Los autores desean agradecer a Javier E. García y Lene Grønkjær para la asistencia técnica y Merete K. Raarup para un debate fructífero. Este trabajo fue financiado por la Fundación de Investigación de la Universidad de Aarhus y la Fundación Simon Spies.

El protocolo experimental fue revisado y aprobado por el Comité de Ética del Condado de Aarhus (M-20100032). 1. confocal microscópica de calibración radiométrica del tinte <ol><li> Para la adquisición de imágenes, usar un microscopio invertido confocal equipado con una incubadora, un objetivo de inmersión en agua apertura 63X / 1.2-numérico, una línea láser de 543 nm y un detector de META. </li><li> Preparar tampón HEPES soluciones madre (50 mM, ajustado a pH 4.5 a 8.5 en pasos de 0,1 unidades de pH). Pipetear 100 l de cada solución en los pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo transparente para microscopía fluorescente. </li><li> Use guantes de nitrilo al manipular el medio de contraste radiométrico C-SNARF-4. Preparar una solución madre 1 mM del colorante en sulfóxido de dimetilo. Añadir 5 l de la solución madre a cada pocillo con tampón HEPES. Coloque la placa de 96 pocillos en el microscopio. </li><li> Encienda el microscopio. Abra el software de microscopio. Haga clic en los siguientes paneles: Adquirir → Laser; Adquirir → MICRO; Adquirir → Config; Adquirir → Scan; Adquirir → escenario. Calentar la incubadora a 37 ° C. </li><li> Encienda la línea de láser 543 nm haciendo clic en el láser de 543 nm y el botón &quot;Sí&quot; en la ventana &quot;Control de láser&quot;. Elija el objetivo de inmersión en agua apertura 63X / 1.2-numérico en la ventana &quot;Control microscopio&quot;. </li><li> Ajuste el detector de META para monitorear simultáneamente fluorescencia dentro de 576- a 608-nm (verde) y 629- a 661 nm (rojo) intervalos ( &quot;Control de Configuración&quot; → &quot;ChS&quot;). Ajustar la potencia del láser ( &quot;Control de Configuración&quot; → &quot;excitación&quot;). Ajuste el agujero de alfiler para dar un grosor de corte óptico de 1,6 micras ( &quot;Scan Control&quot; → &quot;agujero de alfiler&quot;). </li><li> Adquirir una imagen de cada solución tampón de HEPES, 5 m por encima del fondo de cristal de la placa de 96 pocillos. Nota: Tan pronto como el plano de enfoque se sitúa por debajo del fondo de cristal, no hay luz fluorescente puede ser vistoen la pantalla. Después de cada tercera imagen, ajustar la potencia del láser a cero y tomar una imagen de la sustracción del fondo. </li><li> Realizar el experimento de calibración por triplicado (1,2-1,7). </li><li> Determinar la intensidad de fluorescencia media y la desviación estándar en todas las imágenes rojas y verdes. <ol><li> Calcular la relación R y el error estándar de la media, S R, para cada imagen de acuerdo con las ecuaciones (1) y (2) (1) <img alt="ecuación1" src="/files/ftp_upload/53622/53622equation1.jpg" /> (2) <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/53622/53622equation2.jpg" /> g, r, s g r y s son los promedios y las desviaciones estándar en las respectivas imágenes de verde y rojo. b g, b R, S y BG s br son los valores correspondientes para las imágenes de fondo. n <em&gt; 2 es el número de píxeles de imágenes. </li><li> Trazar las relaciones calculadas para cada valor de pH de los tres experimentos de calibración se replican en un diagrama y construir una curva ajustada de esta serie de puntos de datos (es decir, utilizando el software Sigma Plot 13). Hacer una función matemática de la curva ajustada que puede convertir fracciones en valores de pH 10. </li></ol></li></ol> 2. Recogida de muestras in situ Grown Dental Biofilm <ol><li> Seleccionar voluntarios que cumplen los criterios de inclusión y exclusión relevantes para el estudio. Hacer impresiones de alginato de la arcada dentaria superior e inferior. Hacer modelos de yeso de estas impresiones y fabricar una férula de acrílico en el maxilar inferior. El diseño de la férula con bridas de acrílico bucales conectadas por un alambre de ortodoncia lingual, que permite al voluntario para morder en una oclusión normal 12. </li><li> Recesiones agujeros en las bridas bucales de la férula acrílica (Figura 1 </strong&gt;) Con la ayuda de fresas de acrílico dental para permitir la inserción de los ladrillos de vidrio para la recogida de biofilm. La profundidad de las recesiones debe ser de al menos 1,5 mm, mientras que la anchura y la longitud de las recesiones pueden variar en función del número de los ladrillos de vidrio que debe insertarse. </li><li> Para la recolección de biofilm, los usos finales hechos a la medida no fluorescentes de vidrio (4 x 4 x 1 mm 3) con una rugosidad superficial de grano 1200 con el fin de imitar el patrón de colonización en esmalte natural 11. </li><li> Esterilizar las planchas de vidrio por tratamiento en autoclave antes del montaje. Montar las placas de vidrio con cera pegajosa en las depresiones en las bridas bucal de cada lado un poco empotradas a la superficie de la superficie acrílica con el fin de proteger el biofilm de las fuerzas de corte ejercidas por el movimiento de las mejillas 11. Nota: El número de los ladrillos de vidrio colocados en una recesión puede variar entre 3 y 14, dependiendo del objetivo del estudio. </li><li> Insertar el aparato en la boca del voluntario. Instruir a la voluntaTeer para retener el aparato intra-oral durante todo el período experimental. Instruya al voluntario que guarde el aparato en un recipiente retenedor de ortodoncia con un trozo de tejido de papel húmeda (para mantenerlo húmedo) a temperatura ambiente durante el cepillado de los dientes y la ingesta de alimentos y bebidas que no sean agua. Dar instrucciones al voluntario para que no toque las bridas de acrílico bucales con los ladrillos de vidrio, mientras que la colocación o retirada del aparato. Nota: El período experimental puede variar en función del objetivo del estudio (un día a varias semanas). </li><li> Retirar con cuidado las placas de vidrio del aparato al final del periodo experimental. Eliminar la cera adhesiva alrededor de las losas con un cuchillo y transferirlos con un par de pinzas para un recipiente cerrado, el biofilm hacia arriba, hasta que el análisis microscópico. Mantener el envase húmedo con un pañuelo de papel mojado. Realizar las imágenes de pH dentro de pocas horas después de la recogida de biopelículas. </li></ol> 3. El biofilm pH Imaging <ol><li> Prepararsolución salival mediante la adición de ditiotreitol a la saliva recogida de acuerdo con el método de de Jong et al. 13. Valorar la solución salival a pH 7,0 y añadir glucosa a una concentración de 0,4% (vol peso /). Pipeta de 100 l por biopelícula a analizar en una placa de 96 pocillos con fondo de vidrio para microscopía. Añadir 5 l de colorante radiométrica por pocillo. </li><li> Coloque la placa de 96 pocillos sobre la platina del microscopio. Encienda el microscopio y la línea láser de 543 nm. Calentar la incubadora a 37 ° C. Usar los mismos ajustes del microscopio utilizado para la calibración del colorante (consulte los pasos 1.5-1.6). Espere durante 30 minutos, hasta que la placa de 96 pocillos se ha alcanzado la temperatura de trabajo. </li><li> Recoger una o más planchas de vidrio con un conjunto de pinzas delgada y colocarlos en los pozos llenos de saliva, una losa por pozo, con las biopelículas hacia abajo. </li><li> Adquirir imágenes individuales ( &quot;Scan Control&quot; → &quot;único&quot;) o z-pilas ( &quot;Scan Control&quot; → &quot;Inicio&quot;) spanning de la profundidad de los biofilms en diferentes áreas. Adquirir z-pilas elegir el número de cortes para formar una imagen ( &quot;Scan Control&quot; → &quot;Ajustes Z&quot; → &quot;Num rebanadas&quot;) y marque la posición z para el primero y el último corte en el software del microscopio ( &quot;Scan Control &quot;→&quot; Ajustes Z &quot;→&quot; Mark primero &quot;;&quot; Marcar el último &quot;). Nota: Z-pilas con una profundidad de hasta 75 micras pueden ser adquiridos con un buen contraste entre las zonas extracelulares e intracelulares. </li><li> Para seguir los cambios de pH en un campo microscópico de vista con el tiempo, marcar la posición xy en el software del microscopio ( &quot;Stage y Control de enfoque&quot; → &quot;Mark Pos&quot;) y tomar imágenes repetidas en puntos de tiempo consecutivos ( &quot;Scan Control&quot; → &quot; Soltero&quot;). Regularmente tomar imágenes con la potencia del láser se establece en cero para la sustracción de fondo. </li></ol> 4. Análisis de Imágenes Digitales <ol><li> para export las imágenes microscópicas como archivos TIF, utilizar el archivo por lotes de exportación del software de microscopio ( &quot;macro&quot; → &quot;archivos por lotes de exportación&quot;). Marque los archivos que desea exportar y guardar imágenes de los canales rojo y verde en carpetas separadas como archivos TIF ( &quot;Iniciar lotes de exportación&quot;). Cambiar el nombre de los archivos en las carpetas que les dan los números secuenciales. </li><li> Importe la imagen de la serie roja y verde en el software como Daime (análisis digital de imagen en la ecología microbiana) 14. Segmento de las imágenes del canal verde con umbrales elegidos individualmente brillo (segmento → → segmentación automática de umbral de encargo). Elija los umbrales de luminosidad con cuidado (típicamente entre 20 y 80), de manera que todas las bacterias (más brillante que la matriz extracelular), pero no la matriz serán reconocidos como objetos durante la segmentación. Verificar visualmente que las áreas reconocidas como objetos corresponden bien a la biomasa bacteriana. </li><li> La transferencia de la capa de objetos de la g segmentadoreen imágenes de los canales correspondientes a las imágenes del canal rojo (Segmento → Transferencia de capa de objeto). Utilice la función de editor de objetos de rechazar y eliminar todos los objetos en las imágenes de los canales rojo y verde. Ahora solamente la matriz extracelular se deja en las imágenes de biofilm. Exportar la serie de imágenes procesadas como archivos TIF. </li><li> Importar la serie de imágenes en ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij; v.1.47). Determinar la intensidad media de fluorescencia en las imágenes de fondo tomadas con el láser apagado (Analizar → Histograma). Restar el fondo apropiada de las imágenes rojas y verdes (Proceso → Matemáticas → Restar). </li><li> Todavía en ImageJ, dividir la serie de imágenes verde (G1) por sí mismo (Proceso → calculadora de imagen). Entonces multiplicar la serie de imagen resultante (G2) con la serie de imágenes verde (G1). Esto dará lugar a una serie de imágenes (G3), donde NaN se asigna a todos los píxeles que pertenecen a áreas que fueron reconocidos como objetos en el Daime. Proceder de tél mismo con la serie de imágenes de color rojo (R1 / R1 = R2; R2 x R1 = R3). Nota: Como la biomasa bacteriana se eliminó de las imágenes en el paso 4.3, la intensidad fluorescente es 0 en estas áreas. Paso 4.5 es necesario convertir el valor 0 a NaN, que permite cálculo de la relación en el paso 4.6. </li><li> Aplicar el filtro &#39;Mean&#39; (Proceso → → Filtros media; radio: 1 píxel) para compensar el ruido del detector. Dividir la serie de imágenes verde por la imagen de la serie roja (Proceso → calculadora de imagen). Esto resulta en una relación de verde / rojo para cada pixel que queda en el espacio extracelular de las imágenes. Utilizar mapeos de colores para la representación gráfica de las proporciones de las imágenes (cuadros de imagen → de búsqueda). Calcular la relación media para cada imagen (→ Analizar histograma). </li><li> Convertir los coeficientes de verde / rojo a valores de pH de acuerdo con la función ajustada bajo 1.9.2). Nota: Un ejemplo de datos de calibración y curva ajustada se puede ver en Schlafer etal, 2015 11. </li></ol>

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	<li>Hunter, R. C., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+pH-sensitive+fluoroprobe+(C-SNARF-4)+for+pH+microenvironment+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).</li><li>Takahashi, N., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caries+ecology+revisited:+microbial+dynamics+and+the+caries+process.">Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process.</a> Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).</li><li>von Ohle, O. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Revsbech, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microbial+communities+with+electrochemical+microsensors+and+microscale+biosensors.">Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors.</a> Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).</li><li>Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iridium+oxide+pH+microelectrode.">Iridium oxide pH microelectrode.</a> Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy &amp; Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+penetration+and+detection+of+pH+gradients+in+biofilms+by+two-photon+excitation+microscopy.">Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).</li><li>Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+tolerance,+proton+permeabilities,+and+membrane+ATPases+of+oral+streptococci.">Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci.</a> Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+using+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+identification+of+streptococci+and+other+bacteria+in+initial+dental+biofilm+by+confocal+laser+scanning+microscopy+and+fluorescence+in+situ+hybridization.">In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization.</a> Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+understanding+the+contribution+of+alkali+generation+in+dental+biofilms+to+inhibition+of+dental+caries.">Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries.</a> Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Monitoreo microscópico de pH biofilm proporciona varias ventajas, en comparación con los electrodos o microelectrodos mediciones 4-6. técnicas microscópicas permiten determinar el pH con una alta resolución espacial y permitir la captura de gradientes de pH, tanto horizontales como verticales en biofilms sin perturbar el biofilm mecánicamente. Los intentos previos de monitoreo del pH microscópico, sin embargo, no pudieron diferenciar entre pH extracelular e intracelular en las biopelículas 1,7,9....

El método aquí descrito permite el seguimiento de pH extracelular en biofilms dentales en el intervalo entre 4,5 y 7, usando el colorante radiométrica seminaphthorhodafluor-4F 5- (y-6) ácido carboxílico (C-SNARF-4) en combinación con microscopía confocal de barrido láser y análisis de imagen digital. El colorante fluorescente empleado es sensible al pH y muestra un cambio en su emisión fluorescente en función del estado de protonación. La emisión fluorescente de los picos de moléculas protonadas en 580 nm, y la emisión de la molécula desprotonado a 640 nm 1. La relación de las intensidades de emisión fluorescente en dos ventanas de detección que comprende los dos picos de emisión (576-608 nm y 629-661 nm) refleja así pH en la fase líquida, con independencia de la concentración de colorante. Con un pK a de ~ 6,4 el colorante es adecuado para visualizar pH en ambientes moderadamente ácidas. PH en las biopelículas bacterianas es de vital importancia para todos los procesos metabólicos.En el caso de biofilms dentales, pH en la matriz extracelular es el factor de virulencia clave para el desarrollo de la caries dental. Los períodos prolongados con un pH bajo en la interfaz de plomo-biopelícula dental para frenar la desmineralización del esmalte subyacente 2. Debido a la compleja arquitectura tridimensional de biofilms, metabolitos, incluyendo ácidos orgánicos, no se distribuyen uniformemente a través de la biopelícula. Altamente y menos microambientes acidogénicas se pueden encontrar en estrecha proximidad espacial 3. Durante décadas, los gradientes de pH verticales en biofilms se registraron con la ayuda de microelectrodos 4-6. Mientras que ofrecen una buena resolución espacial debido a su pequeño tamaño de la punta, no son muy adecuados para controlar los gradientes horizontales. Por otra parte, la inserción del electrodo perturba el biofilm mecánicamente. Cuantitativos técnicas microscópicas fluorescentes ofrecen la ventaja de visualizar los cambios de pH en las diferentes áreas de un biofilm sin interferir mecánicana vez. Diferentes campos microscópicos de vista se pueden seleccionar libremente y la imagen varias veces durante periodos prolongados 1,7-9. Sin embargo, al interpretar imágenes microscópicas de biofilm, es importante distinguir entre la fluorescencia que deriva de la biomasa microbiana y la fluorescencia derivada del espacio extracelular. En condiciones ácidas, el pH dentro de las células bacterianas es diferente de pH en la matriz extracelular, como las bacterias transportan activamente protones a través de su membrana celular a expensas de trifosfato de adenosina 10. En el contexto de la caries dental, pH intracelular bacteriana no tiene un impacto directo sobre el esmalte mientras que subyacen bajo pH extracelular conduce a la desmineralización. Un promedio de pH en imágenes microscópicas que contienen ambas áreas y bacterias libres de bacterias conduce a resultados erróneos. El uso de otros a lo largo de las manchas con el colorante sensible al pH con el fin de visualizar la biomasa bacteriana y diferenciar entre las áreas extra e intracelulares trae abel riesgo de contaminación fluorescente del espacio extracelular y mediciones falsas 11. Por consiguiente, la presente manuscrito describe el uso del colorante radiométrico en una doble función; tanto como un marcador de pH y como una mancha bacteriana universal. A medida que el tinte es up-concentra en las células bacterianas, la combinación de imágenes microscópicas confocal y un procedimiento de análisis de imagen digital precisa permite la determinación de pH extracelular en el intervalo entre 4,5 y 7,0 en las biopelículas dentales delgados.

<table><tbody><tr><td>Zeiss LSM 510 META</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>C-Apochromat 63X water immersion objective</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>XL Incubator</td><td>PeCON</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td><td>Life Technologies</td><td>S23920</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11344-041</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96-well black clear-bottom plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-567</td><td></td></tr><tr><td>Custom-made glass slabs (4 x 4 x 1 mm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;; 1,200 grit)</td><td>Menzel</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Alginate impression material</td><td>GC Corporation</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs</td><td>Axis Dental</td><td>LS-906</td><td></td></tr><tr><td>Orthodontic retainer containers</td><td>Spark Medical Equipment Co., Ltd</td><td>SK-WDTC01</td><td></td></tr><tr><td>Sticky wax</td><td>Dentsply</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Chewing paraffin wax&amp;nbsp;</td><td>Ivoclar Vivadent AG</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>Used during preparation of salivary solution</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m and 0.2 &amp;micro;m syringe filters</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431220; CLS431219&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>daime</td><td>University of Vienna, Austria</td><td>http://dome.csb.univie.ac.at/daime</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH, Bethesda, Maryland, USA</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr></tbody></table>

ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms

El pH en las biopelículas bacterianas en los dientes es de importancia central para la caries dental, una enfermedad con una alta prevalencia en todo el mundo. Los nutrientes y metabolitos no se distribuyen uniformemente en las biopelículas dentales. Una compleja interacción de sorción para y la reacción con la materia orgánica en la biopelícula reduce los caminos de difusión de solutos y crea gradientes empinados de moléculas reactivas, incluyendo ácidos orgánicos, a través de la biopelícula. métodos microscópicos fluorescentes cuantitativos, tales como formación de imágenes tiempo de vida de fluorescencia o ratiometry pH, se pueden emplear para visualizar pH en diferentes microambientes de biofilms dentales. ratiometry pH explota un cambio dependiente del pH en la emisión fluorescente de los colorantes sensibles al pH. Cálculo de la relación de emisión a dos longitudes de onda diferentes permite determinar pH local en imágenes microscópicas, independientemente de la concentración del colorante. Contrariamente a la técnica de microelectrodos permite la monitorización ambos gradientes de pH verticales y horizontales, en tiempo real conperturbar mecánicamente el biofilm. Sin embargo, se debe tener cuidado para diferenciar con precisión entre los compartimentos extra e intracelulares de la biopelícula. Aquí, el colorante radiométrica, seminaphthorhodafluor 4F-5- (y 6) el ácido carboxílico (C-SNARF-4) se emplea para controlar el pH extracelular en vivo en los biofilms dentales cultivadas de la composición de especies desconocidas. Tras la exposición a la glucosa es el colorante concentrado hasta el interior de todas las células bacterianas en las biopelículas; se utiliza de este modo tanto como una mancha bacteriana universal y como un marcador de pH extracelular. Después de la adquisición de imagen microscópica confocal, la biomasa bacteriana se elimina de todas las imágenes utilizando software de análisis de imagen digital, que permite calcular exclusivamente pH extracelular. ratiometry pH con el colorante radiométrico es muy adecuado para estudiar pH extracelular en biofilms delgadas de hasta 75 m de espesor, pero está limitado al intervalo de pH entre 4,5 y 7,0.

El método presentado permite la monitorización extracelular pH cae en diferentes microambientes de biofilms dentales en el intervalo de pH de 4,5 a 7, en tiempo real. Si se eligen las condiciones experimentales como se ha descrito anteriormente, el pH comienza a caer en todas las áreas de las biopelículas poco después de la exposición a la glucosa. Cuando el pH en un biofilm gotas, las células bacterianas se hacen visib...

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Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Imaging radiométrica de pH extracelular en los biofilms dentales

Un colorante radiométrica sensible al pH se usa en combinación con microscopía confocal de barrido láser y análisis digital de imágenes para monitorizar el pH extracelular en biofilms dentales, en tiempo real.

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

ratiometric-imaging-of-extracellular-ph-in-dental-biofilms

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K vistas.  Aarhus University.  Un colorante radiométrica sensible al pH se usa en combinación con microscopía confocal de barrido láser y análisis digital de imágenes para monitorizar el pH extracelular en biofilms dentales, en tiempo real. 

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Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

The development of fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically encoded and synthetic fluorophores with sensing abilities allowed the visualization of biologically relevant species with high spatial and temporal resolution. Synthetic dyes are of particular interest thanks to their high tunability and the wide range of measureable analytes. However, these molecules suffer several limitations related to small molecule behavior (poor solubility, difficulties in targeting, often no ratiometric imaging allowed). In this work we introduce the development of dendrimer-based sensors and present a procedure for pH measurement in vitro, in living cells and in vivo. We choose dendrimers as ideal platform for our sensors for their many desirable properties (monodispersity, tunable properties, multivalency) that made them a widely used scaffold for several biomedical devices. The conjugation of fluorescent pH indicators to the dendrimer scaffold led to an enhancement of their sensing performances. In particular dendrimers exhibit reduced cell leakage, improved intracellular targeting and allow ratiometric measurements. These novel sensors were successfully employed to measure pH in living HeLa cells and in vivo in mouse brain.

Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

Fluorescence sensors are powerful tools in life science. Here we describe a methodology to synthesize and use dendrimer-based fluorescent sensors to measure pH in living cells and in vivo. The dendritic scaffold enhances the properties of conjugated fluorescent dyes leading to improved sensing properties.

Síntesis, Entrega y Celular<em&gt; En vivo</em&gt; Aplicación de sensores de pH basadas en dendrímeros

The development of  fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically  encoded and synthetic fluorophores with sensing ...

Investigación

Química

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

Una analítica Caja de Herramientas para la Evaluación Integral de bioquímica, estructural y transcriptoma de biopelículas oral mediada por Streptococcus mutans

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Inmunología e Infección

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

In vitro Monitoring of Extracellular pH in Real-Time

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to chronic inflammation. Without efficient PMN clearance at sites of infiltration, PMN can accumulate and contribute to chronic inflammatory conditions, including the intestinal diseases ulcerative colitis (UC) and Crohn's Disease (CD). The pH in the distal colon in individuals with active UC can range between a pH of 5 and 6, whereas healthy individuals maintain colonic pH in the range of 6.8-7.4. Extracellular pH has been shown to influence both intestinal epithelial cells and the infiltrating immune cells. More specifically, extracellular acidosis significantly impacts PMN. At pH below 6.5, there are increases in the production of H2O2, inhibition of apoptosis, and increases in the functional lifespan of PMN. Given the significant presence of PMN and extracellular acidification at sites of inflammation, we developed a novel model that allows for the monitoring of extracellular pH during PMN transepithelial migration in real time. Here, we describe this model and how it can be utilized to measure both the apical and basal pH during PMN trafficking. This model can be utilized to monitor extracellular pH under a wide range of conditions; including, hypoxia, PMN transepithelial migration, and for extended periods of time.

<meta charset="utf8"></head><body>Monitorización in vitro del pH extracelular en tiempo real

This article represents a useful in vitro assay to measure changes in extracellular pH during neutrophil (PMN) transepithelial migration (TEM)

In vitro Monitorización del pH extracelular en tiempo real

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to ...

Bioquímica

High Spatial Resolution Chemical Imaging of Implant-Associated Infections with X-ray Excited Luminescence Chemical Imaging Through Tissue

Microbial infections associated with implantable medical devices are a major concern in fracture fixation failure. Early diagnosis of such infection will allow successful eradication with antibiotics without an extra cost for a second surgery. Herein, we describe XELCI as a technique with high X-ray resolution, implant specificity, and chemical sensitivity to noninvasively image chemical concentrations near the surface of implanted medical devices. The devices are coated with chemically reporting surfaces. This chemically responsive surface consists of two layers coated on an implantable medical device; a pH-sensitive layer (bromothymol blue or bromocresol green incorporated hydrogel) which is coated over a red-light emitting scintillator (Gd2O2S: Eu) layer for monitoring. A focused X-ray beam irradiates a spot on the implant, and the red light generated by the scintillator (with 620 nm and 700 nm peaks) is transmitted through the sensing layer which alters the spectral ratio depending on the pH. An image is generated by scanning the X-ray beam across the implant and measuring the spectral ratio of light passing through the tissue point-by-point. We used this imaging technique for monitoring implant-associated infections previously on the bone surface of the femur with a modified implantable plate sensor. Now we are studying pH changes that occur from tibial intramedullary rod infections. Two different types of intramedullary rod designs are used in pre-pilot rabbit studies, and we learned that the XELCI technique could be used to monitor any chemical changes that occur not only on the bone surface but also inside the bone. Thus, this enables noninvasive, high spatial resolution, low background local pH imaging to study implant-associated infection biochemistry.

Here, we present a protocol for high-resolution optical detection of chemical information around implanted medical devices with X-ray excited luminescence chemical imaging (XELCI). This novel imaging technique is developed in our lab which enables studying implant-associated infection biochemistry.

Imágenes químicas de alta resolución espacial de infecciones asociadas a implantes con imágenes químicas de luminiscencia excitada por rayos X a través de tejidos

Microbial infections associated with implantable medical devices are a major concern in fracture fixation failure. Early diagnosis of such infection will ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Un nuevo método para el análisis cualitativo multi-escala de biopelículas bacterianas en filamentosa fúngica Colonias Utilizando microscopía confocal y electrónica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular compartment where the killing and digestion of engulfed particles take place, is the main arena for neutrophil pathogen killing that requires tight regulation. Phagosomal pH is one aspect that is carefully controlled, in turn regulating antimicrobial protease activity. Many fluorescent pH-sensitive dyes have been used to visualize the phagosomal environment. S-1 has several advantages over other pH-sensitive dyes, including its dual emission spectra, its resistance to photo-bleaching, and its high pKa. Using this method, we have demonstrated that the neutrophil phagosome is unusually alkaline in comparison to other phagocytes. By using different biochemical conjugations of the dye, the phagosome can be delineated from the cytoplasm so that changes in the size and shape of the phagosome can be assessed. This allows for further monitoring of ionic movement.

This manuscript describes a simple method to measure the phagosomal pH and area as well as the cytoplasmic pH of human and mouse neutrophils using the ratiometric indicator seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, or S-1. This is achieved using live-cell confocal fluorescence microscopy and image analysis.

Imágenes de la Neutrófilos Fagosoma y el citoplasma usando un indicador de pH Ratiometric

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, periodontitis, mucosal infections and, most notably, early childhood caries. In all of these conditions, the pH in the biofilm matrix impacts microbe-host interactions and thus the disease progression. The present protocol describes a confocal microscopy-based method to monitor pH dynamics inside cross-kingdom biofilms comprising Candida albicans and Streptococcus mutans. The pH-dependent dual-emission spectrum and the staining properties of the ratiometric probe C-SNARF-4 are exploited to determine drops in pH in extracellular areas of the biofilms. Use of pH ratiometry with the probe requires a meticulous choice of imaging parameters, a thorough calibration of the dye, and careful, threshold-based post-processing of the image data. When used correctly, the technique allows for the rapid assessment of extracellular pH in different areas of a biofilm and thus the monitoring of both horizontal and vertical pH gradients over time. While the use of confocal microscopy limits Z-profiling to thin biofilms of 75 &#181;m or less, the use of pH ratiometry is ideally suited for the noninvasive study of an important virulence factor in cross-kingdom biofilms.

The protocol describes the cultivation of cross-kingdom biofilms consisting of Candida albicans and Streptococcus mutans and presents a confocal microscopy-based method for the monitoring of extracellular pH inside these biofilms.

Monitoreo del pH extracelular en biopelículas entre reinos mediante microscopía confocal

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

Óptica pH cuantificación de intracelular en epitelios de túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster con fluorescentes genéticamente codificado pH indicador

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Imaging radiométrica de pH extracelular en los biofilms dentales

Resumen

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Síntesis, Entrega y Celular

Una analítica Caja de Herramientas para la Evaluación Integral de bioquímica, estructural y transcriptoma de biopelículas oral mediada por Streptococcus mutans

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

In vitro Monitorización del pH extracelular en tiempo real

In vitro Monitorización del pH extracelular en tiempo real

Imágenes químicas de alta resolución espacial de infecciones asociadas a implantes con imágenes químicas de luminiscencia excitada por rayos X a través de tejidos

Un nuevo método para el análisis cualitativo multi-escala de biopelículas bacterianas en filamentosa fúngica Colonias Utilizando microscopía confocal y electrónica

Imágenes de la Neutrófilos Fagosoma y el citoplasma usando un indicador de pH Ratiometric

Monitoreo del pH extracelular en biopelículas entre reinos mediante microscopía confocal

Óptica pH cuantificación de intracelular en epitelios de túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster con fluorescentes genéticamente codificado pH indicador