Los autores desean agradecer a Javier E. García y Lene Grønkjær para la asistencia técnica y Merete K. Raarup para un debate fructífero. Este trabajo fue financiado por la Fundación de Investigación de la Universidad de Aarhus y la Fundación Simon Spies.

El protocolo experimental fue revisado y aprobado por el Comité de Ética del Condado de Aarhus (M-20100032). 1. confocal microscópica de calibración radiométrica del tinte <ol><li> Para la adquisición de imágenes, usar un microscopio invertido confocal equipado con una incubadora, un objetivo de inmersión en agua apertura 63X / 1.2-numérico, una línea láser de 543 nm y un detector de META. </li><li> Preparar tampón HEPES soluciones madre (50 mM, ajustado a pH 4.5 a 8.5 en pasos de 0,1 unidades de pH). Pipetear 100 l de cada solución en los pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo transparente para microscopía fluorescente. </li><li> Use guantes de nitrilo al manipular el medio de contraste radiométrico C-SNARF-4. Preparar una solución madre 1 mM del colorante en sulfóxido de dimetilo. Añadir 5 l de la solución madre a cada pocillo con tampón HEPES. Coloque la placa de 96 pocillos en el microscopio. </li><li> Encienda el microscopio. Abra el software de microscopio. Haga clic en los siguientes paneles: Adquirir → Laser; Adquirir → MICRO; Adquirir → Config; Adquirir → Scan; Adquirir → escenario. Calentar la incubadora a 37 ° C. </li><li> Encienda la línea de láser 543 nm haciendo clic en el láser de 543 nm y el botón &quot;Sí&quot; en la ventana &quot;Control de láser&quot;. Elija el objetivo de inmersión en agua apertura 63X / 1.2-numérico en la ventana &quot;Control microscopio&quot;. </li><li> Ajuste el detector de META para monitorear simultáneamente fluorescencia dentro de 576- a 608-nm (verde) y 629- a 661 nm (rojo) intervalos ( &quot;Control de Configuración&quot; → &quot;ChS&quot;). Ajustar la potencia del láser ( &quot;Control de Configuración&quot; → &quot;excitación&quot;). Ajuste el agujero de alfiler para dar un grosor de corte óptico de 1,6 micras ( &quot;Scan Control&quot; → &quot;agujero de alfiler&quot;). </li><li> Adquirir una imagen de cada solución tampón de HEPES, 5 m por encima del fondo de cristal de la placa de 96 pocillos. Nota: Tan pronto como el plano de enfoque se sitúa por debajo del fondo de cristal, no hay luz fluorescente puede ser vistoen la pantalla. Después de cada tercera imagen, ajustar la potencia del láser a cero y tomar una imagen de la sustracción del fondo. </li><li> Realizar el experimento de calibración por triplicado (1,2-1,7). </li><li> Determinar la intensidad de fluorescencia media y la desviación estándar en todas las imágenes rojas y verdes. <ol><li> Calcular la relación R y el error estándar de la media, S R, para cada imagen de acuerdo con las ecuaciones (1) y (2) (1) <img alt="ecuación1" src="/files/ftp_upload/53622/53622equation1.jpg" /> (2) <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/53622/53622equation2.jpg" /> g, r, s g r y s son los promedios y las desviaciones estándar en las respectivas imágenes de verde y rojo. b g, b R, S y BG s br son los valores correspondientes para las imágenes de fondo. n <em&gt; 2 es el número de píxeles de imágenes. </li><li> Trazar las relaciones calculadas para cada valor de pH de los tres experimentos de calibración se replican en un diagrama y construir una curva ajustada de esta serie de puntos de datos (es decir, utilizando el software Sigma Plot 13). Hacer una función matemática de la curva ajustada que puede convertir fracciones en valores de pH 10. </li></ol></li></ol> 2. Recogida de muestras in situ Grown Dental Biofilm <ol><li> Seleccionar voluntarios que cumplen los criterios de inclusión y exclusión relevantes para el estudio. Hacer impresiones de alginato de la arcada dentaria superior e inferior. Hacer modelos de yeso de estas impresiones y fabricar una férula de acrílico en el maxilar inferior. El diseño de la férula con bridas de acrílico bucales conectadas por un alambre de ortodoncia lingual, que permite al voluntario para morder en una oclusión normal 12. </li><li> Recesiones agujeros en las bridas bucales de la férula acrílica (Figura 1 </strong&gt;) Con la ayuda de fresas de acrílico dental para permitir la inserción de los ladrillos de vidrio para la recogida de biofilm. La profundidad de las recesiones debe ser de al menos 1,5 mm, mientras que la anchura y la longitud de las recesiones pueden variar en función del número de los ladrillos de vidrio que debe insertarse. </li><li> Para la recolección de biofilm, los usos finales hechos a la medida no fluorescentes de vidrio (4 x 4 x 1 mm 3) con una rugosidad superficial de grano 1200 con el fin de imitar el patrón de colonización en esmalte natural 11. </li><li> Esterilizar las planchas de vidrio por tratamiento en autoclave antes del montaje. Montar las placas de vidrio con cera pegajosa en las depresiones en las bridas bucal de cada lado un poco empotradas a la superficie de la superficie acrílica con el fin de proteger el biofilm de las fuerzas de corte ejercidas por el movimiento de las mejillas 11. Nota: El número de los ladrillos de vidrio colocados en una recesión puede variar entre 3 y 14, dependiendo del objetivo del estudio. </li><li> Insertar el aparato en la boca del voluntario. Instruir a la voluntaTeer para retener el aparato intra-oral durante todo el período experimental. Instruya al voluntario que guarde el aparato en un recipiente retenedor de ortodoncia con un trozo de tejido de papel húmeda (para mantenerlo húmedo) a temperatura ambiente durante el cepillado de los dientes y la ingesta de alimentos y bebidas que no sean agua. Dar instrucciones al voluntario para que no toque las bridas de acrílico bucales con los ladrillos de vidrio, mientras que la colocación o retirada del aparato. Nota: El período experimental puede variar en función del objetivo del estudio (un día a varias semanas). </li><li> Retirar con cuidado las placas de vidrio del aparato al final del periodo experimental. Eliminar la cera adhesiva alrededor de las losas con un cuchillo y transferirlos con un par de pinzas para un recipiente cerrado, el biofilm hacia arriba, hasta que el análisis microscópico. Mantener el envase húmedo con un pañuelo de papel mojado. Realizar las imágenes de pH dentro de pocas horas después de la recogida de biopelículas. </li></ol> 3. El biofilm pH Imaging <ol><li> Prepararsolución salival mediante la adición de ditiotreitol a la saliva recogida de acuerdo con el método de de Jong et al. 13. Valorar la solución salival a pH 7,0 y añadir glucosa a una concentración de 0,4% (vol peso /). Pipeta de 100 l por biopelícula a analizar en una placa de 96 pocillos con fondo de vidrio para microscopía. Añadir 5 l de colorante radiométrica por pocillo. </li><li> Coloque la placa de 96 pocillos sobre la platina del microscopio. Encienda el microscopio y la línea láser de 543 nm. Calentar la incubadora a 37 ° C. Usar los mismos ajustes del microscopio utilizado para la calibración del colorante (consulte los pasos 1.5-1.6). Espere durante 30 minutos, hasta que la placa de 96 pocillos se ha alcanzado la temperatura de trabajo. </li><li> Recoger una o más planchas de vidrio con un conjunto de pinzas delgada y colocarlos en los pozos llenos de saliva, una losa por pozo, con las biopelículas hacia abajo. </li><li> Adquirir imágenes individuales ( &quot;Scan Control&quot; → &quot;único&quot;) o z-pilas ( &quot;Scan Control&quot; → &quot;Inicio&quot;) spanning de la profundidad de los biofilms en diferentes áreas. Adquirir z-pilas elegir el número de cortes para formar una imagen ( &quot;Scan Control&quot; → &quot;Ajustes Z&quot; → &quot;Num rebanadas&quot;) y marque la posición z para el primero y el último corte en el software del microscopio ( &quot;Scan Control &quot;→&quot; Ajustes Z &quot;→&quot; Mark primero &quot;;&quot; Marcar el último &quot;). Nota: Z-pilas con una profundidad de hasta 75 micras pueden ser adquiridos con un buen contraste entre las zonas extracelulares e intracelulares. </li><li> Para seguir los cambios de pH en un campo microscópico de vista con el tiempo, marcar la posición xy en el software del microscopio ( &quot;Stage y Control de enfoque&quot; → &quot;Mark Pos&quot;) y tomar imágenes repetidas en puntos de tiempo consecutivos ( &quot;Scan Control&quot; → &quot; Soltero&quot;). Regularmente tomar imágenes con la potencia del láser se establece en cero para la sustracción de fondo. </li></ol> 4. Análisis de Imágenes Digitales <ol><li> para export las imágenes microscópicas como archivos TIF, utilizar el archivo por lotes de exportación del software de microscopio ( &quot;macro&quot; → &quot;archivos por lotes de exportación&quot;). Marque los archivos que desea exportar y guardar imágenes de los canales rojo y verde en carpetas separadas como archivos TIF ( &quot;Iniciar lotes de exportación&quot;). Cambiar el nombre de los archivos en las carpetas que les dan los números secuenciales. </li><li> Importe la imagen de la serie roja y verde en el software como Daime (análisis digital de imagen en la ecología microbiana) 14. Segmento de las imágenes del canal verde con umbrales elegidos individualmente brillo (segmento → → segmentación automática de umbral de encargo). Elija los umbrales de luminosidad con cuidado (típicamente entre 20 y 80), de manera que todas las bacterias (más brillante que la matriz extracelular), pero no la matriz serán reconocidos como objetos durante la segmentación. Verificar visualmente que las áreas reconocidas como objetos corresponden bien a la biomasa bacteriana. </li><li> La transferencia de la capa de objetos de la g segmentadoreen imágenes de los canales correspondientes a las imágenes del canal rojo (Segmento → Transferencia de capa de objeto). Utilice la función de editor de objetos de rechazar y eliminar todos los objetos en las imágenes de los canales rojo y verde. Ahora solamente la matriz extracelular se deja en las imágenes de biofilm. Exportar la serie de imágenes procesadas como archivos TIF. </li><li> Importar la serie de imágenes en ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij; v.1.47). Determinar la intensidad media de fluorescencia en las imágenes de fondo tomadas con el láser apagado (Analizar → Histograma). Restar el fondo apropiada de las imágenes rojas y verdes (Proceso → Matemáticas → Restar). </li><li> Todavía en ImageJ, dividir la serie de imágenes verde (G1) por sí mismo (Proceso → calculadora de imagen). Entonces multiplicar la serie de imagen resultante (G2) con la serie de imágenes verde (G1). Esto dará lugar a una serie de imágenes (G3), donde NaN se asigna a todos los píxeles que pertenecen a áreas que fueron reconocidos como objetos en el Daime. Proceder de tél mismo con la serie de imágenes de color rojo (R1 / R1 = R2; R2 x R1 = R3). Nota: Como la biomasa bacteriana se eliminó de las imágenes en el paso 4.3, la intensidad fluorescente es 0 en estas áreas. Paso 4.5 es necesario convertir el valor 0 a NaN, que permite cálculo de la relación en el paso 4.6. </li><li> Aplicar el filtro &#39;Mean&#39; (Proceso → → Filtros media; radio: 1 píxel) para compensar el ruido del detector. Dividir la serie de imágenes verde por la imagen de la serie roja (Proceso → calculadora de imagen). Esto resulta en una relación de verde / rojo para cada pixel que queda en el espacio extracelular de las imágenes. Utilizar mapeos de colores para la representación gráfica de las proporciones de las imágenes (cuadros de imagen → de búsqueda). Calcular la relación media para cada imagen (→ Analizar histograma). </li><li> Convertir los coeficientes de verde / rojo a valores de pH de acuerdo con la función ajustada bajo 1.9.2). Nota: Un ejemplo de datos de calibración y curva ajustada se puede ver en Schlafer etal, 2015 11. </li></ol>

<ol>
	<li>Hunter, R. C., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+pH-sensitive+fluoroprobe+(C-SNARF-4)+for+pH+microenvironment+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).</li><li>Takahashi, N., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caries+ecology+revisited:+microbial+dynamics+and+the+caries+process.">Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process.</a> Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).</li><li>von Ohle, O. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Revsbech, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microbial+communities+with+electrochemical+microsensors+and+microscale+biosensors.">Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors.</a> Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).</li><li>Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iridium+oxide+pH+microelectrode.">Iridium oxide pH microelectrode.</a> Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy &amp; Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+penetration+and+detection+of+pH+gradients+in+biofilms+by+two-photon+excitation+microscopy.">Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).</li><li>Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+tolerance,+proton+permeabilities,+and+membrane+ATPases+of+oral+streptococci.">Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci.</a> Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+using+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+identification+of+streptococci+and+other+bacteria+in+initial+dental+biofilm+by+confocal+laser+scanning+microscopy+and+fluorescence+in+situ+hybridization.">In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization.</a> Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+understanding+the+contribution+of+alkali+generation+in+dental+biofilms+to+inhibition+of+dental+caries.">Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries.</a> Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Monitoreo microscópico de pH biofilm proporciona varias ventajas, en comparación con los electrodos o microelectrodos mediciones 4-6. técnicas microscópicas permiten determinar el pH con una alta resolución espacial y permitir la captura de gradientes de pH, tanto horizontales como verticales en biofilms sin perturbar el biofilm mecánicamente. Los intentos previos de monitoreo del pH microscópico, sin embargo, no pudieron diferenciar entre pH extracelular e intracelular en las biopelículas 1,7,9....

El método aquí descrito permite el seguimiento de pH extracelular en biofilms dentales en el intervalo entre 4,5 y 7, usando el colorante radiométrica seminaphthorhodafluor-4F 5- (y-6) ácido carboxílico (C-SNARF-4) en combinación con microscopía confocal de barrido láser y análisis de imagen digital. El colorante fluorescente empleado es sensible al pH y muestra un cambio en su emisión fluorescente en función del estado de protonación. La emisión fluorescente de los picos de moléculas protonadas en 580 nm, y la emisión de la molécula desprotonado a 640 nm 1. La relación de las intensidades de emisión fluorescente en dos ventanas de detección que comprende los dos picos de emisión (576-608 nm y 629-661 nm) refleja así pH en la fase líquida, con independencia de la concentración de colorante. Con un pK a de ~ 6,4 el colorante es adecuado para visualizar pH en ambientes moderadamente ácidas. PH en las biopelículas bacterianas es de vital importancia para todos los procesos metabólicos.En el caso de biofilms dentales, pH en la matriz extracelular es el factor de virulencia clave para el desarrollo de la caries dental. Los períodos prolongados con un pH bajo en la interfaz de plomo-biopelícula dental para frenar la desmineralización del esmalte subyacente 2. Debido a la compleja arquitectura tridimensional de biofilms, metabolitos, incluyendo ácidos orgánicos, no se distribuyen uniformemente a través de la biopelícula. Altamente y menos microambientes acidogénicas se pueden encontrar en estrecha proximidad espacial 3. Durante décadas, los gradientes de pH verticales en biofilms se registraron con la ayuda de microelectrodos 4-6. Mientras que ofrecen una buena resolución espacial debido a su pequeño tamaño de la punta, no son muy adecuados para controlar los gradientes horizontales. Por otra parte, la inserción del electrodo perturba el biofilm mecánicamente. Cuantitativos técnicas microscópicas fluorescentes ofrecen la ventaja de visualizar los cambios de pH en las diferentes áreas de un biofilm sin interferir mecánicana vez. Diferentes campos microscópicos de vista se pueden seleccionar libremente y la imagen varias veces durante periodos prolongados 1,7-9. Sin embargo, al interpretar imágenes microscópicas de biofilm, es importante distinguir entre la fluorescencia que deriva de la biomasa microbiana y la fluorescencia derivada del espacio extracelular. En condiciones ácidas, el pH dentro de las células bacterianas es diferente de pH en la matriz extracelular, como las bacterias transportan activamente protones a través de su membrana celular a expensas de trifosfato de adenosina 10. En el contexto de la caries dental, pH intracelular bacteriana no tiene un impacto directo sobre el esmalte mientras que subyacen bajo pH extracelular conduce a la desmineralización. Un promedio de pH en imágenes microscópicas que contienen ambas áreas y bacterias libres de bacterias conduce a resultados erróneos. El uso de otros a lo largo de las manchas con el colorante sensible al pH con el fin de visualizar la biomasa bacteriana y diferenciar entre las áreas extra e intracelulares trae abel riesgo de contaminación fluorescente del espacio extracelular y mediciones falsas 11. Por consiguiente, la presente manuscrito describe el uso del colorante radiométrico en una doble función; tanto como un marcador de pH y como una mancha bacteriana universal. A medida que el tinte es up-concentra en las células bacterianas, la combinación de imágenes microscópicas confocal y un procedimiento de análisis de imagen digital precisa permite la determinación de pH extracelular en el intervalo entre 4,5 y 7,0 en las biopelículas dentales delgados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1258">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Zeiss LSM 510 META</td>
			<td style="width:305px;">Zeiss</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">C-Apochromat 63X water immersion objective</td>
			<td style="width:305px;">Zeiss</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">XL Incubator</td>
			<td style="width:305px;">PeCON</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>S23920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">HEPES</td>
			<td style="width:305px;">Life Technologies</td>
			<td>11344-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Costar 96-well black clear-bottom plate</td>
			<td style="width:305px;">Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:409px;">Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit)</td>
			<td style="width:305px;">Menzel</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Alginate impression material</td>
			<td style="width:305px;">GC Corporation</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs</td>
			<td style="width:305px;">Axis Dental</td>
			<td style="width:243px;">LS-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Orthodontic retainer containers</td>
			<td style="width:305px;">Spark Medical Equipment Co., Ltd</td>
			<td style="width:243px;">SK-WDTC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Sticky wax</td>
			<td style="width:305px;">Dentsply</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chewing paraffin wax&#160;</td>
			<td>Ivoclar Vivadent AG</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:305px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td>Used during preparation of salivary solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">0.45 &#181;m and 0.2 &#181;m syringe filters</td>
			<td style="width:305px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS431220; CLS431219&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:409px;">daime</td>
			<td style="width:305px;">University of Vienna, Austria</td>
			<td style="width:243px;">http://dome.csb.univie.ac.at/daime</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:409px;">ImageJ</td>
			<td>NIH, Bethesda, Maryland, USA</td>
			<td style="width:243px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric imaging of extracellular ph in dental biofilms

El pH en las biopelículas bacterianas en los dientes es de importancia central para la caries dental, una enfermedad con una alta prevalencia en todo el mundo. Los nutrientes y metabolitos no se distribuyen uniformemente en las biopelículas dentales. Una compleja interacción de sorción para y la reacción con la materia orgánica en la biopelícula reduce los caminos de difusión de solutos y crea gradientes empinados de moléculas reactivas, incluyendo ácidos orgánicos, a través de la biopelícula. métodos microscópicos fluorescentes cuantitativos, tales como formación de imágenes tiempo de vida de fluorescencia o ratiometry pH, se pueden emplear para visualizar pH en diferentes microambientes de biofilms dentales. ratiometry pH explota un cambio dependiente del pH en la emisión fluorescente de los colorantes sensibles al pH. Cálculo de la relación de emisión a dos longitudes de onda diferentes permite determinar pH local en imágenes microscópicas, independientemente de la concentración del colorante. Contrariamente a la técnica de microelectrodos permite la monitorización ambos gradientes de pH verticales y horizontales, en tiempo real conperturbar mecánicamente el biofilm. Sin embargo, se debe tener cuidado para diferenciar con precisión entre los compartimentos extra e intracelulares de la biopelícula. Aquí, el colorante radiométrica, seminaphthorhodafluor 4F-5- (y 6) el ácido carboxílico (C-SNARF-4) se emplea para controlar el pH extracelular en vivo en los biofilms dentales cultivadas de la composición de especies desconocidas. Tras la exposición a la glucosa es el colorante concentrado hasta el interior de todas las células bacterianas en las biopelículas; se utiliza de este modo tanto como una mancha bacteriana universal y como un marcador de pH extracelular. Después de la adquisición de imagen microscópica confocal, la biomasa bacteriana se elimina de todas las imágenes utilizando software de análisis de imagen digital, que permite calcular exclusivamente pH extracelular. ratiometry pH con el colorante radiométrico es muy adecuado para estudiar pH extracelular en biofilms delgadas de hasta 75 m de espesor, pero está limitado al intervalo de pH entre 4,5 y 7,0.

El método presentado permite la monitorización extracelular pH cae en diferentes microambientes de biofilms dentales en el intervalo de pH de 4,5 a 7, en tiempo real. Si se eligen las condiciones experimentales como se ha descrito anteriormente, el pH comienza a caer en todas las áreas de las biopelículas poco después de la exposición a la glucosa. Cuando el pH en un biofilm gotas, las células bacterianas se hacen visib...

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Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Imaging radiométrica de pH extracelular en los biofilms dentales

Un colorante radiométrica sensible al pH se usa en combinación con microscopía confocal de barrido láser y análisis digital de imágenes para monitorizar el pH extracelular en biofilms dentales, en tiempo real.

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K vistas.  Aarhus University.  Un colorante radiométrica sensible al pH se usa en combinación con microscopía confocal de barrido láser y análisis digital de imágenes para monitorizar el pH extracelular en biofilms dentales, en tiempo real. 

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Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Crecimiento de Mycobacterium tuberculosis Las biopelículas

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Investigación

Inmunología e Infección

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Medición de pH Fagosoma por Ratiometric microscopía de fluorescencia

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular compartment where the killing and digestion of engulfed particles take place, is the main arena for neutrophil pathogen killing that requires tight regulation. Phagosomal pH is one aspect that is carefully controlled, in turn regulating antimicrobial protease activity. Many fluorescent pH-sensitive dyes have been used to visualize the phagosomal environment. S-1 has several advantages over other pH-sensitive dyes, including its dual emission spectra, its resistance to photo-bleaching, and its high pKa. Using this method, we have demonstrated that the neutrophil phagosome is unusually alkaline in comparison to other phagocytes. By using different biochemical conjugations of the dye, the phagosome can be delineated from the cytoplasm so that changes in the size and shape of the phagosome can be assessed. This allows for further monitoring of ionic movement.

This manuscript describes a simple method to measure the phagosomal pH and area as well as the cytoplasmic pH of human and mouse neutrophils using the ratiometric indicator seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, or S-1. This is achieved using live-cell confocal fluorescence microscopy and image analysis.

Imágenes de la Neutrófilos Fagosoma y el citoplasma usando un indicador de pH Ratiometric

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus formation in veins remain obscure. Lack of mobility (e.g., after surgery or long-haul flights) is one of the main factors leading to DVT. The pathophysiological consequence of the lack of mobility is blood flow stagnation in venous valves. Here, a model is described that mimics such flow disturbance as a thrombosis-driving factor. In this model, partial flow restriction (stenosis) in the inferior vena cava (IVC) is created. Closure of about 90% of the IVC lumen for 48 h results in development of thrombi structurally similar to those in humans. The similarities are: i) most of the thrombus volume is red, i.e., consists of red blood cells and fibrin, ii) presence of a white part (lines of Zahn), iii) non-denuded endothelial monolayer, iv) elevated plasma D-Dimer levels, and v) possibility to prevent thrombosis by low molecular weight heparin. Limitations include variable size of thrombi and the fact that a certain percentage of wild-type mice (0 - 35%) may not produce a thrombus. In addition to visual observation and measurement, thrombi may be visualized by non-invasive technologies, such as ultrasonography, which allows for monitoring the dynamics of thrombus development. At shorter time points (1 - 6 h), intravital microscopy may be applied to directly observe events (e.g., recruitment of cells to the vessel wall) preceding thrombus formation. Use of this method by several teams around the world has made it possible to uncover basic mechanisms of DVT initiation and identify potential targets that might be beneficial for its prevention.

We describe here stenosis in the inferior vena cava as a murine model of deep vein thrombosis. This model recapitulates blood flow restriction, one of the major triggers of venous thrombosis in humans.

Estenosis de la Vena Cava Inferior: un modelo murino de trombosis venosa profunda

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has been disrupted. Loss of function following gene disruption is subsequently restored by exogenous addition of the product of the disrupted gene. This helps to determine the function of the gene. A method previously described involves generating a gtfC gene-disrupted Streptococcus mutans strain. Here, an undemanding method is described for purifying the gtfC gene product from the newly generated S. mutans strain following the gene disruption. It involves the addition of a polyhistidine-coding sequence at the 3&#8242; end of the gene of interest, which allows simple purification of the gene product using immobilized metal affinity chromatography. No enzymatic reactions other than PCR are required for the genetic modification in this method. The restoration of the gene product by exogenous addition after gene disruption is an efficient method for determining gene function, which may also be adapted to different species.

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Described here is a simple method for the purification of a gene product in Streptococcus mutans. This technique may be advantageous in the purification of proteins, especially membrane proteins and high molecular mass proteins, and can be used with various other bacterial species.

Purificación de una proteína de masa molecular alta en Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, periodontitis, mucosal infections and, most notably, early childhood caries. In all of these conditions, the pH in the biofilm matrix impacts microbe-host interactions and thus the disease progression. The present protocol describes a confocal microscopy-based method to monitor pH dynamics inside cross-kingdom biofilms comprising Candida albicans and Streptococcus mutans. The pH-dependent dual-emission spectrum and the staining properties of the ratiometric probe C-SNARF-4 are exploited to determine drops in pH in extracellular areas of the biofilms. Use of pH ratiometry with the probe requires a meticulous choice of imaging parameters, a thorough calibration of the dye, and careful, threshold-based post-processing of the image data. When used correctly, the technique allows for the rapid assessment of extracellular pH in different areas of a biofilm and thus the monitoring of both horizontal and vertical pH gradients over time. While the use of confocal microscopy limits Z-profiling to thin biofilms of 75 &#181;m or less, the use of pH ratiometry is ideally suited for the noninvasive study of an important virulence factor in cross-kingdom biofilms.

The protocol describes the cultivation of cross-kingdom biofilms consisting of Candida albicans and Streptococcus mutans and presents a confocal microscopy-based method for the monitoring of extracellular pH inside these biofilms.

Monitoreo del pH extracelular en biopelículas entre reinos mediante microscopía confocal

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch from yeast-form growth to hyphal growth. Cells initiating this process become adherent to surfaces as well as to each other, with the resulting development of a biofilm colony. This commonly occurs not only on mucosal tissue surfaces in yeast infections, but also on medical implants such as catheters. It is well known that biofilm cells are resistant to antifungal drugs, and that cells that shed from the biofilm can lead to dangerous systemic infections. Biofilms range from heavily translucent to opaque due to refractive heterogeneity. Therefore, fungal biofilms are difficult to study by optical microscopy. To visualize internal structural, cellular, and subcellular features, we clarify fixed intact biofilms by stepwise solvent exchange to a point of optimal refractive index matching. For C. albicans biofilms, sufficient clarification is attained with methyl salicylate (n = 1.537) to enable confocal microscopy from apex to base in 600 &#181;m biofilms with little attenuation. In this visualization protocol we outline phase contrast refractometry, the growth of laboratory biofilms, fixation, staining, solvent exchange, the setup for confocal fluorescence microscopy, and representative results.

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

To view and quantify the internal features of Candida albicans biofilms, we prepare fixed intact specimens that are clarified by refractive index matching. Then, optical sectioning microscopy can be used to obtain three-dimensional image data though the full thickness of the biofilm.

Aclaración e imagen de Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular deoxyribonucleic acid (ecDNA) is released during different forms of cell death including apoptosis, necrosis, necroptosis, neutrophil extracellular traps (NETs) and pyroptosis. Measurement of this cell death is time consuming with several different biomarkers required to identify the different biochemical forms of cell death. Measurement of ecDNA is generally conducted in serum and urine as a surrogate for renal damage, not in the actual target organ where the pathological injury occurs. The current difficulty in investigating ecDNA in the kidney is the lack of methods for formalin fixed paraffin embedded tissue (FFPE) both experimentally and in archived human kidney biopsies. This protocol provides a summary of the steps required to stain for ecDNA in FFPE tissue (both human and murine), quench autofluorescence and measure the ecDNA in the resulting images using a machine learning tool from the publicly available open source ImageJ plugin trainable Weka segmentation. Trainable Weka segmentation is applied to ecDNA within the glomeruli where the program learns to classify ecDNA. This classifier is applied to subsequent acquired kidney images, reducing the need for manual annotations of each individual image. The adaptability of the trainable Weka segmentation is demonstrated further in kidney tissue from experimental murine anti-MPO glomerulonephritis (GN), to identify NETs and ecMPO, common pathological contributors to anti-MPO GN. This method provides objective analysis of ecDNA in kidney tissue that demonstrates clearly the efficacy in which the trainable Weka segmentation program can distinguish ecDNA between healthy normal kidney tissue and diseased kidney tissue. This protocol can easily be adapted to identify ecDNA, NETs and ecMPO in other organs.

Extracellular DNA (ecDNA) released during cell death is proinflammatory and contributes to inflammation. Measurement of ecDNA at the site of injury can determine the efficacy of therapeutic treatment in the target organ. This protocol describes the use of a machine learning tool to automate measurement of ecDNA in kidney tissue.

Aprendizaje automático supervisado para la semi-cuantificación del ADN extracelular en glomerulonefritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells maintain organismal homeostasis and immunity. Simultaneously, and in contrast to its homeostatic role, it can also drive various pathologies, including cancer and viral infections. Unlike other modes of endocytosis, the tools developed for studying the maturation of macropinosomes remain underdeveloped. Here the protocol describes newly developed tools for studying the redox environment within the lumen of early and maturing macropinosomes. Methodologies for using ratiometric fluorescence microscopy in assessing the pH, production of reactive oxygen species, and the degradative capacity within the lumen of individual macropinosomes in live cells are described. Single organelle measurements offer the advantage of revealing spatiotemporal heterogeneity, which is often lost with population-based approaches. Emphasis is placed on the basic principles of dual fluorophore ratiometric microscopy, including probe selection, instrumentation, calibration, and single-cell versus population-based methods.

We describe protocols for measuring pH, oxidative events, and protein digestion in individual macropinosomes in live cells. An emphasis is placed on dual-fluorophore ratiometric microscopy and the advantages it offers over population-based techniques.