המחברים מודים בני הזוג. ג&#39;יימס הוקינס, Zu-Xi יו וואן צ&#39;ו מהלב הלאומי, הריאות ודם מכון (NHLBI) לסיוע שלהם עם ניתוח עכבר והכנה וצביעה של חלקי פרפין. המחברים מודים לועדת עורכי עמיתי NIH למערכת סיוע.

כל ניסויי העכבר אושרו על ידי הטיפול בבעלי חיים ושימוש בתכנית במכון הלאומי לבריאות (NIH) עם מספר פרוטוקול H0083R3. NHLBI IACUC אישר את הפרוטוקול ללא משככי כאבים. 1. היפותרמיה הרדמה בעכברים בילוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר ספוגים וציוד כירורגי בחיטוי לפני הניתוח. הכן את כל החומרים כירורגית ולעבור על דקות 15-20 מעקר חרוז חם מראש להגיע 240 מעלות צלזיוס עד 270 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כל C57BL הגורים / 6 (P1 גיל) מאם הסיעוד שלהם לכלוב עכבר נקי עם מצעים טריים וחומרי קינון. ברגע שהגורים נלקחים לחדר ניתוח, לבצע את ניתוח הפסגה מייד כדי למזער את זמנם בילה מופרד מאמו וכדי להפחית את הסיכון של קניבליזציה האימהית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו ספוגים על מיטת קרח ולאחר מכן למקם גור אחד בספוג ל~ 3 דקות כדי להשיג הרדמה היפותרמיה. לאשר הרדמה על ידי התבוננות APNea ואקינזיה וצובטת את רגל אחורית. בדוק את המצב של ילודים לעתים קרובות בגלל מעט מדי זמן לא יעשה את האקינטי הגור וapneic, ומשך מוגזם של הרדמה יכול להוריד את שיעור הישרדות 12. </li></ol> 2. פתיחת בית החזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הגור מהמיטה הקרח על אזור benchtop כירורגית ולהשתמש בקלטת כדי לשתק את זרועות, רגליים, והזנב שלה במצב שכיבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את החזה באמצעות בטאדין ועדינות לנקות אותו באמצעות 70% משטח הכנת אלכוהול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך בעור רוחבי לאורך האזור הלאה הצלע של חלל החזה באמצעות Vannas אביב מספריים, ולאחר מכן להקהות לנתח את השרירים הלאה צלע כדי להקל על גישה ללב. הערה: שיעורי הישרדות לשפר כאשר אובדן דם ממוזער במהלך התהליך כירורגי. </li></ol> 3. קטיעה כירורגית של לב חדרית איפקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביד, בעדינות להפעיל לחצו על הבטן כדי exteriorizeשיאו של הלב. ספוג דם סביב אזור הניתוח עם החלת כותנה שקצה סטרילי להדמיה ברורה. לילודי שליטת דמה המופעל, להמשיך ישירות לשלב 4 (תפרים ושחזור של עכברים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת לפנס מגדלת ושימוש iridectomy מספריים, בעדינות לבצע כריתת טיפין טיפין של החדר השמאלי (LV) עד תא LV חשוף. להיות זהיר כדי למזער את החלקים שעברו כריתה של LV. כ -15% כריתה היא הכרחית כדי להשיג חשיפה אופטימלית של חדר LV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהלב חוזר לחלל החזה פעם אחת קאמרי LV חשוף. </li></ol> 4. תפר ושחזור של עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפור את הצלעות ושרירים יחד כדי לאטום את חלל החזה באמצעות תפרי פרולין 6-0 סטרילי, ולאחר מכן לסגור בקפידה אתר חתך בעור באמצעות דבק עור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את הילוד תחת מנורת חום ל~ 3 דקות להתאוששות, ולאחר מכן לנקות את עקבות דם ודבק באמצעות 70% משטח הכנת אלכוהול befoמחדש reintroducing להמלטה שלה. לנסות להשלים את כל ההליך כירורגי בתוך 10 דקות, כי צמצום המשך הזמן מופרד מהאם משפר הישרדות גור לאחר כריתת הפסגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל ניתוח, למקם את הכלים כירורגיים במגע עם חרוזים של מעקר חרוז החם לכ -20 שניות לעיקור מלא. לאפשר כלים כירורגיים להתקרר לRT לפני כל ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שסיים את הניתוחים לכל הגורים בהמלטה, לערבב את הגורים עם המצעים של האמא וצואה לפני החזרתם לקן של האמא. הערה: באופן כללי, עכברי ICR / CD-1 הן אמהות אומנה טובה יותר מאשר C57BL / 6, אבל גם בקרב אמהות מניקות מאותו הרקע הגנטי, אינסטינקטים טיפוח להשתנות. אם שינוי אם מניקה יש צורך להפחית תמותה על ידי קניבלים אימהיים, להסיר את גורי P0 לאם מניקה ולאחר מכן לבצע כריתת הפסגה בP1. לבצע גם את פעולת דמה או r הפסגה רקesection בהמלטה אחת גורים, כי דמה ערבוב וגורים כירורגית יכולים להפחית את שיעורי ההישרדות של הקבוצה כירורגית של גורים 6. </li></ol> ניתוח 5. לאחר ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לאחר הניתוח, לעקוב אחר הגורים, להבטיח שאין הבדל בין זיוף וקבוצות כירורגית, ולספור את מספר הגורים למדוד את שיעור ההישרדות. אם הניתוחים מבוצעים כראוי, שיעורי ההישרדות צריכים להיות דומים ויותר מ -60% בשני קבוצות דמה וניתוחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד לב וקיבעון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הגורים בימים 1 ו -2 לאחר ניתוח באמצעות עריפת ראש ויום 21 לאחר ניתוח על ידי CO2 עם הבטחה של מוות על ידי נקע בצוואר הרחם, ולאחר מכן לנקות את החזה באמצעות הכנת אלכוהול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את העור ושרירים קו האמצע של החזה ולאחר מכן פתח את החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו כל הלב מחלל בית החזה ולתקן את כל הלב של כל דגימה ב 5 מיליליטר של 4% O paraformaldehyde / N ב RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום שלמחרת, להעביר את הדגימות לאתנול 70%. דוגמאות ניתן לאחסן עד שבוע לפני הטבעת פרפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי Slice 5-מיקרומטר בעובי פרפין דרך כל החדר ולבצע hematoxylin הסטנדרטי וeosin (H &amp; E) וצביעת Trichrome של האסון לבחון את התגובה 5 משובי, 7. באופן ספציפי, כתם H &amp; E משמש כדי לבחון החלפת שריר וכתם Trichrome של האסון משמש כדי לבחון את תגובות fibrotic 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את האזור של עניין ולהקים לפחות שלושה מוקדים לדגימה באמצעות סורק שקופיות באופן ידני. תמונה ולנתח את השקופיות מכתימה ב 40 × הגדלה פי הוראות היצרן עם פרמטרים של ברירת מחדל. </li></ol>

<ol>
	<li>Lin, Z., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+cardiac+regeneration+and+repair.">Strategies for cardiac regeneration and repair.</a> Sci Transl Med. 6, 231-239 (2014).</li><li>Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mending+broken+hearts:+cardiac+development+as+a+basis+for+adult+heart+regeneration+and+repair.">Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 529-541 (2013).</li><li>Mahmoud, A. I., Porrello, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+back+the+cardiac+regenerative+clock:+lessons+from+the+neonate.">Turning back the cardiac regenerative clock: lessons from the neonate.</a> Trends Cardiovasc Med. 22, 128-133 (2012).</li><li>Porrello, E. R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neonatal+blueprint+for+cardiac+regeneration.">A neonatal blueprint for cardiac regeneration.</a> Stem Cell Res. 13, 556-570 (2014).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart.">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331, 1078-1080 (2011).</li><li>Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+models+for+cardiac+regeneration+in+neonatal+mice.">Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice.</a> Nat Protoc. 9, 305-311 (2014).</li><li>Allen, T. C., Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin.">Hematoxylin and eosin.</a> Laboratory methods in Histotechnology. , 53-58 (1992).</li><li>Andersen, D. C., Ganesalingam, S., Jensen, C. H., Sheikh, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+neonatal+mouse+hearts+regenerate+following+heart+apex+resection?.">Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection?.</a> Stem cell reports. 2, 406-413 (2014).</li><li>Kotlikoff, M. I., Hesse, M., Fleischmann, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comment+on+'Do+neonatal+mouse+hearts+regenerate+following+heart+apex+resection?'.">Comment on 'Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection?'.</a> Stem cell reports. 3, 2 (2014).</li><li>Sadek, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-investigator+letter+on+reproducibility+of+neonatal+heart+regeneration+following+apical+resection.">Multi-investigator letter on reproducibility of neonatal heart regeneration following apical resection.</a> Stem cell reports. 3, 1 (2014).</li><li>Andersen, D. C., Jensen, C. H., Sheikh, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+Sadek+et+al.+and+Kotlikoff+et+al.">Response to Sadek et al. and Kotlikoff et al.</a> Stem cell reports. 3, 3-4 (2014).</li><li>Phifer, C. B., Terry, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+hypothermia+for+general+anesthesia+in+preweanling+rodents.">Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents.</a> Physiol Behav. 38, 887-890 (1986).</li><li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+the+heart.">Regenerating the heart.</a> Nat Biotechnol. 23, 845-856 (2005).</li><li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. , 326-335 (2011).</li><li>Jesty, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-kit++precursors+support+postinfarction+myogenesis+in+the+neonatal,+but+not+adult,+heart.">c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 13380-13385 (2012).</li><li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li></ol>

עמלות פרסום לכתבה זו מומנו על ידי מתנה מכלי מדע פיין לד&quot;ר ג&#39;יאן הו.

Cardiac regeneration shows potential for the treatment and prevention of heart failure1, 2. Animal models are indispensable and play a critical role in understanding how cardiac regeneration occurs3-6. Many amphibians and fish regenerate heart tissue in response to injury, providing insight into our understanding of human cardiovascular disease13, 14. In terms of evolution, however, the pathophysiology should be more conserved between a mouse model and humans. Heart regeneration in mammal...

Prolonged human life span leads to various aging- and lifestyle-related diseases, including heart failure, a leading cause of mortality. However, without replacement of lost or dysfunctional cardiac muscle cells, current therapeutics can only transiently improve cardiac function1, 2. Thus, it is necessary to discover and develop innovative strategies for cardiac regeneration and repair. The adult mammalian heart has limited regenerative potential. Studies from lower vertebrates, such as urodele amphibians and teleost fish, have provided unprecedented insights into the molecular and cellular mechanisms underlying heart regeneration3, 4. Recently, a neonatal mouse model of heart regeneration has emerged that might enable identification and characterization of more evolutionarily conserved pathophysiological events required for human heart regeneration5. 
Apical resection refers to the surgical removal of left ventricular apex. This procedure is restricted to 1- to 7-day-old (P1 to P7) mice due to its high lethality in older mice6. The cardiac regeneration process in neonatal mice after apical resection is expected to be as follows: (I) rapid and effective formation of a hematoma to seal the apex and prevent exsanguination; (II) cardiomyocyte regeneration and restoration of systolic function5, 7. Recent work has stimulated debate on the significance and efficiency of this model8-11. Thus, it is important to present the apical resection clearly and in detail. To this end, this protocol vividly and specifically describes a video of how I did apical resection based on a previous protocol6. 
Understanding the molecular mechanisms underlying cardiac regeneration is of importance for treatment of heart disease characterized by loss and/or injured cardiomyocytes, such as heart failure1, 2. Given the current and promising progress of apical resection in the research of cardiac regeneration, this study could promote the use of this technique and its uses in cardiac regeneration research.

<table><tbody><tr><td>Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors, 1.5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 2 mm Cutting Edge</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td>Iridectomy scissors</td></tr><tr><td>Hot Bead Sterilizer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Iris Forceps, Straight, Serrated</td><td>Fine Science Tools</td><td>11064-07</td><td></td></tr><tr><td>Iris Forceps, Curved, Serrated</td><td>Fine Science Tools</td><td>11065-07</td><td></td></tr><tr><td>Shea Scissors - Curved/Blunt-Blunt/12cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14105-12</td><td></td></tr><tr><td>Round Handled Suture Tying Forceps, Straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>18025-12</td><td></td></tr><tr><td>Round Handled Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15400-12</td><td></td></tr><tr><td>Fine Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13007-12</td><td></td></tr><tr><td>Magnifying Lamp</td><td>Luxolamp Corp</td><td>IM120&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Heating lamp</td><td>Brandt Equipment llc</td><td>51152/3</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Prolene sutures</td><td>Ethicon</td><td>8889H</td><td></td></tr><tr><td>Skin glue-Vetbond Tissue Adhesive&amp;nbsp;</td><td>3M&amp;nbsp;</td><td>1469</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Cotton Tipped Applicators</td><td>Dynarex</td><td>4305</td><td></td></tr><tr><td>WEBCOL Alcohol Prep Pad</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td>Medium 2 PLY, 200/BOX, Satured with 70% Isopropyl Alcohol</td></tr><tr><td>Curity All Purpose Sponges</td><td>Covidien</td><td>9024</td><td>Non-woven 4 PLY, 4&quot;x4&quot; (10.2cm&amp;times;10.2cm)</td></tr><tr><td>Bench top protector sheet</td><td>KIMTECH SCIENCE</td><td>7546</td><td>18&quot; x 19.5&quot; (45.72cm x 49.53cm) x 50</td></tr><tr><td>0.9% Sodium Chloride, 250ml</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-6138-22</td><td></td></tr><tr><td>Betadine Solution Swabsticks</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>NDC 67618-153-03</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>TOMY Digital Biology</td><td>SX-700</td><td>HIGH-PRESSURE STEAM STERILIZER</td></tr><tr><td>Slide scanner</td><td>HAMAMATSU</td><td>NanoZoomer 2.0-RS</td><td></td></tr></tbody></table>

apical resection mouse model to study early mammalian heart regeneration

מחלת לב וכלי דם המכות כל העולם בשל שינויים באורח חיים אינטנסיביים. התחדשות לב טומנת בחובו הבטחה גדולה לתיקון ושחזור cardiomyocytes איבד בגלל פציעה ומחלה. בניגוד להתחדשות הלב החזקה של בעלי חוליות התחתונות מסוימים, לב של יונקים בוגרים בדרך כלל להראות יכולת מינימאלית להתחדשות לב ותיקון. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה עוררו עניין מדעי רב עם הממצא ש, בין יום הלידה 1 עד 7 (P1 לP7), לב העכבר בילוד שומר פוטנציאל התחדשות משמעותי לאחר כריתת הפסגה (כלומר, קטיעה כירורגית וחשיפה של קודקוד של חדר השמאלי). מחלוקת עיקרית אחת מעל ממצא זה יכול להיות בגלל הנהלים הקשורים לניתוח המגוונים המשמשים במאמצים כדי לשכפל או להרחיב על ממצא חשוב זה. הוראות אלה באופן דינמי להציג את חומרים ומתודולוגיה לכריתת הפסגה במודל של עכברים. הצעדים הבולטים של surviva מכרסם זההניתוח כרוך בהרדמה l היפותרמיה, פתיחת בית החזה, כריתה כירורגית של קודקוד של חדר לב, ותפר והתאוששות של עכברים. הגישה המתוארת יכול להרחיב את היישום של מודל עכבר כריתת הפסגה למחקר לב וכלי דם.

גורי עכבר היו מורדמים כריתת פוסט-פסגת 1, 2, ו -21 ימים, ולבם נאספו עבור H &amp; E וכתם Trichrome של האסון. צבע כחול בכתם Trichrome של האסון מציין בתצהיר של מטריקס epicardial 5. עם כריתת הפסגה מוצלחת, קריש דם נוצר בצורה יעילה כדי לאטום את כריתת פוסט-פסגת יום אחד LV, כפי שמוצג באיור 1 א.</...

Watch this Scientific Journal Video about Apical Resection Mouse Model to Study Early Mammalian Heart Regeneration at JoVE.com

Apical Resection Mouse Model to Study Early Mammalian Heart Regeneration

A step-by-step video protocol of apical resection is demonstrated in this study. Apical resection is a recently highlighted surgical approach in mammalian heart regeneration research. This study may promote the application of apical resection as a standard methodology in research into the mechanism underlying heart regeneration.

דגם פסגת כריתת עכבר כדי ללמוד התחדשות לב יונקים מוקדמת

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring ...

apical-resection-mouse-model-to-study-early-mammalian-heart

Research

JoVE Journal

Medicine

11.2K Views.  National Institutes of Health. A step-by-step video protocol of apical resection is demonstrated in this study. Apical resection is a recently highlighted surgical approach in mammalian heart regeneration research. This study may promote the application of apical resection as a standard methodology in research into the mechanism underlying heart regeneration.

Video: Apical Resection Mouse Model to Study Early Mammalian Heart Regeneration

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

הדמיה הותרה עוברית ולבבות אחרי לידה ברזולוצית תא בודד

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Developmental Biology

Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study reveals that transplantation of neonatal cardiac macrophages recruited by injury promotes adult heart regeneration after myocardial infarction with improvement of cardiac function and cardiomyocyte proliferation. The results indicate that neonatal cardiac macrophage transplantation could be a promising strategy for cardiac injury treatment. Here, we provide the technical details, including the isolation of neonatal cardiac macrophages from apical resection-injured neonatal mouse hearts, the transplantation of macrophages into myocardial-infarcted adult mice, and the estimation of heart regeneration after a macrophage graft.

We provide a protocol for neonatal cardiac macrophage separation and transplantation into an adult mouse heart, which could be a promising way to promote cardiac repair.

השתלת מקרופאגים לב של עכבר יילודים בעכברים בוגרים

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study ...

Biochemistry

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in cardiac injury, primarily in the form of an acute myocardial infarction. With little resilience following injury, the once healthy cardiac tissue will be replaced by fibrous, non-contractile scar tissue and often be a prelude to heart failure. To identify novel treatment options in regenerative medicine, research has focused on vertebrates with innate regenerative capabilities. One such model organism is the neonatal mouse, which responds to cardiac injury with robust myocardial regeneration. In order to induce an injury in the neonatal mouse that is clinically relevant, we have developed a surgery to occlude the left anterior descending artery (LAD), mirroring a myocardial infarction triggered by atherosclerosis in the human heart. When matched with the technology to track changes both within cardiomyocytes and non-myocyte populations, this model provides us with a platform to identify the mechanisms that guide heart regeneration. Gaining insight into changes in cardiac cell populations following injury once relied heavily on methods such as tissue sectioning and histological examination, which are limited to two-dimensional analysis and often damage the tissue in the process. Moreover, these methods lack the ability to trace changes in cell lineages, instead providing merely a snapshot of the injury response. Here, we describe how technologically advanced methods in lineage tracing models, whole organ clearing, and three-dimensional (3D) whole-mount microscopy can be used to elucidate mechanisms of cardiac repair. With our protocol for neonatal mouse myocardial infarction surgery, tissue clearing, and 3D whole organ imaging, the complex pathways that induce cardiomyocyte proliferation can be unraveled, revealing novel therapeutic targets for cardiac regeneration.

Cardiomyocyte proliferation following injury is a dynamic process that requires a symphony of extracellular cues from non-myocyte cell populations. Utilizing lineage tracing, passive CLARITY, and three-dimensional whole-mount confocal microscopy techniques, we can analyze the influence of a variety of cell types on cardiac repair and regeneration.

לכידת תגובת פגיעה לב של אוכלוסיות תאים ממוקדות באמצעות לב נקי תלת מימדי הדמיה

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Clonal Analysis of the Neonatal Mouse Heart using Nearest Neighbor Modeling

By replacing lost or dysfunctional myocardium, tissue regeneration is a promising approach to treat heart failure. However, the challenge of detecting bona fide heart regeneration limits the validation of potential regenerative factors. One method to detect new cardiomyocytes is multicolor lineage tracing with clonal analysis. Clonal analysis experiments can be difficult to undertake, because labeling conditions that are too sparse lack sensitivity for rare events such as cardiomyocyte proliferation, and diffuse labeling limits the ability to resolve clones. Presented here is a protocol to undertake clonal analysis of the neonatal mouse heart by using statistical modeling of nearest neighbor distributions to resolve cardiomyocyte clones. This approach enables resolution of clones over a range of labeling conditions and provides a robust analytical approach for quantifying cardiomyocyte proliferation and regeneration. This protocol can be adapted to other tissues and can be broadly used to study tissue regeneration.

Presented here is a protocol for using multicolor lineage tracing and nearest-neighbor modeling to identify clonally derived cardiomyocytes during growth and regeneration in mice. This approach is objective, works across different labeling conditions, and can be adapted to incorporate a variety of image analysis pipelines.

By replacing lost or dysfunctional myocardium, tissue regeneration is a promising approach to treat heart failure. However, the challenge of detecting ...

Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail specific developmental stages in a still snapshot, live imaging captures dynamic morphogenetic events, such as cell migration, shape changes, and differentiation, by imaging the embryo as it develops. This complements fixed analysis and expands the understanding of how organs develop during embryogenesis. Despite its advantages, live imaging is rarely used in mouse models because of its technical challenges. Early mouse embryos are sensitive when cultured ex vivo and require efficient handling. To facilitate a broader use of live imaging in mouse developmental research, this paper presents a detailed protocol for two-photon live microscopy that allows long-term acquisition in mouse embryos. In addition to the protocol, tips are provided on embryo handling and culture optimization. This will help understand key events in early mouse organogenesis, enhancing the understanding of cardiovascular progenitor biology.

We present a detailed protocol for mouse embryo culture and imaging that enables 3D + time imaging of cardiac progenitor cells. This video-toolkit addresses the key skills required for successful live imaging otherwise hard to acquire from text-only publications.

הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים בעובר העכבר

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail ...

טרנסגנזה מבוססת אלקטרופורציה של תאי לב בלבבות עכברים

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

מחבר זרקור: טרנסגנזה של תאי לב לבדיקת גנים מהירה

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.

גישת טרנסגנזה יעילה להעברת גנים בלב העוברי של העכבר

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

אוטם שריר לב עכברים ילודים, מודל התחדשות לב

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ligation is a challenging procedure and has a high mortality rate due to its nature. We developed a method to consistently transplant bioprinted patches of cells and hydrogels onto the epicardium of an infarcted mouse heart to test their regenerative properties in a robust and feasible way. First, a deeply anesthetized mouse is carefully intubated and ventilated. Following left lateral thoracotomy (surgical opening of the chest), the exposed LAD is permanently ligated and the bioprinted patch transplanted onto the epicardium. The mouse quickly recovers from the procedure after chest closure. The advantages of this robust and quick approach include a predicted 28-day mortality rate of up to 30% (lower than the 44% reported by other studies using a similar model of permanent LAD ligation in mice). Moreover, the approach described in this protocol is versatile and could be adapted to test bioprinted patches using different cell types or hydrogels where high numbers of animals are needed to optimally power studies. Overall, we present this as an advantageous approach which may change preclinical testing in future studies for the field of cardiac regeneration and tissue engineering.

This protocol aims to transplant a 3D bioprinted patch onto the epicardium of infarcted mice modeling heart failure. It includes details regarding anesthesia, the surgical chest opening, permanent ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery and application of a bioprinted patch onto the infarcted area of the heart.

השתלה של תיקון ביו-מודפס בתלת מיתד במודל מורין של אוטם שריר הלב

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...

דגם פסגת כריתת עכבר כדי ללמוד התחדשות לב יונקים מוקדמת

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הדמיה הותרה עוברית ולבבות אחרי לידה ברזולוצית תא בודד

השתלת מקרופאגים לב של עכבר יילודים בעכברים בוגרים

לכידת תגובת פגיעה לב של אוכלוסיות תאים ממוקדות באמצעות לב נקי תלת מימדי הדמיה

Clonal Analysis of the Neonatal Mouse Heart using Nearest Neighbor Modeling

הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים בעובר העכבר

גישת טרנסגנזה יעילה להעברת גנים בלב העוברי של העכבר

גישת טרנסגנזה יעילה להעברת גנים בלב העוברי של העכבר

גישת טרנסגנזה יעילה להעברת גנים בלב העוברי של העכבר

אוטם שריר לב עכברים ילודים, מודל התחדשות לב

השתלה של תיקון ביו-מודפס בתלת מיתד במודל מורין של אוטם שריר הלב