Name: administering and detecting protein marks on arthropods for dispersal research
Uploaded: 2016-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research at JoVE.com

מימון ניתן על ידי משרד החקלאות האמריקאי כריס 5347-22620-021-00D ו, בחלקו, על ידי החקלאות ומזון מענק המחקר תחרותי היוזמה לא. 2011-67009-30141 מהמכון הלאומי USDA של מזון וחקלאות. אנחנו אסירי תודה על התמיכה הטכנית של יוהנה Nassif. אנו מודים גם פול בייקר, דוד הורטון, דייגו Nieto, ופרנסס Sivakoff למתן חלק מהתמונות השתמשו באיור 3.

1. הפנימי מארק, שמירה, וזיהוי נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך סימון פנימי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף חרקים של עניין (n ≈ 100 אנשים) ממושבת מעבדה גדלה על דיאטה מלאכותית או מהשטח ולחלק לשתי מכולות גידול נקיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מנות רגילות 20 מיליליטר דיאטה (טיפול ביקורת שלילי לא מסומן) לאחת מהמכולות. להשלים מנה שנייה 20 מיליליטר מלאכותית דיאטה עם 1.0 מיליליטר של 1.0 מ&quot;ג / מיליליטר IgG עוף / פתרון IgY, ומערבב היטב, ומניח אותו במכל האחר. הערה: אם החרק של עניין אין דיאטה מלאכותית, הסימן יכול להיות ממוקם באו בכל דיאטה שהם בדרך כלל נגרמו על (למשל, שעועית ירוקה, ביצי עש, מים, סוכר, דבש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר החרקים לחדש פעילות ההאכלה שלהם למשך 24 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך שימור סימן פנימי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מנות דיאטה מכל מכולה ולספק את החרקים wה- i אחר מקור מזון כדי לקיים אותם על משך הניסוי (למשל, שעועית ירוקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף עוקבה (n = 20) של חרקים יומיים (או בכל פרק זמן רצוי) מכל טיפול ולהקפיא מייד ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך ELISA כריך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של נוגדן ארנב נגד עוף IgY העיקרי בדילול 1: 500 בטריס שנאגרו מלוח (TBS) היטב בכל microplate ELISA נקי ודגירה למינימום של שעה 1 ב RT (הערה: O microplates גם יכול להיות מודגרות / N ב 4 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הנוגדן מהצלחת ולחסום כל טוב עם 300 μl של פתרון חלב יבש ללא שומן 1.0% למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן ההמתנה לצעדי דגירה הקודמים, למקם את החרקים קפוא בנפרד ב1.6 מיליליטר צינורות microcentrifuge עם 1.0 מיליליטר של TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים כל חרקים עם העלי נקי עד הומוגני ביסודיות ולהוסיף של כל דגימה 100 μl ולבודד של ELISAצַלַחַת. אפשר הדגימות כדי לדגור על RT עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף לשלילי (TBS בלבד) וחיוביים 100 μl (חלבוני ביצה בTBS) בקרות לבארות בעמודה הראשונה של כל צלחת ELISA. כמו כן, להוסיף בקרות חרקים שליליות (חרקים לא מסומנים) 100 μl לבארות 8 בטור האחרון של כל צלחת (איור 1). אפשר דגימות השליטה כדי לדגור על RT עבור שעה 1. שים לב שהתבנית הניתנת באיור 1 היא התבנית אנו משתמשים למבחנים הסטנדרטיים שלנו. המיקום של הדגימות בבארות הוא לשיקול דעתו של החוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב כל שלוש פעמים עם מי מלח פוספט (PBS) -tween ולאחר מכן להוסיף 50 μl של IgG אנטי-עוף ארנב / IgY מצומדות עם peroxidase חזרת דילול 1: פתרון חלב 10,000 ב 1% ודגירה עבור שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב כל שלוש פעמים עם PBS-tween ולהוסיף 50 μl של tetramethylbenzidine מצע (TMB) זה טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות, לקרוא את הבארותעם ספקטרופוטומטר microplate להגדיר באורך גל של 650 ננומטר. </li></ol></li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53693/53693fig1.jpg" /> איור 1. תרשים סכמטי המציג את הכינויים גם תקניים המשמשים ל96 טיפוסי גם microplate ELISA. כל צלחת מכילה 7 בארות מוקדשים לבקרה שלילית שנאגרו מלוחה-טריס (TBS), גם ייעודיות לשליטת חלבון חיובית (POS Ctrl), 80 בארות בודדות מוקדשת לחרקים כבשו מחדש (לדוגמא 1 ... 80), ו -8 בארות מוקדשים לבקרת חרקים לא מסומן (שלילית) (נג Ctrl 1 ... 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53693/53693fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 2. החיצוני מארק, שמירה, וזיהוי נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך סימון חיצוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף חרקים של עניין (n ≈ 100יחידים) ממושבת מעבדה או מהשטח והמקום לשני מיכלי פלסטיק 1.0 L עם חור בקוטר 2.5 סנטימטר אגרוף מהצד השני של כל מכולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריסוס החרקים במכל הראשון עם 1.0 מיליליטר של DH 2 O (טיפול בקרה שלילי) באמצעות nebulizer רפואי. ריסוס החרקים במכל השני עם 1.0 מיליליטר של פתרון 5.0% מחלבוני ביצת עוף באמצעות nebulizer רפואי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את הצינור של nebulizer לשקע אוויר מעבדה סטנדרטי ולאחר מכן הכנס את הפה של nebulizer לתוך חור 2.5 סנטימטר של המכל. לאחר מכן, להפעיל את יציאת האוויר בהדרגה עד nebulizer מייצר אדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ריסוס (סימון) עד פתרון חלבוני ביצה כבר לוותר (כ. 2-5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את nebulizer ולמקם את פקק לתוך החור של מיכל הפלסטיק. לאפשר החרקים לעמוד על RT עד הפתרון התייבש לחלוטין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך שימור סימן חיצוני<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל טיפול בחרקים היבש לתוך מיכל נפרד גידול נקי, כדי למנוע חשיפה נוספת לסימן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מזון ומים למכל הנקי כדי לקיים את החרקים על משך המחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף עוקבה (n = 20) של חרקים מכל טיפול היומי ולהקפיא מייד ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך ELISA עקיף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החרקים הקפואים בנפרד לתוך 1.6 מיליליטר צינורות microcentrifuge ולהוסיף 1.0 מיליליטר של TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את הדגימות עבור שעה 1 בסט ייקר מסלולית ב 120 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף בקרות שליליות וחיוביות כמתואר בשלב 1.3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההשריה, פיפטה aliquot 100 μl מכל מדגם לאחד 80 בארות מדגם ייעודיות ובצלחת ELISA חדשה 96 כפי שמוצג באיור 1 אפשר הדגימות כדי לדגור במשך שעה 1 ב RT (הערה:. Microplates יכול להיות גם O מודגרות / N ב 4 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות שלוש פעמים עםPBS-tween ולאחר מכן להוסיף 300 μl של נאגר מלוח פוספט המכיל 1% אלבומין בסרום שור (PBS-BSA) זה טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות ב RT לשטוף פעמיים עם PBS-tween. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של נוגדן ארנב נגד ביצת אלבומין העיקרי בדילול 1: 8,000 ב PBS-BSA-Silwet (0.05%) לכל היטב דגירה עבור שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב כל שלוש פעמים עם PBS-tween ולאחר מכן להוסיף 50 μl של IgG נגד הארנב העז מצומדות עם peroxidase חזרת דילול 1: 2,000 ב PBS-BSA-Silwet (0.05%) במשך שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב כל שלוש פעמים עם PBS-tween ולהוסיף 50 μl של מצע TMB היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות, לקרוא את הבארות עם ספקטרופוטומטר microplate להגדיר באורך גל של 650 ננומטר. </li></ol></li></ol> ניתוח 3. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הערך הממוצע של ספיגת 8 החרקים ביקורת השליליים על כל צלחת ELISA ולאחר מכן לחשב את סטיית התקן בהתבסס על הפקדים השליליים נקוו הלוך ושובכל צלחות ELISA של מחקר ניתנו 12 מ &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף שש פעמים סטיית תקן ונקווה לממוצע המתקבל לכל צלחת ELISA להשיג ערך סף חיובי ELISA. כל מדגם חרקים מניב ערך הספיגה שווה או גדול מהערך הזה נחשב כחיובי לנוכחות של סימן החלבון. </li></ol>

אזכור של שמות מסחריים או מוצרים מסחריים בפרסום זה הוא אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו מעיד על המלצה או אישור על ידי משרד החקלאות האמריקאי. משרד החקלאות האמריקאי הוא ספק הזדמנות שווה ומעביד.

הליך immunomarking חלבון פרוקי רגליים תואר לראשונה כמעט רבע מאה לפני 9. מאז, ההליך הותאם ללמוד את דפוסי הפיזור של מגוון רחב של פרוקי רגליים באמצעות IgG / IgYs מנוהל פנימי וחיצוני. חלבונים אלה הוכיחו סמנים איתנים למגוון הרחב של מיני חרקים נבדקו עד כה. עם זאת, כאמור לעיל, המגב?...

מעקב התנועה של מזיקי פרוקי רגליים, אויבים טבעיים (טפילים וטורפים), ומאביקים בטבע הוא חיוני להבנה טובה יותר כיצד לשפר את שירותי מערכת אקולוגית. המרכיב המרכזי במרבית הסוגים של מחקר הוא שיש פיזור שיטה אמינה כדי לתייג את פרוקי הרגליים (ים) של עניין. מגוון רחב של חומרים (לדוגמא, צבעים, צבעים, אבקות צבעוניות, תגים, אלמנטים נדירים, חלבונים) שימשו כדי לסמן פרוקי רגליים להעריך דינמיקת האוכלוסייה שלהם, יכולות פיזור, האכלת התנהגויות, ואינטראקציות אקולוגיות אחרות 1,2. נאותות סמן המשמש לכל מחקר פיזור נתון תהיה תלויים בסוג של מחקר שנערך. ישנם שלושה סיווגים רחבים לסימון פרוקי רגליים: (1) סימן-שחרור-לכבוש מחדש (MRR), (2) סימן-ללכוד, ו- (3) סימן-לכידה עצמית. למחקר סימן-שחרור-לכבוש מחדש, החוקר בדרך כלל מסמן את פרוקי הרגליים קולקטיבי בlaboratoר&quot;י ומשחרר אותם בנקודה מרכזית בתחום. אז פרוקי רגליהם כבשו במרווחי מרחב ובזמן שונים באמצעות מכשירי אוסף שונים (בניכוי למשל, לטאטא, ואקום, מלכודת דביקה) 3,4,5. אז הדגימות כבשו נבחנות לסימן הספציפי להבחין שוחררו מאנשים מקומיים. למחקר סימן-ללכוד, החוקר בדרך כלל חל הסימן ישירות בציוד השדה באמצעות תרסיס (למשל, מרסס תרמיל, בום ומרסס זרבובית). הסמנים הטובים ביותר עבור מחקר סימן-לכידה זולים ובקלות להחיל בית הגידול של פרוקי הרגליים. למחקר-סימן-לכידה עצמית, החוקר בדרך כלל חל סימנים לכניסה פיתיון פרוקי רגליים 6,7 או 8 קן. בתורו, פרוקי הרגליים מסמנת את עצמו באופן פנימי על ידי טורף את הפיתיון המסומן או חיצוני על ידי &quot;צחצוח&quot; נגד סימן יציאתו לקן. כפי שצוין לעיל, סוגים רבים של סמנים היואד לתייג מגוון מיני פרוקי רגליים. עם זאת, מעט מאוד שימושיים לכל שלושת קטגוריות מחקר פיזור אלה. הפיתוח של הליך immunomarking החלבון היה פריצת דרך משמעותית עבור סימון חרקים. Immunomarking מעמיד תווית חלבון על פרוקי רגליים פנימיים או חיצוני אשר, בתורו, הוא זוהה על ידי assay נגד חלבון מסוים צמוד אנזים immunosorbent (ELISA). סמני החלבון הראשונים מסוג המשמשים היו אימונוגלובולינים ארנב (IgG) וIgG עוף / IgY 9,10. הם הוכיחו להיות יעילים מאוד סימנים לMRR ומחקר-סימן-לכידה עצמית (ראה דיון). למרבה הצער, חלבוני IgG / IgY הם יקרים ולכן אינם מעשיים למחקר סימן-לכידה ורוב הסוגים של מחקר-סימן-לכידה עצמית. בהמשך לכך, ELISAs זיהוי חלבון הדור השני פותחו עבור חלבונים כלולים בחלבוני ביצת עוף (אלבומין), חלב פרה (קזאין) וחלב סויה (חלבון מעכב טריפסין). כל assay הוא רגיש מאוד, ספציפי, והכיחשוב מכך, משתמש בחלבונים שהם הרבה פחות יקרים מאשר חלבוני IgG / IgY 11. חלבונים אלה הוכחו כיעילים לMRR, סימן-ללכוד, ומחקר-סימן-לכידה עצמית (ראה דיון). במאמר זה, אנו מתארים ומדגימים כיצד לבצע מחקרי שימור המעבדה סימן חלבון. מחקרים כאלה הם השלב הראשון של המחקר הדרוש לכל סוג של מחקר פיזור שדה. באופן ספציפי, זה קריטי, כי חוקרים יודעים כמה זמן הסימן יישמר על מיני פרוקי רגליים הממוקדים לפני היציאה ללימודי פיזור שדה. כאן אנו מתארים ומדגימים כיצד פנימיים והן חיצוניים כדי לסמן חרקים לMRR, סימן-ללכוד, ומחקרי שדה הסוג-סימן-לכידה עצמית. לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד לזהות הנוכחות של הסימנים עם ELISAs העקיף וכריך.

<table><tbody><tr><td>Food storage container (for insect rearing)</td><td>Rubbermaid/Tupperware</td><td>Various sizes</td><td>Various manufacturers &amp;amp; vendors. Mesh fabric is glued in a window</td></tr><tr><td>Small volume nebulizer (Micro Mist)</td><td>Teleflex-Hudson RCI</td><td>1881</td><td>Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap</td><td>Continental Lab Products</td><td>4445.X</td><td>Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids.</td></tr><tr><td>Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid)</td><td>RPI Corp.</td><td>145746</td><td>This design is nice because it doesn&#039;t crowd the tubes.</td></tr><tr><td>Dispenser, repeater</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Anything similar will help speed up the dispensing.</td></tr><tr><td>Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml</td><td>Kimble Chase</td><td>749521-1500</td><td>Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse.</td></tr><tr><td>BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom)</td><td>BD</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Ovation pipette, manual (20-200 &amp;micro;l)</td><td>VistaLab</td><td>1057-0200 or 1070-0200</td><td>Any similar type will work. This model is ergonomic.</td></tr><tr><td>Reservoirs, sterile reagent</td><td>VistaLab</td><td>4054-1000</td><td>Anything similar will work.</td></tr><tr><td>Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 &amp;micro;l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730391</td><td>If you had to pick one electronic model, this size is most useful.</td></tr><tr><td>Electronic pipette, 8-channel (10-300 &amp;micro;l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730361</td><td>Anything similar will work.</td></tr><tr><td>Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369802&amp;nbsp;</td><td>Anything similar will work for manual plate washing.</td></tr><tr><td>Microplate reader with absorbance detection</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 250</td><td>Anything similar will work.</td></tr><tr><td>Chicken IgG/IgY</td><td>United States Biological</td><td>I1903-15R</td><td>Also available from other sources</td></tr><tr><td>Egg whites</td><td>Grocery store</td><td>&amp;ldquo;All Whites&amp;rdquo;, &amp;ldquo;Egg Beaters&amp;rdquo;, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;</td><td>Mix 5 ml with 95 ml dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 5% solution</td></tr><tr><td>Tris (Trizma Base)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>2.42 g/L to make TBS</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>29.22 g/L to make TBS and 8.0&amp;nbsp;g&amp;#8288;/&amp;#8288;L for PBS</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td>1.14 g/L for PBS</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>0.2 g/L for PBS</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>0.2 g/L for PBS</td></tr><tr><td>Tween 20, EIA grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved.</td></tr><tr><td>PBS with 1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3688</td><td>Mix 1 packet in 1 L dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6409</td><td>Mix 100 &amp;micro;l in 50 ml TBS</td></tr><tr><td>Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%)</td><td>Grocery store</td><td></td><td>Mix 10 g with 1 L dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 1% solution</td></tr><tr><td>Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9046</td><td>Mix 100 &amp;micro;l in 1 L of 1% milk</td></tr><tr><td>Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6534</td><td>Dilute 125 &amp;micro;l in 1 L PBS-BSA</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td>Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3&amp;nbsp;ml Silwet</td></tr><tr><td>Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer</td><td>Lehle Seeds</td><td>VIS-01</td><td>Add as last ingredient</td></tr><tr><td>TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate</td><td>SurModics</td><td>TMBW-1000-01</td><td></td></tr></tbody></table>

administering and detecting protein marks on arthropods for dispersal research

תנועת פרוקי רגלי ניטור נדרשה לעתים קרובות כדי להבין טוב יותר את הדינמיקה הקשורים האוכלוסייה, דפוסי פיזור, העדפות צמח מארח, ואינטראקציות אקולוגיות אחרות. פרוקי רגליים בדרך כלל במעקב בטבע על ידי תיוגם עם סימן ייחודי ולאחר מכן לאורך זמן ובמרחבם כדי לקבוע את יכולות פיזורם באיסוף מחדש. בנוסף לתגים פיזיים ממשיים, כגון אבק או צבע צבעוניים, סוגים שונים של חלבונים הוכחו כיעילות מאוד לסימון פרוקי רגליים למחקר אקולוגי. יכולים להינתן חלבונים פנימיים ו / או חיצוני. אז יכולים להיות שזוהו החלבונים על פרוקי רגליים וכבשו עם assay חלבון ספציפי צמוד אנזים immunosorbent (ELISA). כאן אנו מתארים פרוטוקולים לחוץ וכלפי פן תיוג פרוקי רגליים עם חלבון. שתי דוגמאות ניסיוניות פשוטות הם הפגינו: (1) סימן חלבון פנימי הציג לחרקים על ידי מתן תזונה מועשר בחלבון ו- (2) סימן חלבון חיצוני topicallypplied לחרקים באמצעות nebulizer רפואי. לאחר מכן, אנו מתייחסים מדריך צעד-אחר-צעד של הכריך ושיטות ELISA עקיפים משמשות לאיתור סימני חלבון בחרקים. בהפגנה זו, היבטים שונים של הרכישה והגילוי של סמני חלבון על פרוקי רגליים לסימן-שחרור-לכבוש מחדש, סימן-ללכוד, וסוגים-סימן-לכידה העצמית של מחקר הם דנו, יחד עם הדרכים השונות כי הליך immunomarking היה מותאם כך שיתאים למגוון רחב של מטרות מחקר.

פנימי לציון: תוצאות בדיקת שימור סימן הפנימית מוצגות באיור 2 א. ערך הסף המחושב ELISA הקריטי היה 0.054. בסך הכל (כל ארבעת תאריכי המדגם משולבים), החרקים טופלו ללא חלבון הניבו ערכים נמוכ...

Watch this Scientific Journal Video about Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research at JoVE.com

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.

ניהול וזיהוי סימני חלבון על פרוקי רגליים לחקר פיזור

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

administering-detecting-protein-marks-on-arthropods-for-dispersal

Research

JoVE Journal

Environment

7.3K Views.  Arid-Land Agricultural Research Center. Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated. 

Video: Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

פליטת אור סידן Assay עבור ניתוח פונקציונלי של יתוש ( Aedes aegypti) ו טיק ( Rhipicephalus microplus) G-חלבון בשילוב רצפטורים

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Immunology and Infection

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells named wing imaginal discs formed during embryonic development. In the larval stages the imaginal discs grow, increasing its number of cells and forming monolayered epithelial&#160;structures. Inside the pupal case, the imaginal discs bud out and fold into bilayers along a line that becomes the future margin of the wing. During this process, the longitudinal primodia veins originate vein cells on the prospective dorsal and ventral surfaces of the wing. During the pupal stage the stripes of vein cells of each surface communicate in order to generate tight tubes; at the same time, the cross-veins begin their formation.
With the help of appropriate molecular markers, it is possible to identify the major elements composing the wing during its development. For this reason, the ability to accurately detect transcripts or proteins in this structure is critical for studying their abundance and localization related to the development process of the wing.
The procedure described here focuses on manipulating pupal wings, providing detailed instructions on how to dissect the wing during the pupal stage. The dissection of pupal tissue is more difficult to perform than their counterparts in third instar larvae. This is why this approach was developed, to obtain rapid and efficient high quality samples. Details of how to immunostain and mount these wing samples, to allow the visualization of proteins or cell components, are provided in the protocol. With little expertise it is possible to collect 8-10 high quality pupal wings in a short amount of time.

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

The ability to accurately detect transcripts or proteins in Drosophila tissues is critical for studying their abundance and localization related to the development process. Here is the description of a straightforward procedure to dissect pupal wings. These wings can be used as samples in several techniques (immunohistochemistry, PCR assay, etc.).

שיטה מהירה ויעילה לנתח הגולמי כנפי דרוזופילה מתאים Immunodetections או מבחני ה-PCR

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Developmental Biology

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

חיתוך של דרוזופילה מלאנוסטר שרירי הטיסה לגישות omics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Genetics

A Method for Quantifying Foliage-Dwelling Arthropods

Terrestrial arthropods play an important role in our environment. Quantifying arthropods in a way that allows for a precise index or estimates of density requires a method with high detection probability and a known sampling area. While most described methods provide a qualitative or semi-quantitative estimate adequate for describing species presence, richness, and diversity, few provide an adequately consistent detection probability and known or consistent sampling areas to provide an index or estimate with adequate precision to detect differences in abundance across environmental, spatial, or temporal variables. We describe how to quantify leaf-dwelling arthropods by sealing the leaves and end of branches in a bag, clipping and freezing the bagged material, and rinsing the previously frozen material in water to separate arthropods from the substrate and quantify them. As we demonstrate, this method can be used at a landscape scale to quantify leaf-dwelling arthropods with adequate precision to test for and describe how spatial, temporal, environmental, and ecological variables influence arthropod richness and abundance. This method allowed us to detect differences in density, richness, and diversity of leaf-dwelling arthropods among 5 genera of trees commonly found in southeastern deciduous forests.

We describe how to quantify leaf dwelling arthropods by sealing the leaves and end of branches in a bag, clipping and freezing the bagged material, and rinsing the previously frozen material in water to separate arthropods from the substrate for quantification.

שיטה לכימות עלווה-מגורים פרוקי רגליים

Terrestrial arthropods play an important role in our environment. Quantifying arthropods in a way that allows for a precise index or estimates of density ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

מדידת תגובות פיזיולוגיות של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עצב סנסורי כדי ליפידים פרומונים שימוש סידן הדמיה חיה

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

SwarmSight: Real-time Tracking of Insect Antenna Movements and Proboscis Extension Reflex Using a Common Preparation and Conventional Hardware

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis during feeding. The ability to rapidly obtain high-resolution measurements of natural antenna and proboscis movements and assess how they change in response to chemical, developmental, and genetic manipulations can aid the understanding of insect behavior. By extending our previous work on assessing aggregate insect swarm or animal group movements from natural and laboratory videos using the video analysis software SwarmSight, we developed a novel, free, and open-source software module, SwarmSight Appendage Tracking (SwarmSight.org) for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The software processes frames about 120 times faster than humans, performs at better than human accuracy, and, using 30 frames per second (fps) videos, can capture antennal dynamics up to 15 Hz. The software was used to track the antennal response of honey bees to two odors and found significant mean antennal retractions away from the odor source about 1 s after odor presentation. We observed antenna position density heat map cluster formation and cluster and mean angle dependence on odor concentration.

This protocol describes steps for using the novel software, SwarmSight, for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The free, open-source software processes frames about 120 times faster than humans and performs at better than human accuracy.

SwarmSight: מעקב בזמן אמת של האנטנה חרקים תנועות רפלקס הרחבת חוטם באמצעות הכנה משותפת חומרה קונבנציונלי

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis ...

Neuroscience

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

המבדק Electroantennographic ככלי מיון עבור נדיפים צמחים מארח

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Biology

Monitoring On-Target Signaling Responses in Larval Zebrafish - Z-REX Unmasks Precise Mechanisms of Electrophilic Drugs and Metabolites

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the mode of action (MOA) of such molecules leverage bulk treatment of experimental specimens with an excess of a specific reactive species. In this approach, the high reactivity of electrophiles renders non-discriminate labeling of the proteome in a time- and context-dependent manner; redox-sensitive proteins and processes can also be indirectly and often irreversibly affected. Against such a backdrop of innumerable potential targets and indirect secondary effects, linking phenotype to specific target engagement remains a complex task. Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX)-an on-demand reactive-electrophile delivery platform adapted for use in larval zebrafish-is designed to deliver electrophiles to a specific protein of interest (POI) in otherwise unperturbed live fish embryos. Key features of this technique include a low level of invasiveness, along with dosage-, chemotype-, and spatiotemporally-controlled precision electrophile delivery. Thus, in conjunction with a unique suite of controls, this technique sidesteps off-target effects and systemic toxicity, otherwise observed following uncontrolled bulk exposure of animals to reactive electrophiles and pleiotropic electrophilic drugs. Leveraging Z-REX, researchers can establish a foothold in the understanding of how individual stress responses and signaling outputs are altered as a result of specific reactive ligand engagement with a specific POI, under near-physiologic conditions in intact living animals.

Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX) is a chemical biology-based method for the investigation of reactive small-molecule signaling. This technique can be applied to live fish of different developmental stages. Here, we couple standard assays in zebrafish with Z-REX for signaling pathway analysis.

ניטור תגובות איתות ממוקדות בדגי זברה זחלים - Z-REX חושף מנגנונים מדויקים של תרופות אלקטרופיליות ומטבוליטים

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the ...

<meta charset="utf8"></head><body>הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של מומי עיניים Drosophila

A Rapid, Simple Workflow for Quantification of External Adult Drosophila Structures

The Drosophila compound eye is a precisely patterned tissue that has revealed molecular mechanisms and biological processes that drive morphogenesis. It is a simple structure of repeating unit eyes, termed ommatidia, that is used to characterize genetic interactions and gene functions. Mutations that affect eye architecture can be easily detected and analyzed; hence, this system is frequently used in under-resourced institutions. Further phenotypic analysis often includes a Scanning Electron Microscope (SEM) to generate high-magnification images suitable for quantitative analysis. However, SEMs are expensive and require costly reagents; sample preparation spans days; and, often, they need full-time staff for sample preparation and instrument maintenance. This limits their utility at under-resourced institutions or during budgetary austerity. In entomology, the use of high-resolution digital imaging technology is a common practice for the identification and characterization of species. This paper describes a method that combines strategies and allows for high-resolution digital imaging of adult Drosophila structures and quantitative analysis using the open software ImageJ. The workflow is a rapid and student-friendly alternative that remedies the limitations of underfunded and under-resourced research facilities with a cost-effective and rapid approach to quantitative phenotypic analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>תהליך עבודה מהיר ופשוט לכימות מבני דרוזופילה חיצוניים למבוגרים

Here, we present a rapid, low-cost, workflow for high-resolution imaging of adult Drosophila eyes to quantify patterning and growth defects. We describe our protocol for sample preparation by point-mounting, high-resolution image acquisition, and image analysis.

תהליך עבודה מהיר ופשוט לכימות מבני דרוזופילה חיצוניים למבוגרים

The Drosophila compound eye is a precisely patterned tissue that has revealed molecular mechanisms and biological processes that drive morphogenesis. It ...

ניהול וזיהוי סימני חלבון על פרוקי רגליים לחקר פיזור

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

פליטת אור סידן Assay עבור ניתוח פונקציונלי של יתוש ( Aedes aegypti) ו טיק ( Rhipicephalus microplus) G-חלבון בשילוב רצפטורים

שיטה מהירה ויעילה לנתח הגולמי כנפי דרוזופילה מתאים Immunodetections או מבחני ה-PCR

חיתוך של דרוזופילה מלאנוסטר שרירי הטיסה לגישות omics

שיטה לכימות עלווה-מגורים פרוקי רגליים

מדידת תגובות פיזיולוגיות של

SwarmSight: מעקב בזמן אמת של האנטנה חרקים תנועות רפלקס הרחבת חוטם באמצעות הכנה משותפת חומרה קונבנציונלי

המבדק Electroantennographic ככלי מיון עבור נדיפים צמחים מארח

ניטור תגובות איתות ממוקדות בדגי זברה זחלים - Z-REX חושף מנגנונים מדויקים של תרופות אלקטרופיליות ומטבוליטים

תהליך עבודה מהיר ופשוט לכימות מבני דרוזופילה חיצוניים למבוגרים

תהליך עבודה מהיר ופשוט לכימות מבני דרוזופילה חיצוניים למבוגרים