המחברים מודים לחברים בעבר ובהווה של המעבדות שלנו שעזרו לפתח את הטכניקות הללו. מימון חלקי שנמסר לי DE על ידי מענק ממכון קליפורניה לרפואת רגנרטיבית / CIRM (RN1-00538).

1. דג הזברה בעלי, דור עובר, וטיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל פרוטוקולי דג הזברה הבאים תחת הדרכתו של ועדה מוסדית טיפול בבעלי החיים ושימוש (IACUC) ובמסגרת הנחיות טיפול בבעלי חיים של NIH או גופים / הנחיות רגולטוריות אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זני דג הזברה שמבטאים חלבוני ניאון ברקמות ספציפיות, תאים או איברים זמינים ממרכז המשאבים הבינלאומי דג הזברה (Zirc). לדוגמא, Tg (KDR: EGPF) s843 להביע EGFP בתאי אנדותל כלי דם 6, אשר יכול לשמש לייצור מבני כלי דם 3D מלאים כפי שמוצג בפרוטוקול זה. קווים אחרים של דג הזברה מהונדס זמינים Zirc. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דג הזברה מבוגר בית במערכת חקלאות ימית מתאימה המנטרת את רמת חומציות, מליחות, טמפרטורה, חמצן מומס, אור, וגורמים סביבתיים אחרים 7. דג הזברה מוצגת כאן שוכנו במערכת Aquaneering Inc (סן דייגו, קליפורניה) בשעה 28.5 ° C עם lig 14 שעהמחזור כהה ht/10 שעה. להאכיל את דג הזברה מבוגר דיאטה מאוזנת של ארטמיה ומזון NRD 4/6 דגים (ארטמיה ישירה, אוגדן, יוטה.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכר בוגר ודג זברת נקבה בגיל פוריות צריך להיות שוכנו בנפרד כדי להגדיל מוצלח הזדווגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר הטלת ביצים והפריה על ידי הצבת נקבות (2-4) וגברים (4-6) יחד במכל הזדווגות שיש לו תחתית רשת עם חורים גדולים מספיק לביצים ליפול דרך, אבל קטן מדי עבור המבוגרים דג הזברה לעבור . הגדרת הזדווגויות הערב לפני; ביצים מוטלות ליד שחר, בדרך כלל בזמן מחזור שעות היום האור מגביר לאט בעצימות (שחר). בדוק עבור ביצים בחלק התחתון של מיכל ההזדווגות כל 15-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף ביצים באמצעות מסננת רשת ונקיה עם חיץ E3 (5 mM NaCl, 0.17 מ&quot;מ KCl, 0.33 מ&quot;מ CaCl 2, 0.33 מ&quot;מ MgSO 4). מעביר את הביצים ל100 תרבות צלחות מ&quot;מ מלא בחיץ E3 וחנות בחממה 28 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללמוד כימיקלים שמשנים CERebrovascular הסתעפות להוסיף ריכוזים כימיים הרצויים. לדוגמא הסתעפות neovasular יכולה להיגרם עם מעכבי γ-secretase (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)] אסתר-S-phenylglycinet-בוטיל) solubilized ב4 DMSO, החל 24 שעות שלאחר הפריה (hpf). באותו הזמן עובר נקודה הם עדיין בתוך סיסי, וכימיקלים רבים יכולים לעבור את זה 8. אם מצב טיפול יש השפעות עצביות או מנוע שעלול לפגוע ביכולתם של עוברים להשתחרר מסיסי, ולאחר מכן עובר צריך להיות דה chorionated בין 24 ו48 hpf, אשר יכול להיעשות גם עם מלקחיים של pronase 2. עוברים שמוצגים בתמונות שסופקו היו dechorionated בעדינות על ידי תופס סיסית עם שני מלקחיים מחודדים וקורע אותה פתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך / רצוי, היווצרות פיגמנט יכולה להיות מעוכבת על ידי הוספת 0.003% N-Phenylthiourea (PTU) למאגר שE3 ב24 hpf. </li></ol> 2. Confocal הדמיה של כלי הדם במוח Structures בעוברי דג הזברה קבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העוברים ב250 methanesulfonate Tricaine מ&quot;ג / ליטר, ולאחר מכן לתקן אותם על ידי טבילה ב2 - paraformaldehyde 4% בין לילה ב 4 ° C. מכולות עם עוברי ניאון צריכה להיות עטופות בנייר כסף. קבוע פעם אחת, צריכים להיות מאוחסנים עוברי PBS ב 4 מעלות צלזיוס עד צילמו - עוצמת הקרינה EGFP הופכת פחות נפתרה לאחר כשבוע, אבל מורפולוגיה (כפי שנצפו בשדה בהיר) נשמרה הרבה זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לעלות את העובר על ידי הסרת עין אחת הראשון באמצעות מחט טונגסטן חידדה. לחתוך סביב רקמת חיבור העין ראשונה ולאחר מכן לחתוך את השרירים ולבסוף חתך את עצב הראייה כדי לעקור את העין. (הערה: להסיר אם ההדמיה שני הצדדים הוא רצוי בשתי העיניים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע העין מוסרת, הר העובר על coverglass באמצעות ירידה של methylcellulose 3%. לכוון את העובר כך שהצד עם העין שהוסרה עומד בפני coverglass וקרוב לזכוכית ככל האפשר. לכסות את כל העובר עם methylcellulose כדי למנוע התייבשות במהלך הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת העובר רכוב באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוך מצויד מטרת 20x תכנית Apo באיכות גבוהה (צמצם מספרי = 0.75 או יותר) באופן מיידי. תצורה זו עדיפה על מיקרוסקופ שאינו הפוך שיחייב הרבדה העובר בין שני מטוסי זכוכית, ולחיצה על העובר על הזכוכית העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף פרוסות אופטיות במרווחים של 1 מיקרומטר באמצעות הגדרת צמצם בינונית או גדולה. גם צעדים גדולים יותר של 2.5 מיקרומטר ניתן להשתמש בם, אבל זה עלול להיות קשה יותר כדי לקבוע את הסדר המרחבי של אובייקטים קטנים יותר. פתחים קטנים לייצר פירוט חדים יותר, אך הסריקות נדרשות עוד יכולות להלבין EGFP וגם להגביל את העומק של הדמיה לעובר שניתן להשיג. מיקרוסקופ confocal מאפשר הדמיה על חצי דרך עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הדמיה של כל הדגים היא רצויה, להסיר את שני העיניים בתחילת הדרך (ראה הערה בשלב 3.2), לסובב את העובר לאחר לדמייןצד אחד גרם וחזור על השלבים 2.3-2.5 לצד הנגדי. </li></ol> 3. 3D שחזור עוברי דג הזברה Cerebrovasculature <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהפצת פיג&#39;י 3 של ImageJ קוד פתוח (http://fiji.sc), אשר מותאמת במיוחד עבור הדמיות 3D, ללא תשלום, ותואמת עם מחשבי PC, Mac ו-Linux. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערימות יבוא confocal לפיג&#39;י ידי הולך BioFormats לוקוסים&gt; יבואן 9 לאחר מכן בחר תוספים&gt; קובץ confocal, למשל name.ids לערימות של ניקון (איור 2 א). בחר צפו במחסנית עם מצב hyperstack, צבע: גווני אפור, בדוק autoscale, לבדוק ערוצים לפצל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירות אלה יפתחו ארבעה פנלי ערוץ נפרדים; לEGFP רק אחד יהיה צורך, בדרך כלל אחד למטה השלישי. סגור שלושה לוחות האחרים (אדום, כחול ואלפא) והשאיר את התמונה 16 סיביות עם שם ארוך ואחריו (איור 2 א) C = 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם סף על ידי סריקה אם כי את התמונה באמצעות הגלילה taב בחלק התחתון כדי למצוא הפרוסה שיש לו את האזור או מבנה של עניין, ואז ללכת לתמונה&gt; התאם&gt; סף (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפנל שעולה, חלק את הסרגל העליון (רמה שחורה) משמאל, כך שהמבנה ניתן לראות היטב על רקע, ולהשאיר את השקופית התחתונה (ברמה לבנה) שבו הוא (איור 2 ד). בחר B &amp; W, בחר רקע כהה. אל תבחר סף לחשב עבור כל תמונה, אלא אם כן התאמות שונות הנדרשות לכל פרוסה, בחרו רקע שחור. תהליך זה יוצר תמונה של 8 ביט חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזהרה: סף לא ניתן לבטל או נשמר בImageJ, אז ערימת confocal תצטרך להיות מחדש בכל פעם שיש צורך בשינוי. רשום את המספרים ולנסות הגדרות שונות עד לתוצאה הרצויה מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לתוספים&gt; 3D Viewer&gt; סף 0, דגימה מחדש של גורם 1 (הטוב ביותר) או 2 (טוב), בטל את התיבות בצבע אדום והכחולים כדי להפוך את פלט 3D ירוק - אחר זה will לייצר לבן טיוח - בחר החל (לא אוטומטי) (2E איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב, ספין וזום תמונת 3D באמצעות העכבר ומקשי מקלדת (איור 2F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירת תמונות סטילס בכל נקודה על ידי שימוש באפשרות ללכוד בתפריט. גודל תיבת התמונה על המסך מכתיב ממדי פיקסל של התמונה מיוצרים על כך שאם תמונה ברזולוציה גבוהה היא רצויה להפוך את התיבה גדולה יותר על ידי גרירת הפינה ימנית התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור סרט 3D ספינינג על ידי בחירת סיבוב תצוגה&gt; שיא 360 מעלות (איור 2G). ברירות המחדל של סיבוב עד 2 מעלות לכל צעד, אבל זה יכול להיות שונה עד 5 מעלות לדוגמא, אשר ייצרו גדלי קובץ קטנים בהרבה, אבל עשוי להוסיף עצבנות לאנימציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הקובץ באחד מכמה פורמטים זמינים לשימוש מאוחר יותר צפייה עם נגני מדיה, העלאה לאינטרנט, או באמצעות במצגות PowerPoint. נגן המדיה בקוד הפתוח, VLC <a href="http://www.videolan.org/vlc/index.html">(ht</a>TP :/ / www.videolan.org / vlc / index.html), הנו ללא תשלום ומטפל בסרטונים האלה טובים מאוד. </li></ol>

<ol>
	<li>Staudt, D., Stainier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+molecular+and+cellular+mechanisms+of+heart+development+using+the+zebrafish.">Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish.</a> Annu Rev Genet. 46, 397-418 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Cameron, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's-related+peptide+amyloid-&#946;+plays+a+conserved+role+in+angiogenesis.">Alzheimer's-related peptide amyloid-&#946; plays a conserved role in angiogenesis.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Cunvong, K., Huffmire, D., Ethell, D. W., Cameron, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-&#946;+increases+capillary+bed+density+in+the+adult+zebrafish+retina.">Amyloid-&#946; increases capillary bed density in the adult zebrafish retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, 1516-1521 (2013).</li><li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li><li>Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+husbandry+of+zebrafish+(Danio+rerio):+a+review.">The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review.</a> Aquaculture. 269, 1-20 (2007).</li><li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+major+permeability+barrier+in+the+zebrafish+embryo.">Characterization of a major permeability barrier in the zebrafish embryo.</a> Biol Reprod. 59, 1240-1250 (1998).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Opitz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+zebrafish+illuminate+the+dynamics+of+thyroid+morphogenesis+and+its+relationship+to+cardiovascular+development.">Transgenic zebrafish illuminate the dynamics of thyroid morphogenesis and its relationship to cardiovascular development.</a> Dev Biol. 372, 203-216 (2012).</li><li>Gleave, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroanatomical+phenotyping+of+the+mouse+brain+with+three-dimensional+autofluorescence+imaging.">Neuroanatomical phenotyping of the mouse brain with three-dimensional autofluorescence imaging.</a> Physiol Genomics. 44, 778-785 (2012).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Markaki, Y., Smeets, D., Cremer, M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+applications+for+super-resolution+3D+structured+illumination+microscopy.">Fluorescence in situ hybridization applications for super-resolution 3D structured illumination microscopy.</a> Methods Mol Biol. 950, 43-64 (2013).</li><li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. 68, e4272 (2012).</li></ol>

אין מה לחשוף.

השיטות שתוארו כאן לספק בסיס ללימודים חזותיים של מערכת כלי הדם בפיתוח דג הזברה. דגימות בשידור חי ניתן להשתמש כדי להעריך את פרמטרים פיסיולוגיים, כגון קצב לב ונפח פעימת לב, ואילו דגימות קבועות יכולות לשמש לconfocal הדמיה ברזולוציה גבוהה. דרוזופילה וג elegans לאפשר הדמיה של כל גוף, אבל דג הזברה הן בעלי חוליות ולספק מודל שימושי לרקמות חוליות, כולל מערכת כלי דם מרופד תא האנדותל. מחקרים אלה יכולים לשלב קווים מהונדסים משמעותיים ומשאבים הגנומי מהקהילה מחקר דג הזברה. שחזור 3D ו טיוח של תמונות confocal מדג הזברה עוברית, כפי שתואר כאן, מאפשר גישת ביולוגיה של מערכות להסתעפות של כלי דם וצפיפות כלי דם שאינה אפשרי עם מודלים של בעלי חיים גדולים כמו חולדות ועכברים. יתר על כן, כamniotes דג הזברה מתפתחת בסביבה לשינוי (חיץ E3), שבו אפשר להוסיף בקלות גhemicals המעכבים אנזימים ספציפיים או תהליכים אחרים המשפיעים על התפתחות של כלי דם. הריכוז ועיתוי המשלוח כימי ניתן לשנות, מה שמאפשר לחוקר תנאי טיפול לכוונן. 1. שינויים ופתרון בעיות שינויים במערכת זו יכולה לשלב קווים מהונדסים של דג הזברה שמבטאים חלבוני ניאון EGFP או אחרים במגוון רחב של דפוסי רקמות ספציפיים, איבר או אזור 10. יתר על כן, ניתוח של שינויי neovascular ברשתית דג הזברה באחרונה פורסם 5. בעיות עם פיגמנטציה בעוברים ודג זברה מבוגרים יותר יכולות להיות מתוגמלות על ידי מעבר עם קווים מהונדסים, שאינו מייצרים פיגמנטים בקנה מידה או פיגמנט של רשתית. בעיות עם הקרינה מופחתת בדרך כלל כתוצאה מתנאי קיבעון לא הולמים. Paraformaldehyde (4%) ליום 1 הוא אופטימלי, אבל fixatives חזק יותר, כגון glutaraldehyde, tetroxide אוסמיום או אלכוהול, עלוללהרוס הקרינה EGFP. לאחר קיבוע, צריך להיות כל הזמן עובר בPBS ב 4 ° C ותמיד מוגן מפני אור שמש ישיר. 2. מגבלות של טכניקה זו האיכות והרזולוציה של הדמיות 3D מיוצרות עם פרוטוקול זה תלויות באיכות של תמונות שנוצרו. חדירת אור דרך עוברים אלה מוגבלים למישור אמצע sagittal-באמצעות מיקרוסקופ confocal סטנדרטי. היבט זה של הדמיה מגביל את העומק של הדמיה בעוברים ומבוגרים, אבל מערכות מיקרוסקופיה רב פוטון מתקדמות יותר מאפשרות הדמיה בעומקים גדולים יותר. 3. משמעות ביחס לשיטות קיימות פרוטוקול זה מספק גישה לניתוח של רשתות כלי דם ברמה מערכות שיכולים לשלב כל בעלי חיים. ייצוגים קודמים של נתונים כאלה לעתים קרובות הסתמכו על סדרה של תמונות ערוכים יחד, אבל טיוח 3D מספק רזולוציה טובה יותר של רלה המרחביתtionships מעורב. 4. יישומים עתידיים פיתוחים חדשים בתחום הדמיה ועיבוד רקמות יספק יישומים חדשים רבים לשיטות אלה, שעשויים לכלול מה שהופך את עוברים או מבוגרים 11-14 שקוף מבוגרים יותר. שקיפות משופרת תגדיל חדירה לרקמות מאוד על ידי לייזרי פוטונים רב confocal ו. יתר על כן, כמו המהירות של מצלמות וצינורות מכפיל להגדיל זה עשוי להיות אפשרי בקרוב לייצר הדמיות 3D של דגים בזמן אמת, ומספק ממד ה -4 של ניתוח. 5. צעדים קריטיים שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא הכנה להדמיה, הכולל קיבוע נכון. הדמיה צריך להיעשות בהקדם האפשרי לאחר קיבוע עם יעדים באיכות גבוהה שיש להם הפתחים המספריים הטובים ביותר הזמינים. החלטה תלויה במערכת ההדמיה משמשת, מערכות איכות כל כך גבוהה הן בדרך כלל טוב יותר. יצירת הדמיות 3D היא זיכרון אינטנסיבילכך מחשבים עם כמות גדולה של זיכרון ומעבדי גרפיקה טובים יותר, high-end מומלץ. מערכת הביולוגיה החזותית שתוארה כאן כבר מותאמת לדג זברה מהונדס המבטא EGFP בתאי האנדותל של כלי דם, אם כי יכולים להיות מותאמות בשיטות אלה לעוברים מהונדסים המבטאים את ה-GFP, או חלבוני ניאון אחרים, באוכלוסיות של תאי עצב, שרירים, בלוטות או כל מספר של תאים אחרים. היתרון העיקרי בעבודה עם מערכת זו הוא היכולת ללמוד מה שקורה בכל העובר בכל עת במהלך תקופת התפתחותי זה, בבעלי חיים קבועים ו / או בשידור חי.

דג הזברה לספק מערכת רבת עוצמה כדי לחקור ביולוגיה התפתחותית, והשקיפות היחסית של העוברים שלהם ניתנת למחקרים מבוססי הדמיה 1. החברה דג הזברה שמשה כמודל לפיתוח חוליות במשך עשרות שנים. Teleosts, כוללים דג הזברה, יש מערכת כלי דם חוליות פשוטה שאין לו הומולוג סביר בחסרי חוליות. דם נשאב מהלשכה הקדמית של לב שני תאיים דרך זימים, שם הוא מחומצן. דם מהזימים מתכנס באב העורקים הגב ועובר דרך עורקי הסניף לתוך כלי קטן יותר ויותר, בסופו נימי לכת ברקמות איברים. בתוך חמצן נימים הוא שוחרר ופחמן דו חמצני נספג. בצד הוורידים של נימי דם זורם לורידים גדולים יותר ויותר ולבסוף נשאב לתוך התא האחורי של הלב, שבו המחזור חוזר. דג הזברה מבוגר יכולה להניח 200 או יותר ביצים בכל פעם, וoncדואר מופרה, שהם מפתחים במהירות 2. בתוך יום אחד ציר הגוף מפותח, כולל שרירים שחוזה ולהעביר את העובר סביב בתוך קרום כוריוני. מ2-7 ימים לאחר הפריה (DPF) רוב מערכות הגוף לפתח, כולל עיניים ומערכת עצבים מרכזיות שיכולים לתאם שוחה לעבר מזון או הרחק מאור בהיר. עד 7 עוברי DPF הם קטנים מספיק כדי לאפשר הדמיה עם מיקרוסקופ. קווים מהונדסים המבטאים את חלבוני ניאון ניתן הדמיה עם מיקרוסקופיה confocal או הקרינה. ההדמיה confocal ניתן לזווג עם תוכנות קוד פתוח 3 כדי ליצור הדמיות 3D של מבני כלי דם מלאים בעוברי דג הזברה המספקים נקודת מבט ביולוגיה מערכות של התפתחות כלי דם. מחקרים העוסקים בשינויים במורכבות כלי דם וכלי דם במוח ייהנו מפרוטוקול זה כפי שהוא מאפשר ניתוח ברמת מערכות של רשתות כלי דם 4,5. אוסף של שיטות ומשאבים הם לספקד, כדי לאפשר אימוץ קל ושל טכניקות אלה ללימודים שדורשים הדמיה של מבני כלי דם בדג זברה עוברית. יעילות העלות של דג הזברה כמודל חיה היא שילוב עם טכנולוגיות הדמיה המתעוררות לספק פלטפורמות חדשות שבה להעריך את השפעות angiogenic של מסלולים מולקולריים בהתפתחות חוליות והומאוסטזיס.

<table><tbody><tr><td>N &amp;ndash; Phenylthiourea&amp;nbsp;</td><td>Alfa Aesar, catalog #41972</td><td></td><td>0.2 M in E3 buffer, kept at 4 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>E3 buffer</td><td>Sigma</td><td></td><td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Confocal microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>Mat-Tek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSI IX/DAPT</td><td></td><td></td><td>N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences</td></tr><tr><td>24 well plates&amp;nbsp;</td><td>Becton-Dickinson, cat# 351147</td><td></td><td>BD Falcon</td></tr><tr><td>Transfer pipettes&amp;nbsp;</td><td>VWR, cat #414004-001</td><td></td><td>VWR disposable transfer pipettes</td></tr><tr><td>Methyl-cellulose&amp;nbsp;</td><td>Alfa Aesar, cat#43146</td><td></td><td>3% in E3 buffer</td></tr><tr><td>NRD 4/6 Fish food&amp;nbsp;</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td></td><td>Dried</td></tr><tr><td>Brine shrimp</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td></td><td>Live</td></tr><tr><td>Tungsten wire&amp;nbsp;</td><td>Small Parts # TW-016-60</td><td></td><td>0.016&amp;rdquo; OD</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>VWR # 101107-950</td><td></td><td>Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer</td></tr></tbody></table>

imaging and 3d reconstruction of cerebrovascular structures in embryonic zebrafish

דג הזברה הוא כלי רב עוצמה כדי ללמוד ביולוגיה התפתחותית ופתולוגיה בגוף חי. הגודל הקטן ושקיפות היחסית של עוברי דג הזברה להפוך אותם שימושי במיוחד לבדיקה ויזואלית של תהליכים כגון לב והתפתחות כלי דם. בכמה מחקרים שנעשה לאחרונה דג הזברה מהונדס המבטא EGFP בתאי האנדותל של כלי דם שימשו לתמונה ולנתח את רשתות כלי דם מורכבות במוח וברשתית, באמצעות מיקרוסקופיה confocal. תיאורים מסופקים להכין, לטפל ותמונה עוברי דג הזברה שמבטאים את החלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP), ולאחר מכן ליצור הדמיות 3D מקיפות של מערכת כלי הדם במוח. פרוטוקולים כוללים את הטיפול בעוברים, הדמיה confocal, ופרוטוקולי קיבעון שלשמר הקרינה EGFP. יתר על כן, עצות שימושיות על קבלת תמונות באיכות גבוהה של מבני כלי דם במוח, כגון הסרת עין ללא רקמה עצבית סמוכה מזיקה מסופקות. בעיות פוטנציאליותעם ההדמיה confocal הם דנו, יחד עם הצעדים הדרושים כדי ליצור 3D שחזורים מארובות תמונת confocal באמצעות תוכנת קוד פתוח זמינה באופן חופשי.

שחזור 3D של מבני כלי דם מספק נקודת מבט מקיפה ומעניינת מבחינה ויזואלית של פיתוח דג הזברה. איורים שיטות מופע 1 ו -2 כפי שהם בדרך כלל עשו. איור 3 מציג כמה זוויות של מבני כלי דם ב6 DPF עובר דג הזברה שהביע EGFP בתאי האנדותל. עם צבע ירוק או לבן מוצק זה יכול להיות קשה להעריך את עוצמת אות; פסאודו צביעה לספק עוצמת תמונה מלהסתכל למעלה שולחנות ומאפשרת תפיסת עומק טובה יותר כאשר מבנים חופפים. דוגמא לתמונת 3D פסאודו בצבע של כלי הדם ב6 DPF דג הזברה מסופקת באיור 4. דימות פלואורסצנטי של עוברים חיים יכולה לשמש כדי לחקור מאפיינים פיסיולוגיים הכוללים את העין ותנועת גוף, ופעילות לב. איורים 3 ו -4 להראות תוצאות שהושגו עם נציג שיטות אלה, תוך שימוש בקו דג הזברה המהונדס<html> תאר. הדמיה ברזולוציה תלויה במאפייני מיקרוסקופ, אבל הבהירות של אות EGFP מספיק עבור איכות תמונה טובה עם רוב המערכות מסחריות. שיקום וטיוח של ייצוגי 3D הוא עקביים ואפשרויות בתוך תוכנת קוד פתוח זו מספקות תוצאות טובות באופן עקבי. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" width="600" /> איור 1. הסרת עין. א) העובר DPF 3 קבועים עם צורך טונגסטן ממוקם בסמוך לעין. רקמה היא לחתוך מסביב לעין מזו עמדה. B) העין היא נופל החוצה ושרירי העין הבסיסיים ועצב ראייה נחתכים. שקע העין הריק מסומן בעיגול מקווקו. C) אותו העובר התהפך ועלה עם מתיל תאית, בעין ללא פגע פונה כלפי מעלה.<html> hres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" width="600" /> איור 2. צעד אחר צעד שחזור 3D של ערימת תמונת confocal. א) פתח קובץ (4104.1.ids) הטעון בתוך פיג&#39;י באמצעות תוספים&gt; לוקוסים&gt; Bioformat לבחור. ב &#39;) לאחר מציאת פרוסה עם האזור של עניין, התאמת סף נבחרה כפי שמוצגת. C) סף מותאם ל214 משתמש העליון מחוון ולהחיל נבחר. צופה 3D D) נקרא כפי שמוצג. E) שחזור 3D מוצג של דג הזברה עם עין שלמה, להתמצאות. F) התמונה כבר מוגדלת ומסובבת. G) סרט סיבוב של o360 הוא עשה כפי שמוצג.<html> res.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" width="600" /> איור 3. פרספקטיבות משחזור 3D. א) נקודת מבט המדיאלי של 6 העובר DPF צילם עם 10x אובייקטיבי, פה הוא בצד הימין, ולא זימים בתוך פה. ב &#39;) לרוחב של אותו העובר, סנפיר פתק הוא לולאה באמצע.) אותו העובר C צילם עם 20x אובייקטיבי, נקודת מבט המדיאלי, רזולוציה זימים פתק. ד) נקודת מבט רוחבית של 20x הדמיה אובייקטיבית. הסנפיר הוא בקצה הימני של הפנל.) תצוגה Antero-E המדיאלי של 20x הדמיה אובייקטיבית, זימי פתק בתוך הפה של בטן. F) מאותו העובר צילם עם 20x אובייקטיבי, ראשו לצד הימין. שים לב כלי דם בצק החלמון בפינה הימנית התחתונה.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" width="600" /> איור 4. הבדלי עוצמה ב6 עובר DPF. תמונה של שיקום 6 DPF באמצעות להסתכל למעלה שולחנות pseudocolor לעוצמת אות. פה, מוח, זימים וצק חלמון מסומנים להתמצאות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still.jpg" width="500" /> איור 5. הסרט של מערכת כלי דם משוחזרת בדג זברת DPF 4. הדגים היו צילם ב2.5 מיקרומטר. התמונות היומהדמית חצי אחד של העובר. השוואת מבני כלי דם עם מבנים בדג זברה שטופל GSI סיפקו באיור 6. שים לב לצפיפות נמוכה יותר של כלי דם בראש ובזימים גדולים יותר. (ראה קובץ משלים &quot;Zfish_spin.avi&quot; תחת הורדות) <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still1.jpg" width="500" /> איור 6. 3D סרט של מערכת כלי דם בעובר שטופל ב-GSI בDPF 4. הדגים היו צילם ב2.5 מיקרומטר באמצעות מרוחב לקו אמצע. השוואת מבני כלי דם עם השליטה DPF 4 דגים שמוצגים באיור 5. הגב המקומר והגודל קטן יותר אופייניים בעוברים שטופלו בחומר כימי זה. (ראה קובץ משלים &quot;GSI-treated_4dpf_fish.avi&quot; תחת הורדות)

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish at JoVE.com

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

הדמיה של כלי דם במוח בפיתוח דג הזברה זחל הוא תאר. טכניקות כדי להקל על ההדמיה 3D ולשנות התפתחות כלי דם במוח באמצעות טיפולים כימיים גם מסופקות.

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

imaging-3d-reconstruction-cerebrovascular-structures-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K Views.  Western University of Health Sciences.  הדמיה של כלי דם במוח בפיתוח דג הזברה זחל הוא תאר. טכניקות כדי להקל על ההדמיה 3D ולשנות התפתחות כלי דם במוח באמצעות טיפולים כימיים גם מסופקות. 

Video: Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Developmental Biology

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

החדר דג הזברה המוח Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Neuroscience

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of visual impairment, yet mechanisms of eye morphogenesis are still poorly understood. The basic organization of the embryonic eye is conserved throughout vertebrates, thus live imaging of zebrafish embryos has become a powerful approach to directly observe eye development at real time under normal and pathological conditions. Dynamic cell processes including movements, morphologies, interactions, division, and death can be visualized in the embryo. We have developed methods for uniform labeling of subcellular structures and timelapse confocal microscopy of early eye development in zebrafish. This protocol outlines the method of generating capped mRNA for injection into the 1-cell zebrafish embryo, mounting embryos at optic vesicle stage (~12 hours post fertilization, hpf), and performing multi-dimensional timelapse imaging of optic cup morphogenesis on a laser scanning confocal microscope, such that multiple datasets are acquired sequentially in the same imaging session. Such an approach yields data that can be used for a variety of purposes, including cell tracking, volume measurements, three-dimensional (3D) rendering, and visualization. Our approaches allow us to pinpoint the cellular and molecular mechanisms driving optic cup development, in both wild type and genetic mutant conditions. These methods can be employed directly by other groups or adapted to visualize many additional aspects of zebrafish eye development.

This protocol describes an approach for in toto labeling and multidimensional imaging of zebrafish early eye development. We describe labeling, embedding, and four dimensional (4D) imaging using laser scanning confocal microscopy, and considerations for optimizing acquisition of datasets for dissecting mechanisms of optic cup morphogenesis.

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at cellular and subcellular resolution. Advances in molecular and imaging technologies have allowed us to gain numerous detailed insights into cellular and molecular mechanisms of brain development in the transparent zebrafish embryo. Recently, processes of refinement of neuronal connectivity that occur at later larval stages several weeks after fertilization, which are for example control of social behavior, decision making or motivation-driven behavior, have moved into focus of research. At these stages, pigmentation of the zebrafish skin interferes with light penetration into brain tissue, and solutions for embryonic stages, e.g., pharmacological inhibition of pigmentation, are not feasible anymore.
Therefore, a minimally invasive surgical solution for microscopy access to the brain of awake zebrafish is provided that is derived from electrophysiological&#160;approaches. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neurons and axonal tracts without damage. This allows for recording neuronal morphology, including synaptic structures and their molecular contents, and the observation of physiological changes such as Ca2+ transients or intracellular transport events. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological inhibition or optogenetic manipulation is feasible. This brain exposure approach provides information about structural and physiological changes in neurons as well as the correlation and interdependence of these events in live brain tissue in the range of minutes or hours. The technique is suitable for in vivo brain imaging of zebrafish larvae up to 30 days post fertilization, the latest developmental stage tested so far. It, thus, provides access to such important questions as synaptic refinement and scaling, axonal and dendritic transport, synaptic targeting of cytoskeletal cargo or local activity-dependent expression. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated.

Here we present a method to image the zebrafish embryonic brain in vivo upto larval and juvenile stages. This microinvasive procedure, adapted from electrophysiological approaches, provides access to cellular and subcellular details of mature neuron and can be combined with optogenetics and neuropharmacological studies for characterizing brain function and drug intervention.

In vivo הדמיה של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלי דגי זברה ערים וצעירים על ידי הסרת גולגולת ועור

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...