מודל פציעת פצע דקירה של הטקטום האופטי הבוגר באמצעות דגי זברה ומדאקה לניתוח השוואתי של יכולת התחדשות

פציעת פצע דקירה היא שיטת פציעה מכנית הגורמת לאבלציה של תאים לא ספציפיים. שיטה זו מאפשרת הערכה של התפשטות RGC והתמיינות לאחר פגיעה מוחית. פגיעה בפצע דקירה בתיווך מחט היא שיטה פשוטה ויעילה לגרימת פגיעה מוחית.

שיטה זו יכולה להיות מיושמת על דגימות ניסיוניות רבות באמצעות קבוצה סטנדרטית של כלים. יכולת ההתחדשות של דגי הזברה הודגמה באמצעות מודל פציעת פצע דקירה. תובנות חדשות על מנגנון מולקולרי המווסת התחדשות עצבית תורמות לטיפול רגנרטיבי במערכת העצבים המרכזית.

התחילו בהנחת דג זברה בוגר מורדם או מדאקה על מגש קלקר. מקבעים את הדג זקוף בין שתי מחטים של 30 מד המוחדרות אנכית לתוך הקלקר. החזיקו את גוף הדג כדי למנוע מראש הדג לזוז, ולאחר מכן הכניסו אנכית מחט של 30 מד דרך הגולגולת לאזור המדיאלי של אחד מכדורי הטקטום האופטי.

לאחר מכן, העבירו את הדגים הפצועים למיכל דגים עם מי מתקן דגים טריים. לאחר שהדגים התאוששו לחלוטין מההרדמה, העבירו את המיכל למערכת הרבייה. הניחו מגבות נייר על מגש הקלקר כדי להניח את הדג המורדם.

לאחר מכן החזיקו את גוף הדג במקומו על ידי החדרה אנכית של שתי מחטים של 30 מד משני צדי סנפיר פי הטבעת. לאחר הצבת הדג, בצע חתך גחוני מפי הטבעת אל הלב. שמור על הלב גלוי על ידי החדרת שתי מחטים של 30 מד בכל צד.

לאחר מכן השתמש בקצה המלקחיים כדי להסיר את שכבת האפיתל הכסופה. הכנס את המחט 30 מד לתוך החדר, שמירה על השיפוע למעלה, ולעשות חתך לתוך אטריום באמצעות מלקחיים. לאחר מכן, לדחוף PBS לתוך האטריום על ידי לחיצה על המזרק כדי לשטוף את הדם מן האטריום.

כאשר הדם מנוקז והזימים הופכים לבנים, הפסיקו את הזלוף של PBS. מאוחר יותר, הסירו את המחטים המקבעות את גוף הדג במקומו, וקיבעו את הצד הגחוני של הדג כלפי מטה. לאחר חיתוך חוט השדרה והסרת הגולגולת מהטקטום האופטי והטלנספלון, חתכו את עצבי הראייה ונתחו את המוח.

לאחר מכן, העבירו את המוח לצינורות של 1.5 מיליליטר עם מיליליטר אחד של 4% פרפורמלדהיד ב-PBS, כדי לתקן בן לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת המוחות הקבועים שלוש פעמים ב-PBS במשך חמש דקות כל אחת, העבירו את המוחות לצינורות של 1.5 מיליליטר עם מיליליטר אחד במשקל של 30% בנפח סוכרוז ב-PBS כחומר הגנה קריופרוטקטיבי, ודגרו עליהם למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. הכינו את תרכובת ההטבעה על ידי שילוב של 30% סוכרוז עם 30 מיליליטר של טמפרטורת חיתוך אופטימלית, או OCT, תרכובת, ואחסנו את התרכובת בארבע מעלות צלזיוס.

כדי לקרר את הקריומולד פעם אחת, דגרו על בלוק אלומיניום למשך הלילה בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס, והכניסו את הבלוק המקורר מראש לקופסת קלקר עם מכסה למניעת התחממות. עבור קטעי העטרה, הטמע את המוח המנותח בקריומולד על ידי התאמת הכיוון באמצעות מלקחיים מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן, הניחו את הקריומולד על בלוק האלומיניום המקורר מראש בקופסת הקלקר, ואפשרו לתרכובת OCT לקפוא ולהפוך ללבנה.

כאשר התרכובת קופאת, יש למרוח עיגול קטן של תרכובת OCT על דיסק דגימה לפני הרכבת הקריובלוק על דיסק הדגימה. על ידי הנחת דיסק הדגימה בהקפאה, להקפיא את תרכובת OCT. לאחר מכן הניחו את דיסק הדגימה על ראש הדגימה בהקפאה.

לאחר הגדרת הכיוון של cryoblock, לחתוך את OCT כדי להסיר אזורים מיותרים. חתכו מקטעים טוריים בעובי 14 מיקרומטר דרך כל הטקטום האופטי באמצעות קריוסטט, ואחסנו את המגלשות במינוס 25 מעלות צלזיוס. התא הגליה הרדיאלי, או RGC, התפשטות ברקמת המוח של דגי זברה הוערכה.

רוב ה-RGCs התרבו אנטיגן תאי שלילי בהמיספרה הנגדית שלא נפגעה. יומיים לאחר הפציעה, התפשטות RGC נגרמה בצד הפגוע של טקטום המדאקה. לאחר הפגיעה המוחית, שושלת התאים והתמיינות RGC הוערכו באמצעות תיוג ברומודוקסיורידין, או BrdU.

הניתוח המייצג מראה נוירונים שזה עתה נולדו שבעה ימים לאחר הפציעה בדגי הזברה הפגועים ובמדאקה. אחד השלבים הקריטיים בפציעות מפצעי דקירה הוא החדרת מחט ידנית. פציעה עקבית נחוצה ליצירת תוצאות הניתנות לשחזור.

צבעים פלואורסצנטיים יעילים כסמני פצע. מידת פיזור הצבע הפלואורסצנטי מצביעה על מיקום ועומק פצע הדקירה. טכניקה זו מותאמת פוטנציאלית למיני דגים קטנים אחרים, והסתגלות למדאקה מאפשרת השוואה של יכולת התחדשות.