ברצוננו להודות לד&quot;ר גארי נולאן מאוניברסיטת סטנפורד למתן קו תא אריזת הפניקס GP לייצור חלקיקי retroviral. אנו מודים לד&quot;ר רוג&#39;ר Tsien באוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו למתן td עגבניות. כמו כן, אנו רוצים להודות למתקן סן דייגו סטייט cytometry הזרימה Core השירות והעזרה שלהם.

1. הכנת תאי יונקים, ייצור נגיפים ותמרה לBarcoding הגנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 2.5 x 10 6 תאים חסיד בצלחת 10 סנטימטר (או confluency סביב 50-60%) יום אחד לפני transfection במדיום הנשר (DMEM) עם 10% עוברי עגל בסרום (FCS) שונה Dulbecco. לתא-קו אריזת שימוש ייצור retroviral של בחירה כגון הפניקס-GP (מתנה מסוג גארי נולאן, אוניברסיטת סטנפורד). הערה: קו תא אריזה ביציבות מבטאת חלבוני Gag ופול להיווצרות חלקיקי retroviral בטראנס. להפוך תאים בטוחים בריאים ודבקו בצלחת בשכבה, לפני transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות מאוחר יותר, להכין את תערובת transfection DNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 125 μl של סרום ללא DMEM להוסיף וקטור 3 מיקרוגרם מעטפת וירוס לפוחי Stomatitis גליקופרוטאין (PCI-VSVG) ו -3 מיקרוגרם של וקטור העברה נושא את גן חלבון פלואורסצנטי של עניין. לערבב ולהוסיף 15 μl של polyethylimine (2 מ&quot;ג / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תערובת בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות ולהוסיף לתאים הנפתח חכם. הערה: Polyethylimine מתווסף לתערובת הומוגנית DNA כמגיב transfection ליצירת polyplexes. על מנת לקבל את החלקיקים נגיפיים ביצוע סמני חלבון ניאון שונים, לבצע כל transfection באופן עצמאי עם הסמן של בחירה. זכור כי וקטור העברת retroviral הוא סביב 7 קילו באורך ולא ניתן לארוז אם מעל 10 קילו-בייט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס. על מנת להגדיל את צלחות מקום ייצור נגיפיות על 30 מעלות צלזיוס או 32 ° C במקום. הערה: ניתן להחליף 24 תקשורת transfection הודעה hr עם 7 מיליליטר של תקשורת טריות, ואם כי זה עשוי לשפר את בריאות תא זה עלול להפחית עומס נגיפי בsupernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר transfection 48 שעות לאסוף את החלקיקים המכיל supernatant ויראלי ומסנן עם מסנן 0.45 מיקרומטר polytetrafluoroethylene. השתמש supernatant ויראלי טרי שנאסף עבור התמרה. Otherwise לשמור supernatant בaliquots ב -80 ° C ולהימנע להקפיא להפשיר. זכור כי כייל נגיף יקטן כנראה עד 50% בכל מחזור ההקפאה-הפשרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שורת תאי צלחת של בחירת 24 שעות לפני התמרה אם חסיד, או מייד לפני התמרה אם לא חסיד. זרעי 2.0 x 10 5-3.0 x 10 5 תאים חסיד (כאן הא 7.5.1 וHEK 293T) או 5.0 x 10 5 ל 1 x 10 6 תאים שאינם חסיד (כאן SupT1) לכל גם בצלחת 6-היטב. הערה: הקפד לכייל את מספר התאים שנזרע לפני התמרה, במיוחד לתאים חסיד, כך שתאים להשיג confluency של כ -60% בזמן של התמרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיקרוגרם / מיליליטר polybrene (ברומיד hexadimethrene) לתאי זרע ולאחר מכן להוסיף supernatant ויראלי שנאסף בעבר להשיג סביב 20-40% זיהום (כאן 2 מיליליטר). הערה: משרד הפנים או אחוז מהזיהום הוא בעיקר שרירותית, כמו מיון יאפשר להגביר כל subpopulatיון של תאים. כמובן, שיעור גבוה יותר של זיהום מקל ומאיץ את התהליך של הגברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transduce תאים על ידי צנטריפוגה בהרוטור דלי תלייה ב 1500 XG במשך 120 דקות ב 32 מעלות צלזיוס. Resuspend תאים שאינם חסיד עם תקשורת טרי לפני הדגירה. לתאים חסיד, להחליף עם תקשורת 24 לאחר התמרה-hr טרי. הערה: מומלץ לאטום את הצלחות לפני צנטריפוגה עם parafilm כדי למנוע שפיכה מעל. כדי להגדיל את המגוון גנטי של תאי המינימרקטים, transduce תאים עם חלקיקים נגיפיים ביצוע חלבונים שונים ניאון (המתקבלים משלב 1.4). בעת בחירת סמני ניאון, לוודא שהם תואמים את המכשור ויש להם פרמטרים ניאון להבחין. </li></ol> 2. בחירה והגברה של תאי המינימרקטים גנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח תאי יונקים transduced על ידי הזרימה cytometry לפחות 72 שעות לאחר התמרה לכמת את שיעור אחוז של התמרה. השתמש בשורת תאים-transduced שאינו דומה כביקורת שלילית. הערה: ככל מיון ישמש לטהר אוכלוסיות בודדות המינימרקטים תא, שיעור אחוז גבוה של התמרה ראשונית, ואילו לא נחוץ, צריך להאיץ את התהליך של הגברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנצל את התא-סדרן של בחירה כדי לקבל את התאים המבטאים את החלבון של עניין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם כך, להבטיח את השערים מוגדרים כהלכה בערוצים הנכונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם כך להשתמש באותו קו התא נאיבי כביקורת שלילית ולהגדיר את מתח פרמטר / ערוץ, כך שהאוכלוסייה השלילית היא מתחת לערך של 10 3 על כל ציר ניאון. לקבוע gating לקרינה חיובית כאירועים המופיעים מעל זה של הביקורת השלילית עבור כל ערוץ ניאון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להיות מודע לכך שכל מכשיר עשוי להשתנות והמתח הנכון לקביעת gating צריך להיות בהתאם, מה שהופך את בקרות חיוביות ושליליות הכרחיים בכל expהתקנת erimental. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגילוי הקרינה בהגדרת ניסוי זה להשתמש בערוץ FITC (מסנן 530/30-פס, ולפניו לעבור סינון ארוך 502) לeGFP, ערוץ PE (מסנן 585/42-פס, ולפניו מסנן 556 מסירה ארוכה) לtd עגבניות , וערוץ APC (מסנן 660/20 להקה לעבור) לE2 Crimson. הערה: לייזר 488 ננומטר מרגשת eGFP וtd עגבניות תוך E2 Crimson מתרגש על ידי לייזר 633 ננומטר. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות חרוטי מיין ל -15 מיליליטר עם 1 מיליליטר של 100% FCS. הערה: התהליך של מיון אוכלוסיות תאי ניאון אינו חובה כאחד ישירות יכול להמשיך עם הסוג של שיבוטים בודדים (ראה להלן). מיון אוכלוסיות חזק המבוססות על הקרינה נבחרה מבטיח אוכלוסיית גיבוי לבחירה עתידית של שיבוטים בודדים. זכור כי תאים בודדים הם בזמנים קשים לגדול תוך אפשר להקפיא אוכלוסייה גדולה של תאים בקלות, ולאחר מכן הפשירה ומוגברת בשלב מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Spבמורד האוכלוסיות הממוינים בצנטריפוגה הרוטור דלי תלוי ב524 גרם ב 32 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עד גלולה תאים. להשעות מחדש ב 1 מיליליטר של תקשורת טריות, ומחדש צלחת תאים כך שconfluency התא הוא מתחת ל -60%, כדי לאפשר צמיחה והחלוקה לפחות יומיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמא, תאים חסיד צלחת בסביבות 3 x 10 5 תאים ב 2 מיליליטר של תקשורת בכל טוב בצלחת 6-היטב ו- 2 x 10 6 תאים ב 2 מיליליטר של תקשורת בצלחת 6 סנטימטר. השתמש DMEM לתאים חסיד וRPMI לתאים שאינם חסיד (או כל מדיום שצוין, אם נדרש). הנח תאים מצופים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים כדי לאפשר להגברה. </li></ol></li></ol> 3. לקבל משובטות אוכלוסיות של תאי המינימרקטים גנטי בעוצמות שונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג אוכלוסיות משובטים מתאי transduced במקור (שלב 1.7) או מהאוכלוסייה הממוינת (שלב 2.3). הערה: פעולה זו תבטיח רמה שווה או דומה של ביטוי חלבון פלואורסצנטי בין כל התאים בתוך האוכלוסייה (אוכלוסייה הדוקה עם קורות חיים קטנים בעוצמת הקרינה ממוצעת של עד 40%). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם כך, תאי מין יחידים ל96-גם צלחות עם יחידה בתצהיר תא אוטומטי (ACDU). קבע שערים למיון על פי אוכלוסיות של עניין. שערים להבטיח נקבעים יומן בקנה מידה אחד לפחות מלבד להשיג אוכלוסיות מובחנות בעת בחירת תאים בעוצמות ניאון שונות. להליך המוצג כאן, להשתמש באותו cytometry הזרימה ניסיוני שהוקם כאחד מתואר בשלב 2.2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר שיבוטים בודדים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס לפחות 2 שבועות. בתהליך של הגברה לנתח את התאים תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שאוכלוסיות גדלו נובעות מהתאים בודדים ולא מאחד או יותר. הערה: זכור כי סדרן יציבו תא אחד בכל טוב בממוצע, ובעוד כמה בארות לא יכולות להיות כל תא בכל, אולי לאחרים יש יותר מאחד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח שpopulation נובע מתא אחד בלבד, להיות מאוד עדין עם הצלחת ולא להפריע לבארות על ידי pipetting. שים לב לצלחת, גם על ידי כן, מתחת למיקרוסקופ. הערה: בעוד תאים בודדים עשויים לעתים להיות קשים לזהות, ברגע שהם מתחילים החלוקה הם יהיו קלים לזיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להיות מודע לכך שלעתים קרובות &#39;הגוש של התאים בשולי. זורק אותם הבארות שבו ניתן לצפות אוכלוסיות משובטים מרובות ולשמור על אלה שיש לי אוכלוסייה אחת חזק. הערה: מומלץ להעביר אותם לתוך צלחות גדולות יותר להגברה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך האוכלוסיות המשובטים המשוערות על ידי ניתוחם על ידי cytometry זרימה. להשוות אותם לביקורת שלילית ניצול אותה הזרימה cytometry התקנה ניסיונית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח רק אחוז מהמדגם ולשמור את שאר כגיבוי. בחר האוכלוסיות ביותר המובהק נפרדות המבוססות על עוצמה ואטימות של האוכלוסייה ממוצעת. להגביר אותם לפי צורך או להקפיא מניות בהקפאת תקשורת עם גליצרול 20% ב -80 ° C לפרקי זמן קצרים או חנקן נוזלי למשך זמן ארוך יותר. הערה: זכור כי אוכלוסייה &quot;אמיתית&quot; משובט צריכה דפוס הקרינה חזק מאוד. </li></ol></li></ol> 4. ודאו יכולות Multiplexing לתפוקה גבוהה הקרנה (HTS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב כמה שיותר אוכלוסיות משובטים שונות בהתאם לצורך שיכול להיות מנוצל נוסף בפורמט מרובב. בחר שיבוטים עם קליטה / ספקטרום פליטה להבחין ו / או בעוצמות שונות. אם נעשה שימוש בפורמט צלחת 96-היטב, אשר מתאימה לHTS, זרע 50,000 תאים ב200 μl בכל טוב. הערה: זכור כי מספר התאים הוא אומדן בלבד ועשוי להשתנות בהתאם לסוג תא ובין אם מדובר בחסיד או לא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את המדגם באמצעות זרימת cytometry כדי להבטיח שכל אחד משורות תאים העצמאיים שהוקמו ניאון ניתן להבחין בין זה לזה. לפני הניתוח להכין שליליובקרות צבע אחד לפרמטרים שנקבעו וערכי פיצוי. הערה: הגדרת הפרמטרים להבחנה ברורה האוכלוסיות המעורבות תאפשר להם להיות מנוצלת נוספת בפורמט מרובב. </li></ol> 5. להתאים שורות תאים גנטי המינימרקטים ליישום הביולוגי של בחירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transduce הוקמו קווי המינימרקטים גנטיים תא עם חלקיקים נגיפיים המכילים אלמנטי assay של בחירה, כפי שמתוארים כאן בStolp et al., 2013 59. זכור כי assay של בחירה צריך לכבוש ערוץ ניאון נוסף והבחנה ולכן הוא יועבר לשורת תאי המינימרקטים המתאימה. הערה: כל שורת תאי המינימרקטים יכולה לשאת assay שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי המינימרקטים מיון גנטי ניאון עבור אלה המכילים אלמנטי assay. יכולים להיות מהונדסים אלמנטי Assay מצמידים תג או חלבון פלואורסצנטי (כמו היתוך או באמצעות אתר כניסת הריבוזום פנימי) f: הערהאו איתור פשוט באמצעות מערבי סופג, cytometry זרימה או מיקרוסקופ. המערכת מנוצלת בפרוטוקול זה מסתמכת על ביטוי משטח epitope HA לבד, או עם ביטוי epitope דגל נוסף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכתים את האוכלוסיות המשובטים מכילות assay עם נוגדני מצמידי HA וAPC-fluorescently. לאחר מכן לנתח את האוכלוסיות המשובטים עם אנטי-דגל ומכתים נוגדן FITC- מצומדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקוב אחר בחזרה assay, לנתח או &quot;לפענח&quot; האוכלוסיות בערוץ המתאים שבו ניתן להבחין שורות תאי המינימרקטים שונות גנטי. כאן, לפענח את טיבו של המצע על ידי ניתוח בערוץ PE לגילוי עגבניות td. </li></ol></li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

הנה שני הליכים מבוססים היטב כבר בשילוב; הנדסה גנטית באמצעות טכנולוגיה וזיהוי של חלבוני ניאון ניצול זרימת cytometry retroviral. barcoding הגנטי ניאון המבוסס על חלבונים לייצור של שורות תאים ייחודיות מספק דרך חזקה ופשוטה ליישומים מרובבים. יצירת תאי המינימרקטים מהונדסים גנטי באמצעו?...

טכנולוגיות כגון ספקטרוסקופיה הקרינה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי וcytometry זרימה, כל להסתמך על הקרינה, רכוש ניצל נרחב ביישומים ביוכימיים, ביו-רפואיים, וכימיים. הקרינה, בין אם פנימי או באמצעות תיוג, נוצל לניתוח דפוסי חלבון ביטוי ופרופילים, גורל תא, אינטראקציות חלבון ותפקודים ביולוגיים 1-9, ובאמצעות הקרינה / העברת אנרגיית תהודת פורסטר לצורך זיהוי של אינטראקציות biomolecule ושינויי קונפורמציה 10-13. מאז את בידודו של חלבון Aequorea ויקטוריה הירוק הניאון (GFP) 14, הגילוי של חלבוני ניאון טבעיים נוספים מצורבים אחרים, במיוחד אלמוגים, במידה רבה הגדיל את מספר חלבוני ניאון הקיים עם ספקטרום עירור / פליטה להבחין. אלה, יחד עם ההקדמה של מוטציות בגנים שלהם 15-19, havהדואר הרחיב עוד יותר את האפשרויות, קבלת צבעים נכונים של חלבוני ניאון זמינים למדענים המנצלים מיקרוסקופיה, cytometry זרימה וטכנולוגיות מבוססי הקרינה אחרות למחקר שלהם. במקביל, אם כי באופן עצמאי, הפיתוח של טכנולוגית retroviral אופן דרסטי הקל הביטוי היציב של מידע גנטי מחוץ לרחם בתאי יונקים 20-23. לכן אין זה מפתיע כי טכנולוגיה זו נעשתה שימוש כדי להעביר את הגנים של חלבוני ניאון למספר רחב של סוגי תאים ורקמות 24-28 או לייצור בעלי החיים מהונדסים 29-31. בעקבות הטבע של רטרווירוסים, המידע הגנטי של החלבון פלואורסצנטי מחוץ לרחם הוא הציג בתוך הגנום של התא 32 והתא הופך ניאון &#39;לever&#39;. מאפיין זה מאפשר מעקב אחר גורל תא, או של תא בודד בתוך אוכלוסייה של תאים. התא עכשיו הניאון יש בכך אקיאדום biosignature משלו ויכול להיות מוגדר כהמבורקד. biosignature הייחודי שלה מזהה אותו מהתאים אחרים, וחשוב מכך, מבדיל אותו מהתאים גנטי מניפולציות להביע חלבוני ניאון שונים עם ספקטרום קליטה / פליטה להבחין. יישומים ביולוגיים כגון המעקב של גורמי תכנות מחדש לקראת pluripotency 33, הניתוח של גורמי subnuclear להבהרת לוקליזציה nucleolar 34, הבנייה של פלסמידים כתב ניאון ללימודי תעתיק 35 או התיוג הגנטי של תאי עצב לחקר ארכיטקטורת רשת עצבית 36 , הן רק ארבעה דוגמאות של רב שנצלו גני חלבון פלואורסצנטי שונים עבור אותו התקנה ניסיונית. Cytometry זרימה כבר בשימוש נרחב לניתוח של תהליכים ביולוגיים ברמת התא הבודד, כגון ביטוי גנים, מחזור תא, אפופטוזיס, ואיתות באמצעות phosphorylation 37-43 .the ביטוי יציב של גני חלבון פלואורסצנטי בתאי יונקים שיפר עוד יותר את השירות של הזרימה cytometry לאינטראקציות תא ניתוח 38,44 ויגנד לקלוט 45. יכולות משופרות אפשרו זרימת cytometry להפוך למתודולוגיה שימוש נרחב לתפוקה גבוהה וגבוה תוכן הקרנת 46. למרות המספר כעת המורחב של fluorometers ורובוטיקה טכנולוגיות שיכולים מערכות צלחת זוג קורא, הדמיה וcytometry זרימה, נראה שיש חוסר בתכנון ניסוי שיכול לנצל ולהתאים את יכולות טכנולוגיות משופרות אלה. מתודולוגיות מבוססות תאים מהיר, אמינות, פשוטות וחזקה יש צורך באופן דרסטי עבור יישומים מרובבים שיחזקו את יכולת תפוקה גבוהה. הדבר נכון במיוחד בתחום של גילוי תרופות שבו מבחני מבוססי תאי הנדסה בפורמט ריבוב יכולים לשפר את הכח של הקרנת תפוקה גבוהה 39,47-50 </sup&gt;. ריבוב, שכן היא מאפשרת ניתוחים בו זמנית במדגם אחד, משפר עוד יותר את יכולות תפוקה גבוהה 51-54. barcoding הגנטי ניאון לא רק מאפשר לריבוב אלגנטי, אלא גם, מהונדס פעם, עוקף את הצורך של פרוטוקולי זמן רב, מפחית את עלויות מלווים בנוגדנים, חרוזים וכתמים 39,52,55, ויכול להפחית את מספר המסכים הנדרש לגבוה יישומי תפוקה. יש לנו תארנו לאחרונה איך retroviral טכנולוגיה יכול לשפר את הריבוב דרך barcoding הגנטי ניאון עבור יישומים ביולוגיים, בהבעת assay שפותח בעבר כדי לעקוב אחר פעילות פרוטאז HIV-1 56,57 עם גרסאות קליניות נפוצות שונות 58. המתודולוגיה מוסברת באופן תיאורי יותר התמקדות על איך לבחור ולהגביר תאי המינימרקטים גנטי ניאון ואיך לייצר פנלים של אוכלוסיות משובטים להביע חלבוני ניאון שונים ו / או intensit הקרינה שונהies. פנלים של אוכלוסיות תאים להבחין בהתבסס על מאפייני הניאון שלהם לשפר את יכולות מרובבות, אשר ניתן לניצול נוסף בשילוב עם מבחני מבוססי תאים שהתמודדות עם שאלות ביולוגיות שונות. הפרוטוקול מתאר גם כיצד להנדס פנל של תאי המינימרקטים נושא אחד מבחני מבוססי תאים שפותחו בעבר במעבדה, כמו בדוגמה של 59. פרוטוקול זה ולכן לא נועד להראות את הטכנולוגיה מבוססת היטב retroviral / lentiviral להעברה גנטית, את הערך של חלבוני ניאון או היישומים של זרימת cytometry 60,48 אלא כדי להראות את כוח שיפור של שילוב שלושה עבור יישומים מרובבים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:160px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:515px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10mL syringes</td>
			<td style="width:160px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td>used for filtering the virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45&#181;m plytetrafluoroethylen filter</td>
			<td style="width:160px;">pall corporation</td>
			<td>4219</td>
			<td>used for filtering the virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">45000-304</td>
			<td>cell growth media for HEK 293T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEI (Polyethylenimine)</td>
			<td style="width:160px;">poly sciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>&#160;2mg/mL concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Hanging bucket centrifuge (refrigerated)</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5805 000.017</td>
			<td>used for spin infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PBS (phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>used for washing of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polybrene (hexadimethreen bromide)</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689</td>
			<td>Used to increase viral infection efficiency.&#160; Used at a 5&#181;g/mL concentration.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">FACSAria</td>
			<td style="width:160px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>instrument used for sorting cell populations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">FACSCanto</td>
			<td style="width:160px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>instrument used for cell analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Phoenix-GP</td>
			<td style="width:160px;">Gift from Gary Nolan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cell line used to produced retroviral particles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:160px;">Mediatech</td>
			<td>MT35015CV&#160;</td>
			<td>used for cell growth and sorting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#160;SupT1 cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td>CRL-1942</td>
			<td>Human T lymphoblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>cell growth media for SupT1 cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic barcoding with fluorescent proteins for multiplexed applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

ניאון Multiplexing גנטי המינימרקטים תאים לצורך היישומים ביולוגיים יושג רק פעם אחת אוכלוסיות משובטים בודדות כבר נוצרו. הריבוב הוא יעיל ביותר כאשר יש לי אוכלוסיות המינימרקטים מאפייני ניאון מובהקים ברורים עם חפיפה ספקטרלית מינימאלית. הדוגמא שמוצגת באיור 1 עם אוכלו...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications at JoVE.com

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Barcoding הגנטי עם חלבונים ניאון עבור יישומי Multiplexed

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

genetic-barcoding-with-fluorescent-proteins-for-multiplexed

Research

JoVE Journal

Biology

9.2K Views.  San Diego State University. Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications. 

Video: Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

מחקרים גנטיים של חלבונים תיקון דנ&quot;א אנושי באמצעות שמרים כמודל למערכת

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

תיוג פלורסנט של COS-7-SNAP הבעת תג חלבונים Fusion עבור דימות תא חי

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

מערכת סגורה Cell תרבות פרוטוקול באמצעות כלי HYPERStack עם טכנולוגיה חומר חדיר גז

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

מדידה אבסולוטית קוונטית תשואה של דוגמאות אבקת

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.