We thank David A. Ferrick and David G. Nicholls for contributing to project conception and presentation, Renata L.S. Goncalves and Akos A. Gerencser for data not shown here and for helpful discussions, Barbara Liepe for XF24 consumables, and Andy Neilson for input in developing Eq. (5).

1. מדידת חציצת כוח בתאי שטף מכשיר: שתי וריאציות הערה: החישובים ושיטות שתוארו כאן פותחו באמצעות תאי שטף Analyzer. למכשירים אחרים, מדידת הנפח חייב להיות מדורגים כראוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.1 M HCl הסטנדרטי במים באמצעות להתרכז HCl (ראה חומרים וציוד) לפי הוראות יצרן. הערה: חישוב דוגמא להכנת זריקות HCl לשימוש בכל ארבע יציאות ההזרקה מוצג בטבלה 1: </li></ol><img alt="שולחן 1" src="/files/ftp_upload/53464/53464table1.jpg" /> טבלת 1. זריקות HCl ברציפות לassay שטף תאי גם. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילולים של תקן HCl במדיום להיות assayed כמו בטבלה 1 למספר חזרות הטכניות להיות קארמטען בצלחת אחת, ועוד אחד כדי לאפשר לשגיאת pipetting; למשל, לארבע חזרות טכניות של נמל הזרקה, להכין מלאי של (1.1 x μl 5) 0.1 M HCl ב( 48.9 μl x 5) בינוני assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ 50 μl לכל יציאה של מחסנית הבדיקה מדידה. חזור על תהליך זה עבור יציאות שנותרו B, C, ו- D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל assay תאי שטף 10 עם מחזור כיול סטנדרטי, ואחריו שני מחזורים של [תערובת 2 דקות, לחכות 1 דקות, ו -5 דקות מדידה] לכל אחד מארבע תוספות הנמל (ראה איור 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתכנת את הניסוי מעל בתוכנת המכשיר בהתאם להוראות תוכנה. טען את המחסנית מוכנה למכונה ולבצע כיול על פי הוראות תוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תתבקש על ידי התכנית, להסיר את הצלחת המכילה calibrant והכנס את הצלחת המכילה מדיום assay בכל טוב למכשיר; להמשיך בתכנית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> U<html> לשיר הממוצע של 8-10 נקודות נתונים המתקבלות במצב יציב (בדרך כלל 8-10 הנקודות האחרונות) מלפני ואחרי כל יציאה בנוסף, לחשב את ההבדל (במצטבר) בpH (ΔpH) הנגרם על ידי כל הזרקה של חומצה סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העלילה ΔpH נגד H nmol + כלול ב7 μl לכוד על ידי הבדיקה מדידת הנפח. המדרון ליניארי הוא הכח באגירה (BP) ב+ H קמ&quot;ש / pmol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין לצעדים 1.2-1.3, לבצע מדידות ΔpH הבאות assay שבנמלים, B, ו- C משמשים לביצוע ניסוי, ואחרי הזרקת HCl בנמל ד כמו בטבלה 2, ארבע חזרות הטכניים המשמש לייצור כל נקודה של עקומה סטנדרטית של 5 נקודות ב -20 הבארות הניסיוניות (לא כולל בארות תיקון טמפרטורת ארבעה רקע) של צלחת assay שטף תאית. </li></ol>53464table2.jpg &quot;/&gt; טבלת 2. זריקה אחת HCl לassay שטף תאי גם. 2. מדידת חציצת כוח שימוש חיצוני pH מטר הערה: כדי למדוד את הכח באגירה של מדיום באמצעות בדיקה pH חיצונית, לכייל את הבדיקה על 37 מעלות צלזיוס ולשמור על טמפרטורה זו לכל המגיבים במהלך הניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.1 M HCl הסטנדרטי במים באמצעות להתרכז HCl על פי הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקה חמה pH, תקני ה- pH, בינוני assay החציצה שהכח יימדד, ו0.1 M HCl עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל בדיקה pH על 37 מעלות צלזיוס בהתאם להוראות יצרן. לשמור את כל חומרים כימיים על 37 מעלות צלזיוס לאורך כל assay באמצעות צלחת חום או אמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 10 מיליליטר של מדיום assay לתוך כוס קטנה או צינור חרוטי. צג ה- pH ברציפות באמצעות בדיקה pH שקועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.1 M HCl כל<html> אומר בינוני ב10-20 aliquots μl. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבטיח ערבוב באמצעות סרגל מערבבים או על ידי מתערבל את המכל באופן ידני לאחר כל הוספת חומצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר כמה שניות למדידת pH לייצוב, אז להקליט את ה- pH לאחר כל ההוספה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שמודגם בטבלה 3, לעשות מספר מספיק של תוספות כדי להבטיח חישוב שיפוע מדויק וכדי לכסות את טווח pH הצפוי במהלך הניסוי. </li></ol></li></ol><img alt="טבלה 3" src="/files/ftp_upload/53464/53464table3highres.jpg" width="650" /> טבלה 3. מדידת כוח החציצה באמצעות מד pH. הנתונים מייצגים ניסוי טיפוסי עם שש 20 תוספות μl של 0.1 M HCl. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העלילה ΔpH נגד + H nmol הוסיפה ל7 μl, נותנת מדרון ליניארי שמייצג את הכח באגירה (איור 1). </li></ol>.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53464/53464fig1.jpg" /> איור 1. קביעת כוח החציצה. עקומה סטנדרטית HCl נמדדת כבטבלת 1, טבלה 2 או (כאן) כמו בטבלה 3. השיפוע של העקומה ליניארית בכושר נותן כוח באגירה (pH / H nmol + 7 μl). כל נקודה מייצגת ממוצע ± SEM של n = 9 משכפל טכני. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהכח באגירה ידוע באמצעות שיטת 1 או 2 לעיל, להמיר את אות ECAR (MPH / min) למקום מגורי הקבע (H + / דקות / חלבון מיקרוגרם pmol) על ידי חלוקת ECAR ידי חציצת כוח (BP) (MPH / + H pmol) ומדרוג לתכולת החלבון של כל טוב: טוט (H pmol + / דקות / חלבון מיקרוגרם) PPR = ECAR / BP (MPH / H pmol + 7 μl) / חלבון בכל טוב (מיקרוגרם) משוואת 6 (MPH / min) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להשתמש באותה שיטה בניסוייםשל 1 או 2 כדי לחשב את ערך קיבולת חציצה (BC) המשמש את תוכנת המכשיר כדי לחשב באופן אוטומטי PPR במהלך איסוף הנתונים. הערה: המדריך למשתמש מכשיר 12 (עמוד 107) מספקת מידע מפורט על חישוב ושימוש בקיבולת חציצה, שבו לפני הספירה מתוארת כ לפנה&quot;ס (mol / L) = H שומות + / (ΔpH חיץ x נפח (L)) משוואת 7 הערה: קיבולת החציצה כהגדרתו במשוואה 7 ניתן לחשב במבחני המכשיר או בדיקה חומציות חיצונית שתוארו לעיל. המרה בין כוח באגירה וקיבולת חציצה נעשה בקלות (ראה גיליון מצורף): BC = 1 x 10 -9 / BP ((MPH / H pmol + 7 μl) / 7 μl) משוואה 8 הערה: אם ידוע לפני ביצוע assay, קיבולת החציצה ניתן להזין ישירות לתוך תוכנת המכשיר במהלך התקנה ניסיונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">החל הליך זה והחישובים בשימוש מעל למרבית מערכות חיץ קונבנציונליות, כפי שתואר בפרסום קודם 6. הערה: טבלה 4 רשימות הכח באגירה וקיבולת חציצה של כמה כלי תקשורת קונבנציונליות. </li></ol><img alt="לוח 4" src="/files/ftp_upload/53464/53464table4.jpg" /> לוח 4. כוח החציצה וקיבולת חציצה של המדיה שנבחרה. 3. ביצוע תאי שטף Assay באמצעות תאי C2C12 Myoblast הערה: בשלב 3.4.3, לא היו הבדלים שנצפו בCO 2 -derived ייצור חומצה תלוי בנוכחות של קרבוניק אנהידראז בתרבות C2C12, המצביע על כך את נוכחותה אינה נדרשת להמרה מלאה של CO 2 לHCO 3 - + H +. עם זאת, באופן אמפירי בדיקה זו במערכות ניסיוניות שונות מומלצת לפני אוםקרבוניק אנהידראז התלוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות העכבר C2C12 myoblasts 13 על 37 מעלות צלזיוס מתחת 95% אוויר / 5% CO 2 במדיום השתנה Dulbecco הנשר (DMEM) עם 11.1 גלוקוז מ&quot;מ, 2 גלוטמין מ&quot;מ, 10 V% / V בסרום שור עוברי (FBS), 100 U / פניצילין מיליליטר ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לפני assay, תאי צלחת / זרע מאותו מדיום התרבות 100 μl ב20,000 תאים / גם בצלחת 24 גם קלקר תאי שטף assay (ראה חומרים ושיטות) ללא ציפוי נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל oligomycin, FCCP, וrotenone תוספת myxothiazol, וHCl (אופציונאלי) ל10x ריכוז סופי בקרבס רינגר פוספט HEPES (KRPH) בינוני assay (2 מ&quot;מ HEPES, 136 מ&quot;מ NaCl, 2 מ&quot;מ לאא 2 PO 4, 3.7 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 1.5 מ&quot;מ CaCl 2, 0.1% w / v אלבומין חומצות שומן חופשי שור בסרום, pH 7.4 על 37 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30 דקות לפני assay, לשטוף תאים חסיד שלוש פעמים על ידי aspirating לGEntly להסיר את המדיום מן הבאר ולאחר מכן הוספת 500 KRPH μl לאט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים לאחר השלב השלישי לשטוף על 37 מעלות צלזיוס באוויר (לא מתחת לגיל 5% CO 2, שישנה את ה- pH של מדיום ללא יקרבונט זה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתחילת assay, להחליף KRPH בבארות עם KRPH הטרי 500 μl מכיל קרבוניק אנהידראז 500 U / ml וגם גלוקוז (10 מ&quot;מ) או בינוני בלבד, ללא מצע נוסף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טעינת מחסנית החיישן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 50 aliquots μl של כל מתחם 10x מוכן בשלב 3.3 ליציאות מחסנית של מחסנית תאית שטף חיישן כדלקמן (ריכוזים סופיים בassay ניתנו גם): נמל: 2 מיקרוגרם / מיליליטר oligomycin, נמל B: 0.5 מיקרומטר FCCP, נמל C : Rotenone 1 מיקרומטר, myxothiazol 1 מיקרומטר, הנמל D: HCl (אם ביצוע כיול חומצה ב- assay כפי שתואר לעיל ובטבלה 2). הערה: לצורך עיכוב שרשרת נשימה מלא מתואר כאן, 1 מיקרומטרxothiazol ניתן להשתמש לסירוגין עם א antimycin 1 מיקרומטר </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> assay שטף תאי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע assay שטף תאי סטנדרטי לקביעת שליטה בדרכי הנשימה כפי שתואר ב 10. </li></ol></li></ol> הערה: לכל קטע של הניסוי, לקבוע את התמהיל, לחכות, ופעמים מדידה רצויה, כמו גם את מספר המחזורים במגזר. הערה: הנתונים בלוח 5 נאספו על שני מחזורי assay של 2 דקות לערבב, לחכות 1 דקות, ו -5 דקות מדד לכל מגזר, עם שלושה מחזורי assay מתרחשים לאחר תוספת הנמל D של כמויות שונות של HCl (לכיול של חציצה כוח כמו בטבלה 2). <img alt="לוח 5" src="/files/ftp_upload/53464/53464table5.jpg" /> לוח 5. תצורת assay שטף תאית. 4. Measuring נקודת סיום ריכוז חומצת חלב הערה: כדי לאמת את assay העקיף שתואר כאן בכמה מערכת שונה, ריכוז חומצת החלב נקודת סיום בסוף ניסוי שטף תאי ניתן לקבוע ישירות בצלחת 96-היטב קונבנציונלית על ידי מדידת המהירות ההתחלתית (מעל 2 דקות) של הפחתה NAD + → NADH מזורז על ידי דהידרוגנז חומצת החלב, שתואר בפירוט בפרסום הקודם שלנו 6. לנתונים שהוצגו בנציגי תוצאות, ריכוז חומצת החלב נקודת סיום בבארות assay המכיל גלוקוז היה ~ 40 מיקרומטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני הידרזין 2x: 1 M טריס, 20 מ&quot;מ EDTA, 400 מ&quot;מ הידרזין, pH 9.8 על 22 מעלות צלזיוס). מייד לפני תחילת assay, להוסיף NAD + עד 4 מ&quot;מ ודהידרוגנז חומצת החלב (LDH) 40 U / ml. הרכב בינוני assay סופי (1x): 500 מ&quot;מ טריס, 10 mM EDTA, 200 מ&quot;מ הידרזין, 2 מ&quot;מ NAD +, 20 LDH / מיליליטר U. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר assay השטף תאי, להסיר 100μl של מדיום assay מכל טוב של הצלחת תאי שטף assay והעברה לבאר אטום (שחור) צלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל דגימה היטב, להוסיף 100 μl 2x בינוני הידרזין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לטעון את הצלחת לקורא microplate ולהתחיל ניטור הקרינה NADH בעירור 340 ננומטר / 460 פליטת ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את המהירות הראשונית לכ -2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל ניסוי דומה לבניית עקומת סטנדרט ידי התוויית מהירות ראשונית נגד ריכוז חומצת החלב לריכוזי חומצת החלב הוסיפו 0-50 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב ריכוז חומצת החלב בכל ניסוי גם באמצעות העקומה סטנדרטית. </li></ol> 5. מדידת תכולת חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני assay שנותר מכל טוב של צלחת assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בארות שלוש פעמים עם 250 μl KRPH ללא BSA, להיות זהיר, כדי למזער את דחיקת רגליהם של תאים מפני השטח והתחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תמוגה Ripa 25 μlהבינוני (150 מ&quot;מ NaCl, 50 מ&quot;מ טריס, 1 מ&quot;מ EGTA, 1 mM EDTA, 1% V / V Triton X-100, 0.5% w / v deoxycholate נתרן, 0.1% נ / SDS נ &#39;, pH 7.4 על 22 מעלות צלזיוס) היטב בכל צלחת assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת על קרח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתסיס את צלחת על שייקר צלחת ב1,200 סל&quot;ד במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד ריכוז חלבון על ידי שיטות סטנדרטיים, למשל, על ידי assay BCA, להבטיח כי הרכב מאגר תמוגה תואם את שיטת המדידה. תכולת החלבון בניסוי באיור 2 ~ 4 מיקרוגרם / טובה הייתה. </li></ol>

<ol>
	<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Anal. Chem. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Meth. Enzymol. 547, 309-354 (2014).</li><li>Renner, K., Jansen-D&#252;rr, P., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+oxygen+kinetics+of+cellular+respiration+and+linear+oxygen+dependence+of+antimycin+A+inhibited+oxygen+consumption.">Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption.</a> Mol. Biol. Rep. 29 (1-2), 83-87 (2002).</li><li>Helmlinger, G., Sckell, A., Dellian, M., Forbes, N. S., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+production+in+glycolysis-impaired+tumors+provides+new+insights+into+tumor+metabolism.">Acid production in glycolysis-impaired tumors provides new insights into tumor metabolism.</a> Clin. Cancer Res. 8 (4), 1284-1291 (2002).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. G., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1847, 171-181 (2015).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> Am. J. Physiol. 292 (1), C125-C136 (2006).</li><li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform.">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> J. Bioenerg. Biomembr. 44 (4), 421-437 (2012).</li><li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption.">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Meth. Enzymol. 542, 125-149 (2014).</li><li>Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J. Vis. Exp. (46), 2511 (2010).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21746 (2011).</li><li>Seahorse Biosciences. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> F24 Extracellular Flux Analyzer and Prep Station Installation and Operation Manual. 1.7, (2010).</li><li>Blau, H., Chiu, C., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+activation+of+human+nuclear+genes+in+human+heterocaryons.">Cytoplasmic activation of human nuclear genes in human heterocaryons.</a> Cell. 32, 1171-1180 (1983).</li></ol>

ד&quot;ר השונה Mookerjee מצהיר כי אין לה אינטרסים כלכליים מתחרים. ד&quot;ר מרטין המותג התייעץ לסוסון הים Biosciences, אשר מייצר מכשירים וחומרים כימיים המשמשים בסעיף זה. דמי גישה פתוחים לכתבה זו מומנו על ידי Biosciences סוסון הים.

החמצה תאית היא אינדיקציה נמדדת בקלות של קצב חילוף חומרים תאי. כדי לקבוע כראוי השיעור של גליקוליזה הסלולרית (כהגדרתו על ידי ייצור חומצת החלב) זה קריטי לדעת את הכח באגירה של מדיום assay, ולהמיר את מדידות שטף תאית של צריכת חמצן והחמצה לפרוטון שיעורי ייצור. על ידי ביצוע חישוב זה, יכול להיות מופחת החמצה נובעת מCO 2 שוחרר במעגל החומצה הציטרית, עוזבת את החמצה שנובעת מייצור חומצת החלב. הדרכים שונות מרובות הניתנות כאן כדי למדוד כוח באגירה לתיקון זה לשאת יתרונות וחסרונות שונים. מדידה חיצונית באמצעות בדיקה pH היא מדויקת מאוד לשחזור, אבל עלול שלא לשקף הבדלים קטנים בזיהוי pH הוצג על ידי fluorophores בתוך צלחת assay, התוספת של תרכובות בassay, או הנוכחות של tהוא התאים עצמם. מדידות pH לטפל בצלחת נושאים אלה, אלא גם להציג את הדרגות שונות של רעש ניסיוני. CO 2 התיקון לECAR מאפשר בפעם הראשונה החישוב חד-משמעי וכמותי של שיעור glycolytic, ומגלה וריאציה בתרומת נשימה וglycolytic לECAR הכולל במהלך ניסוי. שימוש במשוואה 5 והמדידות של OCR, ECAR, וחציצת כוח, שיעור glycolytic יכול להיות מחושב באמצעות הגיליון האלקטרוני פשוט סיפק (לוח 6). שיעור זה יכול להיות מאומת על ידי מדידת חומצת החלב פוסט הוק-אם תרצה 6. בתאים שבו מסלול פנטוז פוספט הוא פעיל מאוד, השימוש במעכבי מסלול כגון 6-aminonicotinamide עשויים להיות שימושיים לבודד את שיעור glycolytic. חישוב התרומות של שני CO 2 - ו+ H-נגזר חומצת החלב מהסך נמדדו סלולרי במיוחד החמצת דרג וחמצן Consumptיון דרג הוא כלי רב ערך עבור שימוש בנתוני שטף תאיים להצהיר הצהרות חזקות וכמותי על פעילות המטבולית. שימוש בהליכים שתוארו כאן, כולל שינויים שונים למדידת כוח באגירה, ואופטימיזציה של ניסוי השטף תאי לתאים תחת חקירה והנתונים הרצויים, השיעור של גליקוליזה בתאים שלמים ניתן לכמת במגוון רחב של תנאי ניסוי. שיטה זו מוגבלת לתאים שיכולים לגדול בתרבות חסיד ב( או תאים או אברונים שניתן דבקו) משטח קלקר. זה אמין ביותר כאשר תאים בתרבית הם הומוגנית ומחוברות, אם כי ייתכן שעדיין ניתן לקבל מידע שימושי על פני טווח של תנאים אלה. החישובים דורשים ידע מסוים בחילוף החומרים של התאים, כמו מקס H + / O 2 טווחים 0.65-1.0 לחמצון מלא של מצעים שונים ויותר לחמצון חלקי 6, לעומת זאת, אם התאים הם known לחמצן גלוקוז, ערך של 1.0 ניתן להניח. למרות שרלוונטי לכל האפיון מטבולים, שיטה זו עשויה להיות מועילה במיוחד בעת שימוש במערכות שבמשמרת בין חילוף חומרים בדרכי הנשימה וglycolytic כדי לשמור על אספקת ATP הסלולרית היא פנוטיפ קריטי, כולל האפיון של תאי גזע ותאים סרטניים שמקורם בגידול. הבנת שינויי שליטת חילוף חומרים בהקשרים אלה ואחרים תאפשר מידה רבה יותר של תחכום ודיוק בעיצוב והניתוח הניסיוני של סוגי התאים.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא למדוד את קצב glycolytic של תאים באמצעות ניתוח שטף תאי מדויק. מדידת כמותית של שיעור glycolytic באמצעות החמצה תאית היא נקודת הסיום הרצויה של ניסויים רבים. עם זאת, השיעור הכולל של החמצה תאית הוא הסכום של שני מרכיבים: החמצת נשימה, בצורה של CO 2 (שמוסיף נוזלים לH 2 CO 3 אז dissociates לHCO 3 - + H +), והחמצת glycolytic, בצורה של חומצת חלב - + + H. התרומות של CO 2 להחמצה תאית כוללת שעד לאחרונה נחשבו זניחות בפלטפורמת המדידה המשמשת כאן, מנתח XF24 7. עם זאת, ברור במספר רב של מערכות אחרות שCO 2 יכולים להיות תורם עיקרי להחמצת 4-5 תאיים. ניירות מרובים להכיר קון זהtribution, אבל אל תנסה לכמת ישיר של CO 2 -derived 3,8,9 חומצה. לאחרונה הפגינו כמותית שCO 2 ייצור הוא מקור משמעותי של החמצה תאית במערכת זו 6. יתר על כן, למרות שיש מספר רב של מסלולי מטבוליים שיוצרים CO 2 מפירוק גלוקוז, המתבצע על ידי dehydrogenases מטריצה ​​במעגל החומצה הציטרית הם התורמים המכריע וכל המקורות האחרים לייצר כמויות של CO 2 הנמצאות בניסוי השגיאה 6. ללא תיקון לCO 2 ייצור, החמצה תאית לכן מחוון משמעי של שיעור glycolytic ולא ניתן להשתמש בו כמותית. הפרסום הקודם שלנו מדגיש כמה מקרים שבם הנשימה CO 2 כוללים את חלק הארי של כוללת אות החמצה, גם בתאים האמינו בדרך כלל להשתמש גליקוליזה 6 בעיקר. בנוסף,CO 2 תרומת נשימה להחמצה כוללת משתנית מאוד במהלך ניסויי פרופיל מטבולים משותפים, הוכחה כי השוואה נכונה של שיעור glycolytic במהלך חלקים שונים של ניסוי דורשת תיקון לCO 2. כדי למדוד את קצב glycolytic של תאים תוך שימוש בשיעור של החמצה תאית, יש צורך להמיר שינויי pH לשינויים בסך הכל + H שנוצרו, וכדי להפחית את החמצה תאית הנגרמת על ידי CO 2 שפורסמה במהלך פעולה של מעגל החומצה הציטרית. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה למדידת קצב ייצור פרוטון תאי (משינויים תאיים בpH והכוח המכויל החציצה של מדיום assay) ו- CO 2 ייצור (משינויים תאיים בO 2 ריכוז), ולהדגים כיצד לחשב את שיעור glycolytic באמצעות מדידות אלה. כוח בשיטה זו<html> ens השירות של מדידת החמצה תאית על ידי השימוש בו כדי לחשב כראוי שיעור glycolytic כפי שהוגדר בייצור חומצת החלב. ללא תיקון לCO 2 הנשימה (או מדידה ישירה של חומצת החלב), שאי אפשר לקבוע אם ובאיזו מידה הכוללת שיעור החמצה משקף שיעור glycolytic, בלבול הפרשנות של ניסויים המשתמשים בהחמצה תאית כוללת, כפי שמדידה ישירה של ייצור חומצת החלב. חישובים CO 2 וחומצת חלב הם, בתוך שגיאה ניסיונית, שני התורמים רק לייצור חומצה תאי, המבוססים על ניסויים עם תאים והיצמדות למנגנון 6. לכן, שיעור החמצה מוחלטת תאית (PPR, קצב ייצור פרוטון) יכול להיות מוגדר כ: טוט PPR משוואת glyc = PPR שו&quot;ת + PPR 1 . _content &quot;&gt; בי טוט = כולל; שו&quot;ת = נשימה; = PPR glycolytic glyc glycolytic היא כך: glyc PPR = PPR טוט - PPR שו&quot;ת משוואה 2 כאן, טוט טוט = ECAR PPR / BP משוואה 3 שם ECAR = שיעור תאי החמצה (MPH / min), וBP = כוח באגירה (MPH / H pmol + 7 μl), ואילו PPR שו&quot;ת = (10 1 / (1 ​​+ 10 pH-PK 1) pH-PK) (H מקסימום + / O 2) (OCR טוט - OCR ריקבון / MYX) משוואה 4 כאשר K 1 = קבוע שיווי משקל משולב של CO 2 לחות וניתוק לHCO 3 - + H +; המקסימום H + / O 2 = ההדואר CO 2 החמצת -derived לשינוי מטבולים מסוים כגון חמצון של גלוקוז 6 מלא; = שיעור OCR חמצן הצריכה (O pmol 2 / min), וריקבון OCR / MYX = OCR לא המיטוכונדריה. משוואה 4 מבודדת OCR המיטוכונדריה על ידי הפחתת כל OCR לא המיטוכונדריה (מוגדר כOCR כי הוא עמיד לrotenone המיטוכונדריה הנשימה הרעלים וmyxothiazol) ומהווה H המרבי + שנוצר לO 2 נצרך לכל מצע (H מקסימום + / O 2 ) (ראה 6), כמו גם את חלקם של CO 2 והוליד + H בטמפרטורה הניסיונית וpH (1 / (1 ​​+ 10-PK pH pH 10-PK 1). לחמצון מלא של גלוקוז, חמצן המיטוכונדריה שיעור הצריכה (OCR) הוא בדיוק שווה לשיעור של CO 2 ייצור. במרותק נפח assay של מדידת שטף תאית, CO 2 תוצרתד על ידי נשימה נשאר לכודים במדיום assay. רוב CO 2 לכודים הוא התייבשות לH 2 CO 3, אשר לאחר מכן dissociates לHCO 3 - + H +. חלק קטן נשאר מומס אבל לא התייבשות, ועוד חלק קטן הוא התייבשות אבל לא ניתק, כפי שהוכתב על ידי thermodynamically קבוע שיווי משקל בשילוב של CO 2 לחות וניתוק לHCO 3 - + H + בטמפרטורת ניסוי (37 ° C) ו- pH (~ 7.4). לפיכך, המשוואה המלאה לחישוב g PPR על ידי הפחתת שו&quot;ת PPR מטוט PPR הוא: טוט PPR glyc = ECAR / BP - (PK-pH 1 / (1 ​​+ 10 pH-PK 1) 10) (H מקסימום + / O 2) (OCR טוט - OCR ריקבון / MYX) משוואה 5 אניn בדרך זו, שיעורי נשימה וגליקוליזה, כמו גם שיעורי ייצור ATP הקשורים, ניתן לקבוע כמותית ממדידות פשוטות (צריכת חמצן, החמצה תאית, קיבולת חציצה) ויבוא או חישוב ערכים הנדרשים אחרים (H + / O 2 , P / O, ושיווי המשקל K הקבוע 1) 6. הניסוי המתואר כאן מרחיב על טכניקות סטנדרטי לשימוש תאי שטף Analyzer כגון סוסון הים XF24 10,11; לפורמטים אחרים מדידת שטף תאית (למשל, דואר XF 96, או XFP), כל הכרכים שלהלן יש לשנותם כראוי. הכח באגירה של מדיום assay ניתן למדוד על ידי הבנייה של עקומה סטנדרטית במישרין בפלטפורמת השטף תאית או בנפרד באמצעות בדיקה pH מכוילת. הנה, שלוש אפשרויות למדידת חציצה על ידי מדיום assay שטף תאי מקבלות, כולל שימוש בכל להזריקביציאות של מנתח השטף תאי עם בארות תא ללא מדגם, או באמצעות יציאת הזריקה האחרונה רק בבארות המכילות תא (סעיף 1) או באמצעות מדידה חיצונית pH (סעיף 2). ראה הגיליון האלקטרוני המצורף לחישובי הנתונים מלאים של דוגמא. כדי למדוד את כוח החציצה באמצעות יכולת זיהוי-pH של מכשיר השטף תאי, זה בטוח להשתמש בארות תא ללא למזער וריאציה אות. עם זאת, בתוך השגיאה, אין הבדל סטטיסטי קיים בין ובארות בעת ביצוע מדידה זו המכילה תא-תא ללא (מידע לא מוצג). הערה: הווריאציה המתוארת בשלב 1.7 נושאת את היתרון של טיפול חשבונאי בשינויי פוטנציאל אגירה שמעניק תרכובות נוספות או על ידי הנוכחות של תאים, עם החסרון של אות רועשת. עם זאת, כאמור לעיל, לא נמצאו הבדלים משמעותיים בכח באגירה מחושב בין עיצוב התא ללא מוצג בטבלה 1 והעיצוב שלאחר הניסוי בטבלה 2 תחת תנאי הניסוי המתוארים כאן. בנוסף, על טווחים קטנים ΔpH (&lt;0.4 יחידות; בניסוי הטוב ביותר המוגבלים ל -0.2 יחידות), המדרון ליניארי שהתקבל על ידי התוויית קמ&quot;ש / H pmol Δ + כראוי קרוב היחסים בין לוגריתמי ΔpH ו[ + H]. השיפוע של עקומת סטנדרט זה ולכן מייצג את הכח באגירה של מדיום assay הנבדק ב+ H pH / nmol ב -7 μl, או + H קמ&quot;ש / pmol ב -7 μl. אנו ממליצים להגדיל את כוח חציצה בינוני או הפחתת צפיפות תא לדגימות שתעלינה על שינוי יחידת 0.2 pH בזמן המדידה. זמן המדידה גם עשוי להיות ירידה, אבל זה עשוי לקצר את שיעור החמצת מצב היציב ולהציג את השגיאה בחישוב השיעור.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pherastar FS</td>
			<td>BMG</td>
			<td>n/a</td>
			<td>microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF-24</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>n/a</td>
			<td>extracellular flux instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF assay plate</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>V7-PS</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>38280</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myxothiazol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5580</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbonic anhydrase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2624</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3991</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD+</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7004</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

<html> איור 2 מציג את הנתונים הגולמיים לניסוי טיפוסי. נקודות מדידת 10 שעברה מרישום נקודה לנקודה של שני OCR ו- pH (מוצל קווים אנכיים) שמשו לחישובים. חששות ראשוניים שהערך הממוצע (מדידת נקודת אמצע) של כל מחזור assay לא לספק רזולוציה מספקת של שיעור לחישוב מדויק, במיוחד כפי שיש שנראה כפיגור קל בין בנוסף נמל ושיעור החמצת מצב יציב, לא התממשו, כמו זה אינו מופיע לתרום באופן משמעותי לשגיאת חישוב (לא מוצג). לחלופין, אם קיבולת החציצה הנכונה הוא נכנס במהלך התקנה ניסיונית, ניתן לקרוא PPR ישירות מקריאת נתוני איסוף נתוני מכשיר על ידי הצגת פלט PPR בתוכנת המכשיר או במחשב האישי בפורמט תואם זמין כאחת מהגדרות פלט נתונים. ftp_upload / 53,464 / 53464fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. עקבות שטף תאי נציג של O 2 ו+ H. OCR ו- pH עוקב לניסוי הדוגמא בלוח 5, המכילים 10 מ&quot;מ גלוקוז בתחילת assay. היה לי הנמל D ריכוזי HCl שונים לכיול של כוח באגירה (לא מוצג בממוצע עקבות אלה). נתונים מפרסום קודם 6. כל נקודה מייצגת ממוצע ± SEM של n = 8 חזרות ביולוגיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ניתוח נתונים של תוצאות נציג שימוש בגיליון האלקטרוני מוצג בטבלה 6 ובתנאי כקובץ מצורף, נתונים ערכים מבארות בודדות ניתן להזין בעמודות מוצגות עם כותרות צהובות. כל שישה העמודים ל<html> הזכות מחושבת מערכים אלה. הדוגמא בלוח 6 מציגה את החישובים של שו&quot;ת PPR וglyc PPR באמצעות ECAR ונתונים OCR מבארות בודדות לתנאים המקומיים עם או בלי גלוקוז הוסיף, לפני יציאת תוספת של oligomycin. משכפל טכני על כל הכנה ביולוגית בדרך כלל בממוצע לתת ערכים יחידים של התפוקות בארבעת הטורים האחרונים, אז הנתונים מהכנות ביולוגיות שונות בממוצע עם התפשטות מתאימה לסטטיסטיקה שגיאה בBP וארבעת ערכים אלה. <img alt="לוח 6" src="/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg" /> חישוב לוח 6. של נשימה והחמצת glycolytic. עמודות בראשות בצהוב מצביעים על ערכים שנכנסו מחישוב (למשל, BP, מקסימום H + / O 2), או מאיסוף נתונים (למשל, טוט ECAR, OCR).<html> נ.ב.: &quot;target =&quot; _ //www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של שולחן זה |. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464_Table_6.xlsx">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה כגיליון אלקטרוני Excel .</a> תרומות של גליקוליזה ונשימה למקום מגורי הקבע לאחר תיקון איור 3 מציג את הפלט הגרפי של נתונים מחושבים כבלוח 6 לשיעורי יליד החמצת glycolytic ונשימה, שיעורים הבאים oligomycin בנוסף (נמל), ושיעורים הבאים בנוסף FCCP (הנמל B). נתונים אלה מראים בבירור כיצד הפרופורציות של שינוי הנשימה וglycolytic החמצה עם בחירה של מצע (גלוקוז לעומת השליטה (CTL) עם אף הוסיפו) ועם מצב של המיטוכונדריה (פונקצית ילידים לעומת פונקציה פרמקולוגית שונה). &quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53464/53464fig3.jpg" /> איור 3. שיעור פרוטון ייצור (PPR) ממקורות glycolytic ונשימה. PPR מהנשמה (חלקים פתוחים) וגליקוליזה (מנות מלאות) של תאי C2C12 מחושבים באמצעות משוואה 5 עם גלוקוז הוסיף (שלושה ברים שמאל) או בלי גלוקוז הוסיף (שלושה ברים מימין). נתונים מ 6. כל הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM של n = 8 חזרות ביולוגיות.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate at JoVE.com

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

מדידה וניתוח של תאי ייצור חומצה לקביעת glycolytic דרג

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

measurement-analysis-extracellular-acid-production-to-determine

Research

JoVE Journal

Biology

24.9K Views.  Touro University California College of Pharmacy. Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Video: Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

מדידת כמותית של Proteolysis מטריקס invadopodia בתיווך בקשרים יחידים ורבים תאיים

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

שיטת תפוקה גבוהה למדידה של קצב סינון הגלומרולרי בעכברים בהכרה

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

מדידה של קצב חילוף החומרים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; באמצעות Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

מדידה של תאי יון שטפי שימוש בטכניקת microelectrode העצמית התייחסות יון סלקטיבי

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human disease in this organism. Sensitive methods for measurements of parameters such as metabolic rates are needed to drive the understanding of physiology and disease in small animals such as the fruit fly. The method described here assesses fuel oxidation in small numbers of adult flies fed food containing trace amounts of 14C-labeled substrates such as glucose or fatty acid. After the feeding period and any additional experimental manipulations, flies are transferred to short tubes capped with mesh, which are then placed in glass vials containing KOH-saturated filter paper that traps exhaled, radiolabeled CO2 generated from oxidation of radiolabeled substrates as potassium bicarbonate, KHCO3. This radiolabeled bicarbonate is measured by scintillation counting. This is a quantitative, reproducible, and simple approach for the study of fuel oxidation. The use of radiolabeled glucose, fatty acids, or amino acids allows determination of the contribution of these different fuel sources to energy metabolism under different conditions such as feeding and fasting and in different genetic backgrounds. This complements other approaches used to measure in vivo energy metabolism and should further the understanding of metabolic regulation.

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

מדידת ייצור פחמן דו-חמצני מן radiolabeled מצעים ב<em&gt; תסיסנית</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

זרימה Cytometric ניתוח של שלפוחית חוץ-תאית ממדיה ממוזגים-תא

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

ניתוח מעקב חלקיקים לכימות וקביעת גודל של שלל חוץ-תאי

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically estimated on solidified media by comparing colony size. However, to quantitatively measure the growth rate of genetically different fungal strains or strains under different environmental/growth conditions (pH, temperature, carbon and nitrogen sources, antibiotics, etc.) is challenging. Thus, the pursuit of complementary approaches to quantify growth kinetics becomes mandatory in order to better understand fungal cell growth. Furthermore, it is well-known that filamentous fungi, including Aspergillus spp., have distinct modes of growth and differentiation under sub-aerial conditions on solid media or submerged cultures. Here, we detail a quantitative microscopic method for analyzing growth kinetics of&#160;the model fungus Aspergillus nidulans, using live imaging in both submerged cultures and solid media. We capture images, analyze, and quantify growth rates of different fungal strains in a reproducible and reliable manner using an open source, free software for bio-images (e.g., Fiji), in a way that does not require any prior image analysis expertise from the user.

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

We present a label-free live imaging protocol using transmitted light microscopy techniques to capture images, analyze and quantify growth kinetics of the filamentous fungus A. nidulans in both submerged cultures and solid media. This protocol can be used in conjunction with fluorescence microscopy.

ניתוח כמותי של אספרגילוס nidulans קצב הצמיחה באמצעות מיקרוסקופיה חיה ותוכנה בקוד פתוח

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...