אנו מודים טוני Kulesa, רובין קירקפטריק, Gatzogiannis אוונגלוס לקבלת סיוע עם ההתקנה הראשונית מכשור ובדיקות. אנו מודים נוספים טוני Kulesa לעזרה משמעותית בכתיבה של הערכת החלקיק בודד מותאם אישית תוכנת מעקב. עבודה זו נתמכה על ידי אתחול מימון, פרס את הקריירה ב מדעי ממשק (PCB) של הקרן Wellcome בורוז.

1. הכנה של ביוטין-λ-DNA הערה: ביוטין-λ-DNA מולקולות מוכנים על ידי נבדק התווית על-ידי ביוטין oligonucleotide, 5 &#39;-AGGTCGCCGCCC(A) 20 - ביוטין - 3 &#39; כדי Λ-DNA מולקולות 20-
<ol><li>הכנת 0.1 מ מ ביוטין שכותרתו oligo במאגר טה.</li>
	<li>חום 0.5 מ"ג/מ"ל λ-DNA מניות ב 65 ° C 60 s, ו לצלול לתוך קרח רטוב מיד. 
	הערה: כיבוי מהיר קירור מפחית λ-DNA concatemerization.</li>
	<li>µL 100 פיפטה של הפתרון λ-DNA לתוך צינור microcentrifuge.</li>
	<li>1 להוסיף µL של oligo 0.1 מ מ לתוך µL 9 מאגר טה.</li>
	<li>להוסיף 2 µL של הפתרון oligo הצינור microcentrifuge המכיל את λ-ה-DNA. לערבב ביסודיות. 
	הערה: Oligo קיים כ עודף טוחנת 12-fold מעל לקצה λ משלימים-DNA-</li>
	<li>מחממים את התערובת λ-DNA/oligo-65 ° C 60 ס</li>
	<li>מגניב לאט את התערובת לטמפרטורת החדר. 
	הערה: שלב זה מאפשר את oligo anneal עד הסוף λ משלימים-DNA-</li>
	<li>מניחים את התערובת על קרח. להוסיף µL 11 T4 DNA ליגאז התגובה מאגר (מאגר הסופי ריכוז 1 x). מערבבים בעדינות. לאחר מכן להוסיף 2 µL (800 יחידות) של האנזים ליגאז T4 DNA. מערבבים בעדינות.</li>
	<li>דגירה התערובת כבר שעתיים ב 16 ° C או ללון ב- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>לטהר את המוצר באמצעות צינורות צנטריפוגלי מסנן עם הגבלת משקל מולקולרי הנומינלי של 100 kDa. באופן ספציפי, להעביר את התערובת שלב 1.9 לתוך צינור צנטריפוגלי מסנן צנטריפוגה ב 14,000 x g במשך 5 דקות, לשטוף עם מאגר טה µL 400 פעמיים, לאסוף את המוצר מטוהרים. 
	הערה: כמו לטהר ביוטין-λ-DNAs במאגר טה יציבים ב-20 ° C עד שנה אחת.</li>
</ol> 2. Coverslip functionalization הערה: coverslips זכוכית דקה הם functionalized על ידי מגיבים silane-פג-ביוטין. פרוטוקול תגובת זה צעד אחד הוא פשוט יותר ואמינה יותר מהניסיון שלנו מאשר פרוטוקול תגובת שני שלבים תקן 20. Coverslip functionalization עם silane-פג-ביוטין יוצרת אתרי קישור עבור streptavidin וצמצום DNA לא ספציפית ו חלבון ספיחה השטח coverslip.
<ol><li>Sonicate חמש coverslips מס ' 1 ב- 95% אתנול בפנים צביעת צנצנת 10 דקות, ואז לשטוף עם מים הנדסה גנטית עבור שלוש פעמים. 
	הערה: coverslip החמישי מספק רזרבי במקרה של שבירה.</li>
	<li>למלא את הצנצנת מכתימים 1 מ' KOH, sonicate 10 דקות, ואז לשטוף עם מים הנדסה גנטית שלוש פעמים.</li>
	<li>חוזר מחזור 2.1-2.2 פעמיים.</li>
	<li>יבש על coverslips תחת יבש נקי וזרימת הגז 2 N.</li>
	<li>יותר נקי ויבש על coverslips על-ידי החלת טיפול פלזמה אוויר בלחץ 900 mTorr עבור 5 דק.</li>
	<li>דגירה coverslips עם 25 מ"ג/מ"ל silane-פג-ביוטין מומס באתנול 95% בטמפרטורת החדר במשך ה 2 במיוחד, כריך µL 50 silane-פג-ביוטין פתרון בין שני coverslips יבש ונקי, דגירה של coverslip &#34; כריכים &#34; בתוך קופסא עצה פיפטה סגור עם-10 מ"ל של מים בתחתית (לא בקשר עם coverslips) כדי למזער את אידוי הממס.</li>
	<li>לשטוף את עודף מולקולות פג עם יבש יתדות מצופה coverslips תחת נקי והמים הנדסה גנטית יבש זרימת גז 2 N. 
	הערה: coverslips functionalized ניתן לאחסן שלושה ימים בתנאים אמביינט.</li>
</ol> 3. זרימה הבנייה תא הערה: זרימה תאים בנויים על-ידי sandwiching קלטת דבק כפול עם ערוצי חתוכות מראש בין יתד functionalized coverslip, לוח PDMS המכיל חורים כניסת ו עודפים. ערוצים מרובים משולבים לכל הזרימה תא.
<ol><li>עיצוב ערוצי זרימת תוכנה CAD ולחתוך את הערוצים (רוחב, עומק ואורך כל הערוצים הם 1, 0.13 ו- 12 מ מ בהתאמה) בקלטת דבק כפול על-ידי שימוש בחותך הקלטת (בדרך כלל שמונה ערוצי משולבים בכל תא זרימה). להסיר שאריות הקלטת כדי ליצור את ערוצי זרימה.</li>
	<li>כדי להפוך לוחות PDMS, לערבב ביסודיות 45 גר' PDMS עם 5 g של ריאגנט crosslinking (מספיק להכנת 12 5 מ מ עבה כרונית לוחות יכול להיות מאוחסן באופן בלתי מוגבל בתנאים אמביינט) באמצעות מערבל, שופכים את התערובת לתוך שתי צלחות פטרי 10 ס מ, ולהשאיר מנות בתוך תא ואקום עד למעשה כל אוויר בועות נעלמו (באופן ידני להסיר בועות אוויר אם יישארו כאשר הכלים יוסרו מן החדר ואקום). ואז להעביר את הכלים לתנור 80 ° C עד PDMS עפור (כ ח 2).</li>
	<li>לגזור לוח PDMS התואם לגודל כפול-דבק עם ערוצי חתוכות מראש. סרט הגנה אחד קליפת לדבוק הסרט על פרצוף שטוח של לוח PDMS לסירוגין כפול-דבק. ניקוב החורים outlet, מפרץ צר על שולחן הניתוחים PDMS באמצעות ביופסיה-צעצועים עם מחט מד 23.</li>
	<li>לקלף סרט הגנה השני תוריד את המדבקה כפול-דבק וציות מכלול קלטת PDMS השטח functionalized של coverslip (ודא coverslip הוא שטוח. ראה תמונה של תא זרימה שהרכבתם איור 1a).</li>
</ol> 4. הדמיה TIRF הערה: ביוטין-λ-DNAs הם קשור משטח ערוץ הזרימה, זרימה שכבתית מוחל על זרימה למתוח את מולקולות ה-DNA ( איור 1b). &#62; 80% נמתח לשרת מולקולות DNA כתבניות במרחב מורחבת עבור התבוננות בפעילות האיגוד ותעבורה של מולקולות fluorescently עם תוויות. מסלולים של מולקולות יחיד מתבצע על ידי הדמיה TIRF בצילום מואץ ( איור 1 c &#38; e).
<ol><li>לתקן התא זרימה על מיקרוסקופ הבמה ואת עומס מראש degassed ריק מאגר (10 מ מ סודיום פוספט, 2 מ מ NaCl, 50 מיקרומטר EDTA, אתנול 20 מ מ 5% (v/v) גליצרול, 0.01% Tween-20, 1% (v/v) β-mercaptoethanol, pH 7.4), פתרון streptavidin 0.2 מ"ג/מ"ל, 1 מ ג / mL שור אלבומין (BSA) פתרון והפתרון 100 pM ביוטין-λ-DNA לתוך ארבעה מאגרים בכך אחד שיש אבובים Tygon מחובר ערך סולנואיד ו אבובים Tygon עוד מחובר לצנרת הצצה מאת sleeving הצנרת Tygon מעל (צינורות קטנים יותר הצצה מונע זרם אחורי של ריאגנטים). דגה כרכים קטנים של המאגר על ידי חשיפה לילה ואקום או חשיפה קצרה ואקום עם ערבוב (עד בועות אינן גלויות).</li>
	<li>מכניס הצנרת הצצה של המאגר המאגר ריק חור כניסה אחד של התא זרימה. פריים בערוץ מאת זורם במאגר ריק ולאחר הכנס שלושה צינורות אחרים להציץ לתוך חורים כניסת לחץ האוויר מונע זרימה של כל מגיב הוא נשלט על ידי ברזים, ולגמרי אוטומטית באמצעות סקריפט המחשב. להיזהר לא לגרום היווצרות בועות אוויר בערוץ.</li>
	<li>התחבר עם אבובים Tygon אבובים הצצה קצרה מן החור עודפים במיכל אשפה. הצנרת הצצה קצרה משקע החשמל עוזר לדכא היווצרות בועות אוויר במהלך העירוי על ידי שמירה על לחץ אוויר חיובי בתוך הערוץ.</li>
	<li>קשירת מולקולות ביוטין-λ-DNA על משטח ערוץ הזרימה.
	<ol><li>זרימה בפתרון streptavidin 0.2 מ"ג/מ"ל, תקופת דגירה של 5 דקות, ואז לזרום במאגר ריק לשטוף את streptavidin לא מאוגד.</li>
		<li>זרימה בפתרון 1 מ"ג/מ"ל BSA, תקופת דגירה של 1 דקות, וזרימה ואז במאגר ריק לשטוף את BSA לא מאוגד. 
		הערה: BSA נוסף מדכאת את ה-DNA, דוגמת ספיחה אל פני השטח.</li>
		<li>זרימה בפתרון 100 pM ביוטין-λ-DNA, תקופת דגירה של 10 דקות, ואז לזרום במאגר ריק לשטוף את DNAs לא מאוגד. 
		הערה: לאחר ה-DNA מאוגדת אל פני השטח, למנוע זורם מהירה כדי למנוע נזק מולקולות DNA קשור.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>כדי לבדוק את איכות coverslip functionalized, זרימה ב- DNA צביעת צבע כגון Sytox כתום בתנאים assay כדי לשמש (קריאה 4.6 להלן), ולהתחיל פלורסצנטיות הדמיה מתחת 532 ננומטר לייזר תאורה. 
	הערה: איכות coverslip functionalized טובה בדרך כלל, הצפיפות של מולקולות DNA זרימה נמתח יהיה גבוה. זה חיוני כדי יש צפיפות גבוהה מספיק של מולקולות DNA זרימה נמתח כך יכול להיות שנצפו איגוד ה-DNA ואירועים דיפוזיה הזזה/1 יח.</li>
	<li>פיין לכוון את זווית TIRF כדי להשיג את האות הטוב ביותר ליחס רעש של תמונות של מולקולות DNA נמתח ( איור 1 d).</li>
	<li>להקליט מסלולים של מולקולות יחיד נע לאורך ה-DNA, חזור על שלבים 4.2-4.4 בתוך ערוץ חדש (ללא DNA מכתימה את צבען), ולאחר מכן להשרות sub טרום degassed-nanomolar fluorophore שכותרתו מולקולות בספיקה גבוהה מספיק באמצעות מזרק משאבה ו לאסוף תמונות בצילום מואץ זריחה עם קצב מסגרות של 100 הרץ- 
	הערה: קצב זרימה שווה ערך למספר ויסנברג (אינטרנט: המוצר שהוא של הזמן הארוך ביותר פולימר הרפיה - כ 0.2 s עבור λ-DNA - וקצב הטיה - שינוי מהירות זרימה עם המרחק מפני הקרקע coverslip) של 500 בפנים ערוץ מומלץ עבור הדמיה מולקולה בודדת עם קצב מסגרות של 100 הרץ 21.
	<ol><li>10,000 לאסוף מסגרות באחד שדה-Of-View (FOV) כדי לייצר סרט, לאסוף סרטים דומים מן FOVs (בדרך כלל 10) מרובים עבור דגימה. 
		הערה: צפיפות החלקיקים יחיד FOV אחד צריך להיות אף גבוה מדי - אשר תגרום לסיבוך ניתוח נתונים על-ידי הפיכת הקצאה אובייקט מעבר מסגרות רב-משמעי, וגם לא נמוכה מדי - אשר עלול להוביל נמוך התרחשות של אירועים מולקולה בודדת על ה-DNA-</li>
		<li>לייעל את עוצמת תאורה כך מולקולות שמאוגד אל פני השטח coverslip הם במהירות צילום קשה לדכא את הרקע בזמן הם מולקולות לשדר על ה-DNA לא מולבן מהר מדי, כך שניתן לאתר מסלולים ארוכים יותר. 
		הערה: אנחנו בדרך כלל משתמשים 200-800 W/cm 2 כוח צפיפות FOV.</li>
	</ol></li> <li>בסוף שלב 4.6, להחדיר DNA צביעת צבע כדי לאשר במולקולות דנ א עדיין ניתן נמתח-זרימה.</li>
	<li>להפעיל שתי דוגמאות חיוביות ושליליות שליטה. 
	הערה: פקד חיובי טוב הוא tetrapeptide, TetraMethylRhodamine (TMR)-מעניין (TMR הוא מצמידים את N-מסוף amine) אשר יש קבוע דיפוזיה 1 י רשע של 10.5 ± 0.7 (שגיאה סטנדרטית) M (bp 2/s) ב- pH נייטרלי 11. פקד שלילית טובה היא למדוד דגימות שכותרתו עניין במאגר וזמינותו של ערוץ בעל אין דנ א קשורה, שבו אין פעילות ב- DNA דיפוזיה שיזוהו.</li>
</ol> 5. ניתוח נתונים: הערה: חלקיק יחיד מותאמות אישית תוכנת מעקב זה המשמש לזיהוי מסלולים של מולקולות יחיד לשדר לאורך הדנ א מעריכים דיפוזיה קבועים. תוכנה זו קובע תחילה העמדות centroid של חלקיקים יחיד עם רמת דיוק גבוהה, מזהה חלקיקים התקועות בקרקע coverslip, וקישורים ואז חלקיקים במסגרות שונות כדי ליצור מסלולים זמן לשגות. מכל אלה מסלולים, מוערך הקבועים דיפוזיה 1 י.
<ol><li>כדי להפעיל את ניתוח נתונים, פתח את תוכנת ה-scripting (ראה טבלה של חומרים), ללכת לספרייה של החלקיק בודד תוכנת מעקב. פתח את קובץ ה-script בשם &#34; largedataprocess3.m &#34;. פרמטר חשוב אחד יוגדר הוא ערך הסף לגילוי חלקיק בודד.</li>
	<li>כדי לקבוע את ערך הסף האופטימלי, להפעיל &#34; Determine_threshold_value.m &#34; ה-script. קובץ script זה יציין כיצד משפיעה על הסף גילוי חלקיק יחיד. לאחר קביעת הסף האופטימלי, להפעיל &#34; largedataprocess3.m &#34; script.</li>
	<li>לאחר סיום של חלקיק בודד עוקב אחרי ניתוח, לסנן את מסלולי raw על-ידי הפעלת &#34; Trajectory_filtering.m &#34; ה-script. ממשק משתמש גרפי (GUI) בנוי כדי להמחיש את השלב הסינון.</li>
	לוח <li>-GUI, מוגדר העקירה מינימלי לאורך ה-DNA, MinXDisp, 2 פיקסלים להגדיר העקירה מקסימלי רוחבי ל- DNA, MaxYDisp, ל- 2 פיקסלים; להגדיר את מספר מינימלי של מסגרות, minFrames, 10; להגדיר מספר מינימלי של מצבים של שלישיה, minTriplets, 10; הגדר את קבוע דיפוזיה מינימלית לאורך ה-DNA, D_par, 0; הגדר את קבוע דיפוזיה מקסימלי משוער רוחבי ל- DNA, D_trans, S 10 מ' (bp 2) -1; הגדר את פרמטר סטטיסטי מינימלי, צ'י _stat 2,-5; הגדר את יחס מינימלי של עקירה לאורך הדנ א הזה רוחבי ל- DNA, חוצפנית ש ל- 2- 
	הערה: כל מסלולי raw לעבור סינון פרמטרים אלה מפורטים בטבלה 1, ואת אלה שאינן מפורטות בטבלה 3.</li>
	<li>לחץ על מסלול מספר 1 בטבלה, המסלול יהיה שנעקרו גרפיקה 1 &#38; 2. לחץ על &#34; משחק &#34; לחצן לשחק את תמונות raw זריחה. לחץ על &#34; Add_to_Table2 &#34; כדי לזהות את המסלול כמו מולקולה בודדת הזזה מסלול. בסופו של דבר, כל מסלולי נוספו Table2 יישמרו בעת סגירת GUI.</li>
	<li>לחישוב הקבועים דיפוזיה מתכוון להריץ את הסקריפט &#34; Calculate_mean_diffusion_constant.m &#34;. קבוע דיפוזיה רשע מוערך של הסט של מסלולים אשר יש עבר את כל השלבים סינון נוסף שולחן 2-</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion-driven+mechanisms+of+protein+translocation+on+nucleic+acids.+1.+Models+and+theory.">Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 1. Models and theory.</a> Biochemistry. 20, 6929-6948 (1981).</li><li>Blainey, P. C., van Oijen, A. M., Banerjee, A., Verdine, G. L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+base-excision+DNA-repair+protein+finds+intrahelical+lesion+bases+by+fast+sliding+in+contact+with+DNA.">A base-excision DNA-repair protein finds intrahelical lesion bases by fast sliding in contact with DNA.</a> P Natl Acad Sci USA. 103, 5752-5757 (2006).</li><li>Leith, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-dependent+sliding+kinetics+of+p53.">Sequence-dependent sliding kinetics of p53.</a> P Natl Acad Sci USA. 109, 16552-16557 (2012).</li><li>Blainey, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+a+Viral+Proteinase+by+a+Peptide+and+DNA+in+One-dimensional+Space+IV.+Viral+proteinase+slides+along+DNA+to+locate+and+process+its+substrates.">Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space IV. Viral proteinase slides along DNA to locate and process its substrates.</a> J Biol Chem. 288, 2092-2102 (2013).</li><li>Graziano, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+a+Viral+Proteinase+by+a+Peptide+and+DNA+in+One-dimensional+Space+II.+Adenovirus+proteinase+is+activated+in+an+unusual+one-dimensional+biochemical+reaction.">Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space II. Adenovirus proteinase is activated in an unusual one-dimensional biochemical reaction.</a> J Biol Chem. 288, 2068-2080 (2013).</li><li>Graziano, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+a+viral+proteinase+by+a+peptide+and+DNA+in+one-dimensional+space:+I.+binding+to+DNA+and+to+hexon+of+the+precursor+to+protein+VI,+pVI,+of+human+adenovirus.">Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: I. binding to DNA and to hexon of the precursor to protein VI, pVI, of human adenovirus.</a> J Biol Chem. 288, 2059-2067 (2013).</li><li>Baniecki, M. L., McGrath, W. J., Mangel, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+a+viral+proteinase+by+a+peptide+and+DNA+in+one-dimensional+space:+III.+atomic+resolution+structure+of+the+nascent+form+of+the+adenovirus+proteinase.">Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: III. atomic resolution structure of the nascent form of the adenovirus proteinase.</a> J Biol Chem. 288, 2081-2091 (2013).</li><li>Kabata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+molecules+of+RNA+polymerase+sliding+along+DNA.">Visualization of single molecules of RNA polymerase sliding along DNA.</a> Science. 262, 1561-1563 (1993).</li><li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+RNA+polymerase-DNA+interactions+in+real+time.">Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time.</a> Biophysical journal. 76, 709-715 (1999).</li><li>Mangel, W. F., McGrath, W. J., Xiong, K., Graziano, V., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&amp;#34;Molecular+sled&amp;#34;-+vehicle+of+11-amino+acids+that+facilitates+biochemical+interactions+via+sliding+components+along+DNA.">&amp;#34;Molecular sled&amp;#34;- vehicle of 11-amino acids that facilitates biochemical interactions via sliding components along DNA.</a> Nature Communications. , (2016).</li><li>Xiong, K., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+sled+sequences+are+common+in+mammalian+proteins.">Molecular sled sequences are common in mammalian proteins.</a> Nucleic Acids Res. 44, 2266-2273 (2016).</li><li>Xiong, K., Erwin, G. S., Ansari, A. Z., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sliding+on+DNA:+from+peptides+to+small+molecules.">Sliding on DNA: from peptides to small molecules.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55, 15110-15114 (2016).</li><li>Turkin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+biomolecular+interactions+by+molecular+sledding.">Speeding up biomolecular interactions by molecular sledding.</a> Chem Sci. 7, 916-920 (2016).</li><li>Zhang, L., Zheng, L., Meng, Z., Balinin, K., Loznik, M., Herrmann, ,. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+chemical+reactions+by+molecular+sledding.">Accelerating chemical reactions by molecular sledding.</a> Chem Commun (Camb). 47, 6331-6334 (2017).</li><li>van Oijen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+kinetics+of+lambda+exonuclease+reveal+base+dependence+and+dynamic+disorder.">Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li><li>Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains+and+nanoscale+curtain+rods:+high-throughput+tools+for+single+molecule+imaging.">DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging.</a> Langmuir. 24, 10524-10531 (2008).</li><li>Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., Oijen, A. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Observation+of+Enzymes+Replicating+DNA+Using+a+Single-molecule+DNA+Stretching+Assay.">Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay.</a> J Vis. Expt. , e1689 (2010).</li><li>Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+accurate+particle+tracking+by+calculation+of+radial+symmetry+centers.">Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers.</a> Nat Methods. 9, 724 (2012).</li><li>Vestergaard, C. L., Blainey, P. C., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+estimation+of+diffusion+coefficients+from+single-particle+trajectories.">Optimal estimation of diffusion coefficients from single-particle trajectories.</a> Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 89, 022726 (2014).</li><li>Schroeder, C. M., Blainey, P. C., Kim, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydrodynamic Flow-stretching Assay for Single-Molecule Studies of Nucleic Acid-Protein Interactions. , (2008).</li><li>Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Molecule Studies of Protein-DNA Interaction: Diffusive Search and Sequence-Dependent Motors. , (2007).</li><li>Gorman, J., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+one-dimensional+diffusion+of+proteins+along+DNA.">Visualizing one-dimensional diffusion of proteins along DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 768-774 (2008).</li><li>Lin, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Bias+from+Flow+to+Elucidate+Single+DNA+Repair+Protein+Sliding+and+Interactions+with+DNA.">Using the Bias from Flow to Elucidate Single DNA Repair Protein Sliding and Interactions with DNA.</a> Biophysical journal. 96, 1911-1917 (2009).</li><li>Blainey, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonspecifically+bound+proteins+spin+while+diffusing+along+DNA.">Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1224-1234 (2009).</li><li>Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H., Schroeder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+TALE+protein+dynamics+reveals+a+two-state+search+mechanism.">Direct observation of TALE protein dynamics reveals a two-state search mechanism.</a> Nat Commun. 6, 7277 (2015).</li><li>Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H. M., Schroeder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALE+proteins+search+DNA+using+a+rotationally+decoupled+mechanism.">TALE proteins search DNA using a rotationally decoupled mechanism.</a> Nat Chem Biol. 12, 831-837 (2016).</li><li>Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+DNA+replication+in+Xenopus+egg+extracts.">Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts.</a> Methods. 57, 179-186 (2012).</li><li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging.">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Method Enzymol. 472, 293-315 (2010).</li></ol>

מכון רחבה עשויה לבחור קובץ לפטנטים הכוללים היבטי העבודה המוצגת כאן.

כאשר מחליפים שני שלבים מסורתי coverslip functionalization התגובה פרוטוקול פרוטוקול תגובת בשלב אחד, הבחנו כי המהימנות של coverslip functionalization חל שיפור משמעותי. כמו הפעם תרגולים הכולל הכנה coverslip הוא פחות מ 30 דקות, אנו ממליצים על הכנת coverslips טריים הדמיה מולקולה בודדת בכל יום מתוכנן. כדי למזער את ההתדרדרות של silane-פג-ביוטין, הכימית צריך להיות aliquoted מאוחסנת מתחת יבש גז2 N ב-20 ° C עם קבלת. כאן אנחנו לא משתמשים מולקולות פג המייצרים -קו– או -CH3 קבוצות מסוף שימשו בעבר20. המטענים השליליים של -קו– קבוצות וקבוצות של הידרופובי -CH3 נוצלו כדי למנוע ספיחה לא ספציפית של מולקולות DNA ודוגמאות חלבון ספציפי אל פני השטח, בהתאמה. נתבונן ספיחה משטח נמוך מאוד על ידי דגימות פפטיד קטן על פני השטח פג באופן מלא המסתיימת ביוטין, בעוד silane-פג-COOH ו/או silane-פג-CH3 עשוי להיות שימושי עבור מבחני דגימות חלבון מסוים או כאשר assay תנאים (כגון pH &#60; 7.5) לקדם את ה-DNA-פני אינטראקציות.
משמרת מתאי זרימה שקופיות זכוכית PDMS זרימת תאי האצת הבנייה תא זרימה ומאפשר אינטגרציה קלה של ערוצים מרובים. אנחנו לעיתים קרובות מהנדס שמונה ערוצי בכל תא תזרים ולאפשר 8 ניסויים עצמאית לכל functionalized coverslip. להמשיך להגדיל את תפוקת לכל coverslip, מספרים גדול עוד יותר של מיקרו-מפוברק ערוצים יכול לשמש.
מומלץ כדי למנוע היווצרות בועות אוויר בתוך הערוץ בשלב כלשהו לאחר מילוי הראשונית. בדרך כלל, בועות אוויר לא לגרום לאבדן קשור DNAs (למרות שזה אפשרי), אבל מעדיף לשבש את הזרימה, לגרום DNAs לדבוק coverslip. מאגר degassing, על התוספת של כמויות חומרים פעילי שטח קטן הם בדרך כלל יעיל במניעת היווצרות בועה בתוך התעלה אבובים וזרימה. במקרים בו בועות אוויר מוצגים בפני הצנרת, נסה לשטוף את הבועות תחת זרם איטי. ולוודא כי הן אינן זורמות דרך האזור שבו הם קשורה DNAs.
תוכנת ניתוח נתונים מפושטת ויעילה היא קריטית, בגלל הכמות העצומה של הנתונים נוצר. אנו אוספים בדרך כלל 700,000 תמונות ברזולוציה גבוהה של מדידות על זרימה אחד התא, אשר יכול להיות מעובד באמצעות שלנו חלקיק יחיד מותאמות אישית תוכנת מעקב תוך יום אחד במחשב שולחני עם ליבות מעבד ו 32 Gb זיכרון. שיעור חיובי כוזב של זיהוי 1 י דיפוזיה מסלולים על-ידי התוכנה (שלב 5.5) מדגם תלויות, יכולים להיות נמוכה למדי בהתחשב בכך: 1) צפיפות החלקיקים יחיד FOV הוא נמוך מספיק כך אי-בהירות הקטן קישור חלקיקים מעבר מסגרות ( דגימות חלבון באופן כללי נוטים יותר ספיחה ספציפי כדי coverslip מפפטיד דגימות, וטעמו לפיכך, המאגר ואת הצפיפות הכוח של כל חלבון צריך להיות מותאם); 2) את האות לרעש יחס של חלקיקים יחיד הוא מספיק גבוה כך הסבירות שווא-זיהוי החלקיקים היא נמוכה. ובכל זאת, התוכנה יכול לטעות מדי פעם, אנו ממליצים על בדיקה ידנית של נתונים באמצעות GUI שסופקו כדי להעריך את ביצועי התוכנה. ביישום של רגישות גבוהה במיוחד זיהוי חיובי-false מסלול, פרמטרים תהליך כולל את ערך הסף, minFrames, minTriplets _stat2צ'י ניתן להגדיר יותר והטכני במחיר של רגישות נמוכה יותר עבור איגוד אמיתי אירועים, הטיה סטטיסטית פוטנציאל גדול בזיהוי המסלול. . אנחנו כאן לחלוק. ומתארות שלנו חלקיק יחיד מעקב תוכנה עם תקווה לסייע לתקנן שיטות ניתוח הנתונים ולעורר דיון אודות שיטות עבודה מומלצות.
בפרוטוקול שלנו, אשר דורש זרימה רציפה במהלך הדימות לשמירה על מצב מתוח של מולקולות תבנית ה-DNA, זרימת הנוזלים יכולת הטיה התעבורה של חלבונים מסוימים לאורך תבניות DNA אם הם לפזר ע י מנגנון hopping או אם hydrodynamic רדיוס של fluorophore שכותרתו הוא גדול22,23. בזמן כזה הטיה ולהשוואה תוקנה ב- datasets רוב, התעבורה של חלבונים המסומנת fluorophore קטן, לשדר באמצעות מנגנון הזזה הוא לא בדרך כלל מוטה במידה לזיהוי על ידי זרימה2,4, 24. ראוי לציין, ההשפעה של מהירות הזרימה בטרנספורט של חלבונים לאורך הדנ א שימש כדי לחקור את המנגנונים של חלבון לשדר לאורך הדנ א23. A מקרוב הקשורים גישה חלופית המאפשר מדידות בהיעדרו של זרימה מנצל תבניות DNA עם ביוטין-שניהם טרמיני (termini) אשר נמתחים transiently זרימת ו קשורה על ידי שני הקצוות כדי coverslip כזה כי מולקולות DNA להישאר בבית תצורת מורחב כאשר הזרם כבויה25,26,27,28. הגישה כפול-הקשר יש את היתרון של ומאפשר ניסויים ללא זרימת התחבורה אך דורש שינוי בשני הקצוות של מולקולות תבנית ה-DNA, בקרת זרימה זהיר במהלך tethering, ואפיון של המרחקים בין שני האתרים עגינה. בנוסף, השפעת הטרוגניות המתחים ואת הדינמיקה הסתגלותי DNA מעבר מולקולות הדנ א על מולקולה בודדת וזמינותו חייב להיות מוערך.
כליל, בנוסף לומד 1 י דיפוזיה של מולקולות לאורך הדנ א, וזמינותו דיווח כמו מולקולה בודדת יכולים להפיק תועלת רבים במבחנה הביוכימי של מחקרים biophysical ברמת מולקולה בודדת כולל ה-DNA והתמקד תהליכי החיפוש על-ידי חלבונים, פעילויות אנזימטיות על ה-DNA ועוד.
פתרון בעיות
בעיה 1: הדליפה ערוצי זרימה.
פתרון: ראשית, ודא כי העיצוב של ערוצי זרימה מאפשר לפחות 1.5 מ מ שוליים עבור איטום מסביב ובין ערוצי; ואז, במהלך ההרכבה של התא זרימה, ודא כי משטחי מגע בין את coverslip, את כפול-דבק המתים PDMS הם שטוחים, יבש, ללא פסולת, כי הלחץ שהופעל כדי ליצור את החותם הוא אחיד, כי פעולת האטימה לבצע בטמפרטורת החדר.
בעיה 2: הצפיפות של DNAs קשור הוא נמוך מדי.
פתרון: בעיה זו מתעוררת כאשר פג functionalization יעילות נמוכה או מולקולות הדנ א הם לא functionalized עם ביוטין. מהניסיון שלנו, הצפיפות של DNA קשור צריך להיות גבוה עבור &#62; 90% coverslips המוכן טרי או נשמרת כראוי ריאגנט silane-פג-ביוטין. במקרים כאשר הצפיפות של DNA קשור נמוך עם אוסף מוכחת של ביוטין-λ-DNA, לנסות להגביר ריכוז של silane-פג-ביוטין במהלך functionalization פג, ריכוזי streptavidin ביוטין-λ-DNA במהלך קשירת דנ א. ואם זה ייכשל, החלף את ריאגנטים פג ו- streptavidin.
בעיה 3: DNAs לדבוק coverslipלא יכול להיות מתח d על ידי זרימת.
פתרון: בעיה זו יכול גם להתעורר כאשר פג functionalization יעילות נמוכה, מועצמת על ידי pH וזמינותו נמוכה. נסה שתזרים BSA יותר או העלאת ה-pH (למשל ל- 8.0) לעזור לדכא את ה-DNA ספיחה אל פני השטח (שלב 4.3.2). אם ספיחה הדנ א הוא נושא מתמיד בתנאי מסוים assay, נסה כולל עד כדי 90% silane-פג-COOH במהלך functionalization פג.
הערות ניתוח נתונים:
אנו משתמשים מותאמות אישית חלקיק יחיד תוכנת מעקב לזיהוי מסלולים של מולקולות יחיד לשדר לאורך הדנ א, מ אשר קבועים דיפוזיה שלהם 1 י, D1 מוערך. כדי לשפר את ניתוח הנתונים, אנו ליישם אלגוריתם סימטריה מוקדית18 עבור לוקליזציה חלקיקי, מבוסס המשותפת משערך19 עבור הערכת 1 י דיפוזיה קבועים, אשר באופן דרמטי האיץ את ניתוח הנתונים מבלי להתפשר דיוק. אנחנו קודם לכן לאמת את התוכנה מותאמת אישית על-ידי ניתוח נתונים מדומה11. הצעדים העיקריים שיפורטו להלן.
זיהוי החלקיקים:
השלב זה עבור איתור של הממיין חלקיקים - מקומות מוגבל עקיפה - רקע. ראשית, במרחב הלהקה לעבור לסנן את התמונות כדי להגביר את האות של חלקיקים 3-5 טווח הפיקסלים (התואם לגודל של הפונקציה בנקודה-התפשטות במערכת שלנו) ואז סף בהתבסס על עוצמת (ראה קובץ script: spt2_SD_sandbox.m).
הקצאה centroid
רק הממיין את התמונה. רגישה מולקולות ברמת פיקסל רזולוציה מרחבית. כדי להתאים לשפה מולקולות רב ברמת דיוק גבוהה יותר, מעסיקים את סימטריה מוקדית אלגוריתם סופר רזולוציה18 תמונות מסונן כמפורט לעיל. (בשיטה זו מבוסס על חישוב אנליטיות, ובכך מפחית במידה רבה נטל חישובית לעומת שיטות אחרות-דיוק גבוהה פופולריים כגון התאמה לפי עקומת גאוס 2D (ראה קובץ script: spt2_SD_sandbox.m).)
חלקיק מעקב:
כדי לעקוב אחר המסלול של חלקיק דרך הזמן, אנו חייבים מחדש לזהות החלקיקים אותו כפי שהם מעבר בין מסגרות. אנו רואים בשלבים חניכה מהבהב, הפסקת להיות רכיבים של מסלול. אנחנו להגביל הצמדה של חלקיקים במסגרות הנוכחי לאלה המופיעים במסגרות קודמות על ידי המנוע המירבי המותר עבור כל מסגרת. במקרים בהם אפשר קישורים מרובים, האלגוריתם יונקר-Volgenant משמש להניב ערכות הצמדה באופן גלובלי אופטימלית (ראה קובץ script: traceTraj4_kx.3.m).
שערוך D1:
כדי להעריך D1 ערכים ממסלולים, אנו משתמשים משערך מבוססי השונות המשותפת (CVE)19. מבוסס על חישוב אנליטיות, שיטה זו יעילה יותר שהמפתחות, מבחינה סטטיסטית קפדני אחר נפוץ שיטות כמו רגרסיה של רשע displacements בריבוע (ראה קובץ script: runspt5_SD.m).
מסלול סינון:
מסלולים מסוימים מכילים פריטים כגון הצמדה משטח מכורך מולקולות ויש להסירו. אנחנו ליישם מספר תכונות כגון מקביל ל- DNA, רוחבי ל- DNA, אורך מינימלי של מסלול, מספר מינימלי של עמדות שלישיה רצופים זוהה, ואת הציון המינימלי הסתברות (ראה Xiong ואח11 המרבי תזוזה מינימלית הזחה להגדרת) אשר ניתן לסנן כדי לבודד ערכה מינימלית משוחד של מסלולים עשוי לייצג את מולקולות לשדר על ה-DNA (ראה קובץ script: sptViewFig2_update3x.m).

בעיה ארוכת שנים בביולוגיה היא איך אנדוגני חלבונים שפועלים ב ספציפי אתרי הגנום יכול לאתר את המטרות הדנ א שלהם מספיק מהר על האורגניזם לשרוד ולהגיב באופן יעיל את הסביבה. מחקרים ארבעים השנים האחרונות הציע והנחה תמיכה במידה רבה ההשערה כי קינטיקה של ה-DNA מקד חיפוש על-ידי חלבון יכול להיות מואץ על ידי דיפוזיה שבה החלבון חלופות בין דיפוזיה 3D בכמויות 1 י דיפוזיה (כולל הזזה וסיבוב תהליכים) לאורך הדנ א1. כיום ידוע כי רבים החלבונים המעורבים הכונה, מטבוליזם חומצות גרעין ותהליכים אחרים מסוגלים מחליק על ה-DNA2,3,4,5,6,7 8, ,9. יתר על כן, מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו כי פפטידים קטן אפילו ניתן לאגד שקופיות על ה-DNA, עם היכולת לשאת מטען; לדוגמה, מולקולת חלבון או פריימר PCR, לאורך הדנ א10,11,12,13,14.
במהלך 15 השנים האחרונות, וזמינותו מתיחה-זרימה מולקולה בודדת כבר בשימוש נרחב ללמוד האיגוד לבין דיפוזיה של מולקולות לאורך הדנ א2,15,16. בסוג זה של assay, biotinylated כפול גדילי DNA מולקולות הם ותשמרו על פני השטח, זרימה שכבתית מוחל על זרימה למתוח את ה-DNA. &#62; 80% נמתח DNAs משמשים כתבניות במרחב המורחבת לימוד פעילות איגוד ותעבורה של מולקולות המסומנת fluorophores איפה מסלולים של מולקולות יחיד לאורך ה-DNA מסומנים על-ידי קרינה פלואורסצנטית זמן לשגות הדמיה. במימוש שלנו, אופטימיזציה עבור הפארמצבטית וקלות השימוש, וזמינותו הזה מורכב חמישה שלבים עיקריים: הכנה של ביוטין-λ-DNA, coverslip functionalization, זרימה תא הבנייה, קרינה פלואורסצנטית הדמיה וניתוח נתונים. הפרוטוקולים הקודמים17, coverslips זכוכית דקה היו functionalized על ידי הראשון מגיבים עם (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) ולאחר מכן עם ריאגנטים אמין-תגובתי פוליאתילן גליקול (PEG) (למשל, NHS-פג-ביוטין) כדי ליצור שכבת פג המתנגד ספיחה לא ספציפית של רכיבים assay השטח coverslip. איכות functionalized coverslips היו תלויים במידה רבה איכות ריאגנטים פג ועל תנאי ריאקציה בכל שלב. פרוטוקול שלנו מתאר של פרוטוקול functionalization מפושטת ובנייה זרימה מולטיפלקס תא המחייב לא דבק נוזלי או לרפא את הזמן על תאי זרימה הימים הם מורכבים. נתאר גם על נתונים יעיל וחזק ניתוח הליך11 המבטל צעדים רגרסיה שהמפתחות אינטנסיבית על-ידי החלת שיטת סימטריה מוקדית centroid לוקליזציה18 ו דיפוזיה מבוססי המשותפת משערך קבוע19.
כאן, אנחנו מדווחים פשוטה, חזקים, מולקולה בודדת תפוקה גבוהה לזרום יישום assay מתיחה עם שיפורים משמעותיים שנעשו coverslip functionalization, זרימה תא בנייה וניתוח נתונים. בפרט, פיתחנו פרוטוקול functionalization coverslip בשלב אחד, שבו coverslips נקי. יבש להגיב ישירות עם silane-פג-ביוטין. פרוטוקול זה מפשט את ההכנה coverslip, משפר את המהימנות של איכות functionalized משטחים לעומת פרוטוקול תגובת סטנדרטי בן שני שלבים. אנו מתארים את השימוש coverslips אז-functionalized עם תאי זרימה PDMS מרובה ערוצים המאפשרים חיבורים לצנרת חזקים להתבצע ללא דבק. תאים זרימה אלה נוספות כוללות מרובים מבוקר-מחשב אינלטס עבור כל תא זרימה אשר מאפשרים זרימה מגיב אוטומטית לצמצם את זמן על הידיים במהלך ההתקנה ואת וזמינותו מוגברת התפוקה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="906">
	<tbody>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:249px;">Biotin labeled oligo, 5&#8217;-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3&#8217;</td>
			<td style="width:249px;">IDT</td>
			<td style="width:159px;">Custom oligo synthesis</td>
			<td style="width:249px;">Standard desalting purification is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">&#955;-DNA</td>
			<td style="width:249px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:159px;">N3011S</td>
			<td style="width:249px;">Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">T4 DNA ligase and ligation reaction buffer</td>
			<td style="width:249px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:159px;">M0202S</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton</td>
			<td style="width:249px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:159px;">UFC510008</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">No. 1 glass coverslips</td>
			<td style="width:249px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">48393-106</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Pure ethanol</td>
			<td style="width:249px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">89125-186</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Potassium hydroxide pellets</td>
			<td style="width:249px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">P250-500</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Plasma cleaner, model No. PDC-32G</td>
			<td style="width:249px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:249px;">Silane-peg-biotin</td>
			<td style="width:249px;">Nanocs</td>
			<td style="width:159px;">PG2-BNSL-5k</td>
			<td style="width:249px;">Store at -20oC in dry nitrogen gas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">A CAD software</td>
			<td style="width:249px;">Autodesk</td>
			<td style="width:159px;">AutoCAD</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Double-adhesive tape</td>
			<td style="width:249px;">Adhesive Applications</td>
			<td style="width:159px;">8512-2-DP/DL</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP</td>
			<td style="width:249px;">Graphtec America</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PDMS and crosslink reagent kit</td>
			<td style="width:249px;">R.S. Hughes</td>
			<td style="width:159px;">RTV615 CLEAR 010</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">Degassing chamber, model No. F42010-0000</td>
			<td style="width:249px;">BEL-ART Products</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Mixer, model No. ARV-310</td>
			<td style="width:249px;">Thinky</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:249px;">Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm</td>
			<td style="width:249px;">Harris Uni-Cores</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:249px;">This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Tygon tubing</td>
			<td style="width:249px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:159px;">EW-06420-02</td>
			<td style="width:249px;">0.020&#34; ID, 0.060&#34;OD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Peek tubing</td>
			<td style="width:249px;">Western Analytical</td>
			<td style="width:159px;">PK007-031-Y</td>
			<td style="width:249px;">0.007&#34; ID, 0.031&#34;OD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:249px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:159px;">N7021S</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:249px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:159px;">B9000S</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Sytox orange nucleic acid stain</td>
			<td style="width:249px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:159px;">S11368</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Ti-E Microscope</td>
			<td style="width:249px;">Nikon</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td rowspan="5" style="width:249px;">Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF</td>
			<td style="width:249px;">Nikon</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">CMOS camera</td>
			<td style="width:249px;">Hammamatsu</td>
			<td style="width:159px;">Orca Flash 4.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Dichroic mirror</td>
			<td style="width:249px;">Semrock</td>
			<td style="width:159px;">FF560/659-Di01-25x36</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Bandpass filter</td>
			<td style="width:249px;">Semrock</td>
			<td style="width:159px;">FF560/659-Di01-25x36</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">532 nm laser</td>
			<td style="width:249px;">Rayscience Innovation Limited, Shanghai</td>
			<td style="width:159px;">OEMLL-FN-532nm-C</td>
			<td style="width:249px;">Select wavelength to correspond to stain of choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:249px;">Chemxy</td>
			<td style="width:159px;">Fusion 200</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">TMR-KRRR, &#62;=85% purity</td>
			<td style="width:249px;">MIT Biopolymer lab</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">pVIc-Cy3B, HPLC purified</td>
			<td style="width:249px;">A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Script programming software</td>
			<td style="width:249px;">MathWorks</td>
			<td style="width:159px;">Matlab</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:249px;">* see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple, robust, and high throughput single molecule flow stretching assay implementation for studying transport of molecules along dna

אנו מתארים של תפוקה גבוהה, עמיד ופשוט מולקולה בודדת מתיחה-זרימה assay לימוד 1 י דיפוזיה של מולקולות לאורך הדנ א. ב הזה assay, coverslips זכוכית דקה הם functionalized בתגובה בשלב אחד עם silane-פג-ביוטין. תאים זרימה נבנות על ידי sandwiching של סרט דביק עם ערוצי חתוכות מראש בין coverslip functionalized של לוח PDMS המכיל חורים כניסת ו עודפים. ערוצים מרובים משולבים לתוך תא אחד זרימה, הזרימה של ריאגנטים לתוך כל ערוץ יכול להיות מלא אוטומטי, אשר באופן משמעותי מגדילה את התפוקה assay ומפחית הפעם תרגולים לכל וזמינותו. בתוך כל ערוץ, ביוטין-λ-DNAs הם ותשמרו על פני השטח, זרימה שכבתית מוחל על זרימה-מתיחה DNAs. מולקולות DNA נמתחים עד &#62; 80% שלהם אורך מתאר ומגישים גם במרחב מורחב תבניות לימוד הפעילות מחייב ותעבורה של מולקולות fluorescently עם תוויות. מסלולים של מולקולות יחיד מתבצע על ידי הדמיה הכולל פנימי השתקפות קרינה פלואורסצנטית (TIRF) זמן לשגות. בתמונות raw ניתוח שימוש יעיל חלקיק יחיד מותאמות אישית תוכנת מעקב אוטומטית לזהות מסלולים של מולקולות יחיד לשדר לאורך הדנ א של אומדן קבועי דיפוזיה שלהם 1 י.

איור 2a מציגה את מסלולי שזוהו של pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B היא מצומדת את השאריות ציסטאין) מולקולות לשדר על ה-DNA ב- 2 מ מ NaCl מאגר ב- pH 6.5. פעפוע של pVIc הוא דו כיווני, מונעים ע י הסביבה אנרגיה תרמית. מכל אלה מסלולים, מוערך הקבועים דיפוזיה 1 י (D1 ערכים) עבור כל מסלול (ראה ההיסטוגרמה באיור 2b). הממוצע D1 הערך של המספר הזה pVIc המשלים מחושבת להיות 22.2 ± 0.9 (תקן שגיאה) M (bp2/s) לפי ממוצע של כל ערך D1 לאורך מסלולים משוקלל על ידי מספר הקריאות עמדה רצופים שלישיה הכלול בכל מסלול.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55923/55923fig1.jpg"> 
איור 1 : מכשירי מעקב תנועה של מולקולות יחיד לאורך הדנ א. a) PDMS שמונה ערוצים microfluidic שבב דבקה coverslip functionalized אשר דנ א יכולה להיות קשורה (עם מטבע רבע בארה על סולם); b) זורמים תא זום מפרטים טכניים מראה מתוח-זרימה λ-DNA מולקולות; ג) תיאור סכמטי של מיקרוסקופ TIRF ומערכת זרימת למתיחת DNA; ד) TIRF דימוי זרימה-נמתח λ-DNA; ה) TIRF תמונה של pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B היא מצומדת את השאריות ציסטאין) מולקולות מאוגדים נמתח-זרימה λ-DNA. איור זה השתנה עם הרשאה2,12. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55923/55923fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55923/55923fig2.jpg"> 
איור 2 : דיפוזיה חד-ממדי של pVIc (GVQSLKRRRCF) לאורך הדנ א. a). דיפוזיה של pVIc לאורך הזרימה נמתח λ-DNAs (137 מסלולים) במאגר NaCl 2 מ מ ב- pH 6.5. x(t) ו- y(t) הן displacements לאורך, רוחבי כדי λ-DNA, בהתאמה. קווים אופקיים מנוקד מצביעים על נקודות חסר הנובע לצבוע מהבהב. b). היסטוגרמה של קבוע דיפוזיה, D1 עבור pVIc לשדר לאורך λ-DNAs. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55923/55923fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA at JoVE.com

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

מולקולה בודדת פשוטה, חסון וגבוה התפוקה זרימה מתיחה Assay יישום לימוד התחבורה של מולקולות לאורך הדנ א

פרוטוקול זה מדגים תפוקה גבוהה, עמיד ופשוט מולקולה בודדת מתיחה-זרימה assay עבור לומדת מימדי דיפוזיה (1 ד) של מולקולות לאורך הדנ א.

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

a-simple-robust-high-throughput-single-molecule-flow-stretching-assay

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.0K Views.  Massachusetts Institute of Technology and Harvard Medical School. פרוטוקול זה מדגים תפוקה גבוהה, עמיד ופשוט מולקולה בודדת מתיחה-זרימה assay עבור לומדת מימדי דיפוזיה (1 ד) של מולקולות לאורך הדנ א.

Video: A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, consequently, cardiovascular disease. Although PCSK9 proteolysis is required for its full hypercholesterolemic effect, the evaluation of its proteolytic function is challenging: PCSK9 is only known to cleave itself, undergoes only a single turnover, and after proteolysis, retains its substrate in its active site as an auto-inhibitor. The methods presented here describe an assay which overcomes these challenges. The assay focuses on intermolecular proteolysis in a cell-based context and links successful cleavage to the secreted luciferase activity, which can be easily read out in the conditioned medium. Via sequential steps of mutagenesis, transient transfection, and a luciferase readout, the assay can probe PCSK9 proteolysis under conditions of either genetic or molecular perturbation in a high-throughput manner. This system is well suited for both the biochemical evaluation of clinically discovered missense single-nucleotide polymorphisms (SNPs), as well as for the screening of small-molecule inhibitors of PCSK9 proteolysis.

This protocol presents a method to evaluate the proteolytic activity of an intrinsically low-activity, single turnover protease in a cellular context. Specifically, this method is applied to evaluate the proteolytic activity of PCSK9, a key driver of lipid metabolism whose proteolytic activity is required for its ultimate hypercholesterolemic function.

Assay לוציפראז תפוקה גבוהה כדי להעריך את Proteolysis של PCSK9 יחיד-מחזור פרוטאז

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and millisecond temporal resolution. These capabilities make single-molecule localization microscopy ideally suited to study molecular level biological functions in physiologically relevant environments. Here, we demonstrate an integrated protocol for both acquisition and processing/analysis of single-molecule tracking data to extract the different diffusive states a protein of interest may exhibit. This information can be used to quantify molecular complex formation in living cells. We provide a detailed description of a camera-based 3D single-molecule localization experiment, as well as the subsequent data processing steps that yield the trajectories of individual molecules. These trajectories are then analyzed using a numerical analysis framework to extract the prevalent diffusive states of the fluorescently labeled molecules and the relative abundance of these states. The analysis framework is based on stochastic simulations of intracellular Brownian diffusion trajectories that are spatially confined by an arbitrary cell geometry. Based on the simulated trajectories, raw single-molecule images are generated and analyzed in the same way as experimental images. In this way, experimental precision and accuracy limitations, which are difficult to calibrate experimentally, are explicitly incorporated into the analysis workflow. The diffusion coefficient and relative population fractions of the prevalent diffusive states are determined by fitting the distributions of experimental values using linear combinations of simulated distributions. We demonstrate the utility of our protocol by resolving the diffusive states of a protein that exhibits different diffusive states upon forming homo- and hetero-oligomeric complexes in the cytosol of a bacterial pathogen.

3D single-molecule localization microscopy is utilized to probe the spatial positions and motion trajectories of fluorescently labeled proteins in living bacterial cells. The experimental and data analysis protocol described herein determines the prevalent diffusive behaviors of cytosolic proteins based on pooled single-molecule trajectories.

מיקרוסקופ מעקב חד-מולקולה-כלי לקביעת המדינות התפוצבניות של מולקולות ציטוסולג

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. The binding of prokaryotic DnaG-like primases to DNA occurs at a specific trinucleotide recognition sequence. It is a pivotal step in the formation of Okazaki fragments. Conventional biochemical tools that are used to determine the DNA recognition sequence of DNA primase provide only limited information. Using a high-throughput microarray-based binding assay and consecutive biochemical analyses, it has been shown that 1) the specific binding context (flanking sequences of the recognition site) influences the binding strength of the DNA primase to its template DNA, and 2) stronger binding of primase to the DNA yields longer RNA primers, indicating higher processivity of the enzyme. This method combines PBM and primase activity assay and is designated as high-throughput primase profiling (HTPP), and it allows characterization of specific sequence recognition by DNA primase in unprecedented time and scalability.&#160;

Protein binding microarray (PBM) experiments combined with biochemical assays link the binding and catalytic properties of DNA primase, an enzyme that synthesizes RNA primers on template DNA. This method, designated as high-throughput primase profiling (HTPP), can be used to reveal DNA-binding patterns of a variety of enzymes.

זיהוי רצף דנ א על ידי Primase DNA שימוש בתפוקה גבוהה Primase פרופיל

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and others. Many of these functions require motors to operate in ensembles. Despite a wealth of knowledge about the mechanisms of individual cytoskeletal motors, comparatively less is known about the mechanisms and emergent behaviors of motor ensembles, examples of which include changes to ensemble processivity and velocity with changing motor number, location, and configuration. Structural DNA nanotechnology, and the specific technique of DNA origami, enables the molecular construction of well-defined architectures of motor ensembles. The shape of cargo structures as well as the type, number and placement of motors on the structure can all be controlled. Here, we provide detailed protocols for producing these ensembles and observing them using total internal reflection fluorescence microscopy. Although these techniques have been specifically applied for cytoskeletal motors, the methods are generalizable to other proteins that assemble in complexes to accomplish their tasks. Overall, the DNA origami method for creating well-defined ensembles of motor proteins provides a powerful tool for dissecting the mechanisms that lead to emergent motile behavior.

The goal of this protocol is to form ensembles of molecular motors on DNA origami nanostructures and observe the ensemble motility using total internal reflection fluorescence microscopy.

ייצור Dynein וקינסין הרכבים מוטוריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים עבור תצפית מולקולה אחת

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this enzyme can hydrolyze dNTPs into their corresponding nucleosides and inorganic triphosphates. Due to its critical role in nucleotide metabolism, its association to several pathologies, and its role in therapy resistance, intense research is currently being carried out for a better understanding of both the regulation and cellular function of this enzyme. For this reason, development of simple and inexpensive high-throughput amenable methods to probe small molecule interaction with SAMHD1, such as allosteric regulators, substrates, or inhibitors, is vital. To this purpose, the enzyme-coupled malachite green assay is a simple and robust colorimetric assay that can be deployed in a 384-microwell plate format allowing the indirect measurement of SAMHD1 activity. As SAMHD1 releases the triphosphate group from nucleotide substrates, we can couple a pyrophosphatase activity to this reaction, thereby producing inorganic phosphate, which can be quantified by the malachite green reagent through the formation of a phosphomolybdate malachite green complex. Here, we show the application of this methodology to characterize known inhibitors of SAMHD1 and to decipher the mechanisms involved in SAMHD1 catalysis of non-canonical substrates and regulation by allosteric activators, exemplified by nucleoside-based anticancer drugs. Thus, the enzyme-coupled malachite green assay is a powerful tool to study SAMHD1, and furthermore, could also be utilized in the study of several enzymes which release phosphate species.

SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase with critical roles in human health and disease. Here we present a versatile enzyme-coupled SAMHD1 activity assay, deployed in a 384-well microplate format, that allows for the evaluation of small molecules and nucleotide analogues as SAMHD1 substrates, activators, and inhibitors.

בדיקת פעילות מצומדת אנזימים בתפוקה גבוהה לבדיקת אינטראקציה של מולקולות קטנות עם dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...