Name: administering and detecting protein marks on arthropods for dispersal research
Uploaded: 2016-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
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자금은 농업 및 식품 연구 이니셔티브 경쟁 그랜트 아니에 의해, 부분적으로, USDA CRIS 5347-22620-021-00D에 의해 제공되었다. 식량 농업의 USDA 국립 연구소에서 2011-67009-30141. 우리는 요한나 Nassif의 기술 지원을 감사하고 있습니다. 우리는 또한 그림 3에서 사용 된 사진의 일부를 제공하기 위해 폴 베이커, 데이비드 호튼, 디에고 니에 토와 프랜시스 Sivakoff 감사합니다.

1. 내부 마크, 보존 및 검색 절차 <ol><li> 내부 마킹 절차 <ol><li> 인공 다이어트 또는 필드에서 사육 실험실 식민지에서 (n은 100 개인 ≈) 관심의 곤충을 수집하고 두 깨끗한 사육 용기로 나눕니다. </li><li> 컨테이너 중 하나에 정규 20 ㎖ 다이어트 패킷 (표시되지 않은 음성 대조군 처리)를 놓습니다. , 1.0 ㎎ / ㎖ 닭의 IgG / IGY 용액 1.0 mL를 제 20 ㎖ 인공 다이어트 패킷을 보완 철저하게 혼합, 다른 용기에 넣습니다. 주 : 관심 곤충 인공식이가 없으면 마크 또는 이들이 보통 (예를 들어, 녹색 콩 나방 달걀, 물, 설탕, 꿀)에 유지되어 어떠한 다이어트에 배치 될 수있다. </li><li> 곤충은 24 시간 동안 그들의 먹이 활동을 재개하도록 허용합니다. </li></ol></li><li> 내부 마크 보존 절차 <ol><li> 각 컨테이너에서 다이어트 패킷을 제거하고 승 곤충을 공급다른 음식 소스 i 번째 실험 (예를 들어, 녹색 콩)의 기간 동안을 유지합니다. </li><li> 하루 (또는 임의의 시간 간격으로) 각각의 처리에서 곤충의 코호트 (N = 20)를 수집하고 -20 ℃에서 즉시 동결. </li></ol></li><li> 샌드위치 ELISA 절차 <ol><li> 1 희석 토끼 방지 닭 ​​IGY 차 항체의 50 μl를 추가 트리스 500 깨끗한 ELISA 마이크로 플레이트의 각 웰에 식염수 (TBS)을 버퍼 및 RT (주에서 1 시간의 최소 품어 : 마이크로도 배양 할 수 O / N) 4 ° C에서. </li><li> 판에서 항체를 취소하고 30 분 동안 1.0 % 무 지방 분유 용액 300 μL 잘 각을 차단합니다. </li><li> 이전 배양 단계 기다리는 동안, TBS의 1.0 ㎖로 개별적으로 1.6 ml의 마이크로 원심 튜브에 냉동 곤충을 배치합니다. </li><li> 완전히 균질화 될 때까지 깨끗한 유봉 각 곤충을 갈기 및 ELISA의 개별 아니라 각 샘플의 100 μl를 추가플레이트. 샘플을 1 시간 동안 실온에서 품어하도록 허용합니다. </li><li> 각 ELISA 플레이트의 첫 번째 열에 우물 100 (TBS 계란 흰자) 음 (TBS 만 해당)과 긍정적 인 ㎕의 컨트롤을 추가합니다. 또한, 각 플레이트 (그림 1)의 마지막 열에서 8 우물에 부정적인 곤충 컨트롤 (표시되지 않은 곤충)의 100 μl를 추가합니다. 제어 샘플을 1 시간 동안 실온에서 품어하도록 허용합니다. 그림 1에서 제공하는 템플릿은 우리가 우리의 표준화 된 분석에 사용하는 템플릿입니다 있습니다. 웰에서 샘플의 위치는 연구자의 판단에 달려있다. </li><li> 각 웰을 인산염 완충 식염수 (PBS) -tween로 3 회 세척 한 후 토끼 방지 닭의 IgG / IGY 고추 냉이 퍼 옥시 다제 1 희석과 결합의 50 μl를 추가 : 10,000 1 % 우유 솔루션을하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> PBS-트윈 (tween)와 각 웰을 세 번 세척하고 각 웰에 테트라 메틸 벤지딘 (TMB) 기판의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 10 분 후, 웰을 읽어650 nm의 파장에서 설정된 마이크로 플레이트 분광 광도계. </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53693/53693fig1.jpg" /> 도 1의 전형적인 96에 사용 표준화 웰 명칭을 나타내는 개략도 웰 ELISA 마이크로. 각 판은 양의 단백질 제어 (POS Ctrl 키)에게 잘 전용 트리스 완충 염수 음성 대조군 전용 7 웰 (TBS)를 포함하고, 표시되지 않은 (음) 곤충 컨트롤 전용 탈환 곤충 (샘플 1 ... 80), 8 우물에 전념 80 개인 우물 (NEG Ctrl 키 1 ... 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53693/53693fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 2. 외부 표시, 보존 및 검색 절차 <ol><li> 외부 마킹 절차 <ol><li> 관심의 곤충 수집 (N 100 ≈2.5 cm 직경 구멍 실험실 콜로니로부터 두 1.0 L를 플라스틱 용기로 필드와 장소에서 개인) 각 용기의 측에서 펀칭. </li><li> 의료 분무기를 사용하여 DH 2 O (음성 대조군 처리)의 1.0 ml의 첫 번째 컨테이너에 곤충 스프레이. 의료 분무기를 사용하여 닭고기 달걀 흰자의 5.0 % 용액 1.0 mL로 두 번째 용기에 곤충 스프레이. </li><li> 표준 실험실 공기 콘센트에 분무기의 호스를 연결 한 다음 컨테이너의 2.5 cm의 구멍에 분무기의 입에 삽입합니다. 분무기가 증기를 생성 할 때까지, 점차적으로 공기 배출구를 켭니다. </li><li> 달걀 흰자위 용액 (약. 2-5 분) 분배 될 때까지 (마킹) 살포를 계속합니다. </li><li> 분무기를 제거하고, 플라스틱 용기의 구멍에 코르크 장소. 솔루션이 완전히 건조 될 때까지 곤충은 실온에서 방치한다. </li></ol></li><li> 외부 마크 보존 절차<ol><li> 마크에 더 이상 노출을 방지하기 위해 별도의 깨끗한 사육 용기에 건조 곤충의 각 처리를 놓습니다. </li><li> 연구 기간 동안 곤충을 유지하기 위해 깨끗한 용기에 음식과 물을 추가합니다. </li><li> 매일 각각의 치료에서 곤충의 코호트를 (N = 20) 수집 및 -20 ° C에서 즉시 동결. </li></ol></li><li> 간접 ELISA 절차 <ol><li> 개별적으로 1.6 ml의 마이크로 원심 튜브에 얼어 붙은 곤충을 놓고 TBS의 1.0 ml를 추가합니다. </li><li> 120 rpm으로 궤도 흔드는 세트에 1 시간 동안 샘플을 만끽 해보세요. </li><li> 단계 1.3.5에 설명 된대로 부정과 긍정적 인 컨트롤을 추가합니다. </li><li> 도 1에 도시 된 바와 같이, 침지 한 후, 새로운 96 웰 ELISA 플레이트에 80 지정된 샘플 웰 중 하나에 각 시료로부터 100 ㎕의 분취 액을 피펫 샘플을 실온에서 1 시간 동안 배양 허용 (주 :. 마이크로도 될 수있다 배양 O / N 4 ° C에서). </li><li> 와 우물 세 번 씻어PBS-Tween 및 다음도 1 %를 각각 소 혈청 알부민 (BSA-PBS)을 함유하는 인산염 완충 식염수 300 μl를 추가한다. </li><li> 실온에서 30 분 후 PBS-트윈 (tween)로 두 번 씻는다. </li><li> 물론 각 PBS-BSA-실 웨트 (0.05 %)에서 8,000 실온에서 1 시간 동안 품어 : 1 희석 토끼 반 달걀 알부민 차 항체의 50 μl를 추가합니다. </li><li> PBS-트윈 (tween)와 각 웰을 세 번 세척 한 후 1 희석 고추 냉이 과산화 효소와 결합 염소 항 - 토끼 IgG를 50 μL 추가 : 실온에서 1 시간 동안 PBS-BSA-실 웨트 (0.05 %)에서 2,000. </li><li> PBS-트윈 (tween)와 각 웰을 세 번 세척하고 각 웰에 TMB 기판의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 10 분 후, 650 nm 파장으로 설정 마이크로 플레이트 분광 광도계로 웰을 판독. </li></ol></li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 아프로 풀링 음성 대조군에 기초한 표준 편차를 각각 ELISA 플레이트 상에 8 대조군 곤충의 평균 흡광도 값을 계산하고 계산M 주어진 연구 (12)의 ELISA 플레이트의 모든. </li><li> ELISA 양성 임계 값을 획득하기 위해 각 ELISA 플레이트에 대해 얻어진 평균 여섯 배 풀링 표준 편차를 추가한다. 이 값 이상 흡광도 값을 산출 상관 곤충 시료 단백질 마크의 존재에 대한 긍정적 인 것으로 간주된다. </li></ol>

이 책에서 상표명 또는 상업적 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공하는 목적으로 만이며, 미국 농무부에 의해 추천이나 보증을 의미하지는 않습니다. USDA는 평등 한 기회를 제공하는 고용 기관입니다.

절지 동물 단백질 immunomarking 절차는 먼저 세기 전 (9)의 4 분의 1 정도를 설명했다. 이후 절차는 내부 및 외부 투여의 IgG / IgYs를 사용 절지 동물의 다양한 분산 패턴을 연구하기 위해 적용되어왔다. 이 단백질은 지금까지 테스트 곤충 종의 다양한에 대한 확고한 마커를 입증했다. 그러나, 전술 한 바와 같이, IgG의 / IgYs를 사용하는 주요 한계는 이들이 매우 비싸다는 것이다. 따라서, IgG의 / IgY...

자연에서 절지 동물 해충, 천적 (기생 포식자), 및 수분 매개자의 움직임을 추적하는 것은 생태계 서비스를 개선하는 방법에 대한 이해에 필수적이다. 분산 연구의 대부분의 유형에 대한 핵심 요소는 관심의 절지 동물 (들) 태그를 신뢰할 수있는 방법을 가지고있다. 다양한 재료 (예를 들면, 도료, 염료, 착색 먼지, 태그, 희귀 원소, 단백질) 동작, 및 다른 생태 상호 1,2- 먹이, 그 집단의 동력학, 분산 능력을 평가하는 절지 동물을 표시하는 데 사용되어왔다. 주어진 분산 연구에 사용 마커의 적절성의 연구가 진행되고 유형에 의존 할 것이다. (1) 마크 릴리스 탈환 (MRR), (2) 마크 캡처, (3) 자기 마크 캡처 : 절지 동물을 표시하기위한 세 가지 범주화가 있습니다. 마크 릴리스 탈환 조사의 경우, 조사는 일반적으로 laborato에 집합 절지 동물을 표시RY 및 필드 중앙 지점에서 릴리스 그들을. 절지 동물은 다음 다른 수집 장치 (예를 들어, 스위프 그물, 진공, 접착 트랩) 3,4,5를 사용하여 다양한 공간과 시간 간격에서 다시 캡처됩니다. 특정 마크가 기본 개인 해제 구별 할 탈환 표본은 다음 검사합니다. 마크 캡처 연구, 연구자는 일반적으로 필드 사용하는 스프레이 장비 (예를 들어, 배낭 분무기, 붐과 노즐 스프레이)에서 직접 표를 적용한다. 마크 캡처 연구를위한 최적의 마커는 저렴하고 쉽게 절지 동물의 서식지에 적용됩니다. 자기 마크 캡처 연구, 연구자는 보통 절지 동물 미끼 6,7 또는 둥지 입구 8 마크를 적용합니다. 차례로, 절지 동물은 둥지를 빠져 나갈 때까지 마크에 대해 &quot;칫솔질&quot;에 의해 외부에 표시된 미끼 또는 삼키려에 의해 내부적으로 자체를 표시합니다. 위에서 언급 한 바와 같이, 마커의 많은 유형이 우리를왔다ED는 절지 동물 종의 다양한 태그를. 그러나 거의 이러한 분산 연구 범주의 세 가지 유용하다. 단백질 immunomarking 절차의 개발은 곤충 마킹 돌파구이었다. Immunomarking은 절지 동물에 단백질 라벨을두고 내부적 또는 외부 적으로, 이는 차례로, 항 - 단백질 특정 효소 면역 분석법 (ELISA)에 의해 검출된다. 사용 된 최초의 단백질 마커는 토끼 면역 글로불린 (IgG를) 닭의 IgG / IGY 9,10했다. 그들은 MRR과 자기 마크 캡처 연구 (설명 참조)에 매우 효과적 마크 입증했다. 불행하게도, IgG의 / IGY 단백질은 비용이 많이 드는 때문에 마크 캡처 연구 및 자체 마크 캡처 연구의 대부분의 유형에 대한 실질적인 없습니다. 그 후, 2 세대 단백질 검출 ELISA를 닭 달걀 흰자 (알부민), 우유 (카제인)과 두유 (트립신 억제제 단백질)에 포함 된 단백질을 위해 개발되었다. 각각의 분석은, 매우 민감한 특정, 가장중요한 것은, 훨씬 적은 비용의 IgG / IGY 단백질 (11)보다 단백질을 사용합니다. 이 단백질은 MRR, 마크 캡처, 자기 마크 캡처 연구 (토론 참조)에 대한 효과가 입증하고있다. 이 글에서, 우리는 기술과 단백질 마크 실험실 보존 연구를 수행하는 방법을 보여줍니다. 이러한 연구는 전계 분산 연구의 모든 유형에 필요한 조사의 첫 단계이다. 연구자가 표시 전에 필드 분산 연구에 착수을 대상 절지 동물 종에 유지됩니다 얼마나 알고 구체적으로는 중요하다. 여기, 우리가 설명하고 내부 및 외부 MRR 곤충, 마크 캡처, 자기 마크 캡처 형 현장 연구를 표시하는 방법을 보여줍니다. 우리는 간접적 샌드위치 ELISA를 함께 표시의 존재를 검출하는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Food storage container (for insect rearing)</td><td>Rubbermaid/Tupperware</td><td>Various sizes</td><td>Various manufacturers &amp;amp; vendors. Mesh fabric is glued in a window</td></tr><tr><td>Small volume nebulizer (Micro Mist)</td><td>Teleflex-Hudson RCI</td><td>1881</td><td>Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap</td><td>Continental Lab Products</td><td>4445.X</td><td>Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids.</td></tr><tr><td>Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid)</td><td>RPI Corp.</td><td>145746</td><td>This design is nice because it doesn&#039;t crowd the tubes.</td></tr><tr><td>Dispenser, repeater</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Anything similar will help speed up the dispensing.</td></tr><tr><td>Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml</td><td>Kimble Chase</td><td>749521-1500</td><td>Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse.</td></tr><tr><td>BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom)</td><td>BD</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Ovation pipette, manual (20-200 &amp;micro;l)</td><td>VistaLab</td><td>1057-0200 or 1070-0200</td><td>Any similar type will work. This model is ergonomic.</td></tr><tr><td>Reservoirs, sterile reagent</td><td>VistaLab</td><td>4054-1000</td><td>Anything similar will work.</td></tr><tr><td>Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 &amp;micro;l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730391</td><td>If you had to pick one electronic model, this size is most useful.</td></tr><tr><td>Electronic pipette, 8-channel (10-300 &amp;micro;l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730361</td><td>Anything similar will work.</td></tr><tr><td>Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369802&amp;nbsp;</td><td>Anything similar will work for manual plate washing.</td></tr><tr><td>Microplate reader with absorbance detection</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 250</td><td>Anything similar will work.</td></tr><tr><td>Chicken IgG/IgY</td><td>United States Biological</td><td>I1903-15R</td><td>Also available from other sources</td></tr><tr><td>Egg whites</td><td>Grocery store</td><td>&amp;ldquo;All Whites&amp;rdquo;, &amp;ldquo;Egg Beaters&amp;rdquo;, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;</td><td>Mix 5 ml with 95 ml dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 5% solution</td></tr><tr><td>Tris (Trizma Base)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>2.42 g/L to make TBS</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>29.22 g/L to make TBS and 8.0&amp;nbsp;g&amp;#8288;/&amp;#8288;L for PBS</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td>1.14 g/L for PBS</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>0.2 g/L for PBS</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>0.2 g/L for PBS</td></tr><tr><td>Tween 20, EIA grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved.</td></tr><tr><td>PBS with 1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3688</td><td>Mix 1 packet in 1 L dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6409</td><td>Mix 100 &amp;micro;l in 50 ml TBS</td></tr><tr><td>Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%)</td><td>Grocery store</td><td></td><td>Mix 10 g with 1 L dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 1% solution</td></tr><tr><td>Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9046</td><td>Mix 100 &amp;micro;l in 1 L of 1% milk</td></tr><tr><td>Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6534</td><td>Dilute 125 &amp;micro;l in 1 L PBS-BSA</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td>Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3&amp;nbsp;ml Silwet</td></tr><tr><td>Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer</td><td>Lehle Seeds</td><td>VIS-01</td><td>Add as last ingredient</td></tr><tr><td>TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate</td><td>SurModics</td><td>TMBW-1000-01</td><td></td></tr></tbody></table>

administering and detecting protein marks on arthropods for dispersal research

모니터링 절지 동물의 움직임은 종종 더 나은 관련된 인구 역학, 분산 패턴, 기주 식물의 환경 설정 및 기타 생태 학적 상호 작용을 이해하는 것이 필요합니다. 절지 동물은 일반적으로 고유의 마크를 태그에 의해 자연에서 추적 한 다음 다시 수집 그들의 분산 기능을 결정하기 위해 시간과 공간을 통해들을 수 있습니다. 이러한 착색 도료 또는 먼지 등의 실제 물리적 태그 외에, 단백질의 다양한 유형에 대한 생태 학적 연구 절지 마킹하는 데 매우 효과적인 것으로 입증되었다. 단백질은 내부 및 / 또는 외부로 투여 할 수있다. 단백질이어서 특이 단백질 효소 면역 분석법 (ELISA)과 수복 절지 검출 될 수있다. 여기에서 우리는 외부와 내부에 단백질과 절지 동물에 태그를위한 프로토콜을 설명합니다. 간단한 두 실험 예는 증명되어 국소 적으로 단백질이 풍부한 규정 식 및 (2)의 외부 단백질 마크를 제공하여 곤충에게 소개 (1) 내부 단백질 마크의료용 분무기를 사용하여 곤충 pplied. 우리는 다음과 샌드위치 곤충 단백질 마크를 검출하는데 사용될 간접 ELISA 방법을 단계별로 설명 관한 것이다. 이 데모에서는, 마크 릴리스 탈환, 마크 캡처, 연구의 자기 마크 캡처 유형의 절지 동물의 수집 및 단백질 마커 검출의 다양한 측면은 immunomarking 절차가되었습니다 다양한 방법과 함께 설명되어 있습니다 연구 목적의 다양한 적합하도록.

내부 표시 : 내부 마크 보존 시험의 결과는도 2a에 도시되어있다. 계산 된 ELISA 위험 임계 값은 0.054이었다. 전체 (전 4 샘플 날짜가 결합), 단백질없이 처리 된 곤충은 지속적으로 낮은 ELISA 값 (X = 0.038 ± 0.002, N = 80)을 수득 하였다. 반대로, 모든 곤충 단백질 농축 다이어트 일관 강한 ELISA 값 (X = 0.4...

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Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.

관리 및 분산 연구를위한 절지 동물에 단백질 마크를 검출

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

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7.3K 조회수.  Arid-Land Agricultural Research Center. Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated. 

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A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

모기의 기능 분석을 위해 칼슘 Bioluminescence 분석 ( Aedes aegypti)와 틱 ( Rhipicephalus microplus) G 단백질 결합 수용체

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

연구

면역학 및 감염병학

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells named wing imaginal discs formed during embryonic development. In the larval stages the imaginal discs grow, increasing its number of cells and forming monolayered epithelial&#160;structures. Inside the pupal case, the imaginal discs bud out and fold into bilayers along a line that becomes the future margin of the wing. During this process, the longitudinal primodia veins originate vein cells on the prospective dorsal and ventral surfaces of the wing. During the pupal stage the stripes of vein cells of each surface communicate in order to generate tight tubes; at the same time, the cross-veins begin their formation.
With the help of appropriate molecular markers, it is possible to identify the major elements composing the wing during its development. For this reason, the ability to accurately detect transcripts or proteins in this structure is critical for studying their abundance and localization related to the development process of the wing.
The procedure described here focuses on manipulating pupal wings, providing detailed instructions on how to dissect the wing during the pupal stage. The dissection of pupal tissue is more difficult to perform than their counterparts in third instar larvae. This is why this approach was developed, to obtain rapid and efficient high quality samples. Details of how to immunostain and mount these wing samples, to allow the visualization of proteins or cell components, are provided in the protocol. With little expertise it is possible to collect 8-10 high quality pupal wings in a short amount of time.

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

The ability to accurately detect transcripts or proteins in Drosophila tissues is critical for studying their abundance and localization related to the development process. Here is the description of a straightforward procedure to dissect pupal wings. These wings can be used as samples in several techniques (immunohistochemistry, PCR assay, etc.).

번데기 날개 초파리 Immunodetections 또는 PCR 분석 실험에 적합의 해 부를 신속 하 고 효율적인 방법

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

발생학

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

오믹스 접근법에 대한 드로소필라 멜라노가스터 비행 근육의 해부

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

유전학

A Method for Quantifying Foliage-Dwelling Arthropods

Terrestrial arthropods play an important role in our environment. Quantifying arthropods in a way that allows for a precise index or estimates of density requires a method with high detection probability and a known sampling area. While most described methods provide a qualitative or semi-quantitative estimate adequate for describing species presence, richness, and diversity, few provide an adequately consistent detection probability and known or consistent sampling areas to provide an index or estimate with adequate precision to detect differences in abundance across environmental, spatial, or temporal variables. We describe how to quantify leaf-dwelling arthropods by sealing the leaves and end of branches in a bag, clipping and freezing the bagged material, and rinsing the previously frozen material in water to separate arthropods from the substrate and quantify them. As we demonstrate, this method can be used at a landscape scale to quantify leaf-dwelling arthropods with adequate precision to test for and describe how spatial, temporal, environmental, and ecological variables influence arthropod richness and abundance. This method allowed us to detect differences in density, richness, and diversity of leaf-dwelling arthropods among 5 genera of trees commonly found in southeastern deciduous forests.

We describe how to quantify leaf dwelling arthropods by sealing the leaves and end of branches in a bag, clipping and freezing the bagged material, and rinsing the previously frozen material in water to separate arthropods from the substrate for quantification.

단풍 주거 절지동물을 정량화하는 방법

Terrestrial arthropods play an important role in our environment. Quantifying arthropods in a way that allows for a precise index or estimates of density ...

환경과학

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

의 생리적 반응을 측정<em&gt; 초파리</em&gt; 라이브 칼슘 이미징을 사용하여 지질 페로몬에 감각 뉴런

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

SwarmSight: Real-time Tracking of Insect Antenna Movements and Proboscis Extension Reflex Using a Common Preparation and Conventional Hardware

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis during feeding. The ability to rapidly obtain high-resolution measurements of natural antenna and proboscis movements and assess how they change in response to chemical, developmental, and genetic manipulations can aid the understanding of insect behavior. By extending our previous work on assessing aggregate insect swarm or animal group movements from natural and laboratory videos using the video analysis software SwarmSight, we developed a novel, free, and open-source software module, SwarmSight Appendage Tracking (SwarmSight.org) for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The software processes frames about 120 times faster than humans, performs at better than human accuracy, and, using 30 frames per second (fps) videos, can capture antennal dynamics up to 15 Hz. The software was used to track the antennal response of honey bees to two odors and found significant mean antennal retractions away from the odor source about 1 s after odor presentation. We observed antenna position density heat map cluster formation and cluster and mean angle dependence on odor concentration.

This protocol describes steps for using the novel software, SwarmSight, for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The free, open-source software processes frames about 120 times faster than humans and performs at better than human accuracy.

SwarmSight: 곤충 안테나와 일반적인 준비와 기존 하드웨어를 사용 하 여 코 확장 반사의 실시간 추적

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis ...

신경과학

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

호스트 식물 휘발성 물질에 대한 선별 도구로 Electroantennographic Bioassay

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

생물학

Monitoring On-Target Signaling Responses in Larval Zebrafish - Z-REX Unmasks Precise Mechanisms of Electrophilic Drugs and Metabolites

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the mode of action (MOA) of such molecules leverage bulk treatment of experimental specimens with an excess of a specific reactive species. In this approach, the high reactivity of electrophiles renders non-discriminate labeling of the proteome in a time- and context-dependent manner; redox-sensitive proteins and processes can also be indirectly and often irreversibly affected. Against such a backdrop of innumerable potential targets and indirect secondary effects, linking phenotype to specific target engagement remains a complex task. Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX)-an on-demand reactive-electrophile delivery platform adapted for use in larval zebrafish-is designed to deliver electrophiles to a specific protein of interest (POI) in otherwise unperturbed live fish embryos. Key features of this technique include a low level of invasiveness, along with dosage-, chemotype-, and spatiotemporally-controlled precision electrophile delivery. Thus, in conjunction with a unique suite of controls, this technique sidesteps off-target effects and systemic toxicity, otherwise observed following uncontrolled bulk exposure of animals to reactive electrophiles and pleiotropic electrophilic drugs. Leveraging Z-REX, researchers can establish a foothold in the understanding of how individual stress responses and signaling outputs are altered as a result of specific reactive ligand engagement with a specific POI, under near-physiologic conditions in intact living animals.

Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX) is a chemical biology-based method for the investigation of reactive small-molecule signaling. This technique can be applied to live fish of different developmental stages. Here, we couple standard assays in zebrafish with Z-REX for signaling pathway analysis.

유충 제브라피쉬의 표적 신호 반응 모니터링 - Z-REX는 친전자성 약물 및 대사 산물의 정확한 메커니즘을 밝힙니다.

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Drosophila eye Defect의 고해상도 이미징 및 분석

A Rapid, Simple Workflow for Quantification of External Adult Drosophila Structures

The Drosophila compound eye is a precisely patterned tissue that has revealed molecular mechanisms and biological processes that drive morphogenesis. It is a simple structure of repeating unit eyes, termed ommatidia, that is used to characterize genetic interactions and gene functions. Mutations that affect eye architecture can be easily detected and analyzed; hence, this system is frequently used in under-resourced institutions. Further phenotypic analysis often includes a Scanning Electron Microscope (SEM) to generate high-magnification images suitable for quantitative analysis. However, SEMs are expensive and require costly reagents; sample preparation spans days; and, often, they need full-time staff for sample preparation and instrument maintenance. This limits their utility at under-resourced institutions or during budgetary austerity. In entomology, the use of high-resolution digital imaging technology is a common practice for the identification and characterization of species. This paper describes a method that combines strategies and allows for high-resolution digital imaging of adult Drosophila structures and quantitative analysis using the open software ImageJ. The workflow is a rapid and student-friendly alternative that remedies the limitations of underfunded and under-resourced research facilities with a cost-effective and rapid approach to quantitative phenotypic analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>외부 성체 초파리 구조의 정량화를 위한 빠르고 간단한 워크플로우

Here, we present a rapid, low-cost, workflow for high-resolution imaging of adult Drosophila eyes to quantify patterning and growth defects. We describe our protocol for sample preparation by point-mounting, high-resolution image acquisition, and image analysis.

외부 성체 초파리 구조의 정량화를 위한 빠르고 간단한 워크플로우

The Drosophila compound eye is a precisely patterned tissue that has revealed molecular mechanisms and biological processes that drive morphogenesis. It ...

관리 및 분산 연구를위한 절지 동물에 단백질 마크를 검출

요약

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모기의 기능 분석을 위해 칼슘 Bioluminescence 분석 ( Aedes aegypti)와 틱 ( Rhipicephalus microplus) G 단백질 결합 수용체

번데기 날개 초파리 Immunodetections 또는 PCR 분석 실험에 적합의 해 부를 신속 하 고 효율적인 방법

오믹스 접근법에 대한 드로소필라 멜라노가스터 비행 근육의 해부

단풍 주거 절지동물을 정량화하는 방법

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유충 제브라피쉬의 표적 신호 반응 모니터링 - Z-REX는 친전자성 약물 및 대사 산물의 정확한 메커니즘을 밝힙니다.

외부 성체 초파리 구조의 정량화를 위한 빠르고 간단한 워크플로우

외부 성체 초파리 구조의 정량화를 위한 빠르고 간단한 워크플로우