רוב העבודה שבוצע במרכז המיקרוסקופי והדמית UMCG (UMIC), אשר ממומן על ידי NWO 175-010-2009-023 ו ZonMW 91,111,006; STW &quot;עמק מיקרוסקופי 12718&quot; כדי BNGG. עבודה זו מומנה על ידי מענק ZonMW Veni, מענק אינטגרציה הקריירה מארי קירי (חיסכון למות נוירונים) ו המילגה אלצהיימר Nederland כדי TJvH

כל הניסויים עם הזחלים דג הזברה אושרו על ידי ועדת ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת חרונינגן פי הנחיות לאומיות והאיחוד האירופי. לדוגמא הכנה 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבוע והטבעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש הזחלים הדגים tricaine (0.003%) מתווסף (NaCl 5 מ&quot;מ, 0.17 מ&quot;מ KCl, 0.33 מ&quot;מ CaCl 2, 0.33 מ&quot;מ MgSO 4, 10 HEPES מ&quot;מ, pH 7.6) E3 מים ולבדוק דג הזברה עבור עומק ההרדמה על ידי חדירה בעדינות עם קצה פיפטה 200 μl תחת מיקרוסקופ לנתיחה עד הצעת אי מזוהה יותר (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עיבוד דגימות עבור EM גומל לאחר שרכשה בנתונים הדמיה vivo באמצעות confocal או 2 הדמיה פוטון ב -1.8% agarose כמתואר, 5-15 הזחלים לתקן ב agarose באמצעות PFA 4% PBS המכיל טריטון-X-100 (0.05%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי זחלים מן agarose ותהליכיםבקנה מידה גדול EM 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן הזחלים paraformaldehyde טרי 4% ב PBS המכיל טריטון-X-100 (0.05%) עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר צינורות פלסטיק. הערה: תאים הגדלים בתרבית (במבחנה) ניתן לתקן ישירות glutaraldehyde, כפי שמתואר בשלב הבא (1.1.1.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון ולהוסיף 100 μl 0.5% PFA, 2% glutaraldehyde (GA), ו -0.1 M נתרן cacodylate (pH 7.4). אחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס. דגימות שטיפה פעמיים cacodylate 0.1 M נתרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי ראשי זחל rostrally אל למוח האחורי כדי להקל על חדירה של אוסמיום. השתמש מזרקים / מלקחיים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Postfix הזחלים tetroxide אוסמיום 1% (OSO 4) /1.5% פרוציאני אשלגן (K 4 [Fe (CN) 6]) ב 0.1 M cacodylate נתרן על קרח במשך 2 שעות ולשטוף 3 x 5 דקות כפול מזוקקים H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים באתנול ב -20 incubations דקות בהגדלה ריכוזי אתנול (50%, 70%, 3 פעמים 100%). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl">Embedding <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן שרף אפוקסי על פי מתכונים סטנדרטיים המשמשים במעבדות EM. הערה: אנו משתמשים שרף אפוקסי כדלקמן: לערבב 19.8 גרם glycid אתר 100, 9.6 גרם 2-dodecenylsuccinic אנהידריד חומצה 11.4 גרם methylnadic אנהידריד באמצעות בוחש מגנטי. הוסף 0.5 גרם DMP-30 (כמה עצוב (dimethylaminomethyl) פנול) ומערבבים שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לילה הזחלים שרף אפוקסי 50% אתנול (v / v) תוך כדי סיבוב (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלף אפוקסי-שרף מדולל עם שרף טהור. דגירה למשך 30 דקות, להוסיף בטרי שוב דגירה במשך 30 דקות אחרות. שוב לרענן את שרף ואז דגירה 3 שעות ב RT, ואחריו 15 דקות ב 58 ° C ועוד 1 hr ב RT בלחץ נמוך (200 mbar). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוריינט הראשי בתוך תבניות הטבעה שטוחה סיליקון זמינות מסחרי תחת מיקרוסקופ לנתיחה באמצעות מחט או קיסם עם הקדמי מול הצד של העובש או לפי צורך (איור 1 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפלמר מיל אפוקסיב הלילה ב 58 מעלות צלזיוס. אם שרף אפוקסי הוא עדיין רך מדי לאפשר עוד יום לפלמר להקשיח ב -58 מעלות צלזיוס. קשיחות בדיקה על-ידי הפעלת לחץ באמצעות מלקחיים. אם זה בקלות משאיר חריץ לאפשר עוד יום לפלמר להקשיח ב -58 מעלות צלזיוס. כאשר הדגימה הוא התקשה מלא להמשיך זמירה ו חתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך משם שרף עודף סכיני גילוח באמצעות בדל (האיור 1B). </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתך, מנוגדים, שמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום שרף אפוקסי סעיף באמצעות ultramicrotome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת סכין זכוכית או יהלום histoknife לחתוך חלקי semithin (500 ננומטר) עבור toluidine הכחול / fuchsin הבסיסי (איור 1D) מכתים כדי לזהות את המיקום הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה חצי דקת סעיפים בשקופיות מיקרוסקופיות ידי להרים אותם עם pipet פסטר זכוכית שהקצה שלו נסגר על ידי המסה בלהבה. יבש על פלטה חשמלית until אין מים שנשאר. הכתם למשך 10 שניות עם toluidine כחול 1% במים על פלטה חשמלית ואחרי שטיפה במים, כתם במשך 10 שניות עם fuchsin בסיסי 0.05% ב tetraborate 1% נתרן. לבחון באמצעות מיקרוסקופ אור רגיל ב 10X כדי 40X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אתר תקין / אוריינטציה בתוך המוח הוא הגיע, להמשיך חתך את גוש שרף אפוקסי עם סכין יהלום לחתוך קטעים ultrathin (~ 70 ננומטר; איור 1E) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מבנים אנטומיים לזיהוי בקלות בתוך ומסביב המוח, כולל בורות חוש ריח, עיניים, גבולות חומר אפורים-לבנים, כדי לזהות את האזור של עניין במהלך Ultrathin חתך ולהתאים את זווית החתך כאשר המדגם הוא מוטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף הר על משבצת האחת L2 x 1 רשתות נחושת (איור 1F), כדי לאפשר רכישה ללא שיבושים ברי רשת. השתמש Formvar רשתות מצופות לתמוך חלקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוֹגֵד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי ultrathin כתם על רשתים למשך 2 דקות ב אצטט uranyl 2% מתנול ואחריו ריינולדס להוביל ציטראט עבור 2 דקות אחר 16. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Image Acquisition <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> STEM בקנה מידה גדול הערה: אנו משתמשים EM סריקה עם גנרטור סריקה חיצוני מסוגל לרכוש שדות גדולים מרובים מבט ברזולוציה גבוהה 3,5,7,17 ​​באמצעות זיהוי גזע. בדרך כלל, תמונה אחת שנוצרה בדרך זו שקולה בתחומים לאור ~ 100 הילוכי אלקטרונים מיקרוסקופים (TEM) תמונות, צמצום משמעותי את כמות התפרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבה לדוגמא ב מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח רשת עם סעיף ב בעל מדגם רשת המרובה ולהעביר ההחדרה של SEM. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערך של גלאי STEM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הרשת עם המדגם תחת הקורה ולעבור את זה כך שזה יהיה כ. 5 מ&quot;מ מקוטב העדשה. לרכוש תמונה ב 20 kV באמצעותאל הגלאי-העדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגש על קצה הרשת ולהתאים עובד המרחק ל -4.0 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את בעל מדגם לעמדה בטוחה להביא את גלאי STEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכז את החור של גלאי STEM בתחום הדימוי על ידי סיבוב ברגי התאמות תוך הדמיה במהירות מרבית עם הגלאי ב-עדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להחזיר את בעל המדגם אשר רק יתאים בין קוטב העדשה לבין הגלאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונה עם הגלאי-העדשה להיות בטוח יהיה על אזור הסעיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף ל STEM זיהוי (בינוני רווח וכל הרביעים להגדיר על &#39;מינוס&#39;) ולרכוש תמונה ובחר את האזור לסריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרי מתח אץ ל -21 ק ולחכות ייצוב של הקורה (תמונה היציבה שוב) ולאחר מכן ללכת 29 kV בצעדים של 2 קילו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת תמונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מקרינים את המדגם (כדי למנוע שינויים בהירים שנגרמו על ידי הקורה האלקטרוני) על ידי התקרבותמתוך כך שהאזור המלא לסריקה מתאימה בחלון התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי צמצם 120 מיקרומטר (כדי לשמור על הטווח הדינמי הראוי הרווחים הגלאי צריכים להיות מופחתים צעד אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דה-פוקוס ולכן התמונה מטושטשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את האזור שנסרק כמו הדוק ככל האפשר באמצעות אפשרות הסריקה באזור המופחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהירות סריקה הגדר כך מסגרת נסרק ב כ. שניות 1 - 2. הערה: בהתאם לגודל ורקמות זה בדרך כלל לוקח ½ שעה (100 x FOV מיקרומטר 100) עד 3 שעות (1,000 x 500 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זום פנימה לפחות 100X ולסרוק שטח קטן במשך 10 שניות. הערה: כאשר אזור זה אינו משנה בהיר לעומת, טרום ההקרנה וסביבתה מספיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את הצמצם 30 מיקרומטר (גזע רווח בינוני) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר צמצם באמצעות wobbler (בהגדלה ~ 40,000X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד בפוקוס לבחור את האזור / תכונה הקלה, להגדיר מהירות סריקה כך פרטיםגלויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנת מיקרוסקופ לכוונן את הבהירות והניגודיות באמצעות צפייה בהיסטוגרמה בזהירות כדי לשמור את כל הפיקסלים הטווח הדינמי. לעשות את אותו הדבר עבור האזור / תכונות האפלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור אל האזור הבהיר ולבדוק שוב. להיות בצד הבטוח ולכן יש קצת מקום משני הצדדים של ההיסטוגרמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זום החוצה כך שהאזור המלא לסריקה מתאימה לחלון ההדמיה, ולהתחיל את תכנית רכישת שטח הגדולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באפשרות אשף להקים פסיפס ידי בחירת שטח מהמסך. השתמש פיקסל בגודל 2 - 5 ננומטר תלוי מה פרטים נחוצים. השתמש להתעכב זמן 3 מיקרו-שניות עבור STEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;פוקוס אוטומטי על אריח קודם&quot;, השתמש הפוקוס אוטומטי תוכנת רכישה בקנה מידה הגדולה עם הגדרות חברה מחדל, תיבת הסימון &quot;לאמת הגדרה לפני ביצוע&quot; ולהגדיר היכן לשמור את הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ &quot;לייעל&quot; כדי לבדוק את הגדרות מיקרוסקופ. הערה: עכשיו את הזמן הדרוש יהיה shשֶׁלוֹ. זה עשוי להיות עד 72 שעות עבור 1 x 0.5 מ&quot;מ אזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון &quot;ברזולוצית אריח מקסימלית&quot; סוג 20,000 כך אריחים בודדים, לא יהיו גדול מ 20k x 20k, במניעת תופעות קצה קהות. לחץ &quot;הוצאה להורג&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשנשאל לבדיקת להתמקד בהירות / ניגודיות (C / B), לכבות גנרטור סריקה חיצוני ובזהירות להתאים את המיקוד ואת אסטיגמציה בתוכנה מיקרוסקופ. אל תשנה B / C. הערה: השלב ניתן להעביר והגדלה השתנה, אבל יש הגדלה יאופסו בגודל פיקסל הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעילו גנרטור סריקה חיצוני שוב ולחץ על &quot;המשך&quot;. </li></ol></li></ol></li></ol> .3 ניתוח נתונים <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תכנית צופה קובץ EM בקנה מידה גדולה לפתוח את הקובץ &quot;מידע פסיפס&quot;. פעולה זו תפתח את כל טיף-קבצי רעפים. זה רצוי מבוצע על תחנת עבודה אחרת לא להכשיל רכישות חדשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;auלתפור כל פסיפס (פרמטרי החפיפה במצב אונ וחצי, תופר סף 0.90, הפחתת רעש אוטומטית. בקריטריוני תפרים מקרה לא יכולה להתממש, זום פנימה למקם אריח ידני במצב ולחץ על &#39;להמשיך כפי שהוא &quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצוא כקובץ HTML, או לחילופין כסינגל TIF. שים לב שעבור TIF לייצא downscaling ייתכן שיש צורך. כלול את גודל פיקסל הסופי בשם הקובץ המאפשר מדידות מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הסברים בקובץ TIF ידי פתיחתו ב תוכנית לעריכת תמונות. במקביל, פתח את קובץ html zoomable בדפדפן אינטרנט להסתכלות רזולוציה אופטימלית. </li></ol>

<ol>
	<li>Faas, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+nanoscopy:+generation+of+ultra-large+high+resolution+electron+microscopy+maps.">Virtual nanoscopy: generation of ultra-large high resolution electron microscopy maps.</a> J Cell Biol. 198, 457-469 (2012).</li><li>Kuipers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIPPER,+a+combinatorial+probe+for+correlated+live+imaging+and+electron+microscopy,+allows+identification+and+quantitative+analysis+of+various+cells+and+organelles.">FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles.</a> Cell Tissue Res. 360, 61-70 (2015).</li><li>Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Lindsey, L. F., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+transmission-mode+scanning+electron+microscopy+(tSEM)+for+large+volume+analysis+at+nanoscale+resolution.">Automated transmission-mode scanning electron microscopy (tSEM) for large volume analysis at nanoscale resolution.</a> PLoS One. 8, e59573 (2013).</li><li>Ravelli, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destruction+of+tissue,+cells+and+organelles+in+type+1+diabetic+rats+presented+at+macromolecular+resolution.">Destruction of tissue, cells and organelles in type 1 diabetic rats presented at macromolecular resolution.</a> Sci Rep. 3, 1804 (2013).</li><li>van Ham, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+correlated+microscopy+reveals+differential+macrophage+and+microglial+dynamics+during+resolution+of+neuroinflammation.">Intravital correlated microscopy reveals differential macrophage and microglial dynamics during resolution of neuroinflammation.</a> Dis Model Mech. 7, 857-869 (2014).</li><li>Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+EM+of+non-heavy+metal+stained+biosamples:+Large-field+of+view,+high+contrast+and+highly+efficient+immunolabeling.">Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling.</a> Exp Cell Res. 15477, 202-207 (2015).</li><li>Sokol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Electron+Microscopy+Maps+of+Patient+Skin+and+Mucosa+Provide+Insight+into+Pathogenesis+of+Blistering+Diseases.">Large-Scale Electron Microscopy Maps of Patient Skin and Mucosa Provide Insight into Pathogenesis of Blistering Diseases.</a> J Invest Dermatol. 135, 1763-1770 (2015).</li><li>de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopy:+Ultrastructure+lights+up!+Nat+Methods.">Correlated light and electron microscopy: Ultrastructure lights up! Nat Methods.</a> Nat Methods. 12, 503-513 (2015).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12, 51-54 (2015).</li><li>Helmstaedter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connectomic+reconstruction+of+the+inner+plexiform+layer+in+the+mouse+retina.">Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina.</a> Nature. 500, 168-174 (2013).</li><li>Oosterhof, N., Boddeke, E., van Ham, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+dynamics+in+the+CNS:+Learning+from+the+zebrafish.">Immune cell dynamics in the CNS: Learning from the zebrafish.</a> Glia. 63, 719-735 (2015).</li><li>van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cells+are+cleared+by+directional+migration+and+elmo1-+dependent+macrophage+engulfment.">Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment.</a> Curr Biol. 22, 830-836 (2012).</li><li>Davison, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+from+Gal4-VP16+transgenic+insertions+for+tissue-specific+cell+labeling+and+ablation+in+zebrafish.">Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish.</a> Dev Biol. 304, 811-824 (2007).</li><li>Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish.">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13365-13370 (2009).</li><li>van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+apoptotic+cells+in+zebrafish.">Live imaging of apoptotic cells in zebrafish.</a> FASEB J. 24, 4336-4342 (2010).</li><li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron-opaque+stain+in+electron+microscopy.">The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 17, 208-212 (1963).</li><li>Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+reconstruction+of+brain+tissue+from+high-resolution+serial+section+images+acquired+by+SEM-based+scanning+transmission+electron+microscopy.">Large-volume reconstruction of brain tissue from high-resolution serial section images acquired by SEM-based scanning transmission electron microscopy.</a> Methods Mol Biol. 950, 253-273 (2013).</li><li>Stensaas, L. J., Reichert, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+and+amoeboid+microglial+cells+in+the+neonatal+rabbit+brain.">Round and amoeboid microglial cells in the neonatal rabbit brain.</a> Z Zellforsch Mikrosk Anat. 119, 147-163 (1971).</li><li>Mori, S., Leblond, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+microglia+in+light+and+electron+microscopy.">Identification of microglia in light and electron microscopy.</a> J Comp Neurol. 135, 57-80 (1969).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

EM מאפשר ניתוח של קשר הסלולר עם הדמיה ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולות בהקשר ביולוגי. עם זאת, זה בדרך כלל מגביל את שדה הראייה. גדולה בקנה המידה 3D EM מתאימה במיוחד קישוריות עצבית מיפוי ידי יצירה ברזולוציה של ננו 3 שחזורים ממדיים, המחייבות עיבוד נתונים מורכבים 10. לעומת זאת, EM בקנה מידה גדול 2D דורש סעיף ורקמה אחת בלבד של הנתונים הדמיה, והערכה של נתונים ניתן על ידי מי שיש לו גישה אל דפדפן אינטרנט. אנו ואחרים השתמשו בעבר EM בקנה מידה הגדול כדי לנתח רקמות חיות שלמות. באשר ביותר תפרי הגישות, TEM ו- SEM מבוססים יש יתרונות משלהם. הנה, סריקת השידור EM (STEM) שמש המאפשר דור של שדה גדול של השקפה ברזולוציה גבוהה. בדרך כלל, תמונת STEM אחד שווה בתחומים לאור כ -100 תמונות TEM, צמצום משמעותי את כמות התפרים כאשר הדמית fiel הגדולds מבט ברזולוציה גבוהה. אם ברזולוציה גבוהה יותר יש צורך, TEM עשוי להיות יתרון. STEM יש יתרון על פני TEM כי דגימות הלא בניגוד ניתן להשתמש עם ניגודיות ultrastructural טוב 6. בנוסף, השיטה המתוארת כאן יכולה להיות מותאמת פשוט לשימוש עם זיהוי אלקטרוני גב מפוזר (BSD) על חלקים רכובים על פרוסות סיליקה, הרחבת השימוש במערכות מיקרוסקופ מרובות. קבצי HTML-zoomable רקמות EM הם מאוד שימושיים עבור כימות, שיתוף נתונים שעשויים לא נותחו לתוכן המלא שלה, שילוב LM ונתוני EM (קלם) 8, לצרכי הצגה במחקר מדעי, לנתח נתונים מטופלים, ושל חינוך. לחלופין, ב EM בקנה מידה גדולה בתוך SEM, אך לא TEM, ופלי סיליקה יכולים לשמש, אשר יש שני יתרונות עיקריים: BSD ניתן להשתמש, וזה יותר זמין בדרך כלל על מיקרוסקופי אלקטרוני סורק אבחון גזע. שנית, הרכבה של חלקים גדולים (&gt; 1 מ&quot;מ 2 תחומיםהריבית) היא פשוטה. הרכבה על רשתות יחידות מחוררות היא עבודה אינטנסיביות מאתגרת מבחינה טכנית. השוואה מפורטת בין TEM, SEM ו STEM מפורטת במקומות אחרים 6. חסרון של הדמית BSD הוא, לעומת הגזע, תמונות גדלו רעש. זה יכול להיות מתוגמל באופן חלקי על ידי הגדלת זמן להתעכב פיקסל, וכתוצאה מכך פעמים הרכישה עוד זמן רב. למרות להכנת מדגם עיבוד EM סטנדרטי יחסית (קיבעון, הטבעה ו חתך) נדרש 5-7, זה מאתגר מבחינה טכנית כדי לחתוך חלקים ultrathin גדול נטול לחלוטין של חפצים. מדורים הם שבירים מאוד, בקלות לשבור, לקפל או נהרסים במהלך ההדמיה, אשר בדרך כלל לוקח שעות מרובות בכל מערך נתונים. עם זאת, בגלל השיתוף המקוון של הנתונים המשוחדים הגלם, זה צריך להיות אפשרי להשוות ביתר קלות נתונים שפורסמו, ולהשתמש במערך שפורסם התחום הפתוח כקבוצת ביקורת. נכון לעכשיו, כמה מכשירי EM מסוגל להrge בקנה מידה ניתוח נמצאים בשימוש, ולכן הנגישות טכניקה זו היא מוגבלת במידה מסוימת, אם כי מרכזי הדמיה ביותר בברכה שיתופי פעולה. עבור חלקים גדולים הרקמה צריכה להיות קבועה כראוי ברחבי המדגם. זו הסיבה תערובת של מקבע מהר אבל מתונה PFA משמש בשילוב עם מקבע איטי אבל חזק GA. חיתוך להרים חלקים גדולים בלי לכלוכים קשה. עבודה עם פרוסות בשילוב עם BSD קל לעומת איסוף חלקים על רשתות חור אחד. מכתים פוסט רוק כבד יותר קריטי לעומת EM קלאסית. מאז הקטע השלם הוא צלם כל חפץ יהיה גלוי. משתמשים TEM בדרך כלל מתקשים לעבור SEM, בגלל השוני במבצע מיקרוסקופ. כימות ושיתוף נתונים - כימות תכונות subcellular קשה בתמונות יחידות EM. האפשרות להתקרב ולהתרחק של בקנה מידה גדולתמונות בקלות מאפשרות זיהוי של תאים בעלי עניין, אשר יכול להיות מלווה מדידות ננו בתוך התאים. מערכי נתונים אלו מעידים כי סוגי תאים מסוימים ניתן לזהות במהירות לכמת בצורה משוחדת לחלקים גדולים של הרקמה אלה בהתבסס על תכונות לזיהוי בקני מידה שונים. לדוגמה microglia ניתן לזהות המבוססת על המורפולוגיה שלהם הציטופלסמה צפופה. בהמשך לכך, על התקרבות על תאים בודדים, תכונות subcellular ומולקולרית ננומטריים של תאים אלה ניתן למדוד בתוך אותו בסיס הנתונים, כפי שהראנו קודם לכן עבור רוחב ER בתוך בסיס הנתונים בתרבית רקמה EM בקנה מידה גדול 2. יתרון נוסף של nanotomy הוא כי האירוח של מערכי נתונים בקנה מידה גדולים באינטרנט יאפשר לאחרים לבדוק את הנתונים, אולי עבור תכונות אחרות, ולהסיק המסקנות שלהם על השערה חדשה. קלם - בנוסף להקל EM כמותי, EM בקנה מידה גדול מקל לתאם microsco אורתיוג תמונות כדי EM ברמה 8. בדוגמא הנוכחית בנוכחות microglia phagocytic במודל אבלציה דג זברה מוצגת. שאלה מרכזית במדעי המוח היא מה פונקציות פרט התרומות הן של המיקרוגליה ממקורות אחרים פוטנציאל של phagocytic ותאי חיסון. מחקרי EM מוקדמים הראו תכונות subcellular ייחודיות של microglia במחלה 18. למרבה הצער, קשה לתייג microglia סלקטיבי ובמיוחד אם זה יעשה פתולוגי, כפי שהם מציגים חפיפה גדולה עם תאים חיסוניים אחרים ביטוי גנים, מורפולוגיה ותפקוד. לכן, לא ברור אם ומתי microglia ברמת ultrastructural נבדל תאים חיסוניים ממקורות אחרים כולל מונוציטים הנגזרים שחדר מקרופאגים. הבנה אם קיימים הבדלי ultrastructural בין תאים אלה יספקו נקודת התחלה עבור ניתוח של הבדלים תפקודיים. שילוב סמנים מהונדס או ביטוי סלקטיבי קלם מאפשר detשיקוף של תכונות ultrastructural סלקטיבית לאוכלוסיות ספציפיות. אבחון &amp; מצגת וחינוך - עצם העובדה שאנו רואים ננומטריים כדי microscale בתוך נתונים EM במערך יחיד הוא הקל מאוד לקהל הרחב. עם מגוון אפשרויות וכלים המוגברים EM גומל בקנה מידה גדול אנו צופים התעוררות של EM במחקר בסיסי רפואי. השיטה שלנו מיוצג כאן מוחל מודל פגיעה מוחית דג הזברה 5, אבל נעשה שימוש על רקמה אנושית 7, עכברוש המוח 3, במודל חולדה לסוכרת 4 וב תרבית תאים 2, והוא יכול לשמש גם בשילוב עם TEM גישה מבוססת 1 מראה את הרבגוניות של שיטה זו. מפעיל מיקרוסקופ כבר לא הקלטה שנבחר מאוד, ולכן תמונות מוטות, אבל כל תכונות ultrastructural הרבות נרשמות ופתוחות לניתוח ברחבי עולם.

התפתחויות טכניות אחרונות שפרו את צדדיות, תחולת טבע כמותי של EM, שמובילה התעוררות של ניתוח ultrastructural. התקדמות כוללת 3D EM, EM 2D בקנה מידה גדול שיטות משופרות ריאגנטים עבור במיקרוסקופ אלקטרוני מיקרוסקופיה אור בקורלציה (קלם) כדי להשוות מצבים אחרים של ניתוח מיקרוסקופי ישר לרמת EM 8-10. 2D EM בקנה מידה גדולה מתאים במיוחד לכמת או לזהות (רומן) תכונות מחלת לפתולוגיה אדם, ללמוד במודלים של בעלי חיים עבור מודלי תרבות מחלה ורקמות. בשל השדה בדרך כלל קטן מבט קשה להתאים את השינויים בהגדלה גבוהה בקנה מידה רחב רקמות, כמו גם unbiasedly וכמותית לנתח תכונות ultrastructural. לקבלת ניתוח פתולוגי של רקמה אנושית או הערכת פתולוגיה במודלים של בעלי חיים, haematoxylin ו eosin (H &amp; E) בצבע קטעי פרפין פורמלין קבוע מוטבע (FFPE) tisסו היא התקן. חוץ מזה פשוט immunolabeling צביעת H &amp; E מבוצע גם לזהות חריגויות פתולוגי. אם רקמות כזה יכול להיות מנותח ברמה EM, סוגי תאים מסוימים, ושינויים subcellular ניתן היה לזהות. האופי המוטה של ​​EM בקנה מידה הגדול מאפשר מציאת תכונות צפויות רומן של מחלה. חלקי פנים בקנה מידה גדולה באזורי EM עד מילימטרים רבועים ניתן דמיינו. אנחנו ואחרים בעבר להחיל nanotomy להלשין איי לבלב 4, תרבות 2 תאים, עכברוש מוח 3, עור ובריריות 7 וזחלי דג זברה שלמים 1,5 (www.nanotomy.org). דג הזברה מתאימה מאוד עבור in vivo הדמיה, ב במיוחד לדמיין סוגי תאים אשר קשה גישה ברקמות יונקות כולל תאי חיסון מוח 11. הנה הליך nanotomy מתואר בפירוט, להחיל סעיפי עטרה של ראשי דג זברה שעברו אבלציה עצבית ממותנת על ידי מרה של metronidazole ידי עצביnitroreductase הביע (www.nanotomy.org) 5,12-14. כל הנתונים הגולמיים מוצג כקבצי HTML zoomable, הדמיה מולקולרית לשינויים בהיקף רקמות. הצגת הנתונים הגולמיים מאפשרת ניתוחים משוחדים של מערכי נתונים מזוויות אחרות על ידי מומחים ברחבי העולם.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>low melting point agarose</td><td>VWR</td><td>444152G</td><td></td></tr><tr><td>tricaine</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldehyde</td><td>Polysciences</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>sodium cacodylate</td><td>Sigma</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>osmium tetroxide</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19114</td><td></td></tr><tr><td>potassium ferrocyanide (K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;[Fe(CN)]&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)</td><td>Merck</td><td>4984</td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>VWR</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>uranyl acetate&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>8473</td><td></td></tr><tr><td>sodium tetraborate</td><td>Merck</td><td>1063808</td><td></td></tr><tr><td>toluidene blue</td><td>Merck</td><td>1273</td><td></td></tr><tr><td>basic fuchsin</td><td>BDH</td><td>340324</td><td></td></tr><tr><td>lead citrate</td><td>BDH</td><td>discontinued</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EPON&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-dodecenylsuccinicacid anhydride&amp;nbsp;</td><td>Serva</td><td>20755</td><td></td></tr><tr><td>methylnadic anhydride</td><td>Serva</td><td>29452</td><td></td></tr><tr><td>glycid ether 100</td><td>Serva</td><td>21045</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>553</td><td></td></tr><tr><td>standard flat embedding mold</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70901</td><td></td></tr><tr><td>diamond knife</td><td>Diatome Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>copper grids&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>double sided carbon tape&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>scanning EM Zeiss Supra55</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultramicrotome Leica EM UC7</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>atlas external scan generator&amp;nbsp;</td><td>Fibics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

large-scale scanning transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain

במיקרוסקופ אלקטרונים 2D בקנה מידה גדול (EM), או nanotomy, הוא יישום רחב-רקמה במיקרוסקופ אלקטרונים ברזולוציה של ננו. אחרים ואנחנו בעבר להחיל EM בקנה מידה הגדול כדי איי לבלב עור אנושיים, תרבות רקמות 1-7 זחלי דג זברה כולה. כאן אנו מתארים שיטה ישימה אוניוורסלי עבור EM סריקה בקנה מידת רקמות לגילוי משוחד של תכונות תת-תאיות ומולקולריות. Nanotomy יושמה לחקור את בריא מוח דג זברה ניווניות. השיטה שלנו מבוססת על פרוטוקולי הכנת מדגם סטנדרטיים EM: קיבוע עם glutaraldehyde ו אוסמיום, ואחריו הטבעה אפוקסי-שרף, Ultrathin חתך הרכבת סעיפי Ultrathin על רשתות אחד גומות, ואחריו פוסט מכתים עם uranyl ועופרת. תמונות פסיפס בקנה מידה גדולה 2D EM נרכשות באמצעות סריקה EM מחובר גנרטור סריקת שטח גדול חיצוני באמצעות EM שידור סריקה (STEM). תמונות EM בקנה מידה גדולה הן בדרך כלל ~ 5 - 50 פיקסלים G iגודל n, ו נראה במיטבו באמצעות קבצי HTML zoomable, אשר ניתן לפתוח בכל דפדפן אינטרנט, בדומה מפות HTML גיאוגרפיות באינטרנט. שיטה זו יכולה להיות מיושמת (אדם) רקמה, חתכים של חיות שלמות כמו גם בתרבית רקמת 1-5. כאן, מוח דג זברה נותח מודל אבלציה עצבי לא פולשנית. אנו לדמיין בתוך רקמה במערך יחידה, סלולרית, שינויי subcellular אשר ניתן לכמת בסוגי תאים שונים, כוללים נוירונים microglia, מקרופאגים של המוח. בנוסף, nanotomy הופך לפשוט את המתאם של EM עם מיקרוסקופ אור (קלם) 8 ​​באותו רקמות, כמו שטח פנים גדול צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעבר, יכול להיות כפופים להם ובהמשך EM שטח גדול, וכתוצאה מכך את האנטומיה ננו (nanotomy) של רקמות. בסך הכל, nanotomy מאפשר זיהוי משוחדת ב- רמת EM באופן לכימות-רחב רקמות.

נתוני EM בקנה מידה גדולה של חלקי עטרה של ראש זחלי דג זברה בן 1 שבועות תערוכות רקמות רבות ותכונות הסלולר תמונה בקנה מידה גדולה אחד (www.nanotomy.org). Nanotomy סעיפי שליטת מוח מגלה תכונות ultrastructural טיפוסיות של רקמה העצבית של המוח הקדמי המקורי כולל חוט חבילות חוש ריח, גרעינים עצביים ו-תאים תת עצביים כולל סינפסות (איור 2 א, www.nanotomy.org). סוגי תאים בראש כי ניתן להבחין כוללים chondrocytes עם vacuoles גדול בלסת התחתונה, המיאלין osmiophilic של תאי עצב ההרחה, תאי אנדותל של כלי שיט קטן, מבנים כוללים את meninx (עמיתו דג הזברה של קרומי המוח, את encasing שכבת קרומי במוח היונקים). מבני subcellular כוללים את glycocalyx של האפידרמיס, מורפולוגיות גרעיניות שונות מוקדים ב cel השונה<html> סוגי האברונים l כולל מערכת גולג&#39;י, reticulum endoplasmic (ER), מיטוכונדריה שלפוחית ​​סינפטית וצפיפות הפוסט סינפטי. באופן בלתי צפוי את הגרעינים של תאים המצפים את החדר הם אלקטרונים צפופים מאוד בהשוואה לתאים אחרים התפזרו יותר רוחבי במוח. בנוסף, גרעינים חדרית אלה מראים מוקדים כהים שנעדרים בתאים אחרים במוח להיראות שונים בגודל ומבנה מן heterochromatin, המצוי בגרעין של microglia phagocytic (איור 2). תאים המצפים את החדר בפיתוח דג זברה כוללים ותאי גלייה רדיאלי בעיקר אבות עצביים, אשר עשוי לשקף מצב הכרומטין שינה מאשר תאים מובחנים יותר. כמו תאי גזע ברקמות הם בדרך כלל די נדירים, nanotomy לתאם תיוג רקמות עבור סמני תא גזע עם סולם רקמות EM ולכן יכולה לשמש כדי לזהות תכונות ultrastructural של תאי גזע. ve_content &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; EM-מידה גדולה (www.nanotomy.org) של קטע עטרה בתוך זחל דג זברה שעבר אבלציה עצבית מגלה רקמות ספציפיות רבות, ותכונות תאיות ומולקולריות לא נמצאו אצל בעלי חיים מלאים. תכונות סלולריות כוללות microglia phagocytic ו vacuoles את גודל התאים, מייצג תאים מתים סביר (התרשים 2B, www.nanotomy.org). מחקרי EM קודמים זיהו המיקרוגליאה חוליות 18,19. תכונות אופייניות של microglia כוללות גרעינים מאורכים גושים, של הכרומטין בלתי סדיר ליד מעטפת הגרעין, מערכת גולג&#39;י בולטת, polyribosomes חינם, reticulum endoplasmic הפרטני (ER) עם cisternae הצר וארוך, יחסית כהה / הציטופלסמה צפופה, תכלילים רבים, כגון phagosomes, טיפות שומנים ו lysosomes. כל אלה סימני ההיכר, המיוחס microglia ברקמות יונקים, נמצאו גם בתאים אלה במוח דג הזברה (תרשים 2B, www.nanotomy.org). &lt;p class = &quot;jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53635/53635fig1.jpg" /> איור 1: Workflow של מיקרוסקופית אלקטרונים רקמות בקנה מידה גדול על המוח דג הזברה. (א) 7 זחל דג זברה בן יומו. (ב) ראשי זחל דג זברה מוטבעים זו לצד זו שרפה אפוקסי. (C) סכין זכוכית חצי -thin חתך ואת מכוון את הדגימה. (ד) סעיף מוכתם הכחול נציג semithin toluidine מראה שני Side-by-side מוטבע זחלי דג זברה. (E) Diamond סכין לחתוך ultrathin (70 ננומטר) סעיפים. (F) נערך תמונה (ד) סעיף מוח זחל דג זברה כולה על רשת אחת-חור כדי לציין מיקום. (G) מערכת מיקרוסקופית משמש בקנה מידה גדול EM 2D במחקר זה. (H) זרימה של עיבוד תמונה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53635/53635fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן</a>כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53635/53635fig2.jpg" /> . איור 2: תוצאות Nanotomy:. מ מקרומולקולה לרקמות (א) Nanotomy של מוחם של 7 ימים לאחר שליטה הפריה (B) מטופלים (אבלציה העצבית; איור 1), המציגות תכונות ספציפיות העצבית ablated ניווניות של המוח (B) אלה כולל microglia phagocytic, תאים חשוכים שעבר מוות של תאים ומראה ספוגי של רקמה עצבית ((א) ו- (ב)). לוחות עליונים (המותאמים מ 5): תצוגה מוגדלת 10X של אזור מצוין לוחות ביניים. לוחות תיכון: תצוגה מוגדלת 10X של אזור מצוין לוחות נמוכים. (A, פאנל באמצע) נוף בהגדלה גבוהה של סינפסה מראה neuropil ב (א, הפאנל התחתון), שלפוחית ​​סינפטית (SVS) וצפיפות postsynaptic (PD). (B, פאנל באמצע) נוף בהגדלה גבוהה של מיקרוגליאה אמבואידית או אולי מקרופאג (פאנל באמצע, M), המציגות תכונות microglial אמבואידית טיפוסי (הפאנל התחתון) כולל מערכת גולג&#39;י בולט (G), תכלילים כולל vacuoles ליזוזומלית (L). ברי סולם: 50 מיקרומטר (למעלה), 5 מיקרומטר (באמצע) ו -0.5 מיקרומטר (למטה). נתון זה יש הבדל בין 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53635/53635fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו</a> , או בקר באתר המקוון נתונים מלא (nanotomy.org).

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain at JoVE.com

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.

סריקה הילוכים בקנה מידה גדול מיקרוסקופית אלקטרונים (Nanotomy) של בריאה ונפצעו דג הזברה המוח

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

large-scale-scanning-transmission-electron-microscopy-nanotomy

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

11.0K Views.  UMC Groningen. Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury. 

Video: Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

אלומת יונים ממוקדת כרסום מיקרוסקופיית אלקטרונים של רקמת המוח

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Neuroscience

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biology

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at cellular and subcellular resolution. Advances in molecular and imaging technologies have allowed us to gain numerous detailed insights into cellular and molecular mechanisms of brain development in the transparent zebrafish embryo. Recently, processes of refinement of neuronal connectivity that occur at later larval stages several weeks after fertilization, which are for example control of social behavior, decision making or motivation-driven behavior, have moved into focus of research. At these stages, pigmentation of the zebrafish skin interferes with light penetration into brain tissue, and solutions for embryonic stages, e.g., pharmacological inhibition of pigmentation, are not feasible anymore.
Therefore, a minimally invasive surgical solution for microscopy access to the brain of awake zebrafish is provided that is derived from electrophysiological&#160;approaches. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neurons and axonal tracts without damage. This allows for recording neuronal morphology, including synaptic structures and their molecular contents, and the observation of physiological changes such as Ca2+ transients or intracellular transport events. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological inhibition or optogenetic manipulation is feasible. This brain exposure approach provides information about structural and physiological changes in neurons as well as the correlation and interdependence of these events in live brain tissue in the range of minutes or hours. The technique is suitable for in vivo brain imaging of zebrafish larvae up to 30 days post fertilization, the latest developmental stage tested so far. It, thus, provides access to such important questions as synaptic refinement and scaling, axonal and dendritic transport, synaptic targeting of cytoskeletal cargo or local activity-dependent expression. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated.

Here we present a method to image the zebrafish embryonic brain in vivo upto larval and juvenile stages. This microinvasive procedure, adapted from electrophysiological approaches, provides access to cellular and subcellular details of mature neuron and can be combined with optogenetics and neuropharmacological studies for characterizing brain function and drug intervention.

In vivo הדמיה של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלי דגי זברה ערים וצעירים על ידי הסרת גולגולת ועור

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo imaging with subcellular resolution. 3PM has two major advantages for deep-tissue imaging over 2PM that has been widely used in biology laboratories: (i) longer attenuation length in scattering tissues by employing ~1,300 nm or ~1,700 nm excitation laser; (ii) less background fluorescence generation due to higher-order nonlinear excitation. As a result, 3PM allows high-contrast structural and functional imaging deep within scattering tissues such as intact mouse brain from the cortical layers to the hippocampus and the entire forebrain of adult zebrafish.
Today, laser sources suitable for 3PM are commercially available, enabling the conversion of an existing two-photon (2P) imaging system to a three-photon (3P) system. Additionally, multiple commercial 3P microscopes are available, which makes this technique readily available to biology research laboratories. This paper shows the optimization of a typical 3PM setup, particularly targeting biology groups that already have a 2P setup, and demonstrates intravital 3D imaging in intact mouse and adult zebrafish brains. This protocol covers the full experimental procedure of 3P imaging, including microscope alignment, prechirping of ~1,300 and ~1,700 nm laser pulses, animal preparation, and intravital 3P fluorescence imaging deep in adult zebrafish and mouse brains.

Three-photon microscopy enables high-contrast fluorescence imaging deep in living biological tissues, such as mouse and zebrafish brains, with high spatiotemporal resolution.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תלת-פוטונית של שלושה פוטונים ברקמות עמוקות במוח של עכברים ושל דגי זברה שלמים

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

ב Vivo הדמיה מוחית שלמה של זחלי דגי זברה

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the cellular resolution. Here, we provide an optimized protocol for performing whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy, including sample preparation and immobilization, sample embedding, image acquisition, and visualization after imaging. The current protocol enables in vivo imaging of the structure and neuronal activity of a larval zebrafish brain at a cellular resolution for over 1 h using confocal microscopy and custom-designed fluorescence microscopy. The critical steps in the protocol are also discussed, including sample mounting and positioning, preventing bubble formation and dust in the agarose gel, and avoiding motion in images caused by incomplete solidification of the agarose gel and paralyzation of the fish. The protocol has been validated and confirmed in multiple settings. This protocol can be easily adapted for imaging other organs of a larval zebrafish.

מחבר זרקור: In Vivo הדמיה של המוח כולו של זחלי זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת מימדי  

Presented here is a protocol for in vivo whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy. The experimental procedure includes sample preparation, image acquisition, and visualization.

ב Vivo הדמיה מוחית שלמה של זחלי דגי זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת מימדי

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the ...

סריקה הילוכים בקנה מידה גדול מיקרוסקופית אלקטרונים (Nanotomy) של בריאה ונפצעו דג הזברה המוח

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

אלומת יונים ממוקדת כרסום מיקרוסקופיית אלקטרונים של רקמת המוח

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

In vivo הדמיה של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלי דגי זברה ערים וצעירים על ידי הסרת גולגולת ועור

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תלת-פוטונית של שלושה פוטונים ברקמות עמוקות במוח של עכברים ושל דגי זברה שלמים

ב Vivo הדמיה מוחית שלמה של זחלי דגי זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת מימדי

ב Vivo הדמיה מוחית שלמה של זחלי דגי זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת מימדי

ב Vivo הדמיה מוחית שלמה של זחלי דגי זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת מימדי