This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

הערה: פרוטוקול זה מכיל הוראות כיצד להשתמש בעמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים במערכת HPLC יחד עם גלאים מרובים לאיתור מרובב. הפרוטוקול נכתב בהנחת שהקורא יש לו ידע בסיסי וניסיון בכרומטוגרפיה ושיטות זיהוי HPLC שונים. זהירות: עיין בגיליונות נתוני בטיחות חומרים (MSDS) עבור כל החומרים וריאגנטים לפני השימוש (כלומר, MSDS למתנול). להבטיח את השימוש של כל נהלי הבטיחות המתאימים בעת טיפול בחומרים ממסים ונוזלית כרומטוגרפיה eluent ביצועים גבוהים (HPLC). להבטיח שימוש נכון של בקרות הנדסה של HPLC, מכשור איזון וגלאי אנליטיות, ולהבטיח את השימוש בציוד מגן אישי (משקפי מגן, כפפות, מעיל מעבדה, מכנסיים באורך מלאים, ונעליים סגורות הבוהן). 1. הגדרה של HPLC Instrument <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מכשיר HPLC עם המים ultrapure (למשל, 100% מים מילי- Q) לליןהדואר ומתנול 100% לקו B כשלב הנייד ולטהר את המשאבות לפי דרישת יצרן. אם אחד מהגלאים משמשים הוא MS, כפי שהוא כאן, להוסיף 0.1% חומצה פורמית לשני שלבים הניידים A ו- B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת HPLC רכיבים וגלאים סייעו כפי שמודגם באיור 2. זה דורש מיקום נוח של גלאים ביחס לטור כדי למזער את הנפח המת בין הגלאי ועמודה. גמישות בתצורת מערכת HPLC רצויה. </li></ol> 2. התקנה של UV-Vis וגלאי MS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גלאי UV-Vis לאורך הגל הרצוי התלוי במדגם של עניין (למשל, ננומטר 280). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גלאי MS במצב חיובי לניתוח רוזן סה&quot;כ יון (TIC) באמצעות שיטת זיהוי סריקה מלאה. גם להתאים את הפרמטרים הבאים MS בהתאם: הטמפרטורה מאדה 500 מעלות צלזיוס, טמפרטורת נימים 350 ° C, גז נדן, בשיעור של 60 יחידות, זרימת גז עזר40 ולטאטא זרימת גז ב 5 יחידות, ומתח תרסיס 3.5 קילו וולט. ניתן לכוונן את הגדרות אלה מאוחר יותר לדרישות משתמש ספציפיות תלויות במדגם להיות מנותח. </li></ol> 3. הכנת 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl הרדיקלי (DPPH •) מגיב התקנה של גלאי מערכת • DPPH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 25 מ&quot;ג של DPPH • ולפזר ב250 מיליליטר של מתנול בבקבוק נפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של חומצה פורמית למגיב DPPH •. מכסה את הבקבוק בנייר כסף, כדי למנוע חשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate הבקבוק המכיל מגיב DPPH • במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את משאבת DPPH • עם מגיב DPPH • מוכן לפי הדרישה של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את מערכת DPPH • על פי איור 2 על ידי הצמדת קו המשאבה לכניסה של T-פיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף סליל תגובת μl 100 השקע דואר של T-החתיכה ולצרף את הקצה השני של סליל התגובה לגלאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים בארגז סליל התגובה בתנור טור ולהגדיר את טמפרטורת תנור עמודה עד 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את-Vis UV גלאי DPPH • 520 ננומטר. </li></ol> 4. הגדרה של טור כוחות הביטחון הפלסטיניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הכניסה של כוחות הביטחון הפלסטיניים לעמודת מכשיר HPLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את היציאה המרכזית לגלאי MS, באמצעות אורך 15 סנטימטר של צינורות id 0.13 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר יציאה היקפית לגלאי UV-Vis באמצעות אורך 15 סנטימטר של צינורות id 0.13 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר אחר יציאה היקפית לT-פיסת מערכת איתור DPPH • שימוש באורך 15 סנטימטר של צינורות id 0.13 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את היציאה ההיקפית שאינו בשימוש באמצעות פקק טור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את קצב הזרימה של משאבת HPLC לדקות 1 מיליליטר -1 ב 100% קו B - מתנול 100% (0.1% חומצה פורמית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את העמודה עם 100% ph הנייד מתנולASE עבור 20 דקות לx 250 מ&quot;מ אורך טור 4.6 id מ&quot;מ. הפעם ישתנה בהתאם לממדים של עמודות אחרות המשתמש יכול להעסיק. </li></ol> 5. כוונון טור כוחות הביטחון הפלסטיניים לאיתור Multiplexed <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את המסה של לפחות שני כלי אוסף ריקים (אחד ליציאה המחוברת לגלאי UV-Vis ואחד לגלאי DPPH •) באמצעות איזון אנליטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף שלב נייד מUV-Vis ויציאות DPPH • לשני כלים נפרדים,-שקל מראש אוסף (5.1). רשום את פרק זמן לאיסוף. לאסוף לפחות 500 מ&quot;ג של ממס בכל כלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את כלי האיסוף ולקבוע את המסה של שלב נייד. בהתחשב בצפיפות של מתנול הוא .791 מיליליטר ז -1, לקבוע את עוצמת הקול של שלב נייד שנאסף מכל יציאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ידי הבדל, כלומר, סט קצב זרימת משאבה נומינלית בניכוי קצב הזרימה דרך • DPPH ו- UV-Vis detectoזרימת יציאות R, לקבוע את קצב הזרימה לגלאי MS. הגעה כל תזרים פרופורציה כאחוז מהסך כל הזרימה. הערה: באופן אידיאלי, זרימת האחוזים הם: לטרשת הנפוצה היא 18% מכלל קצב הזרימה, לUV-Vis 22%, לגלאי DPPH • 60%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם לא, להתאים את זרימת אחוזים על ידי שינוי הלחץ שוב על גלאי UV-Vis. לדוגמא, אם את הזרימה לUV-Vis היא גבוהה מדי, להפחית את השיעור על ידי הוספה להוסיף סעיף 15 סנטימטר של צינורות id 0.13 מ&quot;מ ליציאה של גלאי UV-Vis. אז לחזור על שלבי 5.1 עד 5.5. </li></ol> 6. תנאי התקנה סופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קצב הזרימה של המשאבה מגיב DPPH • לאותו קצב זרימת יציאת היציאה לשקע מחוברת לגלאי DPPH •. הערה: טור כוחות הביטחון הפלסטיניים multiplexed עם UV-Vis, DPPH • וMS מוכן לניתוח עכשיו. </li></ol>

<ol>
	<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+of+a+new+concept+chromatography+column.">The design of a new concept chromatography column.</a> Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+separation+performance+using+a+new+column+technology:+Parallel+segmented+outlet+flow.">Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow.</a> J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+flow+management+in+preparative+chromatographic+separations:+A+preliminary+investigation+into+enhanced+separation+using+a+curtain+flow+inlet+fitting+and+segmented+flow+outlet.">Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet.</a> 35 (3), 410-415 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient+elution+chromatography+with+segmented+parallel+flow+column+technology:+A+study+on+4.6mm+analytical+scale+columns.">Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns.</a> J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+HPLC+separation+performance+using+parallel+segmented+flow+chromatography.">Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography.</a> Microchem. J. 111, 3-7 (2013).</li><li>Shalliker, R. A., Ritchie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmented+flow+and+curtain+flow+chromatography:+Overcoming+the+wall+effect+and+heterogeneous+bed+structures.">Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures.</a> J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+active+flow+technology+HPLC+columns+as+a+platform+for+multiplexed+detection.">Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection.</a> Microchem. J. 110, 473-479 (2013).</li><li>Camenzuli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+outlet+flow+high+performance+liquid+chromatography+with+multiplexed+detection.">Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection.</a> Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).</li><li>Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns:+Conventional+analytical+scale+column+formats+presenting+as+a+'virtual'+narrow+bore+column.">Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column.</a> J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).</li><li>Soliven, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+narrow-bore+HPLC+columns+using+active+flow+technology.">Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology.</a> Microchem. J. 116, 230-234 (2014).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection:+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products.">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

מחקר זה כלל האפיון ואפיון של קפה באמצעות HPLC עם גילוי ריבוב העסקת עמודה מקבילה זרימה מפולחת (כוחות הביטחון הפלסטיניים). המרובב HPLC באמצעות עמודות כוחות הביטחון הפלסטיניים מאפשר אפיון וזיהוי של גורמים כימיים מפתח על ידי הפחתת מורכבות נתוני המדגם תוך קבלת מידה רבה יותר ?...

עמודות זרימת טכנולוגיה פעילה עמודות כרומטוגרפיה טכנולוגית זרימה פעילה (AFT) פותחו לאחרונה להתגבר חוסר יעילות בהפרדות הקשורים זרימת ההטרוגניות 1-6 וגם כדי לאפשר זיהוי מרובב. בפירוט שתקשורת מסוים זה התהליך התפעולי של המקביל מפולח זרימת טור (PSF) עם זיהוי מרובב. היתרונות הפונקציונליים המפתח של טור כוחות הביטחון הפלסטיניים הם: (1) התזרים מאזור המרכז הרדיאלי של מיטת העמודה מבודד מאזור הפריפריה או קיר של זרימה, (2) הנפח של שלב נייד שחייבים להיות מעובד על ידי זיהוי מקור מצטמצם, וניתן multiplexed מקורות (3) זיהוי להרחיב מידע מדגם ללא הקניית עיכובי זיהוי פני כל תהליך זיהוי, או לאחר מכן מחייבים את הפיצול של זרימת זרם פוסט עמודת 7,8. התכונה המרכזית בעיצוב של עמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים, המאפשרת לdvantage של זיהוי מרובב היא ההרכבה הראויה וfrit לשקע רומן. איור 1 הוא תצלום של טור AFT בהשוואה לטור קונבנציונלי. חשוב להבין כי תהליך הפיצול הושג באמצעות זרימה מפולחת עמודות מקבילות הוא לא אותו הדבר כמו פיצול זרימת הודעה טור זרם. בזרימה הודעה טור זרם לפצל את הלהקה כולה מדגם מהמוביל הקצה לגפיים של הזנב נדגם באותה מידה (כלומר, צירי), ובכך, כל תזרים זרם שווה ביחס ליעילות ורגישות; סדר הגודל של הרגישות ובכך הם מחולקים במספר הפיצולים. בכוחות הביטחון הפלסטיניים, לעומת זאת, דגימות תהליך פיצול הלהקה רדיאלית, לא צירי. ככזה, הדגימות המרכזיות נמל שיא השיא - האזור מרוכז ביותר של השיא. לפיכך, הרגישות כאן היא גבוהה ביותר כשיא אינו מדולל על ידי האזור המפוזר עוקב. מדגם משחררי מהנמלים ההיקפיים הוא לא יעיל כמו בCENTRAאזור l, אבל, מאז הלהקה נדגם רדיאלית, ולא צירי, הרוחב של השיא הוא צר יותר יהיה המקרה לתהליך דגימה שחלק השיא בכיוון הצירי, כלומר, פיצול הודעה עמודה. מכאן הרגישות עם גלאים תלויים ריכוז לא מצטמצמת. בעמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים, ראוי לשקע כולל יציאות יציאה מרובות ועל החלק הפנימי של סוף זה מתאים לשם שוכן frit טבעתי. החלק הפנימי של ערוצי frit טבעתיים זה לזרום החוצה מהטור דרך יציאת השקע המרכזית רדיאלי, ואילו החלק החיצוני של רדיאלי ערוצי frit לשקע לזרום החוצה של העמודה באמצעות הזרימה לשקע יציאות היקפי או קיר אזור. החלקים הפנימיים וחיצוניים של frit לשקע מופרדים על ידי מחסום בלתי חדיר המונע זרימה צולבת בין זרימת האזורים אלה 2. כתוצאה מעיצוב זה זרימת רדיאלי הזרם המרכזי במיטת העמודה מופרד מזרימת תוספות קיר האזורהחביא את הטור. החלק היחסי של זרימה משני אזורים אלה יכול להיות מגוון כמעט לכל יחס רצוי באמצעות ניהול לחץ כדי לייעל את ההיבטים שונים פונקציונליים של טכנולוגית העמודה, כגון יעילות הפרדה או רגישות זיהוי. במהותה, העיצוב הזה ביעילות קובע במסגרת טור הפורמט הגדול עמודה &quot;וירטואלית&quot;, שקוטר פנימי צר, ולכן פונקציות טור כעמודת קיר-פחות נכונה, להתגבר על ההטרוגניות מיטת טור וקיר ההשפעות 9,10. היתרונות העיקריים של כוחות הביטחון הפלסטיניים עמודות שיפורים ביעילות טור, מזעור עיבוד הממס למקור זיהוי (ים) ומאפשר זיהוי מרובב. עם זאת, יתרון נוסף הוא שמאז tailing והאזורים בחזית של כל להקה יוסרו מelution הכולל פרופיל המומס בelution או זיהוי נמצא בריכוז גבוה יותר מאשר היה להיות שנצפה לאותו יםolute הזרקה ועומס ריכוז על עמודה קונבנציונלית, בהתאם ליחס הפילוח המועסק. כתוצאה מכך יש הוא נצפה לעתים קרובות רווח בעוצמת אות להפרדות שנערכו בטורי כוחות הביטחון הפלסטיניים 2. למעשה, אם יחס הפילוח מותאם כך שעל 25% מתזרים יציאות מכל אחת מארבע יציאות היציאה, עוצמת האות שנצפתה באמצעות זיהוי Ultra-סגולה (UV) מראה כמעט זהה עוצמת האות המדויקת כלכאורה באמצעות קונבנציונלי טור שבו כל (100%) של השלב הנייד מנותח 7. יתר על כן, כוונון עדין של היחס בין שקע זרימת האזורים המרכזיים וקיר מאפשר את יעילות הטור להיות מותאמת. הרווחים ביעילות טור נצפו באמצעות עמודות AFT לא ניתן לומר לערך יחיד, מאז רווחים יעילות אלה הם פונקציה של שלושה גורמים: (1) קצב הזרימה, (2) יחס הפילוח, ו- (3) גורם השימור המומס . עם זאת, עלייה ביעילות בהשוואה למרהעמודות entional כמעט תמיד הם נצפו, ולפעמים רווחים אלה במספר הצלחות התיאורטיות 1,2 יותר מ -100%. היכולת לכוון את יחס הפילוח מאפשר למטפל להתאים את הקוטר של הטור &quot;הווירטואלי&quot; ביעילות, ואת זה הוא גורם חשוב ביחס לתהליך זיהוי. לדוגמא, קוטר עמודה וירטואלית 2.1 מ&quot;מ פנימית (ID) הוקמה מעמודת id 4.6 מ&quot;מ פיזי כאשר יחס הפילוח הוא 21% משלב נייד משחררי מנמל היציאה המרכזי רדיאלי. בתנאים אלה, עמודת id 2.1 מ&quot;מ הווירטואלי מבצעת עם יעילות שעשויה להיות יותר מ -70% יותר מעמודת id 2.1 מ&quot;מ הקונבנציונלי, בהתאם לקצב זרימה, וגורם שימור מומס 10. עיצוב עמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים הנוכחי המשמש לגילוי ריבוב משלב 4 יציאות לשקע מתאימות, אבל הטור יכול להיות מצויד עם 2 יציאות מתאימות גם הסוף, עם זאת, זה לא מגביל את זיהויo רק שני גלאים. הפעולה הבסיסית של עמודות אלה, עם זאת, אותו, מלבד יכולים להיות יחד כי ארבעת גלאים במקביל לטור כוחות הביטחון הפלסטיניים שקע 4 יציאות הרחבת ההיקף לאיתור מרובב. מלבד צינורות חיבור טור לפני ואחרי, הדרישות נוספות רק לפעול עמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים הוא צינור שיכול להיות מחובר ליציאות לשקע ההיקפיים, ואמצעים שבם הסכום של שלב נייד עובר צינור אחד ניתן למדוד, בדרך כלל גם מדידת מסה או מדידת נפח. על מנת להקל על כוונון, הקוטר הפנימי של כל הזרימה לשקע צינורות צריך להיות זהה. זרימת היחס בין יציאות יציאה המרכזיות ההיקפית ורדיאלי אז מגוון באמצעות ניהול לחץ, פשוט על ידי שינוי האורך של הצינור ממוקם בשקע ההיקפי המתאים, או האורך של הודעה צינורות גלאי בפתח היציאה המרכזית רדיאלי. מרובב איתור שימוש בעמודות כוחות הביטחון הפלסטיניים </strong&gt; יתרון חשוב של עמודות כוחות הביטחון הפלסטיניים הוא שכל אחד מנמלי יציאת השקע יכול להיות מחובר למקור איתור ישירות, ובכך לאפשר זיהוי מרובב. במערכת איתור מעוצבת היטב ניתוח יחיד עם זיהוי מרובב יכול לספק מידע משמעותי בכל הקשור לטבע של הרכיבים בתוך המדגם. חשוב לציין, ניתן לבצע בדיקות הרסניות ולא הרסניות בדיוק באותו הזמן, ללא דיחוי זיהוי. זה מאפשר הקצאה המוחלטת של, למשל, נוגדי חמצון באמצעות מגיב DPPH •, עם רכיבים שנצפו לelute עם UV ו / או תגובות זיהוי ספקטרוסקופיית מסות (MS) 7,11. לכן, יכולים להיות מופעלים על ארבעה גלאים עצמאיים בו זמנית עם חלקים מתאימים של זרימה מופנים לכל גלאי באמצעות כל אחת מארבע היציאות לשקע. מאז את הזרימה דרך יציאות אלה יכול להיות מותאמות כמות מומסת להגיע כל הגלאים בקלות יכולה להיות מותאם לחליפההרגישות של מקור הגלאי נתון. יש לציין, עם זאת, כי ההגירה מומסת היעילה ביותר שנצפתה דרך פתח היציאה המרכזית רדיאלי. כל אחד מהנמלים ההיקפיים מציע יעילות הפרדה שווה ערך, שכאשר נקבעו ל- 25% בכל יציאה, היא רק מעט פחות יעיל מאשר טור קונבנציונלי. ככזה, חשוב שהגלאים כמותיים להיות מוגדרים לנתח דגימה מנמל היציאה המרכזית רדיאלי. בעת הגדרת עמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים לצורך זיהוי ריבוב יש מספר השיקולים שצריכים להיעשות כדי להשיג תוצאות יעילה ואיכותיות; שממדי צינור לכל יציאה, בחירה של שיציאה לסוג של גלאי וזרימת התאמה. מימדי צינור לכל יציאה בכרומטוגרפיה האורך של צינורות הודעה עמודה ממלא תפקיד מכריע ביעילות וביצועים של ההפרדה. DEA הגדולד-נפח כתוצאה מצינורות id ארוכים או רחבים משקע עמודה לגלאים יגרום להפסד של יעילות, רזולוציה ורגישות. כך, ממדי צינורות מתאימים חייבים להיות מנוצלים בעת הגדרת עמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים כדי להשיג את הפוטנציאל המרבי במתן הפרדה יעילה תוך מתן היתרונות של ריבוב. נמל לגלאים איור 2 הוא דוגמה להתקנת דוגמא של גילוי ריבוב (ויולט-גלוי Ultra (U-Vis), ספקטרומטר המסה (MS) ו2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH •) זיהוי). האיור מציג את הנמל המרכזי מחובר לגלאי MS, ואילו • DPPH וגלאי UV-Vis מחוברים ליציאות ההיקפיים. מאז MS הוא הגלאי רגיש ביותר של שלוש, תזרום לגלאי זה הופנה מנמל היציאה המרכזי. כגילוי DPPH • הוא סלקטיבית לpresencדואר של נוגדי חמצון, ורגיש לפחות וסובלני ביותר להרחבת להקה, תזרום לגלאי זה הופנה מנמל היקפי. UV-Vis היה גלאי &#39;גנריות &quot;משניים, כך יזרום לגלאי זה הופנה מנמל היקפי שני. זרימת התאמה ברגע שהצינור המתאים כבר מחובר מיציאה לגלאי, זרימת יציאה מכל אחד מהגלאים יכולה להיות מותאמת לסכום הנדרש. דרך פשוטה למדוד את כמות זרימת יציאה מכל גלאי היא לשקול את הסכום של שלב נייד שelutes דרך כל יציאה על תקופת זמן נתונה. זרימת אחוז ובכך ניתן לקבוע, ויכולים להיות מותאם זרימת היחסים או על ידי קיצור או הארכת צינורות המחוברים לקו לשקע בגלאים בהתאם כדי שיתאים לדרישות של הגלאים של בחירה. יש גלאים שונים יש דרישות שונים של זרימה, למשל, תא הזרימה שלגלאי הקרינה (FLD) אינו קצב הזרימה מוגבל, אך יש להקפיד להימנע על-שמירת לחץ של תא הזרימה. מכאן השליטה של ​​זרימה דרך FLD בדרך כלל השיגה על ידי התאמת הירידה בלחץ על פני הגלאים האחרים ואת יתרת הזרימה אז עוברת דרך FLD. גלאי שרגיש לכמות הזרימה שמועברת הוא הטרשת הנפוצה. בדרך כלל, ספקטרומטרים המוניים סוף גבוה הנוכחיים יכולים בקלות לעבד סביב 1 עד 1.5 מיליליטר / דקה של שלב המימי בינוני נייד. מעל קצב זרימה זו, הצפה של המקור עלולה להפוך את MS שמיש. עם זאת, רגישות זיהוי ברוב ספקטרומטרים מסה נהנתה באמצעות ספיקות נמוכות יותר; ומכאן יכולות פיצול זרימת כוחות הביטחון הפלסטיניים הן מאוד שימושיות עבור יישומים הכוללים איתור טרשת נפוצה. יכולות להיות מנוצלת עמודה גבוהה ספיקות נפח, אבל עם המון נפח נמוך הועברו לגלאי MS. כוונון הזרימה לגלאי MS, לעומת זאת, חייבת להתבצע על ידי התאמת הירידה בלחץ לפניגלאי MS, MS ולא הודעה. כאן, השימוש בצינורות צרים נשא (id 0.1 מ&quot;מ) הוא מאוד שימושי, כמו הלחץ יכול להיות מותאם בקלות מבלי להוסיף נפח מת שאינו הולם. בהתאם לסוג של גלאי ההתאמה של יחס הפילוח ניתן לעשות גלאי או לפני או אחרי. אם גלאי אינו הרסני, כגון משמש UV-Vis, זרימת אחוז יהיה מדוד ומכוון פוסט גלאי. אם גלאי הרסני אחת משמש בקומפלקס להגדיר את זרימת אחוז נקבע על ידי החישוב לאחור ביחס לזרימת נמל האחוזים אחרים. אם גלאי מבוסס מגיב משמש כגון DPPH •, זרימת אחוז נמדד הודעה גלאי ללא התוספת של מגיב; ואם שניים או יותר הרסני גלאים משמשים, אז זרימת היחס נמדד מראש גלאי. איתור מערכות שעשויות לדרוש מכשור נוסף, DPPH • כאמור, יהיה לחץ מערכת נוסף שעשויות לשנות את הזרימהאחוז מצורף פעם אחת למערכת האיתור. לכן, שיקול דעת צריכה להיות משולם על לחץ במערכת של גלאים הרסניים, מראש גלאי בעת כוונון זרימת אחוז. ללא קשר ליחס הזרימה שמוגדר דרך כל היציאות, יש לקבל מידע כמותי באמצעות תקינה מתאימה. ברגע שזרימת היחסים מוגדרים, לעומת זאת, הם חזקים, והם לא ישתנו גם בתנאי elution שיפוע 7, פרוטוקול וידאו מפורט המלווה את כתב היד הזה נועד להראות כיצד להשתמש ומנגינת תפקוד עמודת כוחות הביטחון הפלסטיניים במצב ריבוב של זיהוי.

<table><tbody><tr><td>HPLC instrument</td><td></td><td></td><td>Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, pump.</td></tr><tr><td>Parallel Segmented Flow HPLC column</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Not Defined</td><td>Soon to be commercialized</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Any brand</td><td></td><td>HPLC Grade</td></tr><tr><td>PEEK tubing</td><td>Any brand</td><td></td><td>Various lengths and i.d.</td></tr><tr><td>Column stoppers</td><td>Any brand</td><td></td><td>For blocking unused peripheral ports.</td></tr><tr><td>PEEK tube cutter</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytical Scale Balance</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stop watch</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eluent collection vessels</td><td>Any brand</td><td></td><td>1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels</td></tr></tbody></table>

tuning a parallel segmented flow column and enabling multiplexed detection

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

ניתוח HPLC מרובב בוצע באמצעות טור AFT במצב כוחות הביטחון הפלסטיניים (איור 1) ולהגדיר כפי שמודגם באיור 2. סוג זה של התקנה אפשר קפה מדגם להיות מנותח בו זמנית באמצעות UV-Vis, DPPH • ו- MS בסך הכל רוזן יון מצב (TIC). התרכובות של קפה המדגם שהגיב לDPPH • אז יכול...

Watch this Scientific Journal Video about Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection at JoVE.com

Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

כוונון טור מקוטע זרימה מקבילה והפעלת איתור Multiplexed

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

tuning-parallel-segmented-flow-column-enabling-multiplexed

Research

JoVE Journal

Chemistry

7.3K Views.  University of Western Sydney. Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection. 

Video: Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, glass coverslips are functionalized in a one-step reaction with silane-PEG-biotin. Flow cells are constructed by sandwiching an adhesive tape with pre-cut channels between a functionalized coverslip and a PDMS slab containing inlet and outlet holes. Multiple channels are integrated into one flow cell and the flow of reagents into each channel can be fully automated, which significantly increases the assay throughput and reduces hands-on time per assay. Inside each channel, biotin-&#955;-DNAs are immobilized on the surface and a laminar flow is applied to flow-stretch the DNAs. The DNA molecules are stretched to &#62;80% of their contour length and serve as spatially extended templates for studying the binding and transport activity of fluorescently labeled molecules. The trajectories of single molecules are tracked by time-lapse Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) imaging. Raw images are analyzed using streamlined custom single particle tracking software to automatically identify trajectories of single molecules diffusing along DNA and estimate their 1D diffusion constants.

This protocol demonstrates a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying one-dimensional (1D) diffusion of molecules along DNA.

מולקולה בודדת פשוטה, חסון וגבוה התפוקה זרימה מתיחה Assay יישום לימוד התחבורה של מולקולות לאורך הדנ א

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Biochemistry

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

הודעת הטור derivatization שימוש ביצועים גבוהים תזרים תגובת עמודות נוזלת כרומטוגרפיה

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

הרמת מסך טור זרימה: אופטימיזציה של יעילות ורגישות

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

Flow-pattern Guided Fabrication of High-density Barcode Antibody Microarray

Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this report, we renovate the antibody microarray technology by using a novel approach for manufacturing and by introducing new features. The fabrication of our high-density antibody microarray is accomplished through perpendicularly oriented flow-patterning of single stranded DNAs and subsequent conversion mediated by DNA-antibody conjugates. This protocol outlines the critical steps in flow-patterning DNA, producing and purifying DNA-antibody conjugates, and assessing the quality of the fabricated microarray. The uniformity and sensitivity are comparable with conventional microarrays, while our microarray fabrication does not require the assistance of an array printer and can be performed in most research laboratories. The other major advantage is that the size of our microarray units is 10 times smaller than that of printed arrays, offering the unique capability of analyzing functional proteins from single cells when interfacing with generic microchip designs. This barcode technology can be widely employed in biomarker detection, cell signaling studies, tissue engineering, and a variety of clinical applications.

This protocol outlines the fabrication of a large-scale, multiplexed two-dimensional DNA or antibody array, with potential applications in cell signaling studies and biomarker detection.

ייצור מודרך זרימת דפוס בצפיפות גבוהה ברקוד נוגדן Microarray

Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this ...

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the main trend in the advanced development of flow cytometry. Notably, adding high-resolution imaging capabilities allows for the complex morphological analysis of cellular/sub-cellular structures. This is not possible with standard flow cytometers. However, it is valuable for advancing our knowledge of cellular functions and can benefit life science research, clinical diagnostics, and environmental monitoring. Incorporating imaging capabilities into flow cytometry compromises the assay throughput, primarily due to the limitations on speed and sensitivity in the camera technologies. To overcome this speed or throughput challenge facing imaging flow cytometry while preserving the image quality, asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) has been demonstrated to enable high-contrast, single-cell imaging with sub-cellular resolution, at an imaging throughput as high as 100,000 cells/s. Based on the imaging concept of conventional time-stretch imaging, which relies on all-optical image encoding and retrieval through the use of ultrafast broadband laser pulses, ATOM further advances imaging performance by enhancing the image contrast of unlabeled/unstained cells. This is achieved by accessing the phase-gradient information of the cells, which is spectrally encoded into single-shot broadband pulses. Hence, ATOM is particularly advantageous in high-throughput measurements of single-cell morphology and texture &#8211; information indicative of cell types, states, and even functions. Ultimately, this could become a powerful imaging flow cytometry platform for the biophysical phenotyping of cells, complementing the current state-of-the-art biochemical-marker-based cellular assay. This work describes a protocol to establish the key modules of an ATOM system (from optical frontend to data processing and visualization backend), as well as the workflow of imaging flow cytometry based on ATOM, using human cells and micro-algae as the examples.

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

This protocol describes the implementation of an asymmetric-detection time-stretch optical microscopy system for single-cell imaging in ultrafast microfluidic flow and its applications in imaging flow cytometry.

Microfluidic דימות זרימת cytometry ידי אסימטרית איתור זמן למתוח אופטי מיקרוסקופית (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

Engineering

A Modular Microfluidic Technology for Systematic Studies of Colloidal Semiconductor Nanocrystals

Colloidal semiconductor nanocrystals, known as quantum dots (QDs), are a rapidly growing class of materials in commercial electronics, such as light emitting diodes (LEDs) and photovoltaics (PVs). Among this material group, inorganic/organic perovskites have demonstrated significant improvement and potential towards high-efficiency, low-cost PV fabrication due to their high charge carrier mobilities and lifetimes. Despite the opportunities for perovskite QDs in large-scale PV and LED applications, the lack of fundamental and comprehensive understanding of their growth pathways has inhibited their adaptation within continuous nanomanufacturing strategies. Traditional flask-based screening approaches are generally expensive, labor-intensive, and imprecise for effectively characterizing the broad parameter space and synthesis variety relevant to colloidal QD reactions. In this work, a fully autonomous microfluidic platform is developed to systematically study the large parameter space associated with the colloidal synthesis of nanocrystals in a continuous flow format. Through the application of a novel translating three-port flow cell and modular reactor extension units, the system may rapidly collect fluorescence and absorption spectra across reactor lengths ranging 3 - 196 cm. The adjustable reactor length not only decouples the residence time from the velocity-dependent mass transfer, it also substantially improves the sampling rates and chemical consumption due to the characterization of 40 unique spectra within a single equilibrated system. Sample rates may reach up to 30,000 unique spectra per day, and the conditions cover 4 orders of magnitude in residence times ranging 100 ms - 17 min. Further applications of this system would substantially improve the rate and precision of the material discovery and screening in future studies. Detailed within this report are the system materials and assembly protocols with a general description of the automated sampling software and offline data processing.

Detailed herein are the operation and assembly protocols of a modular microfluidic screening platform for the systematic characterization of colloidal semiconductor nanocrystal syntheses. Through fully adjustable system arrangements, highly efficient spectra collection may be carried out across 4 orders of magnitude reaction time scales within a mass transfer-controlled sampling space.

טכנולוגיה Microfluidic מודולרי עבור מחקרים שיטתיים של מוליכים למחצה Colloidal Nanocrystals

Colloidal semiconductor nanocrystals, known as quantum dots (QDs), are a rapidly growing class of materials in commercial electronics, such as light ...

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. This step is necessary for the generation of small molecular weight peptides, generally with MW &#60; 3,000-4,000 Da, that fall within the effective scan range of mass spectrometry instrumentation. Conventional protocols involve O/N enzymatic digestion at 37 &#186;C. Recent advances have led to the development of a variety of strategies, typically involving the use of a microreactor with immobilized enzymes or of a range of complementary physical processes that reduce the time necessary for proteolytic digestion to a few minutes (e.g., microwave or high-pressure). In this work, we describe a simple and cost-effective approach that can be implemented in any laboratory for achieving fast enzymatic digestion of a protein. The protein (or protein mixture) is adsorbed on C18-bonded reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) silica particles preloaded in a capillary column, and trypsin in aqueous buffer is infused over the particles for a short period of time. To enable on-line MS detection, the tryptic peptides are eluted with a solvent system with increased organic content directly in the MS ion source. This approach avoids the use of high-priced immobilized enzyme particles and does not necessitate any aid for completing the process. Protein digestion and complete sample analysis can be accomplished in less than ~3 min and ~30 min, respectively.

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

עיבוד אנזימתי תענית חלבונים עבור איתור MS עם microreactor זרימה דרך

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

Bioengineering

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

ססגוניות קרינת איתור עבור מיקרופלואידיקה אגל באמצעות סיבים אופטיים

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

פלטפורמת microfluidic עם איתור Multiplexed אלקטרוני למערכות מעקב מרחבית של חלקיקים

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the averaging that takes place in bulk-phase studies. To achieve visualization, dual optical tweezers, where one trap is fixed and the other is mobile, are focused into one channel of a multi-stream microfluidic chamber positioned on the stage of an inverted fluorescence microscope. The optical tweezers trap single molecules of fluorescently labeled DNA and fluid flow through the chamber and past the trapped beads, stretches the DNA to B-form (under minimal force, i.e., 0 pN) with the nucleic acid being observed as a white string against a black background. DNA molecules are moved from one stream to the next, by translating the stage perpendicular to the flow to enable the initiation of reactions in a controlled manner. To achieve success, microfluidic devices with optically clear channels are mated to glass syringes held in place in a syringe pump. Optimal results use connectors permanently bonded to the flow cell, tubing that is mechanically rigid and chemically resistant, and which is connected to switching valves that eliminate bubbles that prohibit laminar flow.

Visual, single-molecule biochemistry studied through microfluidic chambers is greatly facilitated using glass barrel, gas-tight syringes, stable connections of tubing to flow cells, and elimination of bubbles by placing switching valves between the syringes and tubing. The protocol describes dual optical traps that enable visualization of DNA transactions and intermolecular interactions.