The work was supported in part by the Duncan and Nancy MacMillan Faculty Development Chair Endowment Fund (K.Y.K.), Busch Biomedical Research Grant (K.Y.K.) and the Rutgers Faculty Development Grant (K.Y.K.).

1. שמירה עצמית התחדשות בתאי IMOP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן iMOP תקשורת ותרבות: DMEM / F12, תוספת 1X B27, 25 מיקרוגרם / מיליליטר וcarbenecillin 20 ng / ml bFGF. לעשות 50 מיליליטר של תקשורת בתרבות iMOP באמצעות ריאגנטים סטרילי. לחמם 49 מיליליטר של DMEM / F12 בחרוטי 50 מיליליטר באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוספת ההפשרה 50X B27 ו- 100 מ&quot;ג / מיליליטר carbenecillin aliquots-מעוקר מסנן במשך 5 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. להפשיר 100 מיקרוגרם aliquot / ml bFGF ב RT. הוסף 1 מיליליטר 50X B27, 10 μl של 100 מיקרוגרם / ml bFGF ו12.5 μl של 100 מ&quot;ג / מיליליטר carbenecillin לDMEM / F12. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 3 מיליליטר של תקשורת בצלחת תרבית רקמת 60 מ&quot;מ לתאי iMOP culturing. הוסף מדיה טרי לתרבויות בכל יום אחר על ידי הכפלת הנפח של תקשורת. ודא כי הריכוז של bFGF לא לרדת מתחת 5 ng / ml. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי iMOP תרבות במעלות צלזיוס 37 עם CO 2. תאי מעבר של 5% לאחר 5-7 ימים בתרבות כמפורט בשלבים הבאים. העברת תרבות ל15חרוטי מיליליטר באמצעות קצה פיפטה 10 מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 1 mM EDTA בHBSS על ידי דילול 0.1 מיליליטר של 0.5 M EDTA pH 8.0 ל50 מיליליטר של HBSS. טרום החם mM EDTA 1 עשה בHBSS באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים על ידי שיקוע כובד או צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות. ב RT. לשקיעה הכבידה, למקם את חרוטי 15 מיליליטר המכילים תרבויות בחממת 37 ° C 5 - 10 דקות. לאחר הזמן, להתבונן otospheres לאסוף בתחתית חרוטי 15 מיליליטר. הערה: כוח הצנטריפוגלי מוגזם יכולה לגרום נזק לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות לשאוב בילה מדיה באמצעות 2 מיליליטר aspirating פיפטה מבלי להפריע תא גלולה. הוסף 0.5 מיליליטר של תמיסת 1 mM EDTA HBSS מראש חימם לתא גלולה. בעזרת פיפטה P1000, בעדינות pipet למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים. הנח חרוטי על 37 מעלות צלזיוס ודגירה של &lt;5 דקות כדי להקל על ניתוק לתוך תאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת בעדינות את פתרון התא כדי לקבוע אם otospheres הם ניתקו. אם לא Otoתחומים משקעים לתחתית חרוטי, התאים הם ניתקו. זמן דגירה עשוי להשתנות. הערה: דגירה ממושכת עם EDTA תגרום למות תא מוגזם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים מ -37 מעלות צלזיוס, להוסיף 2 מיליליטר של תקשורת לנטרל ולדלל את EDTA. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות על RT. לשאוב את דילול EDTA בעזרת פיפטה aspirating 2 מ&quot;ל ולהוסיף 5 מיליליטר של 1X PBS לשטוף את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין תאים למטה ב XG 200 במשך 5 דקות על RT ולשאוב את 1X PBS באמצעות פיפטה aspirating 2 מיליליטר. Resuspend התאים בעזרת פיפטה P1000 ב0.5 מיליליטר של תקשורת בתרבות iMOP ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה 2 - 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות מונה חלקיקי microfluidic עם הקלטות המתאימות 28. צלחת ומחוברות של תאי iMOP תכיל ~ 6 X10 6 תאים. לדלל תאי 1: 100 בתקשורת ולהוסיף 75 ul של פתרון נייד לתוך הקלטת לספירה. צלחת 1 x 10 6 תאים בצלחת 6 סנטימטר בcultu iMOPמחדש תקשורת (~ 1: 10 דילול). iMOPs מעבר כל 5 - 7 ימים. הערה: תאים היוצרים otospheres הגדול או לצרף לתחתית צלחת תרבית הרקמה יבדיל. תאים גם ימותו אם התרבויות הן מעל ומחוברות. </li></ol> 2. תאי IMOP הקפאה להפשרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני הקפאה סינתטית על ידי הפשרה וequilibrating הפתרון ל4 מעלות צלזיוס לפני תאי הקפאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים מצלחת סנטימטר ומחוברות 6 תאי iMOP. השתמש פיפטה 10 מיליליטר ותאי העברה (~ 6 - 8 x 10 6 תאים) לחרוטים 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים על ידי שיקוע כובד או צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות על RT. אם otospheres קטן, תאים לא יסתפקו בשקיעה הכבידה. אופציונאלי: ספירת תאים באמצעות צעד 1.9 כדי לקבוע כולל מספרים סלולריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בילה מדיה באמצעות 2ml aspirating פיפטה תוך השארת התא גלולה הרופפת מאחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.25 מיליליטר של תקשורת הקפאה סינתטית לresuspend לסה&quot;נLLS בצפיפות של ~ 5 x 10 x 5 3 10 6 תאים / מיליליטר. בעדינות פיפטה תאים עם טפטפת P1000. מעבירים את ההשעיה התא לבקבוקוני קריוגני בעזרת פיפטה P1000 עם 1 מיליליטר מסונן קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הבקבוקונים במכל הקפאה נטולת אלכוהול ולמקם את מיכל ההקפאה ב -80 ° C כדי להפחית את מעלות צלזיוס בטמפרטורת 1 לדקה עד לטמפרטורה מגיעה -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחסון לטווח הארוך של תאים, להעביר את הבקבוקונים לשלב האדים של טנק נוזל אחסון חנקן. להפשיר את תאים לתרבות, לאזן בקבוקון המכיל תאי קירור קפוא ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת ותרבות iMOP טרום חמה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את הבקבוקון הקפוא במהירות על ידי מתערבל תחתית הבקבוקון באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הוסף 1 מיליליטר של תקשורת בתרבות iMOP מראש חימם לתאים מופשרים פעם גביש הקרח האחרון נעלם. העברת תאים לתוך חרוטי 15 מיליליטר ולהוסיף 4 מיליליטר נוסף של תקשורת בתרבות iMOP </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין שיתוף 15 מיליליטרnical במשך 5 דקות. ב XG 200 ולשאוב התקשורת בילתה. Resuspend התאים 2 מיליליטר של תקשורת בתרבות iMOP ותאי צלחת בצלחת 6 סנטימטר. דגירה תרבויות על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 להרחבה. </li></ol> 3. ההתמיינות תאי IMOP לחושית epithelia <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מיליליטר של תקשורת בידול epithelia החושית iMOP: DMEM / F12, תוספת 1X B27, 25 מיקרוגרם / מיליליטר carbenecillin. לעשות 50 מיליליטר של תקשורת בידול epithelia החושית iMOP. לחמם 49 מיליליטר של DMEM / F12 בחרוטי 50 מיליליטר באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. תוספת ההפשרה 50X B27 ו- 100 מ&quot;ג / מיליליטר carbenecillin aliquots במשך 5 דקות. באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הוסף 1 מיליליטר 50X B27 ו12.5 μl של 100 מ&quot;ג / מיליליטר carbenecillin לDMEM / F12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים למסוק, לנתק, גלול ולספור חזרו על שלבים 1.4-1.9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 x 10 6 תאי צלחת בצלחת 6 סנטימטר ביום -3 באמצעות iMOP תקשורת ותרבות. ביום 0, תרבויות העברה באמצעות פיפטה 10 מיליליטר לחרוטי 15 מיליליטר. לאסוף את Otoתחומים על ידי שקיעה הכבידה כאמור בשלב 1.6. לשאוב בילה מדיה באמצעות 2 מיליליטר aspirating פיפטה ולהשאיר otospheres בתחתית חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף 2 מיליליטר של תקשורת בידול epithelia החושית. העברת otospheres לצלחת 6 סנטימטר בעזרת פיפטה מיליליטר גדולה נשא 10. הערה: גז מכאני מpipetting הקשה יכול לנתק תאים מotospheres. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של תקשורת בידול אפיתל החושית הטרי לתרבויות בכל יום אחר. במידת צורך, ניתן לאסוף תאים על ידי שיקוע כובד ותקשורת הוחלף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף otospheres ביום 10 על ידי העברה לחרוטי 15 מ&quot;ל ומאפשר לotospheres משקע כאמור בשלב 1.6.Aspirate התקשורת בילתה באמצעות 2 מיליליטר aspirating פיפטה ולהשאיר otospheres באין מפריע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן otospheres ידי דוגרים בפורמלין 4% ב1X PBS במשך 15 דקות ב RT. הסר פתרון פורמלדהיד, לשטוף otospheres עם חיץ לשטוף (1X PBS המכיל 0.1% TritonX-100) לפני דוגרים בחסימת חיץ (1X PBS המכיל 10% עזים בסרום נורמלי ושל 0.1% Triton X-100) במשך שעה 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף חיץ דגירה דגימות בחסימת חיץ עם נוגדן מדולל. דגירה על 4 מעלות צלזיוס. לשטוף דגימות עם 1X PBS המכיל 0.1% בכפוף Triton X-100 otosphere לimmunostaining 27. העברת otospheres ל1X PBS וotospheres מקום לתליית תקשורת בשקופית זכוכית בעזרת פיפטה P1000. שים coverslip על המדגם ולאפשר תקשורת הרכבה לייבוש על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות epifluorescence באמצעות התקנת מיקרוסקופ הפוכה מצוידות במצלמת 16 ביט CCD וגם אוויר 20X 0.75 או אובייקטיבי טבילת שמן NA 40X 1.3. לאסוף הקרינה מערוצי צבע שונים באמצעות רשום (העירור ופליטה) אורכי גל: כחולה (377 ± 25 ננומטר / 447 ± 30 ננומטר), ירוק (475 ± 25 ננומטר / 540 ± 25 ננומטר), אדום (562 ± 20nm / ו625 20nm ±) ואינפרא-אדום (628 ± 20nm / ו692 ± 20ננומטר). </li></ol> 4. Assaying edu התאגדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום -3, צלחת 1 x 10 6 תאי iMOP בצלחת 6 סנטימטר. שלושה ימים לאחר מכן ביום 0, קציר, לנתק, גלול ולספור תאים על ידי חזרה על שלבי 1.4-1.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 2.5 x 10 5 תאים בתקשורת ותרבות iMOP ו -5 5 תאים x10 בתקשורת בידול epithelia החושית בבארות שונות של צלחת 6 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את אחוז התאים בשלב S ידי התאגדות edu ביום 3 באמצעות assay התאגדות edu <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מניית edu ישירות לתרבויות iMOP להשיג ריכוז סופי של 1 מיקרומטר edu בתקשורת והתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה edu בתרבויות iMOP לשעה 2 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. קציר, תאים לנתק ולאסוף לחזור על שלבים 1.4-1.9. להוסיף בפורמלדהיד 4% ב1X PBS במשך 15 דקות. ב RT לתקן תאים. קציר תאים על ידי צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות על RT. הסר פתרון פורמלדהיד וproperly להיפטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרעיני תווית של תאים עם Hoechst ושולבו edu עם צבע-אזיד הקרינה ירוקה על פי הפרוטוקול של היצרן. הערה: כל שטיפות נעשות עם 1X PBS, תאי Tween 20. לשטוף 3 BSA% ו -0.1% עם 1X PBS פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי הר בשקופית באמצעות antifade מגיב ולמקם את זכוכית 1.5 כיסוי על המדגם. לרכוש תמונות ניאון של תאים שכותרתו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. </li></ol></li></ol> 5. ההתמיינות נוירונים הנגזר IMOP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות 50 מיליליטר של תקשורת בידול העצבית: תקשורת Neurobasal, תוסף B27 1X, 2 מ&quot;מ L- גלוטמין. בקבוק הפשרה של 50X B27 ו -200 המ&quot;מ L- גלוטמין 37 ° C אמבט מים במשך 5 דקות. הוסף 1ml 50X B27 ו 0.5 מיליליטר 200 המ&quot;מ L- גלוטמין ל48.5 מיליליטר של תקשורת Neurobasal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverglass מעיל על ידי הצבת 12 מ&quot;מ עגול 1.5 coverslips זכוכית בצלחת 10 סנטימטר סטרילי ולהוסיף 70% EtOH לצלחת לעיקור ולנקות את coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להתסיס את המפרץrslips כדי להבטיח שהם מכוסים באתנול. השאר את הצלחת במשך 10 דקות ב RT. יש לשטוף את coverslips 3 פעמים עם סטרילי 1X PBS לשטוף את אתנול נותר. יש לשטוף את coverslip פעם עם סטרילי H 2 0 לשטוף את שנותר 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב H 2 0 באמצעות 2 מיליליטר aspirating פיפטה ולתת את coverslips יבש. לחשוף את coverslips לאור UV בברדס בתרבית רקמה במשך 15 דקות. חנות coverslips בסביבת סטרילית, אם לא נעשה שימוש באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip אחד 12 מ&quot;מ עגול בכל טוב של צלחת 24 היטב. לנער את צלחת בעדינות כדי להבטיח שcoverslips לשכב על תחתית הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרת 2 מ&quot;ג / מיליליטר poly-D- ליזין פתרון מניות ב RT ולדלל את ריכוז פולי-D ליזין / מיליליטר 10 מיקרוגרם ב1X PBS. להוסיף 0.25 מיליליטר של 10 פולי-D ליזין UG / מיליליטר לבארות. השאר את הצלחת בחממת 37 ° C עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות 3 פעמים עם סטרילי 1X PBS. הפשרת 10 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון מניות laminin ב RT ולדלל עד 10 מיקרוגרם / מ &#39;l ב1X PBS. להוסיף 0.25 מיליליטר של 10 מיקרוגרם laminin מיליליטר / עובד פתרון לטוב יחידה של מנה 24 רב גם. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס חממה. לשאוב את פתרון laminin בעזרת פיפטה aspirating 2 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את coverslip 3 פעמים עם 1X PBS על ידי הוספת 1 מיליליטר של 1X PBS עם פיפטה P1000 והסרת PBS 1X ידי aspirating עם 2 מיליליטר aspirating פיפטה. השאר 1X PBS מלשטוף אחרון בבאר עד תאים מוכנים להיות מצופה. ליזום בידול עצבי על ידי קציר, מתנער וספירת תאים בשלבים 1 x 10 6 תאי 1.4-1.9.Plate בצלחת 6 סנטימטר ביום -3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 0, קציר, לנתק ולספור תאים על ידי חזרה על 1.4-1.9. זרעים 1 x 10 5-1.5 x 10 5 תאי iMOP ל0.5 מיליליטר תקשורת עצבית בידול מחומם מראש לכל גם בצלחת רב גם 24. לשאוב ולהוסיף מדיה בידול עצבית מחוממת מראש לתרבויות בכל יום אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן נוירונים נגזר iMOP בפורמלין 4% במשך 15 דקות. אלא RT על פתרון פורמלדהיד 7. הסר יום, לשטוף נוירונים נגזר iMOP עם חיץ לשטוף (1X PBS המכיל 0.1% TritonX-100) לפני דוגרים בחסימת חיץ (1X PBS המכיל 10% עזים בסרום נורמלי ושל 0.1% Triton X-100) במשך שעה 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף חיץ דגירה דגימות בחסימת חיץ עם נוגדן מדולל. דגירה על 4 מעלות צלזיוס. לשטוף דגימות עם 1X PBS המכיל טריטון X-100 תאים כפופים 0.1% לimmunostaining 27. שטוף את coverglass עם 1X PBS לפני הצבה על גבי מדיה הרכבה. לאפשר תקשורת ההרכבה לייבוש על 4 מעלות צלזיוס לפני רכישת תמונות epifluorescence כפי שמופיע בשלב 3.8. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ניטור תרבויות IMOP פרוטוקול לשמירה על התחדשות עצמית וקידום הבידול של שורת תאי iMOP רומן מתואר ופורמטי ציפוי נוספים כלולים (טבלה 1). כמה שלבים קריטיים המסייעים בהרחבה והתמיינות של תאי iMOP שגרה הם ציינו. בדומה לתרביות ?...

The organs of the inner ear, the cochlea, utricle, saccule and three semicircular canals, mediate the ability to hear and balance. Within the cochlea, hair cells convert sounds into electrical signals that are relayed to the spiral ganglion neurons (SGN). The SGNs fire action potentials to propagate neural signals through the auditory circuit. Genetic mutations, ototoxic drugs and exposure to loud sounds contribute to hair cell and SGN death that result in hearing loss1-4. Once lost, these cells are not replaced. Use of iPSC and ESC to generate nascent hair cells or SGNs holds great promise for inner ear cell replacement therapies5-8. A flurry of progress has shown that pluripotent stem cells and inner ear derived progenitors can differentiate into hair cells and SGNs at various stages of maturity. Mammalian embryonic stem cells (ESC) and induced pluripotent stem cells (iPSC) can be used to generate functional hair cells and SGNs9-11. Stem cells and progenitor cells derived from the mammalian inner ear have also been shown to form hair cells and neurons with properties of their in vivo cellular counterparts12-16. 
Use of iPSC or ESC-derived otic progenitors to replace lost hair cells and SGNs requires efficient differentiation. Improper differentiation or continued proliferation of engrafted stem-derived progenitors in the inner ear can exacerbate inner ear function and pose a tumorigenic risk such as teratomas formation in the inner ear17. There is a clear need for developing culture conditions and understanding differentiation of otic progenitors. One strategy in developing these methods is to recapitulate cell fate decisions made by neurosensory progenitors during inner ear development. Protocols that prevent proliferation and direct otic progenitors into hair cells or SGNs will help improve safety as well as efficacy of replacement therapies. 
During development, the inner ear begins with the thickening of surface ectoderm in a restricted region between rhombomeres 5 and 6 to become the otic placode. As the otic placode invaginates to form an otic cup, a collection of cells in the anterior region of the otic cup gives rise to the neural-sensory-competent domain (NSD), which contains precursors of hair cells and neurons of the inner ear18. Fate mapping studies from mouse, chicken and zebrafish developing inner ear suggest multiple populations of neurosensory progenitors that give rise to the sensory hair cells, surrounding supporting cells and otic neurons19-22. The high mobility group transcription factor, Sox2, has been implicated in sensory cell specification and used as a marker for inner ear progenitors23,24. Hypomorphic mutations that decrease Sox2 expression levels in the inner ear result in the loss of the hair cells, supporting cells and SGNs in the cochlea25,26. 
To study otic progenitor cells undergoing cell fate decisions, a fate restricted immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cell line from Sox2 expressing cochlear progenitors was previously established. iMOP cells were originally derived from embryonic E12.5-13.5 cochlea and infected with a c-Myc retrovirus27. iMOP cells can continually proliferate as colony forming cells known as otospheres and have the capacity to differentiate into hair cells, supporting cells and SGNs27. Understanding the capacity of iMOP cells to differentiate into distinct otic lineages allows application of these findings to efficiently generate iPSC or ESC-derived hair cells and SGNs. Efficient differentiation protocols will open new avenues for cell replacement therapies of inner ear diseases that are recalcitrant to conventional treatments. A crucial issue in generating otic cells by in vitro cell culture is to have differentiation markers that help determine if cells are undergoing differentiating. Cdkn1b (p27KIP) has been extensively used as an early marker for differentiation in developing inner ear, however, expression of Cdkn1b in iMOP cells and how it correlates to differentiation has not been addressed. In this study, the current culture conditions and how Cdkn1b expression correlates to other markers of iMOP differentiation are described.

<table><tbody><tr><td>CoolCell LX Alcohol-Free Cell Freezing Containers</td><td>BioCision</td><td>BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Vials (2 ml)&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430654</td><td></td></tr><tr><td>1.5 Thickness Glass Coverslip (Round 12 mm)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72230-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement (50X) Serum Free</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Stored as 1 ml aliquots</td></tr><tr><td>L-Glutamine(200 mM)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Stored as 5 ml aliquots</td></tr><tr><td>Natural Mouse Laminin</td><td>Life Technologies</td><td>23017-015</td><td>Stored as 1 mg/ml aliquots</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>Synth-A-Freeze Cryopreservation Media</td><td>Life Technologies</td><td>A12542-01</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>47743-736</td><td>Stored as 10 mg/ml 100 &amp;micro;l aliquots</td></tr><tr><td>Moxi Z Mini Automated Cell Counter</td><td>Orflo&amp;nbsp;</td><td>MXZ001</td><td></td></tr><tr><td>Moxi Z Cassette Type S</td><td>Orflo&amp;nbsp;</td><td>MXC002</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Murine Fibroblast Growth Factor, basic (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td>Resuspended in 0.1% BSA in H20 and stored as 20 mg/ml aliquots</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P7886</td><td>Resuspended in 1X PBS and stored as 10 mg/ml 100 &amp;micro;l aliquots</td></tr><tr><td>Carbenicillin, Disodium Salt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2648-1</td><td>Resuspended in 10 mM Hepes pH 7.4 and stored as 100 mg/ml aliquots</td></tr><tr><td>5 ml pipet individually wrapped paperback (200/case)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipet individually wrapped paperback (200/case)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Treated Biolite 24-Well Plate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Treated Biolite 6-Well Plate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Treated 6 cm Dish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130181&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore Millex Sterile Syringe PVDF Filter Pore size: 0.22 &amp;mu;m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>TipOne filter pipet tips 0.1 - 10 &amp;mu;l elongated filter tip</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne filter pipet tips 1 - 20 &amp;mu;l filter tip</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne filter pipet tips 1 - 200 &amp;mu;l&amp;nbsp; filter tip</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne filter pipet tips 101 - 1000 &amp;mu;l filter tip</td><td>USA Scientific</td><td>1126-7810</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes)</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0511</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes)</td><td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td></td></tr></tbody></table>

initiating differentiation in immortalized multipotent otic progenitor cells

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations including low yields and heterogeneous populations of differentiated cells hinder the progress of stem cell therapies. A fate restricted immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cell line was generated to facilitate efficient differentiation of large numbers of functional hair cells and spiral ganglion neurons (SGN) for inner ear cell replacement therapies. Starting from dissociated cultures of single iMOP cells, protocols that promote cell cycle exit and differentiation by basic fibroblast growth factor (bFGF) withdrawal were described. A significant decrease in proliferating cells after bFGF withdrawal was confirmed using an EdU cell proliferation assay. Concomitant with a decrease in proliferation, successful differentiation resulted in expression of molecular markers and morphological changes. Immunostaining of Cdkn1b (p27KIP) and Cdh1 (E-cadherin) in iMOP-derived otospheres was used as an indicator for differentiation into inner ear sensory epithelia while immunostaining of Cdkn1b and Tubb3 (neuronal &#946;-tubulin) was used to identify iMOP-derived neurons. Use of iMOP cells provides an important tool for understanding cell fate decisions made by inner ear neurosensory progenitors and will help develop protocols for generating large numbers of iPSC or ESC-derived hair cells and SGNs. These methods will accelerate efforts for generating otic cells for replacement therapies.

bFGF נסיגת ירידות הפצת נשק בתאי IMOP כדי להקטין את יכולת השגשוג של תאי iMOP וליזום התמיינות של תאי iMOP, bFGF הוסר ממדפי התרבויות. כדי לוודא שנסיגת גורם גדילה יורדת התפשטות, התאגדות edu הועסקה כassay...

Watch this Scientific Journal Video about Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells at JoVE.com

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

The current protocols to maintain immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cells and otic differentiation are described. Culture conditions and molecular markers that indicate differentiation into sensory epithelia and spiral ganglion neurons (SGN) are highlighted.

ייזום בידול בתאי multipotent otic אב הונצחו

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

initiating-differentiation-immortalized-multipotent-otic-progenitor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.4K Views.  Rutgers University. The current protocols to maintain immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cells and otic differentiation are described. Culture conditions and molecular markers that indicate differentiation into sensory epithelia and spiral ganglion neurons (SGN) are highlighted.

Video: Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell lineage development. In vitro expansion of neural progenitors from fetal CNS tissue has been well characterized. Despite the identification and isolation of glial progenitors from adult human sub-cortical white matter and development of various culture conditions to direct differentiation of fetal neural progenitors into myelin producing oligodendrocytes, acquiring sufficient human oligodendrocytes for in vitro experimentation remains difficult. Differentiation of galactocerebroside+ (GalC) and O4+ oligodendrocyte precursor or progenitor cells (OPC) from neural precursor cells has been reported using second trimester fetal brain. However, these cells do not proliferate in the absence of support cells including astrocytes and neurons, and are lost quickly over time in culture. The need remains for a culture system to produce cells of the oligodendrocyte lineage suitable for in vitro experimentation.
Culture of primary human oligodendrocytes could, for example, be a useful model to study the pathogenesis of neurotropic infectious agents like the human polyomavirus, JCV, that in vivo infects those cells. These cultured cells could also provide models of other demyelinating diseases of the central nervous system (CNS). Primary, human fetal brain-derived, multipotential neural progenitor cells proliferate in vitro while maintaining the capacity to differentiate into neurons (progenitor-derived neurons, PDN) and astrocytes (progenitor-derived astrocytes, PDA) This study shows that neural progenitors can be induced to differentiate through many of the stages of oligodendrocytic lineage development (progenitor-derived oligodendrocytes, PDO). We culture neural progenitor cells in DMEM-F12 serum-free media supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet derived growth factor (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), neurotrophic factor 3 (NT-3), N-2 and triiodothyronine (T3). The cultured cells are passaged at 2.5e6 cells per 75cm flasks approximately every seven days. Using these conditions, the majority of the cells in culture maintain a morphology characterized by few processes and express markers of pre-oligodendrocyte cells, such as A2B5 and O-4. When we remove the four growth factors (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) and add conditioned media from PDN, the cells start to acquire more processes and express markers specific of oligodendrocyte differentiation, such as GalC and myelin basic protein (MBP). We performed phenotypic characterization using multicolor flow cytometry to identify unique markers of oligodendrocyte.

Primary, human fetal brain-derived, multipotential progenitor cells proliferate in vitro while maintaining the capacity to differentiate into neurons and astrocytes. This work shows that neural progenitors can be induced to differentiate through stages of the oligodendrocytic lineage by conditioning with select growth factors.

מערכת מוליד-נגזר Oligodendrocyte תרבות ממוח העוברי של אדם

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Neuroscience

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Biology

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a single-cell suspension for further use in embryoid body induction. Following mesodermal induction, embryoid bodies undergo hematopoietic differentiation, producing a floating hematopoietic cell population. Subsequently, the harvested hematopoietic cells undergo a macrophage colony-stimulating factor maturation step and, finally, osteoclast differentiation. After osteoclast differentiation, osteoclasts are characterized by staining for TRAP in conjunction with a methyl green nuclear stain. Osteoclasts are observed as multinucleated, TRAP+ polykaryons. Their identification can be further supported by Cathepsin K staining. Bone and mineral resorption assays allow for functional characterization, confirming the identity of bona fide osteoclasts. This protocol demonstrates a robust and versatile method to differentiate human osteoclasts from iPSCs and allows for easy adoption in applications requiring large quantities of functional human osteoclasts. Applications in the areas of bone research, cancer research, tissue engineering, and endoprosthesis research could be envisioned.

This protocol presents the differentiation of human osteoclasts from induced pluripotent stem cells (iPSCs) and describes methods for the characterization of osteoclasts and osteoclast precursors.

התמיינות ואפיון אוסטאוקלסטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

התמיינות של תאי העור של עכבר יילוד נגזר גזע לתאים דמוי נבט<em&gt; במבחנה</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

יצירת נוירונים אנושיים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...

Differentiating Human Embryonic Stem Cells into Neural Progenitors

Source: Jeon, K. et al., <a href="https://app.jove.com/v/60571">Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates the differentiation of human embryonic stem cells, or hESCs, directly into neural progenitor cells without using feeder cells or any intermediate steps. The selective inhibition of bone morphogenetic protein or BMP and transforming growth factor-beta, or TGF-&#946;, signaling pathways leads to hESCs differentiation into neural progenitor cells, or NPCs.

התמיינות תאי גזע עובריים אנושיים לאבות עצביים

1. Preparation of human embryonic stem cells (hESC)-qualified Basement Membrane Matrix-coated Plates

	Slowly thaw the hESC-qualified basement membrane ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Advanced Neuronal Models

A Co-culture Method to Model Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Source: Assetta, B.,et al. <a href="https://app.jove.com/v/61778">Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates the establishment of a co-culture of human induced neurons (iNs) and induced oligodendrocyte precursor cells (iOPCs). iNs are mixed with iOPCs in a co-culture and then incubated to support the maturation of both iNs into neurons and iOPCs into oligodendrocytes. Neurons form synaptic connections with other neurons and oligodendrocytes, while oligodendrocytes develop myelin sheaths around the neurons&#39; axons.

שיטת תרבית משותפת למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים

1. Human neuron induction from human pluripotent stem cells

	Lentivirus preparation (~5 days)
	
		Plate ~1 million Human embryonic kidney 293T (HEK293T) ...

Co-culture and Interaction Studies

Differentiation of Neural Progenitor Cells into Neurons

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
The video showcased a cell culture method for differentiating neural progenitor cells into neurons. By incubating cells in a nutrient-rich medium supplemented with growth factors, the progenitor cells matured into neurons with developed axons and dendrites. A stabilizing agent ensured cell viability and protected against oxidative damage throughout the differentiation process.

התמיינות של תאי אב עצביים לתאי עצב

1. Differentiation from NPCs to neurons (Phase II)

	Seed about 5 x 105 mouse embryonic stem cells or mESC derivatives within 2 mL of basal ...

Differentiating Otic Progenitor Cells Into Sensory Epithelial Cells Followed by Immunostaining

Source: Azadeh, J. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53692">Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the differentiation of immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cells into sensory epithelial cells. It outlines the steps involved in culturing iMOP cells, forming otospheres, inducing differentiation, and visualizing cellular components and differentiation markers through fluorescence microscopy to confirm successful cell differentiation.

התמיינות תאי אב אוטיים לתאי אפיתל חושיים ואחריה אימונוסטיין

1. Maintaining Self-renewal in IMOP Cells

	Prepare iMOP culture media: DMEM/F12, 1X B27 supplement, 25 &#181;g/ml carbenicillin and 20 ng/ml basic ...

Differentiating Immortalized Multipotent Otic Progenitors into Spiral Ganglion Neurons and Evaluating the Differentiation

Source: Azadeh, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53692">Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016).
The video demonstrates the differentiation of immortalized multipotent otic progenitors (iMOPs) into spiral ganglion neurons (SGNs) and immunofluorescence-based confirmation of the differentiation. The iMOPs are plated onto culture substrate-coated coverslips in a neuronal differentiation medium for differentiation into SGNs. The differentiated cells are labeled with antibodies specific for neuronal differentiation markers and analyzed under a microscope to confirm differentiation.

הבחנה בין אבות אוטיים רב-פוטנטיים אלמותיים לנוירונים של גנגליון ספירלי והערכת ההתמיינות

1. Differentiating iMOP-Derived Neurons 

	Make 50 ml of neuronal differentiation media: Neurobasal media, 1X B27 supplement, 2 mM L-Glutamine. Thaw ...