם.

1. הכנת תרבות מיקס המכילה גם תאים סרטניים ותאים שאינם סרטניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתאים סרטניים מקו תא הוקם MPNST S462 5. השתמש פיברובלסטים כמו התאים שאינם סרטניים 6,7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים פיברובלסטים תרבות הן הגידול במדיום תקן DMEM עם 10% בסרום שור העובר (BSA), 3 גלוטמין מ&quot;מ, 0.1 מ&quot;מ 2-mercaptoethanol, 500 U / פניצילין מ&quot;ל, 500 גר &#39;/ מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין ו פירובט סודיום 1 מ&quot;מ ב 37 ° C ו -5% CO 2 5-7. At-מפגש משנה, למסוק את התאים עם טריפסין 0.05% ו לספור אותם באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 400 תאים סרטניים ו -1,600 תאים שאינם סרטניים יחד היטב בכל צלחת תרבות 96-היטב 0.2 מ&quot;ל בינוני. בהתחשב צמיחה מהירה יותר של תאים סרטניים לאורך תקופת הטיפול של 5 ימים, חלקם הראשוני של תאים סרטניים נקבע ל 25%. הגדרת 4 משכפל עבור כל ריכוז התרופה. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 O / N. </li></ol> 2. דרוטיפול g <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש nilotinib כמו תרופת הבדיקה. הכינו פתרונות המניות של 0, 2, 4 ו -20 מ&quot;מ nilotinib ב DMSO. לדלל כל אחד מהם על ידי 200 של פי 5 מ&quot;ל DMEM בינוני, מתן פתרונות תרופתיים מרוכז פי 2 של 0, 10, 20 ו -100 מיקרומטר 6.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 0.1 מ&quot;ל בינוני מבאר כל ולהוסיף 0.1 מ&quot;ל של המכיל תרופה בינוני. הריכוזים הסופיים הם 0, 5, 10 ו -50 מיקרומטר. המשך דוגרי תאי תרופה המכילה בינונית במשך 5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הטיפול, לבדוק התאים המצורפים באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד ולצלם. לשאוב את המדיום משם, לשטוף את התאים דבקים שרד פעם עם 0.2 מיליליטר PBS. </li></ol> 3. הכנת DNA עבור PCR הדיגיטלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תאים באמצעות מאצ 8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl פתרון תמוגה אלקליין (25 מ&quot;מ NaOH, 0.2 mM EDTA) זה טוב. חותם את הבארות עם רדיד. דגירה את הצלחת על 95 מעלות צלזיוס בתנור או על צלחת חימום למשך 30 דקות. בדוק תחת microscope לוודא שאף תאים שלמים יותר נשארים על פני השטח של הבארות. במקרה התאים לא lyse לחלוטין, להגדיל את זמן החימום או להוסיף חומר ניקוי. להקפיא אותם פעם ב -20 מעלות צלזיוס גם משפר שביר תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl נטרול פתרון (40 מ&quot;מ טריס-HC, pH 4.0) היטב כל אחד. להעביר את כל lysates לתוך בארות U-בצורת צלחת PCR ויבש בתוך Cycler PCR ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 30 דקות. מחדש את lysates עם 20 μl מים מזוקקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Desalt באמצעות Drop-דיאליזה 9 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במסנני קרום עם גודל הנקבובי ממוצע 0.025 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Float את המסנן במים מזוקקים עם למעלה בצד מבריק בבארות של צלחת 12-היטב. להרטיב את המסנן במשך 5 דקות. שים לב, כדי למנוע בועות אוויר בין המסנן והמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את lysates מחדש של כל דגימת משלב 3.1.4 בזהירות על על כל אחת מ -4 תחומי המסנן. מכסים את הצלחת ואת dialyze למשך 30 עד 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצוץ את המים תחת המסנן בלי לדפדף על המסנן ולא להפריע את הטיפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את lysate-טיפות לתוך הבארות של PCR-צלחת חדשה. לייבש את טיפות DNA על ידי חימום על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 30 דקות בתוך Cycler PCR. מחדש את lysates ב 10 מי μl. </li></ol></li></ol> 4. PCR דיגיטלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכיבים קפוא להפשיר כגון DNA, חיץ לערבב assay ב RT, ספין למטה במשך 10 שניות לעבר כוח מקסימלית של כל צנטריפוגות זמין (למשל, VWR מיני צנטריפוגות) ולאחר מכן לשמור אותם על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת מאסטר המכיל את כל המרכיבים למעט DNA (טבלה 1). שקול נפח מת ולחשב מאסטר תערובת כ 10% יותר מהסכום הנדרש. הערה: השתמש primers ו בדיקות בשימוש בערכה המסחרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס את התערובת אב, ספין למטה במשך 10 שניות לעבר כוח מקסימלית של צנטריפוגות כל זמין (למשל, צנטריפוגות מיני VWR) ולחלק 15 μl לכלגם צלחת 96-PCR. הוסף את כל lysate (המכיל DNA) של כל דגימה כדי הבארות המכילות תערובת מאסטר. העברת 20 μl של כל תערובת התגובה לתוך באר בצד מדגם של מחסנית ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 70 μl של שמן גנרטור אגל לבאר כל בצד שמן של מחסנית. סגור את המחסנית עם האטם ולמקם את התפאורה כולה למחולל רביב. התחל דור אגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 40 μl אגל-פתרון לתוך בארות צלחת PCR 96-היטב. חותם את הצלחת עם בנייר כסף ומניחים בצלחת לתוך Cycler PCR. הגדר את הטמפרטורה המכסה ל -105 מעלות צלזיוס, כבש שער ב -2 מעלות צלזיוס / sec. לבצע PCR תוך שימוש בהגדרות בטבלה 2. לאחר PCR, להעביר את הצלחת לקורא אגל ולהתחיל לקרוא. לחלופין, אחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 24 שעות. </li></ol> 5. חישוב שיעור של תאים סרטניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טענו את נתוני PCR הדיגיטליים ולבצע analys האוטומטיהוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שליטה בתוצאות של כל assay באופן ידני על ידי בוחן את ההתפלגות חד ממדית ו -2 ממדים של הטיפין החיוביות ושליליות, ואת בטוח שהם מופרדים היטב ואת קווי הסף היו בעמדות הנכונות. אל תכלול תוצאות שלא עמדו בקריטריונים, למשל, אין הפרדה ברורה של טיפות חיוביות ושליליות, בניתוחים נוספים. העתק את RPP30 NF1 / יחס שנוצר לתוך גיליון Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבת את חלקם של תאים סרטניים כמו: 2 x (1 NF1 / RPP30). </li></ol> 6. שינוי תלוי מינון פרופורציה של תאים סרטניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל-ריכוז תרופה, לחשב את הממוצע ואת סטיית התקן מ -4 המשכפל. מגרש את האמצעים ואת סטיות התקן נגד-ריכוזי התרופה. </li></ol>

<ol>
	<li>Caponigro, G., Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+preclinical+testing+of+cancer+therapeutic+hypotheses.">Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).</li><li>McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tumour-stromal+interactions+in+modifying+drug+response:+challenges+and+opportunities.">The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).</li><li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development.">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li><li>Edwards, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+target+validation+using+patient-derived+cells.">Preclinical target validation using patient-derived cells.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).</li><li>Frahm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+phenotypic+characterization+of+tumor+cells+derived+from+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+of+neurofibromatosis+type+1+patients.">Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients.</a> Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+selectivity+of+nilotinib+on+NF1-associated+tumors+in+vitro.">Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro.</a> J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).</li><li>Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+assessment+of+the+anticancer+drug+response+of+plexiform+neurofibroma+tissue+using+primary+cultures.">Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures.</a> J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).</li><li>Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+an+inexpensive+and+high-throughput+genomic+DNA+extraction+method+for+the+molecular+ecology+of+zooplanktonic+diapausing+eggs.">Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs.</a> Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).</li><li>Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desalting+DNA+by+drop+dialysis+increases+library+size+upon+transformation.">Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).</li><li>Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+head+and+neck+cancer+oncogenome:+widespread+PI3K-mTOR+pathway+alterations+and+novel+molecular+targets.">Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets.</a> Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).</li></ol>

The procedure is patent-protected (10 2013 221 452, Germany)

צעד מפתח כלי genetic- ו מבוסס תא זו להערכת סגוליות תרופה במבחנה הוא קביעת שיעור של תאים סרטניים באמצעות אחד או יותר מאפיינים גנטיים ספציפי גידול. בניגוד לתכונות פנוטיפי קונבנציונליות 7, מאפיינים גנטיים ספציפיים, יציבים וקלים לכמת. לדוגמא, וריאצית מספר מוטציה או עותק ספציפי גידול קיימת אך ורק בתאים הסרטניים אך לא בתאים שאינם סרטניים. כזה הסטיגמה גנטי ניתן באופן מהימן ומדויק לכמת, למשל, באמצעות PCR הדיגיטלי כפי שמודגם במחקר זה. לקבלה הדיגיטלי PCR, טוהר גבוה של DNA אינו הכרחי. עם זאת, Desalting והסרת מולקולות מעכבות נחוצים אשר יכולה להיות מושגת על ידי א-דיאליזה ירידה באמצעות מסנן מתאים. תמוגה בשילוב טיפה-הדיאליזה היא פשוט ומהירה, לא דורשת מכשירים מיוחדים ולכן יכולה להתבצע בכל מעבדה סטנדרטית. אם התאים אינם בריk היטב, יכול להיחשב טיפול נוסף כגון הקפאת התאים ב -20 ° C, הוספת חומר ניקוי ו / או באמצעות פרוטאז. במחקר הנוכחי, את המחיקה הטרוזיגוטיים של גן NF1 שמשה תכונה מסוימת גידולים עבור כימות. באופן דומה, מחיקות של גנים או לוקוסים אחרים יכולות לשמש גם. יתר על כן, מוטציות יכולות לשמש גם לכימות תאים סרטניים. במקרה כזה, מבחני PCR דיגיטליים עבור המוטציה ואת אללים הנורמלי צריכים להיות מאומתים נרחב כדי להבטיח הספציפיות שלהם עבור כל אחד מהם. תלוי מינון פרופורציה של תאים סרטניים מספקת אינדיקציה-סגולי סמים או סלקטיביות. יתר על כן, הוא גם מאפשר בתגובה לחילוץ של תאים סרטניים מן התגובה של תאים כוללים של תרבות מעורבת לתרופה (איור 4). מיצוי אסטרטגיה זו מספקת פתרון עבור הבעיה הטכנית באמצעות תרבויות עיקריות (המכיל הוא גידול ולאn-גידול תאים) עבור בדיקות סמים. Genetic- ותא מבוסס בכלי במבחנה הראה במחקר הנוכחי עשויים ולכן יש פוטנציאל יישום (1) ב-גילוי תרופות שבה היא מספקת פלטפורמה להערכה סגולי סמים או סלקטיביות במבחנה (2) בטיפול בסרטן אישית איפה זה מאפשר תרופות בדיקות בתרבויות עיקריות וכתוצאה מכך עשוי לתרום בחירת התרופה אדג&#39;ובנט כימותרפיה 4. יתר על כן, מנגנון תרופתי של תרופה ניתן ללמוד באמצעות הכלי הזה, מאז שינוי גנטי מסוים או שינויים גנטיים מרובים ניתן בעקבות במהלך-הטיפול התרופתי. קושי בשימוש תרבויות עיקריות אישיות הוא חוסר תכונה גנטית אוניברסלית עבור כימות של התאים הסרטניים. עם זאת, עם מקדמה בשיעור היום רצף שלם של הגנום, הגנים ואזורים שינו בתדירות הגבוהה ביותר ידועים גידולים נפוצים. לדוגמה, בין הראש והצווארגידולים, 71%, 23% ו -22% יש מוטציות TP53, FAT1 וגנים CDKN2A, ו -60%, 34% ו -26% יש מחיקות באזורי הגן של CDKN2A, STK11 ו PTEN, בהתאמה 10. הקרנת 5 עד 10 גנים או / ואזורים כגון באמצעות-רצף ממוקד ו / או דיגיטלי PCR יהיה ולכן סביר לזהות אחד או יותר שינויים גנטיים אשר ניתן להשתמש בהם עבור כימות של תאים סרטניים בתרבות העיקרי נגזר. מגבלה נוספת היא הכמות המספיקה של גידולי כריתה להקמת תרבויות עיקריות. למרות תכונות יתרון ופוטנציאל יישום מבטיח של genetic- ותא מבוסס בכלי במבחנה, מגבלותיו צריכים להישמר נפש שלה בטבע במבחנה יודגש. לדוגמא, ההשפעות השונות או הרעיל של תרופה על תאים סרטניים רשאי למדי בשל הבדל בסוגי תאים (פיברובלסטים לעומת בתאי שוואן) או שלהםמקורות שונים (מאנשים שונים). ההשפעה החזקה יותר של תרופה על תאים סרטניים מאשר תאים שאינם סרטניים עשויה גם להיות מוסברת על ידי העובדה כי לשעבר לגדול מהר יותר מאשר האחרון. והחשוב מכל, תאים בהתנהגות במבחנה שונה מאשר תאים בגוף האדם וכתוצאה מכך, תוצאות הערכה במבחנה לעתים קרובות לא או רק חלקית לשקף את המצב קליני האמיתי. לכן, יעילה, cytotoxicity וספציפית של תרופות שהתקבלו עבור תאים בתרבית הם די טבע סמן ביולוגי, אך אין להם את האמינות של יעילות preclinically הנמדד של אנטיביוטיקה. אף על פי כן, נע שורות תאים לתרבויות מעורבות ו / או תרבויות עיקריות הוא צעד קדימה בהערכה ותוצאת תרופה וספציפית / סלקטיביות במבחנה. עם מאמצים רבים, בתנאים במבחנה ניתן למצוא האפשר מתאם סביר של נתונים במבחנה עם תגובות אמיתיות של חולים, לפחות עבור חלק מתרופות.

Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios. 
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated. 
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">membrane filter of 25 mm diameter</td>
			<td style="width:71px;">Merk-Millipore</td>
			<td style="width:119px;">VSWP 02500</td>
			<td style="width:167px;">for drop-dialysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ddPCR assay for NF1</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>dHsaCP1000177</td>
			<td>FAM-labelled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ddPCR assay for RPP30</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>dHsaCP2500350</td>
			<td>HEX-labelled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QX200</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">186-4001</td>
			<td>the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Droplet oil</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cartriges&#160;</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gaskets</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cartrige holder</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pierceble foil</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>181-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing specificity of anticancer drugs in vitro

הליך להערכה ספציפי של תרופות נגד הסרטן במבחנה באמצעות תרביות המכילות גם תאים סרטניים ולא-סרטניים מודגם. אלמנט המפתח הוא נחישות כמותי של שינוי גנטי ספציפי גידול ביחס רצף אוניוורסלי באמצעות assay PCR דיגיטלי כפולה חללית לבין חישוב בדיעבד של הפרופורציה של תאים סרטניים. את assay מתבצעת על תרבות המכילה תאים סרטניים של קו הוקם ומשובץ-בתאים שאינם סרטניים. התרבות המעורבת מטופל בתרופת מבחן בריכוזים שונים. לאחר הטיפול, ה- DNA הוא מוכן ישירות מתאי הדבק שרדו בבארות של צלחות 96-היטב באמצעות שיטה פשוטה וזולה, ועברתי assay PCR הדיגיטלי כפולה בדיקת למדידת שינוי גנטי ספציפי גידול רצף ייחוס אוניוורסלי . בהפגנה הנוכחית, במחיקה הטרוזיגוטיים של הגן NF1 משמש שינוי גנטי ספציפי הגידולגן RPP30 כמו גן ההתייחסות. באמצעות יחס NF1 / RPP30, חלקם של תאים סרטניים חושב. מאז השינוי תלוי במינון של הפרופורציה של תאים סרטניים מספק אינדיקציה במבחנה עבור סגוליות של התרופה, גנטי מבוסס תאים זה assay במבחנה סביר להניח כי יש פוטנציאל יישום של גילוי תרופות. יתר על כן, עבור סרטן טיפול אישית, כלי genetic- ו מבוסס תאים זה עשוי לתרום לאופטימיזציה של כימותרפיה אדג&#39;ובנטי באמצעות יעילויות בדיקות וספציפיות של תרופות מועמדות באמצעות תרבויות עיקריות של גידולים בודדים.

איכות DNA הוכן באמצעות מאצ משולב / Drop-דיאליזה מספיקה עבור PCR דיגיטלי משביע רצון (איור 1B). עבור 2,000 פיברובלסטים, כ -3,000 ± 500 טיפות חיוביות התקבלו, המקביל ל 75% של 4,000 עותקים הצפויים (שני עותקים בתא אחד). במחקר זה, התאים הסרטניים היו מקו הוקם MPNST S462 אשר ידוע כבעלי מחיקת heterozygotic של גן NF1 5. 50% זה הפחתת מינון הגן זוהתה בבירור על ידי assay PCR הדיגיטלי הכפול (האיור 1B). לעומת זאת, שני עותקים של הגן הזה נמדדו פיברובלסטים. הבדל גנטי בין גידול ותאי שאינו סרטני מאפשר חישוב השיעור של תאים סרטניים בתרביות מעורבות (איור 2). באמצעות מדידת מינון הגנים היחסי של NF1 כדי RPP30, חלקם של תאים סרטניים ב תרבות מעורבת ניתן לקבועבכל-ריכוז התרופה (איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig1.jpg" /> איור 1. דיגיטלי PCR. (א) איור של העיקרון. (ב) assay כפול בדיקה מגלה כמות מופחתת של גן המטרה (NF1) בתאי הגידול MPNST S462 ביחס גן הפניה (RPP30). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig2.jpg" /> איור 2. שיעור מחושב של תאים סרטניים. תאים סרטניים ותאים שאינם סרטניים היו מעורבים ב יחסים שונים זורעים לתוך היטב בכל צלחת 96. לאחר מצורף O / N, התאים היו שנינות lysedמאצ h / Drop-דיאליזה ואת lysates desalted היו נתונים PCR דיגיטלי אשר נתן יחס של NF1 / RPP30. על בסיס יחס זה, חלקם של תאים סרטניים בכל טוב חושב. ממוצע וסטיית תקן של פרופורציה של תאים סרטניים חושבו מתוך 4 משכפל בכל פרופורציה הגדרת. הפרופורציות המחושבות של תאים סרטניים (ציר ה- Y) היו זממו נגד פרופורציות הגדרה (ציר ה- X). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig3.jpg" /> איור 3. תלויי מנת שינוי פרופורציה של תאים סרטניים. (א) תלוי במינון ההפחתה של תאים חיוניים גלויים. (ב) חלקם של תאים סרטניים (ממוצע וסטיית תקן של 4 משכפל) שנמדד<html> יחס של NF1: RPP30, ירד בטווח של 10 - 0 מיקרומטר. באותו מיקרומטר הגבוה ביותר 50 מנה, כמה תאים חיוניים נותרו, כנראה עקב השפעה רעילה לכל התאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig4.jpg" /> . איור 4. תגובת הפרדה של תאים סרטניים מזו של תאים שאינם סרטניים (א) כדאיות או / ו תרבות תאים כוללים ניתן למדוד באמצעות מבחנים קונבנציונליים; שיעור של תאים סרטניים ניתן לקבוע באמצעות ההליך הפגין במחקר הנוכחי. (ב) באמצעות שני פרמטרים, תגובה של תאים הכוללים בתרבות מעורבת לתרופה ניתן לחלק התגובה של התאים הסרטניים והתגובה של התאים שאינם סרטניים..com / קבצים / ftp_upload / 53,752 / 53752fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"></td><td style="width:171px;"> תגובה 1 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> 2 x ddPCR Supermix </td><td style="width:171px;"> 12 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> תמהיל Assay עבור NF1 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> תמהיל Assay עבור RPP30 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> HaeIII </td><td style="width:171px;"> 0.6 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> סיכום ביניים </td><td style="width:171px;"> 15 </td><td style="width:99px;"> תערובת מאסטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> DNA </td><td style="width:171px;"> 9 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> סה&quot;כ </td><td style="width:171px;"> 24 </td><td style="width:99px;"> תערובת PCR סופית </td></tr></tbody></table> טבלה 1 הגדרת התגובה Dual ddPCR <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שָׁלָב </td><td> פעולה </td><td> טֶמפֶּרָטוּרָה </td><td> זְמַן </td><td> מחזורים </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Polymלמחוק הפעלה </td><td> 95 ° C </td><td> 10 דק &#39; </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> denaturation DNA </td><td> 94 ° C </td><td> 30 שניות </td><td rowspan="2"> 40 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> חישול / exetension </td><td> 60 ° C </td><td> דקה 1 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> שחרור משרות פולימראז </td><td> 98 ° C </td><td> 10 דק &#39; </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> המתנה (אופציונלי) </td><td> 4 ° C </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 2 הגדרות Cycler PCR

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro at JoVE.com

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

מטרת פרוטוקול זה היא להעריך ספציפי של תרופות נגד סרטן במבחנה באמצעות תרבויות מעורבות המכילות הוא גידול ותאי שאינו סרטני.

הערכה ספציפית של תרופות נגד הסרטן<em&gt; במבחנה</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

assessing-specificity-of-anticancer-drugs-in-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

9.4K Views.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf.  מטרת פרוטוקול זה היא להעריך ספציפי של תרופות נגד סרטן במבחנה באמצעות תרבויות מעורבות המכילות הוא גידול ותאי שאינו סרטני. 

Video: Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Transgenic and knockout mice have been powerful tools for the investigation of the physiology and pathophysiology of airways1,2. In vitro tensometry of isolated tracheal preparations has proven to be a useful assay of airway smooth muscle (ASM) contractile response in genetically modified mice. These in vitro tracheal preparations are relatively simple, provide a robust response, and retain both functional cholinergic nerve endings and muscle responses, even after long incubations.
Tracheal tensometry also provides a functional assay to study a variety of second messenger signaling pathways that affect contraction of smooth muscle. Contraction in trachea is primarily mediated by parasympathetic, cholinergic nerves that release acetylcholine onto ASM (Figure 1). The major ASM acetylcholine receptors are muscarinic M2 and M3 which are Gi/o and Gq coupled receptors, respectively3,4,5. M3 receptors evoke contraction by coupling to Gq to activate phospholipase C, increase IP3 production and IP3-mediated calcium release from the sarcoplasmic reticulum3,6,7. M2/Gi/o signaling is believed to enhance contractions by inhibition of adenylate cyclase leading to a decrease in cAMP levels5,8,9,10. These pathways constitute the so called "pharmaco-contraction coupling" of airway smooth muscle11. In addition, cholinergic signaling through M2 receptors (and modulated by M3 signaling) involves pathways that depolarize the ASM which in turn activate L-type, voltage-dependent calcium channels (Figure 1) and calcium influx (so called "excitation-contraction coupling")4,7. More detailed reviews on signaling pathways controlling airway constriction can be found4,12. The above pathways appear to be conserved between mice and other species. However, mouse tracheas differ from other species in some signaling pathways. Most prominent is their lack of contractile response to histamine and adenosine13,14, both well-known ASM modulators in humans and other species5,15.
Here we present protocols for the isolation of murine tracheal rings and the in vitro measurement of their contractile output. Included are descriptions of the equipment configuration, trachea ring isolation and contractile measurements. Examples are given for evoking contractions indirectly using high potassium stimulation of nerves and directly by depolarization of ASM muscle to activate voltage-dependent calcium influx (1. high K+, Figure 1). In addition, methods are presented for stimulations of nerves alone using electric field stimulation (2. EFS, Figure 1), or for direct stimulation of ASM muscle using exogenous neurotransmitter applied to the bath (3. exogenous ACH, Figure 1). This flexibility and ease of preparation renders the isolated trachea ring model a robust and functional assay for a number of signaling cascades involved in airway smooth muscle contraction.

In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Transgenic mice have been extremely useful in ascribing physiological function to genes. As such, research in general, and functional studies of airway, in particular, have undergone a remarkable shift toward murine models. Here we provide protocols for in vitro trachea constriction studies to evaluate smooth muscle function in murine airway.

במדידות חוץ גופית של היצרות קנה הנשימה באמצעות עכברים

Transgenic and knockout mice have been powerful tools for the investigation of the physiology and pathophysiology of airways1,2. In vitro tensometry of ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

הערכת שינויים teratogenic במודל דג הזברה של חשיפה אלכוהול עוברית

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic Therapy is a novel approach for a more tumor selective treatment.
Photodynamic Therapy (PDT) that makes use of a nontoxic photosensitizer (PS), which, upon activation with light of a specific wavelength in the presence of oxygen, generates oxygen radicals that elicit a cytotoxic response1. Despite its approval almost twenty years ago by the FDA, PDT is nowadays only used to treat a limited number of cancer types (skin, bladder) and nononcological diseases (psoriasis, actinic keratosis)2.
The major advantage of the use of PDT is the ability to perform a local treatment, which prevents systemic side effects. Moreover, it allows the treatment of tumors at delicate sites (e.g. around nerves or blood vessels). Here, an intraoperative application of PDT is considered in osteosarcoma (OS), a tumor of the bone, to target primary tumor satellites left behind in tumor surrounding tissue after surgical tumor resection. The treatment aims at decreasing the number of recurrences and at reducing the risk for (postoperative) metastasis.
In the present study, we present in vitro PDT procedures to establish the optimal PDT settings for effective treatment of widely used OS cell lines that are used to reproduce the human disease in well established intratibial OS mouse models. The uptake of the PS mTHPC was examined with a spectrophotometer and phototoxicity was provoked with laser light excitation of mTHPC at 652 nm to induce cell death assessed with a WST-1 assay and by the counting of surviving cells. The established techniques enable us to define the optimal PDT settings for future studies in animal models. They are an easy and quick tool for the evaluation of the efficacy of PDT in vitro before an application in vivo.

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

The protocol reported here allows the evaluation of the efficacy of photodynamic therapy (PDT) in cell lines and the optimization of the PDT settings before applying the therapy in animal models.

ציטוטוקסיות יעילות של טיפול פוטודינמי בתאי אוסטאוסרקומה<em&gt; במבחנה</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

הערכת מחסומי transmissible מינים ספגו מוח עם<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay המרת חלבון הפריון

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Use of Rabbit Eyes in Pharmacokinetic Studies of Intraocular Drugs

The intraocular route of drug administration enables the delivery of high concentrations of therapeutic drugs, while minimizing their systemic absorption. Several drugs are administered into the anterior chamber or vitreous, and the intraocular injection has been effective in curing various intraocular diseases. Rabbit eyes have been widely used for ophthalmic research, as the animal is easy to handle and economical compared to other mammals, and the size of a rabbit eye is similar to that of a human eye. Using a 30 G needle, drugs can be injected into the intracameral and intravitreal spaces of rabbit eyes. The eyeballs are then frozen until analysis, and can be divided into the aqueous humor, vitreous, and retina/choroid. The vitreous and retina/choroid samples can be homogenized and solubilized before analysis. Then, immunoassays can be performed to measure the concentrations of intraocular drugs in each compartment. Appropriate pharmacokinetic models can be used to calculate several parameters, such as the half-life and maximum concentration of the drug. Rabbit eyes can be a good model for pharmacokinetic studies of intraocular drugs.

Rabbits are widely used to study the pharmacokinetics of intraocular drugs. We describe a method for conducting pharmacokinetic studies of intraocular drugs using rabbit eyes.

שימוש עיני ארנב ב פרמקוקינטיקה מחקרים של סמי תוך עיניים

The intraocular route of drug administration enables the delivery of high concentrations of therapeutic drugs, while minimizing their systemic absorption. ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin-induced נפיחות מעיים Organoids: An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay עבור הערכת תגובה לתרופה בחולי סיסטיק פיברוזיס

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

ניתוח אופטימלי של<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; כבדית steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי הקרנה במחקר שמיעה

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to moderate level of increase in high-density lipoprotein (HDL) cholesterol in plasma. However, a possible role of these drugs in altering morphology and distribution of cholesterol particles is poorly understood. Here, we describe the in vitro evaluation of lipid-lowering drug effects in modulating morphological features of cholesterol particles using the plaque array method in combination with imaging flow cytometry. Image analyses of the cholesterol particles indicated that lovastatin, simvastatin, ezetimibe, and atorvastatin induce the formation of both globular and linear strand-shaped particles, whereas niacin, fibrates, fluvastatin, and rosuvastatin induce the formation of only globular-shaped particles. Next, purified very low-density lipoprotein (VLDL) and LDL particles incubated with these drugs showed changes in the morphology and image texture of cholesterol particles subpopulations. Furthermore, screening of 50 serum samples revealed the presence of a higher level of linear shaped HDL cholesterol particles in subjects with dyslipidemia (mean of 18.3%) compared to the age-matched normal (mean of 11.1%) samples. We also observed considerable variations in lipid-lowering drug effects on reducing linear shaped LDL and HDL cholesterol particles formation in serum samples. These findings indicate that lipid-lowering drugs, in addition to their cell-mediated hypolipidemic effects, may directly modulate morphology of cholesterol particles by a non-enzymatic mechanism of action. The outcomes of these results have potential to inform diagnosis of atherosclerosis and predict optimal lipid-lowering therapy.

The objective of this study was to evaluate in vitro lipid-lowering drug effects in modulating the morphology of cholesterol particles. Comparison of lipid-lowering drugs revealed variations in their effect in modulating the morphological features of cholesterol particles.

דיפרנציאלית השפעות תרופות להורדת שומנים בדם להתכוונן מורפולוגיה של כולסטרול חלקיקים

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard therapy, a considerable number of CLI patients are not suited for either surgical or endovascular revascularization. Angiogenic therapies are emerging as an option for these patients but are currently still under investigation. Before application in humans, those therapies must be tested in animal models and its mechanisms must be clearly understood. An animal model of hindlimb ischemia (HLI) has been developed by the ligation and excision of the distal external iliac and femoral arteries and veins in mice. A comprehensive panel of tests was assembled to assess the effects of ischemia and putative angiogenic therapies at functional, histologic and molecular levels. Laser Doppler was used for the flow measurement and functional assessment of perfusion. Tissue response was evaluated by the analysis of capillary density after staining with the anti-CD31 antibody on histological sections of gastrocnemius muscle and by measurement of collateral vessel density after diaphonization. Expression of angiogenic genes was quantified by RT-PCR targeting selected angiogenic factors exclusively in endothelial cells (ECs) after laser capture microdissection from mice gastrocnemius muscles. These methods were sensitive in identifying differences between ischemic and non-ischemic limbs and between treated and non-treated limbs. This protocol provides a reproducible model of CLI and a framework for testing angiogenic therapies.

Here, a critical hindlimb ischemia experimental model is presented followed by a battery of functional, histologic and molecular tests&#160;to assess the effectiveness of angiogenic therapies.&#8203;

הערכת אנגיוגנזה תרפויטי במודל של מורטין של איסכמיה החוצה

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

הערכה ספציפית של תרופות נגד הסרטן

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

במדידות חוץ גופית של היצרות קנה הנשימה באמצעות עכברים

הערכת שינויים teratogenic במודל דג הזברה של חשיפה אלכוהול עוברית

ציטוטוקסיות יעילות של טיפול פוטודינמי בתאי אוסטאוסרקומה

הערכת מחסומי transmissible מינים ספגו מוח עם

שימוש עיני ארנב ב פרמקוקינטיקה מחקרים של סמי תוך עיניים

Forskolin-induced נפיחות מעיים Organoids: An

ניתוח אופטימלי של

Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו

דיפרנציאלית השפעות תרופות להורדת שומנים בדם להתכוונן מורפולוגיה של כולסטרול חלקיקים

הערכת אנגיוגנזה תרפויטי במודל של מורטין של איסכמיה החוצה