התחדשות הלב הא אנדוגנית היא תהליך דינמי המערב סוגי תאים מרובים עובדים יחד בתיאום כדי לעלות תגובה רגנרטיבית חזקה. הצצה לתוך הרקמה המתחדשת באמצעות הדמיה תלת מימדית של הלב המנוקה בתגובה לפציעה יכולה לסייע בשחזור הדינמיקה התאית שמנחה את התגובה הרגנרטיבית הלבבית הזו. הפרוטוקול שלנו תוכנן במיוחד כדי לעקוב אחר תאים במהלך פיתוח והתחדשות.
איננו צפויים למגבלות ביישום נרחב של טכניקות ההבהבה, הכתם וההדמיה שלנו על סוגי איברים אחרים. עבור העורק הכלילי הנגרמת על ידי LAD, תחילה לחסן את האזור הכירורגי של גור יילודים בן יום אחד עם פתרון חיטוי. בצע חתך עור רוחבי באזור החזה.
כדי להפריד את העור מהשריר, השתמש בזוג מדחפי ההלבשה כדי להרים את העור בזהירות תוך לחיצה עדין על המספריים נגד השרירים הבין-חלקים בתקורה סגורה. אתר את החלל הבין-צלעי הרביעי ולהשתמש במלקחיים קטנים כדי להפוך את ניקור שטחי קטן דואג כדי למנוע את האיברים הפנימיים. באמצעות ניתוח קהה ומטליות ההלבשה, להרחיב את האזור בין השרירים הבין-חלקים רק עד אצבע ניתן להחיל על הצד השמאלי של הבטן תוך החזקת שטח intercostal פתוח עם מטליות ההלבשה בעדינות להנחות את הלב מתוך חלל החזה.
לאחר שהלב חולץ, אפשר ללב לנוח על השרירים הבין-חלקיים ולאתר את LAD כאזור הלב עם דם פחות מקובץ. כדי לגרום אוטם שריר הלב, להשתמש תפר 6-0 לקשור קשר מרובע בחוזקה סביב כלי השיט פעמיים מבלי לנתק את העורק. בלאנשינג על איפקס יש לצפות מיד.
חשוב להישאר עקביים על מיקום התפר לאורך LAD לגודל אוטם דומה. זה מושגת בצורה הטובה ביותר על ידי גישה ללב במהירות בעוד הדם עדיין זורם דרך העורקים. כאשר התפר הונח, לאפשר ללב להחליק בחזרה לתוך חלל החזה.
תפר את הצלעות יחד עם מנתח אחד וקשר מרובע אחד באמצעות ממטרות קהות כדי להרים את הסט העליון של הצלעות תוך העברת תפר 6-0 דרך הסט העליון והתחתון של הצלעות. יש למרוח כמות קטנה של דבק עור על הבטן העליונה ולהשתמש במדפים עדין כדי למקם את עור הבטן התחתונה מעל אזור החזה החשוף. לאחר מכן מניחים את הגור על משטח חימום ולבצע את הקשירה על החיה הבאה.
לאחר ביצוע כל הניתוחים, החזירו את הגורים החמים והמוביילים לכלוב הביתי של האם. לבהירות פסיבית של רקמת הלב שנקטפה, 21 ימים לאחר אישור חוסר תגובה לצביטת בוהן, מניחים את העכבר על אזור כירורגי נקי בתצורת השופע ומאבטחים את הגפיים בקלטת. באמצעות מטחנות רקמה, לתפוס את הפרווה ממש מתחת לתהליך xiphoid ולעשות חתך פורש את רוחב בית החזה.
חותכים לצד החלקים הדיסטליים של בית החזה ולהשתמש במטליות כדי להרים את תהליך xiphoid לחשוף את הסרעפת. נתק את הסרעפת עם מדפים מעוגלים ולמשוך את הרקמה cranially עד הלב הפועם נגיש. השתמש במקלפים המעוקלים כדי לתפוס את הלב בבסיס ולהשתמש מספריים iridectomy לחתוך את כאב הלב ואת וונה קאווה מעולה.
מניחים את הלב הפועם לתוך צלחת פטרי של PBS כך הלב שואב את כל הדם שמור. אוטם שריר הלב יכול להיות מאושר על ידי מיקום אנטומי נכון של רצועות LAD. כאשר הלב מפסיק לפעום, בעדינות לסחוט את האיבר עם ממטרות לגרש את הדם שיורית ולהעביר את הדגימה לתוך בקבוקון זכוכית חד פעמי 2.5 מיליליטר המכיל שני מיליליטר של PBS.
מניחים את הבקבוקון על שייקר לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר ומשנים את תווי PBS כל 10 דקות עד שהפתרון נשאר נקי מדם. כאשר PBS ברור, להחליף את PBS עם שני מיליליטר של קר 4% paraformaldehyde עבור דגירה של ארבע שעות בטמפרטורת החדר ואחריו שלוש 10 דקות שטיפה על השייקר עם שני מיליליטר של PBS טרי לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, למלא את הבקבוקון עם שני מיליליטר של 4% אקרילאמיד בתוספת 0.5%VA-044 פתרון עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס.
למחרת, מניחים את הבקבוקון בבלוק חום של 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות. בסוף הפולימריזציה, מעבירים את הלב לבקבוקון קליפת זכוכית חדש ושוטפים את רקמת הלב בשני מיליליטר של PBS טרי 10 דקות בכל פעם מרעננים את ה- PBS בסוף כל דגירה. כאשר PBS ברור, להחליף את מאגר לשטוף עם שני מיליליטר של פתרון ניקוי.
דגירה הדגימה ב 37 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות עד הלב ברור, מרענן את פתרון הסליקה כל יומיים עד שלושה ימים. כאשר האיבר ברור, לשטוף את הדגימה עם PBS על שייקר כפי שהוכח לפני מילוי הבקבוקון עם PBS טרי עבור דגירה 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, החלף את PBS עם RIMS עבור דגירה 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס.
בסוף הדגירה, הרקמה מנוקה לחלוטין. הרקמה צריכה להיות שקופה לאחר מספר שבועות. להדמיה של לב העכבר לאחר הלידה לאחר אינדוקציה אוטם שריר הלב, למלא חצי תא של שקופית דיכאון בהתאמה אישית עם PBS ולהשתמש מלקחים מעוגלים להעביר בזהירות את הלב פינה לתוך התא.
מלא את הנפח הנותר של התא עם PBS. לאחר מכן למלא את התא עם PBS עד פני השטח של הנוזל יוצר כיפה מעל החלק העליון של התא ולהרכיב את החלקה כיסוי לפני הדמיה של הרקמה על ידי מיקרוסקופ קונפוקל על פי פרוטוקולי הדמיה סטנדרטיים. אם הנקב והתספורת הקהה קרובים מדי בסמיכות לעצם החזה, ייתכן שהלב לא יוכל לצאת חלל החזה.
אם הלב לא יוצא בקלות מהחללים, יש להפעיל לחץ על הבטן השמאלית כדי להקל על התהליך. סיבוכים עלולים להתרחש מהנוחת הלב על השרירים הבין-חלקים. לכן, חשוב לשמור על הניתוח הקהה לגודל מינימלי בכיוון אופקי כדי לאפשר הדמיה ברורה ונגישות של LAD.
שים לב כי קשירה שטחית יהיה פחות מקום להתאמה במיקום התפר הסופי, כי התפר קשירה סביב LAD צריך להתבצע עם תנועות קבועות מבוקרות. עד סוף שלב ההבהרה, הלב כולו צריך להיות אטום באופן עקבי ללא שינוי צבע במרכז. לאחר כמה ימים בתסרון RIMS בטמפרטורת החדר, הלב צריך להיות פינה לחלוטין וכמה הרחבת רקמות ניתן לראות.
כפי שנצפה על ידי ביטוי חלבון כתב tdTomato, עצבי הלב הם בעיקר שטחיים עם כמה אוכלוסיות המתגוררות בשכבה האפיקארדית. חשוב לציין, אישור ביטוי חלבון הכתב נשמר לאחר שעבר את פרוטוקול הבהירות כפי שהוכח. ניקוי והדמיה של הלב תלת-ממדי מספקים פרספקטיבה למיקום ומורפולוגיה של אוכלוסיות תאי לב.
זה מאפשר לנו לזהות היבטים חדשים בתבנית תאים ובאינטראקציות בין תאים לתאים.
