המחברים מבקשים להודות חבייר א גרסיה Lene גרונקיאר לקבלת סיוע טכני Merete ק Raarup לדיונים פוריים. עבודה זו מומנה על ידי ארהוס אוניברסיטת Research Foundation ואת סיימון ספייס קרן.

פרוטוקול הניסוי נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה של מחוז ארהוס (M-20,100,032). 1. הכיול מיקרוסקופי Confocal של דיי ratiometric <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור רכישת תמונה, משתמש במיקרוסקופ confocal הפוך המצויד באינקובטור, טבילה אובייקטיבית מי צמצם 63X / 1.2-מספרית, קו ליזר 543 ננומטר וגלאי META. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן HEPES חיץ פתרונות מניות (50 מ&quot;מ, מותאם 4.5-8.5 pH בצעדים של 0.1 יחידות pH). פיפטה 100 μl של כל פתרון לתוך הבארות של צלחת 96-גם ברורה תחתונה עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש להשתמש בכפפות ניטריל בעת טיפול לצבוע ratiometric C-SNARF-4. כן פתרון מניות 1 מ&quot;מ של הצבע sulfoxide דימתיל. הוסף 5 μl של פתרון המניות היטב כל עם חיץ HEPES. מניחים את צלחת 96-היטב על המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המיקרוסקופ. פתח את תוכנת מיקרוסקופ. לחץ על לוחות הבאים: רוכשת → לייזר; רוכש → Micro; רוכשת Config →; רוכשת סריקת →; רוכשת → שלב. לחמם את החממה עד 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את קו לייזר 543 ננומטר על ידי לחיצה על לייזר 543 ננומטר &quot;על&quot; כפתור בחלון &quot;בקרת לייזר&quot;. בחר את מטרת טבילה במי צמצם 63X / 1.2-מספריים בחלון &quot;בקרת מיקרוסקופ&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גלאי META לפקח הקרינה בו זמנית בתוך 576- ל 608 ננומטר (ירוק) ו 629- ל 661 ננומטר (אדום) במרווחים ( &quot;בקרת תצורה&quot; → &quot;CHS&quot;). התאם את עוצמת הלייזר ( &quot;בקרת תצורה&quot; → &quot;עירור&quot;). הגדר את החריר להניב עובי פרוסה אופטי של 1.6 מיקרומטר ( &quot;בקרת סריקה&quot; → &quot;החריר&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונה של כל פתרון חיץ HEPES, 5 מיקרומטר מעל תחתית הזכוכית של צלחת 96-היטב. הערה: ברגע שמטוס המוקד ממוקם מתחת תחתית הזכוכית, אין אור ניאון ניתן לראותעל המסך. אחרי כל תמונה שלישית, להגדיר את כוח הליזר לאפס ולקחת תמונה עבור רקע חיסור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו את הניסוי כיול בשלושה עותקים (1.2-1.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את עוצמת פלורסנט הממוצעת וסטיית התקן בכל התמונות האדומות וירוקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את R יחס ואת סטיית התקן של הממוצע, S R, עבור כל תמונה על פי משוואות (1) ו- (2) (1) <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/53622/53622equation1.jpg" /> (2) <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/53622/53622equation2.jpg" /> g, r, s g s r והם הממוצעים וסטיות תקן את התמונות ירוק ואדום בהתאמה. g b, b r, s br bg ו- s הם הערכים המתאימים עבור תמונות רקע. n <em&gt; 2 הוא מספר הפיקסלים צילמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את היחסים המחושבים עבור כל ערך pH מהניסויים כיול השלושה לשכפל דיאגרמה לבנות עקום מצויד מסדרה זו של נקודות נתונים (כלומר באמצעות התוכנה SigmaPlot 13). הפוך פונקציה מתמטית מעקומה המצוידת שיכול להמיר יחסים לתוך ערכי ה- pH 10. </li></ol></li></ol> 2. אוסף של דגימות biofilm שיניים Grown באתרו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מתנדב העומדים בקריטריוני כלה ודרה רלוונטיים למחקר. הפוך הופעות אלגינט של קשת השיניים העליונה והתחתונה שלהם. הפכו מודלים יצוקים מן ההופעות הללו מייצרים סד אקריליק בלסת התחתונה. לעצב את הסד עם מסגרת אקריליק buccal מחוברת בכבל לשוני אורתודונטי המאפשר המתנדב לנגוס חסימה רגילה 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיתון מקדחה בתוך מסגרת buccal של סד אקריליק (איור 1 </strong&gt;) בעזרת burs אקריליק שיניים כדי לאפשר החדרת לוחות זכוכית לאיסוף ביופילם. עומקה של המיתון צריך להיות לפחות 1.5 מ&quot;מ, ואילו הרוחב והאורך של המיתון עשוי להשתנות בהתאם למספר של לוחות זכוכית להיות מוכנסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת אוסף ביופילם, השתמש מחוייט ללא ניאון לוחות זכוכית (4 x 4 x 1 מ&quot;מ 3) עם חספוס פני שטח של חצץ 1,200 כדי לחקות את דפוס קולוניזציה על אמייל טבעי 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את לוחות זכוכית על ידי מעוקר לפני ההרכבה. הר לוחות זכוכית עם שעווה דביק שקעים מסגרת buccal של כל צד השקוע מעט אל פני השטח של משטח אקרילי על מנת להגן על ביופילם מכוחות גזירה שמפעילות התנועה של הלחיים 11. הערה: מספר לוחות זכוכית להציב במיתון עשוי להשתנות בין 3 ו -14, תלוי מטרת המחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המכשיר בפה של המתנדב. הדרך את volunteer לשמור על המכשיר התוך דרך הפה במשך כל תקופת הניסוי. הדרך המתנדב לאחסן את המכשיר באריזה נגד שכר אורתודונטי עם פיסת ממחטת נייר רטובה (כדי לשמור אותו לח) בטמפרטורת חדר במהלך צחצוח שיניים וצריכת מזון ומשקאות אחרים מאשר מים. הדריכו המתנדב לא לגעת מסגרת אקריליק buccal עם לוחות זכוכית תוך שימת והסרת המכשיר. הערה: תקופת הניסוי עשויה להשתנות תלוי מטרת המחקר (יום אחד עד מספר שבועות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את לוחות הזכוכית מהמכשיר בסוף תקופת הניסוי. הסר את השעווה הדביקה סביב המלוחות עם סכין ולהעביר אותם עם פינצטה במכל סגור, biofilm פונה כלפי מעלה, עד ניתוח מיקרוסקופי. שמור את המיכל ולח עם ממחטת נייר רטוב. בצע הדמיה pH בתוך כמה שעות לאחר איסוף ביופילם. </li></ol> 3. הדמיה pH Biofilm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכיןפתרון הרוק ידי הוספת dithiothreitol לרוק שנאספו על פי שיטת דה יונג et al. 13. לכייל פתרון הרוק ל- pH 7.0 ולהוסיף גלוקוז בריכוז של 0.4% (wt / כרך). פיפטה 100 μl לכל ביופילם להיות מנותח לתוך צלחת 96-היטב זכוכית התחתונה עבור במיקרוסקופ. הוסף 5 μl של צבע ratiometric לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת 96-היטב על הבמה מיקרוסקופ. הפעל את המיקרוסקופ קו לייזר 543 ננומטר. לחמם את החממה עד 37 מעלות צלזיוס. השתמש באותן הגדרות מיקרוסקופ ובאשר הכיול של הצבע (ראה צעדים 1.5-1.6). חכה 30 דקות, עד הצלחת 96-היטב הגיעה טמפרטורת עבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרים אחד או יותר לוחות זכוכית עם סט דק של פינצטה ולמקם אותם הבארות מלאות הרוק, לוח אחד לכל היטב, עם biofilms פונה כלפי מטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות יחידות ( &quot;בקרת הסריקה&quot; → &quot;יחיד&quot;) או Z- ערימות ( &quot;בקרת הסריקה&quot; → &quot;התחל&quot;) spanning עומק biofilms בתחומים שונים. לרכוש Z- ערימות לבחור המספר הפרוס להיות צלם ( &quot;בקרת הסריקה&quot; → &quot;Z הגדרות&quot; → &quot;Num פרוסה&quot;) ולסמן את Z-Position עבור הרבעון הראשון לבין הפרוסה האחרונה בתוכנת מיקרוסקופ ( &quot;בקרת סריקה &quot;→&quot; Z הגדרות &quot;→&quot; ראשון לציון &quot;;&quot; מארק אחרון &quot;). הערה: Z-ערימות עם עומק של עד 75 מיקרומטר ניתן לרכוש עם ניגודיות טובה בין אזורים תאיים ו תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקוב אחרי שינויי pH בשדה מיקרוסקופי מבט לאורך זמן, לסמן את XY-העמדה בתוכנת מיקרוסקופ ( &quot;שלב ובקרת הפוקוס&quot; → &quot;מארק הממוצע&quot;) ולקחת תמונות חוזרות ונשנות בנקודות רצופות זמן ( &quot;בקרת סריקה&quot; → &quot; אֶחָד&quot;). לוקחים בקביעות תמונות עם כוח לייזר מוגדר כאפס עבור רקע חיסור. </li></ol> 4. ניתוח תמונה דיגיטלית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקספוrt התמונות המיקרוסקופיות כקבצי TIF, השתמשו יצוא קובץ אצווה של תוכנת מיקרוסקופ ( &quot;מאקרו&quot; → &quot;יצוא קובץ יצווה&quot;). סמן את הקבצים להיות מיוצאים ולשמור תמונות ערוץ אדומות וירוקות בתיקיות נפרדות כקבצי TIF ( &quot;התחילו תצווה יצוא&quot;). שנה את שמות הקבצים בשני התיקיות לתת להם מספרים עוקבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבא את סדרת תמונה האדומה וירוקה לתוך תוכנה כגון Daime (ניתוח תמונה דיגיטלי באקולוגיה מיקרוביאלית) 14. לפלח את התמונות בערוץ הירוקות עם ספי בהירות נבחרו בנפרד (קטע → → הפילוח אוטומטי סף מותאם אישית). בחר את ספי בהירות בזהירות (בדרך כלל בין 20 ו -80), כך שכל חיידקים (בהיר יותר תאי מטריקס), אבל לא המטריצה ​​יוכרו כאובייקטים במהלך פילוח. אמת חזותית שהאזורים מוכרים כאובייקטים מתאימים היטב ביומסה החיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את שכבת מטרת הגרם המפולחתמונות ערוץ reen לתמונות מסלול אדום המתאימות (שכבת אובייקט העברת מגזר →). השתמש בפונקצית עורך האובייקט לדחות ולמחוק את כל אובייקטי תמונות הערוץ האדומות וירוקות. עכשיו רק את תאי מטריקס הוא עזב את התמונות ביופילם. לייצא את תמונת סדרת מעובד כקבצי TIF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבא את סדרת התמונה לתוך ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij; v.1.47). לקבוע את עוצמת הקרינה הממוצעת תמונות רקע שצולמו עם לייזר כבוי (לנתח → היסטוגרמה). הפחת את הרקע המתאים מהתמונות האדומות וירוקות (תהליך → הפחת מתמטיקת →). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדיין ImageJ, לחלק את סדרת תמונה הירוקה (G1) על ידי עצמו (מחשבון תמונת התהליך →). ואז להכפיל את סדרת תמונה המתקבלת (G2) עם סדרת תמונה הירוקה (G1). זה יניב סדרת תמונה (G3), שבו NaN מוקצה לכל הפיקסלים השייכים לאזורים שהוכרו כאובייקטי Daime. המשך ב tהוא באותו אופן עם סדרת התמונה האדומה (R1 / R1 = R2; R2 x R1 = R3). הערה: ככל ביומסה חיידקי הוסרה מהתמונות בשלב 4.3, עוצמת הניאון היא 0 באזורים אלה. שלב 4.5 יש צורך להמיר את הערך 0 עד נאן, המאפשר חישוב יחס בשלב 4.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת המסנן &#39;Mean &quot;(תהליך → מסננים → Mean; רדיוס: 1 פיקסל) כדי לפצות על רעש הגלאי. מחלק את תמונת הסדרה הירוקה ידי סדרת תמונה האדומה (מחשבון תמונת תהליך →). התוצאה הוא יחס ירוק / אדום עבור כל פיקסל הנותר במרחב התאי של התמונות. השתמש צביעת שווא עבור ייצוג גרפי של יחסים בתמונות (לוחות בדיקת → תמונה). חשב את היחס הממוצע של כל תמונה (לנתח → היסטוגרמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המר את היחסים הירוקים / אדום לערכי pH פי הפונקציה המצוידת תחת 1.9.2). הערה: דוגמא עבור נתוני כיול עקום מצויד יכולה לראות et Schlaferאל 2015 11. </li></ol>

<ol>
	<li>Hunter, R. C., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+pH-sensitive+fluoroprobe+(C-SNARF-4)+for+pH+microenvironment+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).</li><li>Takahashi, N., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caries+ecology+revisited:+microbial+dynamics+and+the+caries+process.">Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process.</a> Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).</li><li>von Ohle, O. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Revsbech, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microbial+communities+with+electrochemical+microsensors+and+microscale+biosensors.">Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors.</a> Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).</li><li>Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iridium+oxide+pH+microelectrode.">Iridium oxide pH microelectrode.</a> Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy &amp; Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+penetration+and+detection+of+pH+gradients+in+biofilms+by+two-photon+excitation+microscopy.">Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).</li><li>Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+tolerance,+proton+permeabilities,+and+membrane+ATPases+of+oral+streptococci.">Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci.</a> Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+using+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+identification+of+streptococci+and+other+bacteria+in+initial+dental+biofilm+by+confocal+laser+scanning+microscopy+and+fluorescence+in+situ+hybridization.">In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization.</a> Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+understanding+the+contribution+of+alkali+generation+in+dental+biofilms+to+inhibition+of+dental+caries.">Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries.</a> Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

ניטור מיקרוסקופי של pH ביופילם מספק מספר יתרונות, לעומת מדידות אלקטרודה או microelectrode 4-6. טכניקות מיקרוסקופיות להתיר לקבוע pH עם רזולוציה מרחבית גבוהה ולאפשר לכידה הן הדרגתיים pH אופקי ואנכי ב biofilms מבלי להפריע ביופילם מכאנית. ניסיונות קודמים של ניטור pH המיקרוסקופי, ?...

השיטה המתוארת כאן מאפשר ניטור pH תאיים biofilms שיניים בטווח שבין 4.5 ו -7, באמצעות צבע ratiometric seminaphthorhodafluor-4F 5 (ו -6) חומצה קרבוקסילית (C-SNARF-4) בשילוב עם מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal ו ניתוח תמונה דיגיטלי. צבע פלואורסצנטי המועסק הוא pH רגיש ומציג שינוי פליטתו פלורסנט בהתאם למצב של protonation. פליטת הניאון של פסגות מולקולת protonated ב 580 ננומטר, ואת פליטת מולקולת deprotonated ב 640 1 ננומטר. היחס בין עוצמות פליטת הניאון בשני חלונות זיהוי הכולל שתי פסגות הפליטה (576 - 608 ננומטר 629 - 661 ננומטר) ובכך משקפים pH בשלב הנוזלי, ללא קשר ריכוז לצבוע. עם א א PK של ~ 6.4 לצבוע מתאים לדמיין pH בסביבות חומציות מתונה. PH ב biofilms חיידקי היא בעלת חשיבות מרכזית לכל התהליכים המטבוליים.במקרה של biofilms שיניים, pH במטריצה ​​התאית הוא הגורם ארסי מפתח לפיתוח עששת. תקופות ממושכות עם pH הנמוך ביתרון ממשק ביופילם-שן להאט איבוד מינרלי האמייל הבסיסי 2. בשל הארכיטקטורה תלת-ממדי המורכבת של biofilms, מטבוליטים, כוללים חומצות אורגניות, אינם מפוזרים באופן אחיד על פני ביופילם. מאוד ופחות microenvironments acidogenic ניתן למצוא בסמיכות מרחבית קרובות 3. במשך עשרות שנים, הדרגתיים pH אנכי biofilms נרשמו בעזרת microelectrodes 4-6. בעוד שהם מציעים רזולוצית מרחבית טובה בשל גודל טיפ הקטן שלהם, הם לא מתאימים היטב כדי לפקח הדרגתיים אופקיים. יתר על כן, החדרת אלקטרודה מפריעה ביופילם מכנית. טכניקות מיקרוסקופיות פלורסנט כמוני מציעות את היתרון של ביטוי חזותי שינויי pH באזורים שונים של ביופילם ללא מכנים להפריעNCE. שדות מיקרוסקופים מבט שונים ניתן לבחור באופן חופשי צלמו שוב ושוב לאורך תקופות ממושכות 1,7-9. עם זאת, כאשר מפרשים תמונות ביופילם מיקרוסקופיות, חשוב להבחין בין הקרינה הנובעת ביומסה מיקרוביאליים הקרינה הנובעת מן המרחב התאי. בתנאים חומציים, pH בתוך תאי חיידקיים שונה pH בתוך תאי מטריקס, כמו החיידקים פעילים להעביר פרוטונים על פני קרום התא שלהם על חשבון אדנוזין אדנוזין 10. בהקשר של עששת, pH חיידקי תאיים אין השפעה ישירה על האמייל הבסיסי ואילו pH תאיים הנמוך מוביל איבוד מינרלים. מיצוע pH ב תמונות מיקרוסקופיות שמכילות הוא חיידקים ללא באזורים וחיידקים מוביל לתוצאות שגויות. השימוש כתם אחרים יחד עם צבע pH הרגיש על מנת להמחיש את ביומסה החיידקים ולבדל בין אזורי חוּץ ו תאיים מביא abאת הסיכון לזיהום הניאון של מרחב התאים ומדידות שווא 11. כתב היד הנוכחי ולכן מתאר את השימוש של צבע ratiometric ב תפקיד כפול; הן כסמן pH ו ככתם חיידקים אוניוורסלי. כמו לצבוע תלוי-מרוכזים תאים חיידקיים, השילוב של הדמיה מיקרוסקופית confocal ונוהל ניתוח תמונה דיגיטלית מדויקת מאפשר קביעת pH תאיים בטווח שבין 4.5 ו -7.0 ב biofilms שיניים דק.

<table><tbody><tr><td>Zeiss LSM 510 META</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>C-Apochromat 63X water immersion objective</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>XL Incubator</td><td>PeCON</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td><td>Life Technologies</td><td>S23920</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11344-041</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96-well black clear-bottom plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-567</td><td></td></tr><tr><td>Custom-made glass slabs (4 x 4 x 1 mm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;; 1,200 grit)</td><td>Menzel</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Alginate impression material</td><td>GC Corporation</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs</td><td>Axis Dental</td><td>LS-906</td><td></td></tr><tr><td>Orthodontic retainer containers</td><td>Spark Medical Equipment Co., Ltd</td><td>SK-WDTC01</td><td></td></tr><tr><td>Sticky wax</td><td>Dentsply</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Chewing paraffin wax&amp;nbsp;</td><td>Ivoclar Vivadent AG</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>Used during preparation of salivary solution</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m and 0.2 &amp;micro;m syringe filters</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431220; CLS431219&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>daime</td><td>University of Vienna, Austria</td><td>http://dome.csb.univie.ac.at/daime</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH, Bethesda, Maryland, USA</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr></tbody></table>

ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms

ה- pH ב biofilms חיידקים על השיניים היא בעלת חשיבות מרכזית עבור עששת, מחלה עם שכיחות ברחבי העולם גבוהה. Nutrients מטבוליטים אינם מתחלקים באופן שווה ב biofilms שיניים. גומלין מורכב של וספיחה כדי ותגובה עם חומר אורגני ביופילם מפחית השבילים דיפוזיה של מומסים ויוצר הדרגתיים תלולה של מולקולות, כוללים חומצות אורגניות, מעבר ביופילם. שיטות מיקרוסקופיות פלורסנט כמותי, כגון הדמיה זמן החיים הקרינה או pH ratiometry, יכול להיות מועסק על מנת להמחיש pH במיקרו-סביבות שונות של biofilms שיניים. pH ratiometry מנצל משמרת תלויי pH של פליטת ניאון של צבעים pH רגיש. חישוב יחס הפליטה בשני אורכי גל שונים מאפשר קביעת pH מקומית תמונות מיקרוסקופיות, ללא קשר הריכוז של הצבע. בניגוד microelectrodes הטכניקה מאפשרת ניטור הוא הדרגתי pH אנכי ואופקית בזמן אמת עםמתוך מכאני להפריע ביופילם. עם זאת, יש להקפיד להבדיל במדויק בין תאי חוּץ ו התאיים של ביופילם. הנה, לצבוע ratiometric, seminaphthorhodafluor-4F 5 (ו -6) חומצה קרבוקסילית (C-SNARF-4) הוא מועסק כדי לפקח pH תאיים in vivo גדל biofilms שיניים של הרכב מינים שאינם מוכרים. בחשיפה לגלוקוז לצבוע תלוי-המרוכז בתוך כל תאי חיידקי biofilms; הוא ובכך לשמש הוא כתם אוניברסלית חיידקים כסמן של pH התאי. לאחר רכישת תמונה מיקרוסקופית confocal, ביומסה החיידקים תוסר כל התמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה דיגיטלית, המאפשרת לחשב pH התאי באופן בלעדי. ratiometry pH עם צבע ratiometric הוא מותאם היטב כדי ללמוד pH התאי biofilms הדקה של עד 75 מיקרומטר עובי, אבל מוגבל בטווח pH בין 4.5 ו -7.0.

השיטה המוצגת מאפשרת pH תאיים ניטור טיפות במיקרו-סביבות שונות של biofilms שיניים בטווח מה PH 4.5 עד 7 בזמן אמת. אם תנאי הניסוי נבחרים כמתואר לעיל, pH מתחיל לרדת בכל התחומים של biofilms זמן קצר לאחר החשיפה לגלוקוז. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;directio...

Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms at JoVE.com

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

הדמית ratiometric של pH התאי Biofilms השיניים

לצבוע ratiometric רגיש pH משמש בשילוב עם מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal וניתוח תמונה דיגיטלית לפקח pH תאיים biofilms שיניים בזמן אמת.

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

ratiometric-imaging-of-extracellular-ph-in-dental-biofilms

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K Views.  Aarhus University.  לצבוע ratiometric רגיש pH משמש בשילוב עם מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal וניתוח תמונה דיגיטלית לפקח pH תאיים biofilms שיניים בזמן אמת. 

Video: Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

The development of fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically encoded and synthetic fluorophores with sensing abilities allowed the visualization of biologically relevant species with high spatial and temporal resolution. Synthetic dyes are of particular interest thanks to their high tunability and the wide range of measureable analytes. However, these molecules suffer several limitations related to small molecule behavior (poor solubility, difficulties in targeting, often no ratiometric imaging allowed). In this work we introduce the development of dendrimer-based sensors and present a procedure for pH measurement in vitro, in living cells and in vivo. We choose dendrimers as ideal platform for our sensors for their many desirable properties (monodispersity, tunable properties, multivalency) that made them a widely used scaffold for several biomedical devices. The conjugation of fluorescent pH indicators to the dendrimer scaffold led to an enhancement of their sensing performances. In particular dendrimers exhibit reduced cell leakage, improved intracellular targeting and allow ratiometric measurements. These novel sensors were successfully employed to measure pH in living HeLa cells and in vivo in mouse brain.

Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

Fluorescence sensors are powerful tools in life science. Here we describe a methodology to synthesize and use dendrimer-based fluorescent sensors to measure pH in living cells and in vivo. The dendritic scaffold enhances the properties of conjugated fluorescent dyes leading to improved sensing properties.

סינתזה, משלוח נייד ו<em&gt; בvivo</em&gt; יישום של חיישני pH מבוססי dendrimer

The development of  fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically  encoded and synthetic fluorophores with sensing ...

Chemistry

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

כלי אנליטי תיבת להערכת ביוכימיים, מבנית Transcriptome מקיף של Biofilms אוראלי בתיווך Mutans streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

In vitro Monitoring of Extracellular pH in Real-Time

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to chronic inflammation. Without efficient PMN clearance at sites of infiltration, PMN can accumulate and contribute to chronic inflammatory conditions, including the intestinal diseases ulcerative colitis (UC) and Crohn's Disease (CD). The pH in the distal colon in individuals with active UC can range between a pH of 5 and 6, whereas healthy individuals maintain colonic pH in the range of 6.8-7.4. Extracellular pH has been shown to influence both intestinal epithelial cells and the infiltrating immune cells. More specifically, extracellular acidosis significantly impacts PMN. At pH below 6.5, there are increases in the production of H2O2, inhibition of apoptosis, and increases in the functional lifespan of PMN. Given the significant presence of PMN and extracellular acidification at sites of inflammation, we developed a novel model that allows for the monitoring of extracellular pH during PMN transepithelial migration in real time. Here, we describe this model and how it can be utilized to measure both the apical and basal pH during PMN trafficking. This model can be utilized to monitor extracellular pH under a wide range of conditions; including, hypoxia, PMN transepithelial migration, and for extended periods of time.

<meta charset="utf8"></head><body>ניטור חוץ תאי של pH חוץ-תאי בזמן אמת

This article represents a useful in vitro assay to measure changes in extracellular pH during neutrophil (PMN) transepithelial migration (TEM)

במבחנה ניטור pH חוץ-תאי בזמן אמת

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to ...

Biochemistry

High Spatial Resolution Chemical Imaging of Implant-Associated Infections with X-ray Excited Luminescence Chemical Imaging Through Tissue

Microbial infections associated with implantable medical devices are a major concern in fracture fixation failure. Early diagnosis of such infection will allow successful eradication with antibiotics without an extra cost for a second surgery. Herein, we describe XELCI as a technique with high X-ray resolution, implant specificity, and chemical sensitivity to noninvasively image chemical concentrations near the surface of implanted medical devices. The devices are coated with chemically reporting surfaces. This chemically responsive surface consists of two layers coated on an implantable medical device; a pH-sensitive layer (bromothymol blue or bromocresol green incorporated hydrogel) which is coated over a red-light emitting scintillator (Gd2O2S: Eu) layer for monitoring. A focused X-ray beam irradiates a spot on the implant, and the red light generated by the scintillator (with 620 nm and 700 nm peaks) is transmitted through the sensing layer which alters the spectral ratio depending on the pH. An image is generated by scanning the X-ray beam across the implant and measuring the spectral ratio of light passing through the tissue point-by-point. We used this imaging technique for monitoring implant-associated infections previously on the bone surface of the femur with a modified implantable plate sensor. Now we are studying pH changes that occur from tibial intramedullary rod infections. Two different types of intramedullary rod designs are used in pre-pilot rabbit studies, and we learned that the XELCI technique could be used to monitor any chemical changes that occur not only on the bone surface but also inside the bone. Thus, this enables noninvasive, high spatial resolution, low background local pH imaging to study implant-associated infection biochemistry.

Here, we present a protocol for high-resolution optical detection of chemical information around implanted medical devices with X-ray excited luminescence chemical imaging (XELCI). This novel imaging technique is developed in our lab which enables studying implant-associated infection biochemistry.

הדמיה כימית ברזולוציה מרחבית גבוהה של זיהומים הקשורים לשתלים עם צילום רנטגן מעורר לומינסנציה הדמיה כימית דרך רקמות

Microbial infections associated with implantable medical devices are a major concern in fracture fixation failure. Early diagnosis of such infection will ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular compartment where the killing and digestion of engulfed particles take place, is the main arena for neutrophil pathogen killing that requires tight regulation. Phagosomal pH is one aspect that is carefully controlled, in turn regulating antimicrobial protease activity. Many fluorescent pH-sensitive dyes have been used to visualize the phagosomal environment. S-1 has several advantages over other pH-sensitive dyes, including its dual emission spectra, its resistance to photo-bleaching, and its high pKa. Using this method, we have demonstrated that the neutrophil phagosome is unusually alkaline in comparison to other phagocytes. By using different biochemical conjugations of the dye, the phagosome can be delineated from the cytoplasm so that changes in the size and shape of the phagosome can be assessed. This allows for further monitoring of ionic movement.

This manuscript describes a simple method to measure the phagosomal pH and area as well as the cytoplasmic pH of human and mouse neutrophils using the ratiometric indicator seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, or S-1. This is achieved using live-cell confocal fluorescence microscopy and image analysis.

הדמיה נויטרופילים Phagosome ו הציטופלסמה באמצעות אינדיקטור pH ratiometric

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, periodontitis, mucosal infections and, most notably, early childhood caries. In all of these conditions, the pH in the biofilm matrix impacts microbe-host interactions and thus the disease progression. The present protocol describes a confocal microscopy-based method to monitor pH dynamics inside cross-kingdom biofilms comprising Candida albicans and Streptococcus mutans. The pH-dependent dual-emission spectrum and the staining properties of the ratiometric probe C-SNARF-4 are exploited to determine drops in pH in extracellular areas of the biofilms. Use of pH ratiometry with the probe requires a meticulous choice of imaging parameters, a thorough calibration of the dye, and careful, threshold-based post-processing of the image data. When used correctly, the technique allows for the rapid assessment of extracellular pH in different areas of a biofilm and thus the monitoring of both horizontal and vertical pH gradients over time. While the use of confocal microscopy limits Z-profiling to thin biofilms of 75 &#181;m or less, the use of pH ratiometry is ideally suited for the noninvasive study of an important virulence factor in cross-kingdom biofilms.

The protocol describes the cultivation of cross-kingdom biofilms consisting of Candida albicans and Streptococcus mutans and presents a confocal microscopy-based method for the monitoring of extracellular pH inside these biofilms.

מעקב אחר תמציות ביומיסקופיה באמצעות מיקרוסקופ Confocal וקדי

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

PH כימות של תאיים אופטי בדרוזופילה melanogaster צנורית Malpighian Epithelia עם pH מקודד פלורסנט גנטית מחוון

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

הדמית ratiometric של pH התאי Biofilms השיניים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

סינתזה, משלוח נייד ו

כלי אנליטי תיבת להערכת ביוכימיים, מבנית Transcriptome מקיף של Biofilms אוראלי בתיווך Mutans streptococci

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

במבחנה ניטור pH חוץ-תאי בזמן אמת

במבחנה ניטור pH חוץ-תאי בזמן אמת

הדמיה כימית ברזולוציה מרחבית גבוהה של זיהומים הקשורים לשתלים עם צילום רנטגן מעורר לומינסנציה הדמיה כימית דרך רקמות

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

הדמיה נויטרופילים Phagosome ו הציטופלסמה באמצעות אינדיקטור pH ratiometric

מעקב אחר תמציות ביומיסקופיה באמצעות מיקרוסקופ Confocal וקדי

PH כימות של תאיים אופטי בדרוזופילה melanogaster צנורית Malpighian Epithelia עם pH מקודד פלורסנט גנטית מחוון