La maggior parte del lavoro è stata eseguita presso la all&#39;UMCG Microscopia e Imaging Center (UMIC), che è sponsorizzato da NWO 175-010-2009-023 e ZonMw 91.111.006; STW &quot;Microscopia Valley 12718&quot; per BNGG. Questo lavoro è stato sponsorizzato da una sovvenzione ZonMw VENI, una borsa di studio di integrazione carriera Marie Curie (risparmio morendo neuroni) e una borsa di Alzheimer Nederland a TJvH

Tutti gli esperimenti con larve di zebrafish sono stati approvati dal Comitato di Sperimentazione Animale dell&#39;Università di Groningen secondo le direttive nazionali e comunitarie. Preparazione 1. Esempio <ol><li> Fissazione e Embedding <ol><li> Fissazione <ol><li> Anestetizzare larve di pesci in tricaine (0,003%) aggiunto alla E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mm CaCl 2, 0,33 mm MgSO 4, 10 mM HEPES, pH 7,6) acqua zebrafish e test per la profondità dell&#39;anestesia colpendo delicatamente con una punta di pipetta 200 microlitri al microscopio dissezione fino a quando il movimento non viene più rilevato (Figura 1A). </li><li> Durante l&#39;elaborazione di campioni per EM correlativo dopo l&#39;acquisizione di dati di imaging in vivo utilizzando confocale o immagini 2 fotoni a 1,8% agarosio come descritto, 5,15 correzione larve in agarosio utilizzando 4% PFA in PBS contenente Triton-X-100 (0,05%). </li><li> Tagliare le larve da agarosio e di processo perEM su larga scala 5. </li><li> Fix larve fresca 4% paraformaldeide in PBS contenente Triton-X-100 (0,05%) per 2 ore a temperatura ambiente in tubi di plastica. Nota: Le cellule in coltura (in vitro) può essere fissato direttamente in glutaraldeide, come descritto nel passaggio successivo (1.1.1.5). </li><li> Rimuovere la soluzione e aggiungere 100 microlitri 0,5% PFA, 2% glutaraldeide (GA), e 0,1 M cacodilato di sodio (pH 7,4). Conservare una notte a 4 ° C. campioni Sciacquare due volte in cacodilato 0,1 M di sodio. </li><li> Tagliare le teste larvali rostralmente per romboencefalo per facilitare la penetrazione di osmio. Utilizzare siringhe sottili / pinze. </li><li> Postfix larve in 1% tetrossido di osmio (OSO 4) /1.5% ferrocianuro di potassio (K 4 [Fe (CN) 6]) in 0,1 M cacodilato di sodio in ghiaccio per 2 ore e sciacquare 3 x 5 min a doppia H 2 O. distillata </li><li> Disidratare in etanolo per 20 min incubazioni in concentrazioni crescenti di etanolo (50%, 70%, 3 volte 100%). </li></ol></li><li>Incorporare <ol><li> Preparare resina epossidica secondo le ricette standard utilizzate nei laboratori EM. Nota: Usiamo resina epossidica come segue: mescolare 19,8 g glicidi etere 100, 9.6 g di 2-dodecenil succinica anidride dell&#39;acido e 11,4 g di anidride methylnadic con un agitatore magnetico. Aggiungere 0,5 g DMP-30 (tris (dimetil) fenolo) e mescolare ancora. </li><li> Incubare larve notte in resina epossidica 50% in etanolo (v / v) durante la rotazione (RT). </li><li> Sostituire diluito resina epossidica con resina pura. Incubare per 30 minuti, aggiungere nuovamente resina fresca e incubare per altri 30 min. Ancora aggiornare la resina e quindi incubare 3 ore a RT, seguita da 15 minuti a 58 ° C ed un altro 1 ora a RT sotto bassa pressione (200 mbar). </li><li> Orientare le teste in stampi all&#39;incorporamento silicio piatta disponibili in commercio sotto un microscopio di dissezione con un ago o uno stuzzicadenti con anteriore rivolta verso il lato dello stampo o quando necessario (Figura 1B). </li><li> Polimerizzare res epossidichein una notte a 58 ° C. Se la resina epossidica è ancora troppo morbido permettere un altro giorno per polimerizzare e indurire a 58 ° C. Test di rigidità facendo pressione con pinze. Se questo lascia facilmente una rientranza permettono un altro giorno per polimerizzare e indurire a 58 ° C. Quando campione è completamente indurito procedere al taglio e sezionamento. </li><li> Tagliare via la resina in eccesso dalle stub usando lame di rasoio (Figura 1B). </li></ol></li></ol></li><li> Sezionamento, a contrasto, e di montaggio <ol><li> sezionamento <ol><li> blocco di resina epossidica Sezione utilizzando un ultramicrotomo. </li><li> Utilizzare un coltello di vetro o un histoknife diamante per tagliare sezioni semisottili (500 nm) per toluidina blu fucsina / base (Figura 1D) colorazione per rilevare il corretto posizionamento. </li><li> Trasferimento semi-sottili sezioni su preparati microscopici di raccoglierli con una pipetta Pasteur di vetro la cui punta è stato chiuso per fusione in una fiamma. Asciutto su una piastra calda uino senza acqua è a sinistra. Macchia per 10 secondi con 1% blu toluidina in acqua su una piastra calda e dopo il risciacquo con acqua, macchia per 10 secondi con 0,05% fucsina base in tetraborato di sodio 1%. Esaminare con un normale microscopio ottico a 10X a 40X. </li><li> Quando viene raggiunta la corretta sito / orientamento all&#39;interno del cervello, continua sezionare il blocco di resina epossidica con una lama di diamante per tagliare sezioni ultrasottili (~ 70 nm; Figura 1E) </li><li> Utilizzare strutture anatomiche facilmente identificabili in e intorno al cervello, compresi pozzi olfattive, occhi, frontiere materia grigia-bianco, per identificare la regione di interesse durante ultrasottile sezionamento e per regolare l&#39;angolo di taglio quando il campione è inclinato. </li><li> Sezione Monte su griglie L2 x 1 rame singola scanalatura (Figura 1F), per consentire l&#39;acquisizione ininterrotto dalle barre della griglia. Utilizzare Formvar griglie rivestite per sostenere le sezioni. </li></ol></li><li> contrasto <ol><li> sezioni ultrasottili macchia sulla griglias per 2 minuti in 2% acetato di uranile in metanolo seguita da Reynolds citrato di piombo per altri 2 min 16. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Acquisizione di immagini <ol><li> Grande STEM Scale Nota: Usiamo la scansione EM con un generatore di scansione esterna in grado di acquisire più grandi campi di vista ad alta risoluzione 3,5,7,17 ​​utilizzando il rilevamento staminali. In genere, una immagine generato in questo modo è equivalente ai campi di vista di circa 100 immagini Transmission Electron Microscope (TEM), riducendo in modo significativo la quantità di cuciture. <ol><li> Montaggio del campione in microscopio <ol><li> Posizionare griglia con sezione nel portacampioni griglia multipla e trasferire nella camera del SEM. </li></ol></li><li> Allineamento del rilevatore STEM <ol><li> Mettere la griglia con il campione sotto la trave e spostarlo in modo che sarà circa. 5 mm dalla pole lenti. Acquisire un&#39;immagine a 20 kV utilizzandoil rilevatore in-lente. </li><li> Focus sul bordo della griglia e regolare distanza di lavoro di 4,0 mm. </li><li> Spostare il supporto del campione ad una posizione sicura e portare nel rivelatore STEM. </li><li> Centrare il foro del rivelatore STEM nell&#39;immagine campo girando le viti regolazioni mentre immagini alla massima velocità con il rilevatore in-lente. </li><li> riportare delicatamente indietro il supporto del campione, che sarà solo in forma tra il polo della lente e il rivelatore. </li><li> Acquisire un&#39;immagine con il rilevatore in-lente per essere sicuri di essere sulla area della sezione. </li><li> Passa per arginare il rilevamento (mezzo di guadagno e tutti i quadranti impostati su &#39;minus&#39;) e acquisire un&#39;immagine e selezionare l&#39;area da sottoporre a scansione. </li><li> Sollevare tensione di accelerazione di 21 kV e attendere la stabilizzazione del fascio (un&#39;immagine stabile di nuovo) e poi andare a 29 kV in passi di 2 kV. </li></ol></li><li> Acquisizione Immagini <ol><li> Pre-irradiare il campione (per evitare modifiche di luminosità provocate dalla e-beam) per lo zoomfuori così l&#39;intera area da sottoporre a scansione adatta la finestra dell&#39;immagine. </li><li> Cambiare l&#39;apertura a 120 micron (per mantenere la gamma dinamica corretta i guadagni rilevatore devono essere ridotti ad un passo). </li><li> De-focus per cui l&#39;immagine è sfocata. </li><li> Rendere l&#39;area sottoposta a scansione il più stretto possibile con l&#39;opzione di scansione area ridotta. </li><li> Imposta velocità di scansione in modo tale che un frame viene analizzato in ca. 1 - 2 sec. Nota: A seconda delle dimensioni e del tessuto che assume tipicamente ½ ora (100 x 100 micron FOV) fino a 3 ore (1.000 x 500 micron). </li><li> Zoom in almeno 100X e la scansione di una piccola area per 10 sec. Nota: quando questa zona non cambia luminosità rispetto ai suoi dintorni, pre-irradiazione è sufficiente. </li><li> Riportare l&#39;apertura 30 micron (e lo stelo guadagno il fluido) </li><li> Mettere a fuoco il campione. </li><li> Allineare l&#39;apertura utilizzando il disco oscillante (a ~ 40,000X ingrandimenti). </li><li> Mentre a fuoco selezionare il più leggero zona / funzione, impostare la velocità di scansione in modo tale che i dettaglisono visibili. </li><li> Nel software microscopio regolare la luminosità e il contrasto guardando con attenzione l&#39;istogramma per mantenere tutti i pixel nella gamma dinamica. Fare lo stesso per più bui dell&#39;area / caratteristiche. </li><li> Torna alla zona luminosa e prova di nuovo. Essere sul sicuro quindi c&#39;è qualche spazio su entrambi i lati dell&#39;istogramma. </li><li> Diminuire così l&#39;intera area da sottoporre a scansione adatta alla finestra di imaging, e avviare il programma di grandi dimensioni di acquisizione dell&#39;area. </li><li> Utilizzare l&#39;opzione procedura guidata per configurare un mosaico selezionando un&#39;area dallo schermo. Usa dimensione dei pixel 2-5 nm a seconda di ciò sono necessari dettagli. Utilizzare tempo di sosta 3 ms per STEM. </li><li> Selezionare l&#39;opzione &quot;messa a fuoco automatica su piastrelle precedente&quot;, utilizzare il software di acquisizione scala messa a fuoco automatica di grandi dimensioni con le impostazioni di default aziendali, la casella di controllo &quot;, verificare l&#39;impostazione prima dell&#39;esecuzione&quot; e definire dove salvare i dati. </li><li> Premere &quot;ottimizzare&quot; per controllare le impostazioni del microscopio. Nota: Ora il tempo necessario sarà shproprio. Questo potrebbe essere fino a 72 ore per 1 x 0,5 mm aree. </li><li> Nella finestra di tipo &quot;risoluzione massima tile&quot; 20.000 così singole tessere non saranno più grandi di 20k x 20k, evitando effetti di bordo smussato. Premere &quot;esecuzione&quot;. </li><li> Quando è stato chiesto per il controllo messa a fuoco e Luminosità / Contrasto (B / C), spegnere generatore di scansione esterna e con attenzione la messa a fuoco e l&#39;astigmatismo nel software microscopio. Non cambiare B / C. Nota: La fase può essere spostato e l&#39;ingrandimento cambiato, ma l&#39;ingrandimento deve essere arretrato per la dimensione in pixel desiderata. </li><li> Accendere generatore di scansione esterna di nuovo e premere il tasto &quot;continua&quot;. </li></ol></li></ol></li></ol> Analisi 3. Dati <ol style="margin-left: 40px;"><li> Aprire il programma visualizzatore di file EM su larga scala e aprire il file &quot;informazioni mosaico&quot;. Si aprirà tutti i TIF file di tegole. Questa preferenza viene eseguita su un&#39;altra stazione di lavoro di non ostacolare nuove acquisizioni. </li><li> Scegliere l&#39;opzione &#39;aucucire intero mosaico (parametri modalità sovrappongono sul mezzo, cuciture soglia di 0,90, la riduzione automatica del rumore. Nel caso i criteri di cucitura non può essere soddisfatta, zoom in e posizionare manualmente piastrelle in posizione e fare clic su &#39;continuare come è&#39;). </li><li> Esporta come file HTML, o in alternativa come un unico TIF. Si noti che per l&#39;esportazione TIF potrebbe essere necessario un ridimensionamento. Includere la dimensione dei pixel finale nel nome del file che consente misurazioni più tardi. </li><li> Eseguire le annotazioni nel file TIF aprendolo in un programma di editing di immagini. In parallelo, aprire il file html stradale in un browser Web per l&#39;osservazione ottimale risoluzione. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

EM permette l&#39;analisi del contesto cellulare con imaging ad alta risoluzione delle macromolecole in contesto biologico. Tuttavia, questo limita tipicamente il campo visivo. Scala più ampia 3D EM è particolarmente adatto per la connettività mappatura neuronale con la creazione di risoluzione nanometrica 3 ricostruzioni tridimensionali, che richiedono un trattamento di dati complessi 10. Al contrario, 2D su larga scala EM richiede solo una singola sezione e cucitura dei dati di imaging, e la valutazione dei dati è possibile da chiunque abbia accesso ad un browser Internet. Noi e gli altri utilizzati in precedenza EM su larga scala per analizzare i tessuti e animali interi. Per quanto riguarda la maggior parte degli approcci, TEM e cuciture SEM-based non hanno i loro vantaggi. Qui, la trasmissione scansione EM (STEM) è stato utilizzato che consente la generazione di un ampio campo visivo ad alta risoluzione. In genere, una sola immagine STEM è equivalente ai campi di vista di circa 100 immagini TEM, riducendo in modo significativo la quantità di cucitura quando l&#39;imaging grande fields di vista ad alta risoluzione. Se è necessaria una maggiore risoluzione, TEM può essere vantaggioso. STEM ha il vantaggio rispetto TEM che i campioni non contrastata possono essere utilizzati con un buon contrasto ultrastrutturale 6. Inoltre, il metodo descritto qui può essere regolato semplicemente per l&#39;uso con il rilevamento elettronico ridiffusa (BSD) su sezioni montate su wafer di silicio, ampliando l&#39;uso di più sistemi microscopio. Tessuti HTML-stradale file EM sono molto utili per la quantificazione, la condivisione di dati che non possono essere stati analizzati per il contenuto completo, che unisce LM e dati EM (CLEM) 8, scopo di presentazione nella ricerca scientifica, per analizzare i dati dei pazienti, e per l&#39;istruzione. In alternativa, in EM larga scala in un SEM, ma non in un TEM, wafer silice può essere usato, che ha due vantaggi principali: BSD può essere utilizzato, più generalmente disponibile sui microscopi a scansione elettronica di STEM rilevamento. In secondo luogo, il montaggio di grandi sezioni (&gt; 1 mm 2 aree diinteressi) è semplice. Montaggio su griglie a fessura singoli è laborioso e tecnicamente impegnativo. Confronto dettagliato tra TEM, SEM e STEM è dettagliato altrove 6. Uno svantaggio di immagini BSD è che, rispetto al gambo, le immagini sono aumentati del rumore. Questo può essere in parte compensato aumentando il tempo di permanenza del pixel, con conseguente tempi di acquisizione più lunghi. Anche se per la preparazione dei campioni di elaborazione relativamente standard EM (fissazione, inclusione e sezionamento) è necessaria 5-7, è tecnicamente impegnativo per tagliare grandi sezioni ultrasottili completamente priva di artefatti. Le sezioni sono molto fragili, si rompono facilmente, piegare o vengono distrutti durante l&#39;imaging, che richiede in genere più ore al set di dati. Tuttavia, a causa della condivisione online dei dati grezzi imparziali, dovrebbe diventare possibile confrontare più facilmente i dati pubblicati, e utilizzare set di dati pubblicati nel dominio aperta come controlli. Attualmente, pochi dispositivi in ​​grado di EM laanalisi RGE scala sono in uso, e quindi l&#39;accessibilità a questa tecnica è piuttosto limitata, anche se la maggior parte dei centri di imaging accolgono gli sforzi di collaborazione. Per le sezioni larga scala il tessuto deve essere fissata correttamente in tutto il campione. Ecco perché una miscela di veloce ma moderata fissativo PFA è usato in combinazione con la lenta ma forte fissativo GA. Taglio e raccogliendo grandi sezioni senza artefatti è difficile. Lavorare con le cialde in combinazione con BSD è più facile rispetto alla raccolta sezioni su griglie singole buche. Heavy post di metallo colorazione è più critica rispetto a EM classica. Poiché l&#39;intera sezione viene esposta ogni manufatto sarà visibile. utenti TEM tipicamente trovano difficoltà a passare ad un SEM, a causa della differenza di funzionamento microscopio. La quantificazione e la condivisione dei dati - Quantificare caratteristiche subcellulari è difficile in singole immagini EM. La possibilità di ingrandire e rimpicciolire su larga scalaimmagini permette facilmente l&#39;identificazione delle cellule di interesse, che possono essere seguiti da misurazioni su scala nanometrica all&#39;interno delle cellule. Questi set di dati indicano che specifici tipi di cellule possono essere rapidamente identificati e quantificati in modo imparziale in questi grandi sezioni di tessuto, sulla base di caratteristiche rilevabili a scale diverse. Per esempio microglia possono essere identificati in base alla loro morfologia e citoplasma denso. Successivamente, dopo lo zoom sulle singole cellule, su scala nanometrica caratteristiche subcellulari e molecolari di queste cellule possono essere misurati all&#39;interno dello stesso insieme di dati, come abbiamo dimostrato in precedenza per la larghezza ER all&#39;interno di una grande scala del tessuto EM cultura dataset 2. Un ulteriore vantaggio del nanotomy è quello di hosting di set di dati di grandi dimensioni in linea permetterà ad altri di esaminare i dati, forse per altre funzioni, e trarre le conclusioni sulla nuova ipotesi. CLEM - Oltre a facilitare EM quantitativa, EM larga scala rende più facile da correlare microsco luceetichettatura pic a livello EM 8. Nel presente esempio è mostrato la presenza di microglia fagocitiche in un modello di ablazione zebrafish. Una questione importante nel campo delle neuroscienze è quello che le singole funzioni e contributi sono di microglia e potenziali altre fonti di fagocitosi e di cellule immunitarie. I primi studi EM hanno dimostrato caratteristiche distintive subcellulare di microglia nella malattia 18. Purtroppo, è difficile etichettare selettivamente microglia in particolare in un ambiente patologico, in quanto presentano un&#39;ampia sovrapposizione con altre cellule immunitarie nella espressione genica, la morfologia e la funzione. Pertanto, non è chiaro se e quando microglia a livello ultrastrutturale differiscono dalle cellule immunitarie da altre fonti, monociti infiltranti derivato macrofagi. Capire se ci sono differenze ultrastrutturali tra queste cellule forniranno un punto di partenza per l&#39;analisi delle differenze funzionali. La combinazione di marcatori transgenici o l&#39;espressione selettiva e CLEM permette detezione di caratteristiche ultrastrutturali selettive per specifiche popolazioni. Diagnosi e la presentazione e l&#39;educazione - Visualizzando nanoscala a microscala all&#39;interno di un unico set di dati di dati EM è notevolmente facilitato ad un vasto pubblico. Con l&#39;aumento delle possibilità e gli strumenti per EM correlativa e su larga scala ci aspettiamo una ripresa di EM nella ricerca di base e medica. Il nostro metodo qui rappresentata viene applicato ad un modello di lesione cerebrale zebrafish 5, ma è stato usato il tessuto umano 7, cervello di ratto 3, in un modello di ratto per il diabete 4 e in coltura cellulare 2, e può essere utilizzato anche in combinazione con un TEM approccio basato il 1 mostra la versatilità di questo metodo. L&#39;operatore al microscopio non è più la registrazione altamente selezionati, e le immagini, quindi, di parte, ma tutte le numerose caratteristiche ultrastrutturali sono registrati e aperto per l&#39;analisi di tutto il mondo.

Recenti sviluppi tecnici hanno migliorato la versatilità, l&#39;applicabilità e la natura quantitativa di EM, che porta a una rinascita di analisi ultrastrutturale. I progressi includono 3D EM, su larga scala 2D EM e metodi migliorati e reagenti per correlato luce microscopia e microscopia elettronica (CLEM) per confrontare altre modalità di analisi microscopica direttamente al livello EM 8-10. Su larga scala 2D EM è particolarmente adatto per quantificare o identificare (romanzo) caratteristiche della malattia di patologia umana, lo studio di modelli animali per i modelli di malattia e di coltura dei tessuti. A causa tipicamente piccolo campo di vista è difficile correlare i cambiamenti ad alto ingrandimento ad una vasta scala di tessuto, nonché unbiasedly e quantitativamente analizzare caratteristiche ultrastrutturali. Per l&#39;analisi patologica di tessuto umano o la valutazione della patologia in modelli animali, ematossilina e eosina (H &amp; E) colorato sezioni di formaldeide paraffina fisso incorporato (FFPE) tisSue è lo standard. Oltre semplice colorazione H &amp; E immunomarcatura viene eseguita anche per identificare le anomalie patologiche. Se tali tessuti possono essere analizzate a livello EM, specifici tipi cellulari, e potrebbero essere identificati modifiche subcellulari. La natura imparziale della EM larga scala permette di trovare caratteristiche inaspettate e nuove di malattia. In larga scala aree em up a millimetri quadrati possono essere visualizzati. Noi e gli altri in precedenza nanotomy di ratto isole pancreatiche 4, coltura cellulare 2, cervello di ratto 3, della pelle e delle mucose 7 e tutto larve di pesce zebra 1,5 (www.nanotomy.org) applicato. Zebrafish sono molto adatto per l&#39;imaging in vivo, in particolare per visualizzare tipi di cellule che sono di difficile accesso nei tessuti dei mammiferi compreso cerebrali cellule immunitarie 11. Qui la procedura nanotomy è descritta in dettaglio, applicato a sezioni coronali di teste zebrafish sottoposti condizionale ablazione neuronale mediante conversione di metronidazolo da neuronaleespresso nitroreduttasi (www.nanotomy.org) 5,12-14. Tutti i dati grezzi si presenta come file HTML zoomabile, la visualizzazione molecolare per cambiamenti di scala dei tessuti. La presentazione dei dati grezzi permette analisi imparziali di set di dati provenienti da altre angolazioni da parte di esperti di tutto il mondo.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>low melting point agarose</td><td>VWR</td><td>444152G</td><td></td></tr><tr><td>tricaine</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldehyde</td><td>Polysciences</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>sodium cacodylate</td><td>Sigma</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>osmium tetroxide</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19114</td><td></td></tr><tr><td>potassium ferrocyanide (K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;[Fe(CN)]&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)</td><td>Merck</td><td>4984</td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>VWR</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>uranyl acetate&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>8473</td><td></td></tr><tr><td>sodium tetraborate</td><td>Merck</td><td>1063808</td><td></td></tr><tr><td>toluidene blue</td><td>Merck</td><td>1273</td><td></td></tr><tr><td>basic fuchsin</td><td>BDH</td><td>340324</td><td></td></tr><tr><td>lead citrate</td><td>BDH</td><td>discontinued</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EPON&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-dodecenylsuccinicacid anhydride&amp;nbsp;</td><td>Serva</td><td>20755</td><td></td></tr><tr><td>methylnadic anhydride</td><td>Serva</td><td>29452</td><td></td></tr><tr><td>glycid ether 100</td><td>Serva</td><td>21045</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>553</td><td></td></tr><tr><td>standard flat embedding mold</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70901</td><td></td></tr><tr><td>diamond knife</td><td>Diatome Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>copper grids&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>double sided carbon tape&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>scanning EM Zeiss Supra55</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultramicrotome Leica EM UC7</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>atlas external scan generator&amp;nbsp;</td><td>Fibics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

large-scale scanning transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain

Su larga scala di elettroni 2D microscopia (EM), o nanotomy, è l&#39;applicazione a livello dei tessuti della microscopia elettronica risoluzione nanometrica. Altri e abbiamo precedentemente applicati EM su larga scala a pelle umana isole pancreatiche, coltura di tessuti e tutta larve di zebrafish 1-7. Qui si descrive un metodo universalmente applicabile per la scansione dei tessuti scala EM per la rilevazione imparziale delle caratteristiche sub-cellulari e molecolari. Nanotomy è stata applicata per indagare il sano e un cervello zebrafish neurodegenerativa. Il nostro metodo si basa su protocolli di preparazione del campione standardizzati EM: Fixation con glutaraldeide e osmio, seguita da embedding resina epossidica, ultrasottile sezionamento e montaggio di ultrasottili-sezioni di griglie di un foro, seguita da colorazione con posta uranile e piombo. Su larga scala le immagini 2D EM mosaico vengono acquisite utilizzando una scansione EM collegato ad un generatore di un&#39;ampia area di scansione esterna usando EM trasmissione scansione (STEM). Su larga scala le immagini EM sono in genere ~ 5 - 50 G pixel Idimensione n, e ottimizzato per l&#39;utilizzo di file HTML zoomabile, che possono essere aperti in qualsiasi browser web, simili a carte geografiche HTML on-line. Questo metodo può essere applicato al tessuto (umano), sezioni trasversali di animali interi nonché coltura tissutale 1-5. Qui, cervelli zebrafish sono stati analizzati in un modello di ablazione neuronale non invasivo. Visualizziamo all&#39;interno di un unico tessuto set di dati, cellulare e subcellulare cambiamenti che può essere quantificato in vari tipi di cellule, tra cui i neuroni e microglia, i macrofagi del cervello. Inoltre, nanotomy facilita la correlazione di EM con microscopia ottica (CLEM) 8 sul tessuto stesso, come grandi superfici precedentemente ripreso con microscopia a fluorescenza, può essere successivamente sottoposto a grande area EM, conseguente nano-anatomia (nanotomy) di tessuti. In tutto, nanotomy permette la rilevazione imparziale di funzioni a livello EM in maniera quantificabile a livello dei tessuti.

Su larga scala EM set di dati di sezioni coronali del capo di 1 settimane di età larve di zebrafish mostra molti dei tessuti e le caratteristiche cellulari singola immagine larga scala in (www.nanotomy.org). Nanotomy di sezioni di cervello di controllo rivela caratteristiche tipiche ultrastrutturali del tessuto neurale del cervello anteriore rostrale tra cui fasci di fibre, olfattive nuclei neuronali e neuronali sub-comparti tra cui sinapsi (Figura 2A, www.nanotomy.org). tipi di cellule nella testa, che possono essere distinti includono condrociti con grandi vacuoli nella mascella inferiore, mielina osmiophilic delle cellule nervose olfattive, cellule endoteliali di una piccola imbarcazione, strutture includono la meninge (la controparte zebrafish delle meningi, lo strato membranoso encasing il cervello dei mammiferi). strutture subcellulari includono glicocalice dell&#39;epidermide, diverse morfologie nucleari e focolai in diversi cel<html> tipi L e organelli, tra cui apparato di Golgi, reticolo endoplasmatico (ER), mitocondri e vescicole sinaptiche e densità post-sinaptica. Inaspettatamente i nuclei delle cellule che rivestono ventricolo sono molto elettroni dense rispetto ad altre cellule disperse più lateralmente nel cervello. Inoltre, questi nuclei ventricolari mostrano focolai scura che sono assenti in altre cellule del cervello e appaiono diverse per dimensioni e struttura dal heterochromatin, che si trova in nuclei di microglia fagociti (Figura 2). Cellule che rivestono il ventricolo nello sviluppo di zebrafish sono cellule gliali radiali per lo più e progenitori neuronali, che può riflettere uno stato della cromatina alterata di cellule più differenziate. Come le cellule staminali nel tessuto sono generalmente abbastanza rari, nanotomy di correlare l&#39;etichettatura dei tessuti per i marcatori di cellule staminali con scala tessuto EM potrebbe quindi essere utilizzato per identificare caratteristiche ultrastrutturali delle cellule staminali. ve_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; su larga scala EM (www.nanotomy.org) di una sezione coronale in una larva zebrafish fase di ablazione neuronale rivela molti tessuti specifici, e le caratteristiche cellulari e molecolari che non si trovano in animali di controllo. caratteristiche cellulari includono microglia fagociti e vacuoli le dimensioni delle cellule, probabilmente rappresentano cellule morenti (Figura 2b, www.nanotomy.org). precedenti studi hanno identificato EM microglia nei vertebrati 18,19. caratteristiche dei microglia includono nuclei allungati , ciuffi di cromatina chiazze vicino alla membrana nucleare, apparato di Golgi prominente, poliribosomi liberi, granulari reticolo endoplasmatico (ER) con una lunga cisterne stretto, relativamente scura densa citoplasma / e numerose inclusioni, come phagosomes, gocce lipidiche e lisosomi. Tutti questi caratteristiche, attribuiti a microglia nei tessuti dei mammiferi, sono stati trovati anche in queste cellule nel cervello di zebrafish (Figura 2b, www.nanotomy.org). &lt;p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53635/53635fig1.jpg" /> Figura 1: Flusso di lavoro di tessuto larga scala microscopia elettronica a Brains Zebrafish. (A) 7 giorni vecchio larva zebrafish. (B) Zebrafish teste larvali incorporati fianco a fianco in resina epossidica. Coltello (C) vetro per semi-sottile sezionamento e orientare il campione. Rappresentante semisottile blu di toluidina sezione colorato che mostra due (D) side-by-side integrato larve di pesce zebra. (E) diamante coltello per tagliare ultrasottili sezioni (70 nm). (F) immagine modificata in (D) di tutta la sezione del cervello larve zebrafish sulla griglia da un unico foro per indicare il posizionamento. (G) sistema di Microscopia utilizzato su larga scala 2D EM in questo studio. (H) Flusso di elaborazione delle immagini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53635/53635fig1large.jpg" target="_blank">clicca qui</a>per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53635/53635fig2.jpg" /> . Figura 2: Nanotomy Risultati:. Da macromolecola al tessuto (A) Nanotomy del cervello di 7 giorni di controllo dopo la fecondazione e (B) trattati (ablazione neuronale; Figura 1), che mostra le caratteristiche specifiche del neuronale ablated degenerativa del cervello (B) Questi includere microglia fagociti, cellule scure sottoposti morte cellulare e l&#39;aspetto spugnoso del tessuto neurale ((A) e (B)). Pannelli superiori (adattati da 5): 10X vista ingrandita della regione indicati in pannelli centrali. Pannelli di cuore: vista 10 volte ingrandita della regione indicati in pannelli inferiori. (A, pannello centrale) Vista di alto ingrandimento neuropil mostrando sinapsi in (A, pannello inferiore), vescicole sinaptiche (SVS) edensità postsinaptica (PD). (B, pannello centrale) vista Alto ingrandimento della microglia ameboidi o, eventualmente, un macrofago (pannello centrale, M) che mostra caratteristiche tipiche ameboidi microgliali (pannello inferiore) tra cui Golgi di primo piano (G), inclusioni tra cui vacuoli lisosomiali (L). Barre di scala: 50 micron (in alto), 5 micron (al centro) e 0,5 micron (in basso). Questo dato è stato modificato da 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53635/53635fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura</a> , o visitare i dati on-line completo (nanotomy.org).

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Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.

Su larga scala scansione microscopia elettronica a trasmissione (Nanotomy) di sana e feriti Zebrafish Cervello

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

11.0K Views.  UMC Groningen. Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury. 

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Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Ion Beam concentrato di fresatura e Microscopia Elettronica a Scansione di tessuto cerebrale

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Neuroscienze

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biologia

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualizzare il cervello in via di sviluppo nel pesce zebra vivente utilizzando Brainbow e Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imaging 3D e ricostruzione di strutture cerebrovascolari in Zebrafish embrionali

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at cellular and subcellular resolution. Advances in molecular and imaging technologies have allowed us to gain numerous detailed insights into cellular and molecular mechanisms of brain development in the transparent zebrafish embryo. Recently, processes of refinement of neuronal connectivity that occur at later larval stages several weeks after fertilization, which are for example control of social behavior, decision making or motivation-driven behavior, have moved into focus of research. At these stages, pigmentation of the zebrafish skin interferes with light penetration into brain tissue, and solutions for embryonic stages, e.g., pharmacological inhibition of pigmentation, are not feasible anymore.
Therefore, a minimally invasive surgical solution for microscopy access to the brain of awake zebrafish is provided that is derived from electrophysiological&#160;approaches. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neurons and axonal tracts without damage. This allows for recording neuronal morphology, including synaptic structures and their molecular contents, and the observation of physiological changes such as Ca2+ transients or intracellular transport events. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological inhibition or optogenetic manipulation is feasible. This brain exposure approach provides information about structural and physiological changes in neurons as well as the correlation and interdependence of these events in live brain tissue in the range of minutes or hours. The technique is suitable for in vivo brain imaging of zebrafish larvae up to 30 days post fertilization, the latest developmental stage tested so far. It, thus, provides access to such important questions as synaptic refinement and scaling, axonal and dendritic transport, synaptic targeting of cytoskeletal cargo or local activity-dependent expression. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated.

Here we present a method to image the zebrafish embryonic brain in vivo upto larval and juvenile stages. This microinvasive procedure, adapted from electrophysiological approaches, provides access to cellular and subcellular details of mature neuron and can be combined with optogenetics and neuropharmacological studies for characterizing brain function and drug intervention.

Imaging in vivo del tessuto cerebrale completamente attivo in larve di zebrafish svegli e giovani mediante rimozione del cranio e della pelle

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo imaging with subcellular resolution. 3PM has two major advantages for deep-tissue imaging over 2PM that has been widely used in biology laboratories: (i) longer attenuation length in scattering tissues by employing ~1,300 nm or ~1,700 nm excitation laser; (ii) less background fluorescence generation due to higher-order nonlinear excitation. As a result, 3PM allows high-contrast structural and functional imaging deep within scattering tissues such as intact mouse brain from the cortical layers to the hippocampus and the entire forebrain of adult zebrafish.
Today, laser sources suitable for 3PM are commercially available, enabling the conversion of an existing two-photon (2P) imaging system to a three-photon (3P) system. Additionally, multiple commercial 3P microscopes are available, which makes this technique readily available to biology research laboratories. This paper shows the optimization of a typical 3PM setup, particularly targeting biology groups that already have a 2P setup, and demonstrates intravital 3D imaging in intact mouse and adult zebrafish brains. This protocol covers the full experimental procedure of 3P imaging, including microscope alignment, prechirping of ~1,300 and ~1,700 nm laser pulses, animal preparation, and intravital 3P fluorescence imaging deep in adult zebrafish and mouse brains.

Three-photon microscopy enables high-contrast fluorescence imaging deep in living biological tissues, such as mouse and zebrafish brains, with high spatiotemporal resolution.

Microscopia a fluorescenza a tre fotoni nei tessuti profondi nel cervello intatto di topo e zebrafish

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

In vivo Imaging dell'intero cervello delle larve di pesce zebra

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the cellular resolution. Here, we provide an optimized protocol for performing whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy, including sample preparation and immobilization, sample embedding, image acquisition, and visualization after imaging. The current protocol enables in vivo imaging of the structure and neuronal activity of a larval zebrafish brain at a cellular resolution for over 1 h using confocal microscopy and custom-designed fluorescence microscopy. The critical steps in the protocol are also discussed, including sample mounting and positioning, preventing bubble formation and dust in the agarose gel, and avoiding motion in images caused by incomplete solidification of the agarose gel and paralyzation of the fish. The protocol has been validated and confirmed in multiple settings. This protocol can be easily adapted for imaging other organs of a larval zebrafish.

Autore in primo piano: Imaging in vivo dell'intero cervello di larve di pesce zebra mediante microscopia a fluorescenza tridimensionale  

Presented here is a protocol for in vivo whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy. The experimental procedure includes sample preparation, image acquisition, and visualization.

In vivo Imaging dell'intero cervello delle larve di zebrafish mediante microscopia a fluorescenza tridimensionale

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the ...

Su larga scala scansione microscopia elettronica a trasmissione (Nanotomy) di sana e feriti Zebrafish Cervello

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Imaging strutture subcellulari nell'embrione Living Zebrafish

Ion Beam concentrato di fresatura e Microscopia Elettronica a Scansione di tessuto cerebrale

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

Visualizzare il cervello in via di sviluppo nel pesce zebra vivente utilizzando Brainbow e Time-lapse Confocal Imaging

Imaging 3D e ricostruzione di strutture cerebrovascolari in Zebrafish embrionali

Imaging in vivo del tessuto cerebrale completamente attivo in larve di zebrafish svegli e giovani mediante rimozione del cranio e della pelle

Microscopia a fluorescenza a tre fotoni nei tessuti profondi nel cervello intatto di topo e zebrafish

In vivo Imaging dell'intero cervello delle larve di zebrafish mediante microscopia a fluorescenza tridimensionale

In vivo Imaging dell'intero cervello delle larve di zebrafish mediante microscopia a fluorescenza tridimensionale

In vivo Imaging dell'intero cervello delle larve di zebrafish mediante microscopia a fluorescenza tridimensionale