We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung f&#252;r Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung f&#252;r Herzforschung and Deutsche Gesellschaft f&#252;r Thorax-, Herz- und Gef&#228;sschirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum f&#252;r Herz- und Kreislaufforschung S&#228;ule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).

1. Préparation des médias, Réactifs et conditions de culture cellulaire <ol><li> Humain HEK 293 cellules de rein embryonnaire <ol><li> Culture des cellules HEK 293 (CRL-1573, ATCC) par F-12 du milieu de DMEM / Ham additionné de 5% de FCS, de L-glutamine (2 mM), et de la pénicilline (100 U / ml) / streptomycine (100 ug / ml). </li><li> Pour le passage des cellules, laver les cellules une fois avec du PBS, ajouter 0,05% de trypsine / EDTA et incuber pendant 3 minutes à 37 ° C et 5% de CO 2. Des cellules de transfert dans un tube de 15 ml, centrifuger pendant 5 min à 1200 rpm (300 x g) et transférer environ 5x10 5 cellules dans un flacon de culture T25 frais. </li></ol></li><li> Murins fibroblastes embryonnaires (MEF) <ol><li> Ajouter 1 ml d&#39;une solution de gélatine à 0,1% à chaque puits et 6-incuber à température ambiante (TA) pendant 1 heure. Aspirer liquide et conserver à température ambiante jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Culture MEF dans du DMEM supplémenté avec 10% de FCS, de L-glutamine (2 mM), de L-glucose (4,5 g / l), du pyruvate de sodium (1 mM), et de la pénicilline (100 U /ml) / streptomycine (100 ug / ml) sur des plaques à 6 puits revêtues de gélatine. </li><li> Distribuer MEF dans des plaques 6 puits et les laisser pousser jusqu&#39;à confluence. Ajouter la mitomycine (5 ug / ml) pendant 2,5 h pour arrêter les cellules. Aspirer le milieu de laver les cellules deux fois avec support MEF complète et ajouter 3 ml de milieu MEF à chaque 6 puits. Ces cellules servent comme un chargeur-couche pour les cellules murines et iPS porcine. </li></ol></li><li> Culture de l&#39;ES de souris et des cellules iPS <ol><li> Pour préparer souris ES milieu de culture, ajouter du milieu DMEM avec 15% de FCS, de L-glutamine (2 mM), de L-glucose (4,5 g / l), MEM acides aminés non essentiels (1 x), β-mercaptoéthanol (0,1 mM) et facteur inhibiteur de leucémie (1,000 U / ml). </li><li> Rincez 6 puits avec MEF de croissance arrêtée une fois avec DMEM sans sérum, ajouter 2 ml souris milieu ES et des cellules murines iPS (20% des cellules d&#39;un plat de confluence). Tous les cellules de lavage de journée, une fois avec du DMEM sans sérum et ajouter 2 ml de milieu ES de souris frais. </li><li> Pour le passage des cellules, laver chaque puits une fois avec DMEM sans sérum, ajouter 00,25% de trypsine / EDTA et incuber pendant 3 minutes à 37 ° C et 5% de CO 2. Transfert des cellules dans un tube de 15 ml, centrifuger pendant 5 min à 1200 rpm (300 x g), remettre les cellules dans 500 ul souris milieu ES et ajouter 100 pi de la suspension à 2 ml souris milieu ES dans un endroit frais à 6 puits avec un chargeur-couche MEF. </li></ol></li><li> Culture de porc cellules iPS <ol><li> Pour préparer cochon moyen iPS, compléter DMEM / Ham F-12 avec 20% de sérum de KO, L-glutamine (2 mM), MEM acides aminés non essentiels (1X), β-mercaptoéthanol (0,1 mm), et la pénicilline (100 U / ml) / streptomycine (100 ug / ml). Filtrer à travers un filtre de 0,22 um et conserver à 4 ° C pendant 2 à 3 semaines. Lors de la première utilisation, ajouter le bFGF (10 ng / ml de concentration finale). </li><li> Rincez 6 puits avec MEF de croissance arrêtée une fois avec des cellules iPS DMEM sans sérum / F-12 et d&#39;ajouter 1,5 ml de porc moyennes iPS Ham et porcine (10% des cellules d&#39;un plat de confluence). Tous les cellules de lavage de journée, une fois avec du DMEM sans sérum / Ham F-12 et ajouter 1,5 ml porcines fraîches moyennes IPS. </li><li> Pour préparer tampon de dissociation ajouter 2,5% de trypsine, la collagénase IV (10 mg / ml), sérum de knock-out (20%) et du CaCl2 (1 mM) à Ca 2+ exempt de PBS. Laver les cellules deux fois avec du PBS et on incube avec du tampon de dissociation pendant 5 min à 37 ° C et 5% de CO 2. Des cellules de transfert dans un tube de 15 ml, centrifuger pendant 5 min à 1200 rpm (300 x g). </li><li> Reprendre les cellules iPS porcine dans 500 pi porc fraîche moyen iPS et ajouter 50 ul de la suspension à 1,5 ml de porc moyen iPS dans un endroit frais à 6 puits avec un chargeur-couche MEF. Tous les cellules de lavage de journée, une fois avec du DMEM sans sérum / F-12 et d&#39;ajouter 1,5 ml de jambon de porc fraîche moyen IPS. </li></ol></li><li> Culture de cellules iPS humaines sans chargeur- <ol><li> Décongeler le flacon d&#39;origine contenant la préparation de la membrane basale à 4 ° C et diluer avec du DMEM sans sérum glacé / F-12 à 8 mg / ml, aliquote et un magasin de Ham à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li><li> Décongeler une aliquote de la basement préparation membranaire à 4 ° C et diluer avec du DMEM / F12 de Ham sans sérum glacée (90 ug / ml). Pipet 1 ml de cette solution dans des boîtes de culture de 3 cm et agiter doucement pour assurer que la surface est couverte. Sceller les plats avec du parafilm et conserver à 4 ° C pendant jusqu&#39;à une semaine. Avant l&#39;utilisation pour la culture de cellules incuber plats pour 30 minutes à 37 ° C ou 3 heures à température ambiante pour permettre la polymérisation de la préparation de la membrane basale. </li><li> Aspirer le milieu des plats revêtue de la préparation de la membrane basale et laver deux fois avec du DMEM exempt de sérum / de Ham F-12. Ajouter 1,5 ml de milieu E8 à la boîte de culture et les cellules iPS humaines (10% des cellules d&#39;un plat de confluence). Tous les cellules de lavage de journée, une fois avec du DMEM sans sérum / F-12 et d&#39;ajouter 1,5 ml de milieu de E8 frais de Ham. </li><li> Pour le passage des cellules, rincer la vaisselle deux fois avec PBS et ajouter 1 ml de PBS / EDTA 0,5 mM. Incuber les boîtes pendant 5 min à température ambiante. Surveiller les cellules sous un microscope. Remarque: Lorsque les colonies commencent à rassembler et APPEar d&#39;avoir des trous, ils sont prêts pour le transfert. </li><li> Aspirer le liquide, ajoutez 1,5 ml de milieu E8 et détacher les cellules par pipetage doucement monter et descendre. Transfert des cellules à un tube de 15 ml, centrifuger pendant 5 min à 1200 rpm (300 x g), remettre en suspension dans 500 pi de milieu E8 et ajouter 50 ul de la suspension à 1,5 ml de milieu E8 dans un plat de culture frais revêtu de la préparation de la membrane basale . </li></ol></li></ol> 2. Conception de cible séquences entre espèces frontières <ol><li> Sélectionnez séquences d&#39;ADNc de porc des gènes cibles (GAPDH, NANOG, GDF3) humaine de référence, murin et et effectuer une analyse d&#39;alignement multi-séquence CLUSTAL. Note: Ceci indique les séquences homologues entre espèces. <ol><li> Utilisez les paramètres suivants pour l&#39;alignement multiple: pénalité de gap (fixe) 10, pénalité de gap (variant) 5, la transition pondération 0, plage écart de peine de séparation 8,% d&#39;identité en cas de retard de 40, le nombre maximum d&#39;itérations à effectuer 3. </li></ol></li><li> Proposez séquences cibles souhaitées au fabricant (voir le tableau des matériaux) pour la conception et la fabrication de la sonde. Remarque: Le fabricant va alors confirmer la compatibilité de séquence désirée avec la technologie. Si la séquence souhaitée est pas compatible, le fabricant suggère séquences alternatives. <ol><li> Veiller à ce que des régions homologues qui peuvent être utilisés comme potentiels séquences de capture de brins ont une longueur de 27 pb. Remarque: Il est conseillé de commander plusieurs nanoparticules avec différents volets de capture pour un gène cible choisi comme seule l&#39;expérience cellulaire réelle donnera une preuve définitive de la fonctionnalité d&#39;une séquence individuelle. Par conséquent, deux séquences différentes pour GAPDH et GDF3 ont été évalués tandis que trois nanoparticules différentes ont été testées pour évaluer l&#39;expression de NANOG. Leur emplacement et les séquences exactes ont été publiés ailleurs 17. Le fabricant qui produit commercialement le nanoparticles souhaités avec des séquences et leur fournit en format lyophilisé. </li></ol></li></ol> 3. Reconstitution de nanoparticules et ajout à des cultures cellulaires <ol><li> Stockez nanoparticules lyophilisées lors de la réception à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Reconstituer nanoparticules par addition de 50 pi d&#39;eau bidistillée qui donne une concentration finale de 100 nM. Une fois reconstitué nanoparticules de magasin à la température ambiante dans l&#39;obscurité. Remarque: Dans cette condition, ils sont stables pendant au moins un an. Stockage des échantillons reconstitués à 4 ° C peut affecter leur stabilité. </li><li> Pré-diluer la solution de nanoparticules d&#39;achat d&#39;actions avec du PBS à une concentration de 2 (cellules HEK 293) ou 8 nm (iPS et les cellules ES) sur le jour de la demande. Remarque: Cette concentration est 20 fois plus élevée que la concentration finale dans la boîte de culture. Dans les cellules ES et des cellules iPS, 400 pM de nanoparticules induit un signal fluorescent détectable facilement sous le microscope. Pour les cellules HEK 293, AConcentration de 100 PM est suffisante. </li><li> Pipeter 12,5 ul de nanoparticules à une prédilué 237,5 pi de milieu de culture cellulaire complet contenant 24 puits. Pour les puits de différentes tailles, ajuster les volumes en conséquence. Agiter soigneusement la plaque pour assurer une distribution égale des nanoparticules. Incuber les cellules pendant une nuit (O / N) à 37 ° C et 5% de CO2 dans une atmosphère humidifiée. </li><li> Le lendemain, l&#39;analyse des cultures de cellules de fluorescence Cy3 spécifique de gène avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 546 nm (émission 575 - 640 nm) sous un microscope à fluorescence. Remarque: La durée nécessaire pour obtenir une fluorescence suffisamment forte peut dépendre du type de cellule et le gène cible. Dans ces expériences, il a été vu entre 16 et 20 heures après l&#39;application de la sonde. </li></ol> 4. Identification des populations cellulaires Cy3 positifs par cytométrie en flux <ol><li> Cultivez HEK 293 ou cellules ES de souris en utilisant les conditions spécifiées dans la section 1.1 ou 1.3, respectively. Un jour avant l&#39;analyse FACS ajouter GAPDH nanoparticules spécifique de différentes concentrations de cellules HEK 293 (voir figure 6A) et à 400 pM murin des cellules ES. Incuber les cellules O / N à 37 ° C et 5% de CO2 dans une atmosphère humidifiée. </li><li> Analyser les cultures cellulaires pour la fluorescence Cy3 spécifique d&#39;un gène induite sous un microscope à fluorescence. </li><li> Détacher les cellules HEK 293 comme spécifié au point 1.1.2. Centrifugeuse de transférer dans un tube de 1,5 ml et remettre en suspension dans 200 ul de PBS glacé / 0,5% de BSA / (tampon FACS) 2 mM d&#39;EDTA. Gardez cellules sombres sur la glace jusqu&#39;à l&#39;analyse par cytométrie de flux. </li><li> Détacher les cellules ES murines comme spécifié au point 1.3.3. Centrifugeuse de transférer dans un tube de 1,5 ml et remettre en suspension dans 200 ul de PBS glacé / BSA à 0,5% / EDTA 2 mM. Gardez cellules sombres sur la glace jusqu&#39;à l&#39;analyse par cytométrie de flux. </li><li> Appuyez sur les cellules à travers un filtre de 30 um pour empêcher l&#39;agrégation des cellules et ajouter l&#39;iodure de propidium (concentration finale de 2 ug / ml) 2 minavant l&#39;analyse FACS pour exclure les cellules mortes. </li><li> Pour analyser les cellules Cy3-positifs première série portes hiérarchiques sur le FSC-A / SSC-Un sous-ensemble, le FSC-H / FSC-W-sous-ensemble et le sous-ensemble SSC-H / SSC-W. Utilisez l&#39;avant et la diffusion latérale d&#39;exclure les débris cellulaires et les cellules qui ne sont pas dispersés. Exclure les cellules mortes par leur coloration iodure de propidium affichage PE contre PE-Texas Red. Effectuer la porte de tri final sur les cellules positives Cy3-PE (Figure 4). </li></ol>

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HL a reçu les nanoparticules de Merck Millipore Corporation gratuitement. Tous les autres auteurs ont rien à révéler.

Le présent ouvrage décrit l&#39;utilisation de nanoparticules marqué par fluorescence qui permettent l&#39;évaluation fiable de l&#39;expression du gène intracellulaire directement dans les cellules vivantes provenant de différentes espèces de mammifères avec de diverses origines histogénétique sous un microscope à fluorescence. Cette approche présente plusieurs avantages par rapport à d&#39;autres méthodes publiées. Tout d&#39;abord le chercheur ne se limite pas à l&#39;égard de l&#39;une ou l&#39;autre gène cible ou type de cellule. Toutes les méthodes de détection des anticorps en fonction sont limités à un épitope unique. Bien que les balises moléculaires fluorescents peuvent également être conçus pour un large spectre de gènes, cette méthode nécessite la dissociation des cellules et des 15 nucléofection ultérieur. En revanche, l&#39;application de nanoparticules spécifiques d&#39;un gène ne nécessite aucune manipulation de la cellule cible qui engloutit les nanoparticules activement par endocytose. Au cours de repiquage ultérieur des particules d&#39;or quittent progressivement les cellules et la culture peuvent être utilisés dans downstream expériences. Néanmoins, la technologie a aussi encore quelques limitations. Certains marqueurs sont évidemment pas détectable en raison de leur nature glucidique comme SSEA-1 ou TRA-1-81 20. Actuellement, une large gamme de nanoparticules est disponible dans le commerce. Ces particules ont été pré-testés pour leur fonctionnalité dans des expériences cellulaires. L&#39;objectif de ce travail était de concevoir des sondes personnalisées qui peuvent être utilisés à travers les espèces frontières. En suivant une telle approche ou lors de la conception d&#39;une sonde pour un roman d&#39;un gène cible doit être conscient que la fonctionnalité d&#39;un in silico prédit sonde doit être soigneusement évaluée in vitro. La sonde NANOG-SF3 qui a montré une homologie de 100% à l&#39;homologie de séquence n&#39;a pas fonctionné du tout en NANOG-SF1 avec une base dépareillés dans le murin et la séquence porcine produit un signal de fluorescence agréable. Une autre question se réfère à l&#39;absorption efficace des nanoparticules. Les particules entrentles cellules par endocytose, un processus qui est influencé par la taille des nanoparticules 21, le type de cellule et l&#39;état de différenciation 22 cellulaire et la capacité d&#39;effectuer des phagocytose et macropinocytose 23. La concentration optimale pour obtenir un signal de fluorescence satisfaisant doit être testé pour chaque application individuelle ou lignée cellulaire. À cette fin, la première expérience devrait toujours être l&#39;application de la commande de capture pour évaluer la compatibilité des sondes dans les types cellulaires et conditions de culture avant de passer au-cible spécifique détection de l&#39;expression du gène. Un point essentiel pour obtenir des résultats fiables lors de l&#39;application de ce protocole à une ligne nouvelle cellule ou population de cellules est l&#39;inclusion de contrôles appropriés. Le contrôle de l&#39;absorption jamais fluorescent fournira une indication des concentrations de nanoparticules qui induiront un signal de fluorescence suffisante de la population de cellules cibles. La fluorescence doit être évaluerd le lendemain que le signal se fanent avec le temps 17. Dans le même temps le contrôle de brouillage sans un homologue dans le génome eucaryote appliqué à une concentration identique doit induire un signal de fond négligeable. Comme un troisième contrôle, il est conseillé d&#39;utiliser une nanoparticule spécifique d&#39;un gène de ménage (par exemple GAPDH, β-actine). Ces nanoparticules servent de témoin positif que l&#39;approche peut être utilisée pour détecter l&#39;expression spécifique du gène dans la population de cellules cible sélectionné. Si ces contrôles révèlent un satisfaisant peut attendre à obtenir des signaux fluorescents spécifiques fiables utilisant des nanoparticules spécifiques pour d&#39;autres gènes cibles. La concentration des nanoparticules peut également être appliqués critique car ils se sont révélés réguler à la baisse la séquence cible 24. Cependant, cet effet requiert concentrations beaucoup plus élevées (5 nm) que les concentrations utilisées dans les expériences présentées ici (400 heures). A cette concentration, le nanoflares ne touchent pas l&#39;ARNm du gène cible ou les niveaux et les concentrations aussi élevées que 2 nM ne nuisent pas à la prolifération des cellules HEK293 et ES murines 17 protéines. En outre, toute une analyse de l&#39;expression du génome n&#39;a pas révélé de changements significatifs dans l&#39;expression du gène 25. Par conséquent, à des concentrations allant jusqu&#39;à 1 nM les nanoflares ne devraient pas présenter des effets indésirables importants. Une application très prometteuse de cette technologie est la possibilité de marquer une population cellulaire donnée qui est marquée par un gène spécifique. Récemment, des nanoparticules spécifiques de gènes ont été utilisés avec succès pour colorer sélectivement les myocytes ventriculaires en direct 26, sous-populations de 27 cellules de mélanome, des monocytes et des cellules du cervelet 28 29 cultures. De telles populations de cellules marquées par fluorescence peuvent être triés et purifiés par cytométrie en flux des cellules comme vivantes. Dans le domaine de l&#39;oncologie, il est imaginable pour isoler les cellules tumorales métastatiques en direct dans des modèles animauxen fonction de leur expression de CEA, le plus précieux pour la recherche de métastases potentiel promotion des gènes ou des structures cibles. Nous avons récemment montré que les colonies iPS vraiment reprogrammées murins peuvent être identifiées in situ avec Nanog spécifique de nanoparticules à base de l&#39;intensité de fluorescence détectée 17. Par conséquent, l&#39;identification des colonies iPS vraiment reprogrammées peut être effectuée sur des plates-formes à haut débit, qui utilisent la détection de fluorescence et des dispositifs de prélèvement de robot afin d&#39;identifier les colonies les plus prometteurs. Cette technologie semble être approprié dans de nombreux domaines de recherche pour sélectionner les sous-populations cellulaires spécifiques et il semble possible d&#39;appliquer les nanoparticules dans les plates-formes à haut débit. En conclusion, ce protocole représente une nouvelle approche utilisant marqué par fluorescence des nanoparticules qui permet la détection de l&#39;expression génique intracellulaire directement dans les cellules vivantes. Cette technologie peut être un outil précieux pour purifier, développez et davantage de caractèreiser sous-populations cellulaires rares dans de nombreux domaines de recherche.

En 2006, une nouvelle approche a été décrite à reprogrammer des cellules somatiques dans un état pluripotent. Après la présélection d&#39;un tableau de reprogrammation facteurs potentiels fibroblastes murins pourraient être convertis avec succès à ce qu&#39;on appelle induits cellules souches pluripotentes (iPS) par transduction rétrovirale et la surexpression de quatre facteurs de transcription (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Par la suite cette technique a effectivement été reproduite en utilisant des cellules somatiques de différentes espèces de mammifères y compris les humains, les singes 2 3, 4 rats, chiens, moutons 5 6 et 7 porcs. De plus, la modification ou le remplacement des protocoles en omettant le facteur de transcription c-MYC potentiellement oncogènes ont été publiés 8, 9. Indépendamment de la reprogrammation initiale approcher le vrai pluripotence des colonies en croissance doit être confirmée, une tâche laborieuse et chronophage. Un inconvénient majeurde la majorité de ces analyses est qu&#39;ils ne peuvent pas être effectuées sur des cellules vivantes. Facteurs de pluripotence établis tels que OCT4, SOX2, NANOG ou REX1 représentent des facteurs de transcription situés dans le noyau et leur détection exige la fixation des cellules avant l&#39;immunohistochimie ou la lyse des cellules pour l&#39;analyse RT-PCR 10 -. 12 Par la suite, ces cellules sont perdues pour l&#39;avenir expériences exigeant cultures répétées de chaque colonie. Ainsi, une technologie à analyser sur la pluripotence des cellules vivantes est hautement souhaitable. Plusieurs approches peuvent en effet être effectuées directement sur ​​les cellules vivantes en utilisant des anticorps dirigés contre des antigènes membranaires (par ex. TRA-1-60, SSEA4) 12, rapporté colorants fluorescents pour détecter la phosphatase 13 alcaline ou de petites molécules lesquelles une étiquette spécifique souches embryonnaires (ES) et 14 cellules iPS. Cependant, les anticorps pourraient néanmoins affecter les cellules et chaque method est limitée à un seul marqueur pluripotent. Enfin, les balises moléculaires fluorescents, des oligonucleotides antisens à double ayant des structures en épingle à cheveux, qui permettent la coloration des cellules en temps réel, ont été décrits 15. Bien que cette approche peut être appliquée à de nombreux gènes, la technique nécessite nucléofection d&#39;une suspension cellulaire unique, qui ne sont pas applicables aux colonies iPS en croissance. Il ya quelques années nanoparticules spécifiques du gène ont été décrits pour analyser l&#39;expression de la survivine dans les cellules cancéreuses du sein humain SKBR3 16. Ce manuscrit décrit une approche novatrice roman à la détection de marqueurs de pluripotence dans ES vivants et des cellules iPS grâce à l&#39;utilisation de conjugués de nanoparticules d&#39;or. Ces nanoparticules sont constituées d&#39;une particule d&#39;or avec un brin central de capture couplé portant la séquence d&#39;ARN complémentaire et un brin marqué au Cy3 reporter. Le signal fluorescent du brin rapporteur est éteinte par la particule d&#39;or central. En outre, appropriéenanoparticules servent de témoins négatifs et positifs, respectivement (figure 1). Pour une application simplement les nanoparticules sont ajoutées au milieu de culture (figure 2) et pénètrent dans les cellules par endocytose (Figure 3). Si l&#39;ARN cible est exprimé, il déplace le brin de journaliste qui émet alors un signal fluorescent. Cette méthode ne nécessite pas la manipulation de la cellule cible et l&#39;expression du gène cible peut être contrôlée optiquement sous un microscope à fluorescence directement dans les cellules vivantes. En outre, la technologie peut être appliquée à n&#39;importe quel gène cible souhaitée entre les espèces dans le cas de cellules iPS et donc peut être utilisé dans de nombreux domaines de recherche différents. Enfin, la cytométrie en flux analyse permettant l&#39;identification et à l&#39;enrichissement de cellules positives Cy3.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#39;s F12 medium with stable glutamine</td>
			<td>Biochrome GmbH</td>
			<td>FG4815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose with stable glutamine</td>
			<td>Biochrome GmbH</td>
			<td>FG0435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 107 409 001</td>
			<td>prevents cell division of MEFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia inhibitory factor (107 U/ml)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin/EDTA (1x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>detaches adherent cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>supplement for human and porcine iPS cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>growth factor for human and porcine iPS cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td>dissociation of pig iPS cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05940</td>
			<td>defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartFlare Probes</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>customized item</td>
			<td>detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraCell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine (from porcine skin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6144</td>
			<td>enhances attachment of MEFs to surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (1 mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td>labels dead cells in flow cytometric analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Aria Illu</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>A4544</td>
			<td>referred to as device 1 in Figure 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navios</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>775213</td>
			<td>referred to as device 2 in Figure 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FloJo vX 10.0.7r2</td>
			<td>Treestar</td>
			<td></td>
			<td>software for analysis of flow cytometry data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of intracellular gene expression in live cells of murine, human and porcine origin using fluorescence-labeled nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

Dans une première tentative de vérifier et d&#39;établir la détection intracellulaire de l&#39;expression de gènes spécifiques dans les cellules vivantes utilisant des nanoparticules nous avons décidé de mener des expériences pilotes en utilisant un gène de la maison de maintien exprimé de façon constitutive (GAPDH) dans des cellules HEK 293 humaines des cellules. La concentration de nanoparticules utilisées dans ces expériences a été choisie en fonction de la recommandation du fabricant. L&#39;ajout d&#39;une sonde spécifique de GAPDH dans le milieu de culture à une finale 100 pM concentration induit une nette Cy3-fluorescence dans ces cellules qui était visible sous un microscope à fluorescence après O / N incubation (figure 5A). Deux témoins ont été inclus dans ces expériences pour justifier le résultat. Une commande comprend d&#39;une soi-disant &quot;scramble&quot; nanoparticule où le brin de journaliste n&#39;a pas une séquence correspondante dans des cellules de mammifères ou eucaryotes. La «ruée» nanoparticules détermine le fond non spécifique fluorescenCE en raison de la dégradation possible de la sonde ou trempe incomplète de la fluorescence. L&#39;ajout de la sonde de brouillage produit un seul signal marginal fluorescent, ce qui est négligeable (figure 5B). Un contrôle en permanence fluorescent &quot;d&#39;absorption&quot; permet de déterminer la capacité des cellules à incorporer les nanoparticules par endocytose qui peut varier entre différents types de cellules. Ces particules de contrôle positif produit un signal fluorescent lumineux dans des cellules HEK 293 (Figure 5C). Ainsi, la faisabilité de la technologie pour enregistrer un signal fluorescent spécifique d&#39;un gène intracellulaire avec un signal d&#39;arrière-plan négligeable a été confirmée. Il faut mentionner que la différence entre le signal d&#39;arrière-plan et la fluorescence spécifique diminue avec le temps. Les arrière-plan augmente en raison de la dégradation ou de sonder trempe incomplète alors que la fluorescence spécifique disparaît progressivement (figure 5D). Les mêmes nanoparticules spécifique de GAPDH ontété testé dans des cultures de fibroblastes primaires de murine, porcine et ovine origine 17. Ces cellules produisent un signal de fond beaucoup plus élevé que les cellules HEK 293 tandis que la fluorescence spécifique de la cible est assez faible, probablement en raison de la relativement faible capacité de prolifération de ces cultures. Ces expériences pilotes nous ont incités à utiliser cette technologie pour la détection de l&#39;expression du gène de la pluripotence dans iPS dérivées de différentes espèces. A cet effet, NANOG et GDF3 ont été analysés, les deux étant connu pour être exprimé dans des cellules pluripotentes 18. Au début, les cellules iPS dérivées de fibroblastes d&#39;un activateur cardiaque lignée de souris transgénique Nkx2.5 19 bout de la queue ont été étudiés. Pour les deux gènes un signal fluorescent forte a été obtenue (figure 6A) et une fluorescence Cy3-négligeable de la commande de brouillage (données non présentées). Des résultats similaires ont été obtenus sur les cellules iPS humaines et porcine (Figure 6B et C). Surtout, le signal de fluorescence a été limitée aux colonies iPS et n&#39;a pas étiqueter les fibroblastes utilisés comme une couche d&#39;alimentation pour la souris et iPS porcine (voir les flèches sur la figure 6A et C). L&#39;analyse de l&#39;expression du gène NANOG a également révélé que chaque séquence prédite in silico pour être «bon» est enfin fonctionnel. Un des trois dessins d&#39;une NANOG nanoparticules spécifique de induites presque pas de signal fluorescent comparable à celle de la commande de bousculade, malgré un match de séquence de 100% dans des cellules iPS de souris (Figure 6D). Un résultat similaire a été obtenu sur les iPS cellules d&#39;origine humaine et porcine avec cette sonde (données non présentées). Ainsi, les nanoparticules peuvent être utilisés pour détecter l&#39;expression du gène de la pluripotence à travers les espèces frontières tandis que la fonctionnalité de chaque sonde conçue unique doit être évaluée à l&#39;avance. Les résultats prometteurs de l&#39;in situmarquage des cellules vivantes dans des boîtes de culture cellulaire nous a incités à analyser quantitativement l&#39;expression du gène par cytométrie de flux. À cette fin GAPDH nanoparticules spécifique de ont été ajoutés à des concentrations progressives à HEK 293 monocouches afin de comparer l&#39;efficacité de l&#39;étiquetage au sein de la population de la cellule cible. Comme évalué par microscopie fluorescente une fluorescence Cy3-induite accrue a été observée avec la plus faible concentration par rapport aux cellules qui n&#39;a pas reçu les nanoparticules. Des concentrations croissantes des nanoparticules induit une fluorescence clairement de concentration dépend de cellules HEK 293 situ (figure 7A) dans. Le fait de soumettre ces cellules à une analyse par cytométrie en flux a confirmé l&#39;efficacité de marquage dépend de la concentration. La fréquence des cellules positives Cy3 augmenté de façon significative (plus de sept fois) lorsque la concentration la plus élevée des nanoparticules a été appliquée (figure 7B). Dans d&#39;autres expériences cellules ES de l&#39;cardiaque Nkx2.5activateur de ligne de souris transgéniques 19 ont été utilisés pour analyser l&#39;expression de gènes de pluripotence par cytométrie de flux. Des expériences pilotes avec 400 heures le contrôle de l&#39;absorption positifs obtenus clairement Cy3 colonies positives ES vivants sous le microscope et cytométrie de flux détectés près de 40% de cellules positives Cy3 (Figure 7C). En revanche, comparable aux cellules non traitées d&#39;environ 0,1% des cellules traitées avec la course teinté positive (données non présentées). De même, l&#39;addition de nanoparticules spécifiques pour GAPDH et Nanog GDF3 induit un signal de fluorescence distinct dans les colonies individuelles dans la boîte de culture cellulaire. La fréquence des cellules positives pour Cy3 Gapdh tel que déterminé par cytométrie de flux a été comparable à celle observée pour les deux gènes de pluripotence (Figure 7C). Ce résultat est prévisible que sont également pensés Nanog et GDF3 être exprimé de façon constitutive dans les cellules ES pluripotentes. Ainsi, ces données clairement indiCate que les cellules exprimant un gène particulier peuvent être identifiés par cytométrie de flux analyses, qualitativement et par leur quantité relative. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig1.jpg" /> Figure 1: Représentation schématique de la structure des nanoparticules. (A) Structure d&#39;une nanoparticule spécifique d&#39;un gène. (B) nanoparticule Scramble (contrôle négatif). (C) L&#39;absorption de nanoparticules (contrôle positif). Adapté de Lahm et al. 17, réimprimé avec la permission de Wiley. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig2.jpg" /> Figure 2: Application des nanoparticules to Cell Cultures Une solution diluée appropriée de nanoparticules est pipeté simplement dans le milieu de culture.. Après O / N cellules fluorescentes spécifiques du gène incubation sont visibles sous af<html> luorescent microscope. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig3.jpg" /> Figure 3:. Absorption active des nanoparticules par les cellules par endocytose (a) des cellules engloutissent activement les nanoparticules par endocytose (B) cible ARNm se lie au brin de capture et déplace le journaliste fluorescent.. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig4.jpg" /> Figure 4: Stratégie Gating pour cytométrie de flux. (A) Stratégie pour les cellules HEK 293 Stratégie (B). Pour les cellules ES murines. Les données ont été acquises à l&#39;aide dispositif 1 pour les cellules HEK 293 ou dispositif 2 pour les cellules ES murines et ont ensuite été analysés par un outil logiciel (voir le tableau des matériaux). /53268fig5.jpg &quot;/&gt; Figure 5:. Analyse de GAPDH -expression dans des cellules HEK 293 Une nanoparticule spécifique de GAPDH a été ajouté aux cellules à 100 pM (concentration finale) et la fluorescence a été enregistrée après O / N incubation (A) nanoparticules spécifique de GAPDH (B.. ) Scramble (contrôle négatif). (C) Absorption (contrôle positif). (D) Cinétique de bousculade et de contrôle absorption. La fluorescence a été déterminée au moment points indiqués après addition de nanoparticules spécifique de GAPDH. Les barres d&#39;échelle représentent 50 um. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig6.jpg" /> Figure 6:. Analyse de la pluripotence Gene expression dans des cellules iPS de différentes espèces nanoparticules spécifique pour NANOG ou GDF3 ont été ajoutés aux cellules à 400 pM (conce finalentration) et la fluorescence a été enregistrée après O / N incubation. (a) des cellules iPS murin. (b) des cellules iPS humaines. (C) des cellules iPS porcin. Flèches dans (A) et (C) désignent les cellules de la couche de liaison de fibroblastes non marqué. (D) de fluorescence dans des cellules iPS de souris après addition de la NANOG-conception SF3 nanoparticule. Les barres d&#39;échelle représentent 50 um. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig7.jpg" /> Figure 7: nanoparticules a marqué des cellules vivantes peuvent être identifiés par cytométrie de flux. (A) Vue au microscope de Cy3 HEK positif des cellules 293 après addition de différentes concentrations de nanoparticules. (B) Fréquence de cellules positives Cy3 déterminées par cytométrie en flux. (C) la coloration directe de murins colonies de cellules ES et la détermination de la fréquence de Cy3 positif cellules. Les nanoparticules ont été ajoutésà une concentration finale de 400 pM. Les barres d&#39;échelle représentent 50 um.

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Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Détection de intracellulaire Gene Expression dans des cellules vivantes de murin, humain et porcin Origine utilisant des nanoparticules marquées par fluorescence

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

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Biology

10.9K vues.  Technische Universität München. This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species. 

Vidéo: Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

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Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour doser modification des histones dynamique dans l&#39;expression génique dans les cellules humaines Activé

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Un allèle spécifique Assay expression du gène pour l&#39;épreuve la base fonctionnelle des associations génétiques

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA contrôle pour la ubiquitine et les régulateurs du système ubiquitine-comme des voies biologiques dans des cellules de mammifères en culture

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...