Name: fluorescence time-lapse imaging of the complete s. venezuelae life cycle using a microfluidic device
Uploaded: 2016-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device at JoVE.com

The authors thank Grant Calder for technical assistance with the microscope, Matt Bush for comments on the protocol, and the John Innes Centre for purchase of the Zeiss widefield microscope. This work was funded by BBSRC grant BB/I002197/1 (to M.J.B), by BBSRC Institute Strategic Programme Grant BB/J004561/1 to the John Innes Centre, by Swedish Research Council grant 621-2010-4463 (to K.F.), and by a Leopoldina Postdoctoral Fellowship (to S.S.).

1. ניתוק של טרי S. נבגי venezuelae ואת הכנת בינוני תרבות שהות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 30 מ&quot;ל מלטוז-שמרים-מאלט חלץ חלץ (MYM) בינוני, בתוספת 60 μl פתרון אלמנט עקבות R2 (TE), עם 10 נבגים μl של SV60 זן [pSS209 :: BT1 φ attB (divIVA P - divIVA-mCherry P ftsZ -ftsZ-ypet)]. לצמיחה עקבית נביגה של התאים, להשתמש בבקבוק מבולבל או בקבוקון המכיל באביב כדי לאפשר אוורור מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאים עבור 35-40 שעות ב 30 מעלות צלזיוס, 250 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את התאים על ידי מיקרוסקופיה נוזלי רכוב שלב ניגודיות. בשלב זה שברים ונבגי mycelial יהיו גלויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 1 מ&quot;ל תאים בצנטריפוגה בטבלה העליונה ב 400 XG דקות 1 עד גלולה תפטיר ושברי תאים גדולים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כ 300 שיתוף supernatant μlntaining השעיה של נבגים לצינור 1.5 מיליליטר חדש ולשמור על קרח. שמור את מדיום התרבות הנותרת עבור צעד 1.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל נבגים 01:20 ב MYM-TE (ריכוז סופי: 0.5-5 x 10 7 נבגים / מ&quot;ל) ולשמור על הקרח עד הצורך (ראה שלב 2.3). הערה: למרות התנאים המדויקים המפעילים נביגה ב Streptomyces אינם מובנים, באמצעות מדיום MYM-TE בילו, לרבות כל אותות תאיים ידועים מתרבה sporulating, מגרה נביגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן לעקר 10 מ&quot;ל של מדיום תרבות הנותרים כדי להשיג בילה MYM-TE כי הוא חופשי של נבגים ושברי mycelial. שימוש במסנן 0.22 מיקרומטר מזרק סטרילי ולהעביר בילה MYM-TE לצינור 15 מ&quot;ל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את מוכן בילה MYM-TE במשך כמה ימים על 4 מעלות צלזיוס אם ניסויים נוספים באמצעות תנאי הגידול דומים הם להתנהל. </li></ol> 2. הכנת המכשיר microfluidic הערה: כל PLA microfluidicte מאפשר עד ארבעה ניסויים בלתי תלויים להתבצע. כדי למנוע זיהום של תאי זרימה בשימוש, השתמש פתרונות סטרילי ותנאי עבודה בעת הגדרת ניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון משלוח מהצלחת microfluidic ולשטוף את הבארות עם MYM-TE סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 μl MYM-TE כדי מפרצון גם 1 ו 300 μl בילה MYM-TE לבארות 2 עד 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 40 טענו μl מדולל נבגים משלבים 1.6 טעינת תא היטב 8 של השביל &quot;A&quot; ו לאטום את הסעפת לצלחת פי הוראות מייצרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תוכנת בקרת מיקרופלואידיקה, לבחור את סוג הצלחת המתאים ולהקים תכנית זרימת ממשלת ערוץ הזרימה הקאמרית תרבות ידי בינוני זורם מבארות כניסה 1 עד 5 בשעה 6 psi במשך 2 דקות לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת תוכנות שליטת מיקרופלואידיקה, ליצור פרוטוקול זרימה לניסוי: זורם MYM-TE מבאר כניסה 1 עבור 6 שעות, כדי לאפשר נביטה וצמיחה וגטטיבי של התאים. מֶתֶגאז כדי טפטוף של בילה MYM-TE מבארים 2 עד 5 בפעם הנותרת של הניסוי. במהלך הניסוי לשמור קבוע בלחץ הזרימה 6 psi (המקביל ל כ 9 μl בינוני / hr). התחל תוכנית תזרים לאחר שלב 3.5. </li></ol> 3. הגדר של מיקרוסקופ פרוטוקול זמן לשגות הערה: שיטה זו יושמה על מיקרוסקופ widefield הפוך ממונעת האוטומטי לחלוטין מצוידת במצלמת sCMOS, מנורת מתכת הליד, פוקוס אוטומטי חומרה, בעל קרקע צלחות 96-היטב בתא סביבתי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לחמם את החדר הסביבתי עד 30 מעלות צלזיוס מראש על מנת למנוע בעיות עם הפוקוס האוטומטי לאחר תחילת הניסוי. הזמן הדרוש תלוי בתא הסביבתי בשימוש, המיקרוסקופ ומערכת החימום. התחל כדי לחמם את המערכת בלילה שלפני הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את Softwa מיקרוסקופ ואוטומציה מיקרוסקופיה ובקרהמִחָדָשׁ. השתמש צמצם מספרי גבוהת טבילה אובייקטיבי שמן (NA) לאיסוף אותות אופטימלי ברזולוציה מרחבית, כגון 100X, 1.46 אובייקטיבי NA שמן דסק&quot;ש. בחר מסננים מתאימים ומראות dichromatic לרכוש התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) תמונות ותמונות של תערובות חלבון צהוב-ניאון אדום ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח טיפת שמן טבילה על המטרה ולהוסיף נוזל טבילה לתחתית חלון ההדמיה על צלחת microfluidic לשפר פוקוס תא במהלך רכישת תמונה. בזהירות הר מכשיר microfluidic האטום (שלב 2.5) על הבמה של מיקרוסקופ ההפוכה. ודא כי הצלחת מונחת היטב בעל הבמה אינו עוברת במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על חלון ההדמיה של תא תרבות microfluidic אל מוקד באמצעות סמני עמדה המוטבעות להתמצאות. פוקוס על החלק השמאלי ביותר של תא הזרימה הראשונה (שכותרתו &quot;A&quot;) עם הגודל מהלכודה 5, המקבילה לגובה מלכודת של 0.7 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנת מיקרופלואידיקה, תאי עומס מן המפרצון גם 8 ב 4 psi במשך 15 שניות. בדוק את צפיפות התאים בתא התרבות ידי הזזת הבמה על חלון ההדמיה. אם לא נבגים נלכדו, לחזור על שלב טעינת תא או לחלופין להגביר את לחץ הטעינה ו / או זמן עד צפיפות התאים הרצויה מושגת (1-10 נבגים לכל חלון הדמיה עם 2,048 x 2,048 פיקסלים). הימנע להעמיס את חדר התרבות. הערה: בדרך כלל אנחנו משתמשים מלכודת גודל 5 הדמית Streptomyces, אבל אנחנו גם השגנו תוצאות טובות עם מלכודת בגדלי 4 ו -3, עיינו במדריך למשתמש של הספק לקבלת הצעות נוספות על אופטימיזציה של תהליך טעינת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעילו את תוכנית הזרימה תוכנות שליטה משלב 2.5 ולאפשר הצלחת microfluidic לחום-לאזן במשך שעה 1 בשלב מיקרוסקופ לפני תחילת רכישת התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת תוכנות שליטת מיקרוסקופ, להקים רכישה רבה ממדים לקחת muתמונות רובים של בעמדות במה מרובות לאורך זמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור שמירה אוטומטית: לציין ספרייה עבור שמירה אוטומטית של קבצי תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת הגדרות תאורה, לקבוע הגדרות תאורה אופטימלית עבור כל מבנה ספציפי מראש. לצורך הניסוי המתואר, השתמש פעמי החשיפה הבאות: דסק&quot;ש 150 msec, YFP 250 msec, RFP 100 msec. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זמן-סדרה: להגדיר סדרה עתית לרכוש תמונות בנקודות הזמן הרצוי ברצף. הדמית מחזור החיים של ס venezuelae, לבחור מרווח זמן 40 דקות במשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למשרות במת פוקוס אוטומטית: לסרוק את חדר התרבות על ידי הזזת עמדות במת חנות במה לכל תפקיד הדמיה של עניין. ודא כי עמדות חד-שלבי ממוקמים מספיק מזה כדי למזער photobleaching ו phototoxicity.Typically להשתמש עד 12 עמדות. שגרת פוקוס אוטומטית מפעיל עבור כל נקודת זמן לתקן מוקדי סחף האט. אם אפשרות זו זמינה תוכנות שליטה מיקרוסקופ, אסטרטגית פוקוס אוטומטית מוגדר &quot;עדכון שטח מקומי על ידי פוקוס אוטומטי חומרה&quot;. לאחר Z-הקואורדינטות של עמדות הבמה שנבחרו מאומתות, להפעיל את הפוקוס אוטומטי חומרה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הניסוי זמן לשגות של תוכנות שליטה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק שכל העמדות הבמה עדיין בפוקוס בנקודות מאוחר יותר. בניסויי זמן לשגות פועלים במשך כמה שעות, מעת לעת אנו מבחינים להיסחף הבמה גם בעת שימוש פוקוס אוטומטי. אם עמדות במה צריכות להיות refocused, להפסיק את הניסוי בכל נקודת זמן מתאימה, לשנות את הפוקוס ולהפעיל מחדש את הניסוי בתוך פרק הזמן המוגדר הדמיה (שלב 3.7.3). ראה שלב 4.3 עבור איך לשרשר סדרת הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור רכישת תמונה לאחר 24-30 שעות או כאשר העובש באזור של עניין יש בדיל לתוך נבגים (ראה סדרת תמונת DIC). לעצור את תוכנית תזרים בתוכנה לפרק את המכשיר microfluidic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן צלחת microfluidic משומש STO לטווח קצרזַעַם. הסר הנותרים MYM-TE ובילה MYM-TE מבאר 1 עד 6, גם בזבוז ריק 7 וטעינה התא היטב 8. בתנאים סטריליים, למלא מחדש בשימוש בארות של השביל &quot;A&quot; ובארות של נתיבים שאינם בשימוש ( &quot;B&quot; כדי &quot;D&quot;) על צלחת עם בופר פוספט סטרילית (PBS). חותם את הצלחת עם parafilm כדי למנוע ממנו להתייבש ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 4. דור של זמן לשגות סרטים שימוש פיג&#39;י תוכנה הערה: יש לציין כי חבילות תוכנה מסחרית וחופשית שונות זמינות כדי לעבד תמונות מיקרוסקופיה זמן לשגות כולל ZenBlue, Metamorph, קפוא, ImagePro או ImageJ. כאן נתמקד פיג&#39;י, אשר הנה תכנית עיבוד תמונת קוד פתוח מבוססת על ImageJ, ואשר כבר מספק מספר התוספים המותקנים מראש שימושיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני הדמיה העברת מניסוי זמן לשגות למחשב אשר פיג&#39;י מותקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השקת התוכנית ולייבא את הקובץ הדמיה באמצעות &amp;# 34; קובץ&gt; יבוא&gt; ביו-פורמטים &quot;. או פשוט על ידי גרירת קובץ ההדמיה לתוך פיג&#39;י ב&quot; אפשרויות היבוא ביו-הפורמטים &quot;, סמן את התיבה&quot; ערוצים לפצל &quot;כדי לקבל ערימת תמונה נפרדת עבור כל ערוץ תאורה (DIC , RFP, YFP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: כדי למזג זמן-סדרות נפרדות נובעות הפסקה ברכישת התמונה בשל refocusing (שלב 3.9), פתח ערימות תמונת בהתאמה וברח &quot;תמונה&gt; סטאקס&gt; כלים&gt; לשרשר&quot; לכל ערוץ (DIC, RFP, YFP ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את איכות נתוני הזמן לשגות ידי גלילת ערימות תמונה. חפש עובש כי נשאר בפוקוס לאורך זמן, צמיחת mycelial מופע ובסופו של דבר ליצור נבגים (מחסנית DIC). בדוק את לוקליזציה subcellular הצפויה DivIVA-mCherry על קצות hyphal (מחסנית RFP) ו FtsZ-YPet להרכיב טבעות יחידות או מבנים רבים, כמו-סולם וגטטיבי או עובש sporogenic (מחסנית YFP), בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד אזור של אינטרס עבור processi במורד הזרםng של תמונות. זמן לשגות מיקרוסקופ לעתים קרובות מייצרת קבצים גדולים והדבר עשוי להאט עיבוד על ידי פיג&#39;י. לכן מומלץ לזהות ולבודד אזור של העניין (ROI) ולבצע צעדי עיבוד תמונה נוספים על גרסה קטנה יותר זה של מחסנית התמונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;הבחירה מלבנית&quot; בתפריט וצייר ROI מלבני בערימת תמונת DIC בצורה כזאת כי העובש בפיתוח מוקף על ידי ROI במהלך סדרת התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכפל ROI מחסנית עם &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש על הבר שם ערימת תמונת YFP ובחר &quot;ערוך&gt; בחירה&gt; שחזר בחירה&quot; בתפריט כדי לשחזר את הבחירה מלבני הקודמת של דסק&quot;ש המקורי מחסנית לאותה ההופעה במיקום בערימת YFP לשכפל את ההחזר על ההשקעה עם &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך זה עבור מחסנית RFP. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את התמונות בתמונה השלוש ערימות to להסיר מרחף במה במישור xy לאורך זמן. גלול אל המסגרת האחרונה במחסנית דסק&quot;ש ובחר &quot;Plugin&gt; הרשמה&gt; StackReg&gt; RigedBody&quot; מהתפריט. חזור על שלב זה עבור RFP ואת מחסנית תמונת YFP. במידת הצורך, לחתוך את ההחזר על ההשקעה על ידי חזרה על צעד 4.5.1-4.5.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: כוונון הבהירות והניגודיות באופן ידני עבור כל ערימה התמונה עם &quot;כוונון הבהירות והניגודיות כלי&quot; ( &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;C&quot;) או בחר &quot;תהליך&gt; שפר ניגודיות&quot; מהתפריט ולהחיל את &quot;לנרמל&quot; פקודה לכל התמונות בערימה. יצוין כי הפקודה האחרונה תשנה ערכי הפיקסלים ולכן עשוי להשפיע ניתוח התמונה במורד הזרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: שלב ערימות פרט (מרה לפורמט קובץ RGB, ראה 4.11) אופקי או אנכי באמצעות התוסף &quot;תמונה&gt; סטאקס&gt; כלים&gt; שלב&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת סרגל קנה מידה ( &quot;נתח&gt; כלים&gt; בר סולם&quot;) ואת חתם זמן (&amp;# 34; תמונה&gt; סטאקס&gt; זמן סטמפר &quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור ערימות תמונה שונות כרצף תמונה בפורמט &quot;.tiff&quot;. כדי להפיק סרט, שמירה בשם &quot;.אבי&quot;. לחלופין, סדרת תמונת יצוא בפורמט QuickTime באמצעות התוסף &quot;ביו-פורמטים&gt; ביו-פורמטי יצואן&quot; ובחר את סוג הקובץ &quot;.mov&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג תמונות מסגרות יחידות, בחר במסגרת של הריבית לשכפל את התמונה &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot;. שינוי סוג של התמונה המתקבלת כדי &quot;RGB&quot; או &quot;8-bit&quot; תחת &quot;תמונה&gt; סוג&gt; צבע RGB או 8 סיביות&quot; ולשמור את התמונה בשם &quot;.tiff&quot;. הערה: פיג&#39;י מציעה מספר פונקציות נוספות בהמשך ויסמנו או תהליך הסדרת הזמן לשגות. עבור אל תמיכה מקוונת פיג&#39;י לקבלת מידע מפורט (http://fiji.sc/Fiji). </li></ol>

<ol>
	<li>Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Fl&#228;rdh, K., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-di-GMP+signalling+and+the+regulation+of+developmental+transitions+in+streptomycetes.">c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in streptomycetes.</a> Nat. Rev. Microbiol. 13, 749-760 (2015).</li><li>Jakimowicz, D., van Wezel, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division+and+DNA+segregation+in+Streptomyces.:+how+to+build+a+septum+in+the+middle+of+nowhere?.">Cell division and DNA segregation in Streptomyces.: how to build a septum in the middle of nowhere?.</a> Mol. Microbiol. 85, 393-404 (2012).</li><li>McCormick, J. R., Fl&#228;rdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+regulators+that+govern+Streptomyces+development.">Signals and regulators that govern Streptomyces development.</a> FEMS Microbiol. Rev. 36, 206-231 (2012).</li><li>Fl&#228;rdh, K., Richards, D. M., Hempel, A. M., Howard, M., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+apical+growth+and+hyphal+branching+in+Streptomyces.">Regulation of apical growth and hyphal branching in Streptomyces.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 737-743 (2012).</li><li>Hempel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ser/Thr+protein+kinase+AfsK+regulates+polar+growth+and+hyphal+branching+in+the+filamentous+bacteria+Streptomyces.">The Ser/Thr protein kinase AfsK regulates polar growth and hyphal branching in the filamentous bacteria Streptomyces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 109, E2371-E2379 (2012).</li><li>Fuchino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+gradients+of+an+intermediate+filament-like+cytoskeleton+are+recruited+by+a+polarity+landmark+during+apical+growth.">Dynamic gradients of an intermediate filament-like cytoskeleton are recruited by a polarity landmark during apical growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E1889-E1897 (2013).</li><li>Holmes, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coiled-coil+protein+Scy+is+a+key+component+of+a+multiprotein+assembly+controlling+polarized+growth+in+Streptomyces.">Coiled-coil protein Scy is a key component of a multiprotein assembly controlling polarized growth in Streptomyces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E397-E406 (2013).</li><li>McCormick, J. R., Su, E. P., Driks, A., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+viability+of+Streptomyces+coelicolor.+mutant+for+the+cell+division+gene+ftsZ.">Growth and viability of Streptomyces coelicolor. mutant for the cell division gene ftsZ.</a> Mol. Microbiol. 14, 243-254 (1994).</li><li>Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+and+the+division+of+prokaryotic+cells+and+organelles.">FtsZ and the division of prokaryotic cells and organelles.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 862-871 (2005).</li><li>Grantcharova, N., Lustig, U., Fl&#228;rdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+FtsZ+assembly+during+sporulation+in+Streptomyces+coelicolor+A3(2).">Dynamics of FtsZ assembly during sporulation in Streptomyces coelicolor A3(2).</a> J. Bacteriol. 187, 3227-3237 (2005).</li><li>Richards, D. M., Hempel, A. M., Fl&#228;rdh, K., Buttner, M. J., Howard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+basis+of+branch-site+selection+in+filamentous+bacteria.">Mechanistic basis of branch-site selection in filamentous bacteria.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002423 (2012).</li><li>Hempel, A. M., Wang, S. B., Letek, M., Gil, J. A., Fl&#228;rdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assemblies+of+DivIVA+mark+sites+for+hyphal+branching+and+can+establish+new+zones+of+cell+wall+growth+in+Streptomyces+coelicolor.">Assemblies of DivIVA mark sites for hyphal branching and can establish new zones of cell wall growth in Streptomyces coelicolor.</a> J. Bacteriol. 190, 7579-7583 (2008).</li><li>Wolanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replisome+trafficking+in+growing+vegetative+hyphae+of+Streptomyces+coelicolor+A3(2).">Replisome trafficking in growing vegetative hyphae of Streptomyces coelicolor A3(2).</a> J. Bacteriol. 193, 1273-1275 (2011).</li><li>Jyothikumar, V., Tilley, E. J., Wali, R., Herron, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+microscopy+of+Streptomyces+coelicolor.growth+and+sporulation.">Time-lapse microscopy of Streptomyces coelicolor.growth and sporulation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 6774-6781 (2008).</li><li>Willemse, J., Borst, J. W., de Waal, E., Bisseling, T., van Wezel, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+control+of+cell+division:+FtsZ+is+recruited+by+SsgB+during+sporulation+of+Streptomyces.">Positive control of cell division: FtsZ is recruited by SsgB during sporulation of Streptomyces.</a> Genes. Dev. 25, 89-99 (2011).</li><li>Glazebrook, M. A., Doull, J. L., Stuttard, C., Vining, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+of+Streptomyces+venezuelae.+in+submerged+cultures.">Sporulation of Streptomyces venezuelae. in submerged cultures.</a> J. Gen. Microbiol. 136, 581-588 (1990).</li><li>Bibb, M. J., Domonkos, A., Chandra, G., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+chaplin+and+rodlin+hydrophobic+sheath+proteins+in+Streptomyces+venezuelae.is+controlled+by+sigma(BldN)+and+a+cognate+anti-sigma+factor,+RsbN.">Expression of the chaplin and rodlin hydrophobic sheath proteins in Streptomyces venezuelae.is controlled by sigma(BldN) and a cognate anti-sigma factor, RsbN.</a> Mol. Microbiol. 84, 1033-1049 (2012).</li><li>Al-Bassam, M. M., Bibb, M. J., Bush, M. J., Chandra, G., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+regulator+heterodimer+formation+controls+a+key+stage+in+Streptomyces+development.">Response regulator heterodimer formation controls a key stage in Streptomyces development.</a> PLoS Genet. 10, e1004554 (2014).</li><li>Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+aerial+growth,+cell+division,+and+chromosome+segregation+are+targets+of+WhiA+before+sporulation+in+Streptomyces+venezuelae.">Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae.</a> MBio. 4, e00684-e00613 (2013).</li><li>Tschowri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrameric+c-di-GMP+mediates+effective+transcription+factor+dimerization+to+control+Streptomyces+development.">Tetrameric c-di-GMP mediates effective transcription factor dimerization to control Streptomyces development.</a> Cell. 158, 1136-1147 (2014).</li><li>Mirouze, N., Ferret, C., Yao, Z., Chastanet, A., Carballido-L&#242;pez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MreB-Dependent+Inhibition+of+Cell+Elongation+during+the+Escape+from+Competence+in+Bacillus+subtilis.">MreB-Dependent Inhibition of Cell Elongation during the Escape from Competence in Bacillus subtilis.</a> PLoS Genet. 11, e1005299 (2015).</li><li>Zopf, C. J., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquiring+fluorescence+time-lapse+movies+of+budding+yeast+and+analyzing+single-cell+dynamics+using+GRAFTS.">Acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using GRAFTS.</a> J. Vis. Exp. (e50456), (2013).</li><li>Meniche, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpolar+addition+of+new+cell+wall+is+directed+by+DivIVA+in+mycobacteria.">Subpolar addition of new cell wall is directed by DivIVA in mycobacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, E3243-E3251 (2014).</li><li>Donovan, C., Schauss, A., Kramer, R., Bramkamp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+impacts+on+cell+growth+and+division+site+selection+in+Corynebacterium+glutamicum.">Chromosome segregation impacts on cell growth and division site selection in Corynebacterium glutamicum.</a> PLoS One. 8, e55078 (2013).</li><li>Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Escherichia+coli.+growth+rate+to+osmotic+shock.">Response of Escherichia coli. growth rate to osmotic shock.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, 7807-7812 (2014).</li><li>Fl&#228;rdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+DivIVA+in+polar+growth+and+morphogenesis+in+Streptomyces+coelicolor+A3(2).">Essential role of DivIVA in polar growth and morphogenesis in Streptomyces coelicolor A3(2).</a> Mol. Microbiol. 49, 1523-1536 (2003).</li><li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics.">High-throughput subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Mol. Microbiol. 80, 612-627 (2011).</li><li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy.">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nat. Protoc. 7, 80-88 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+fluorescent+D-amino+acids+and+their+use+for+probing+peptidoglycan+synthesis+and+bacterial+growth+in+situ.">Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ.</a> Nat. Protoc. 10, 33-52 (2015).</li><li>Szafran, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+I+(TopA)+is+recruited+to+ParB+complexes+and+is+required+for+proper+chromosome+organization+during+Streptomyces+coelicolor.+sporulation.">Topoisomerase I (TopA) is recruited to ParB complexes and is required for proper chromosome organization during Streptomyces coelicolor. sporulation.</a> J. Bacteriol. 195, 4445-4455 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

זמן לשגות מיקרוסקופית של מחזור החיים Streptomyces כבר מאתגר מבחינה טכנית בעבר. כאן אנו מציגים פרוטוקול חזק כדי לבצע דימות תאי חיים של מחזור החיים המלא באמצעות התכת חלבון פלואורסצנטי אל DivIVA סמן הקוטבי בתא וחטיבת חלבון תא FtsZ לעזור לחזות להתחקות התקדמות באמצעות תכנית התפתחותית (איור 2). מרכזי לשיטה זו היא הטיפוח של ס venezuelae במכשיר microfluidic המאפשר זלוף בינוני קבוע ואת חילופי מדיום הגידול רגיל (MYM-TE) עם המדיום בילה (בילה MYM-TE). השינוי של מצב ההתרבות חשוב בפרוטוקול תאר כי downshift התזונתי כמו גם בארות עדיין שום אותות תאיים לא מזוהים (למשל מניין אותות חישה) במדיום תרבות בילו, לקדם נביגה, ואילו אספקה ​​רציפה של מדיום תזונתי עשירה מגרה growt וגטטיבישעות עם היווצרות כמעט נבג (מידע לא מוצג). לפיכך, culturing תאים במערכת microfluidic זו עדיף על תאי culturing על agarose כי הוא מציע גמישות ניסיון יותר ומאפשר ניטור ארוך טווח של שינויי התפתחות חיידקים בתגובה לשינויים בתנאי תרבות. למרות צלחות microfluidic מיועדות לשימוש יחיד בלבד, לזרום ערוצים שלא היה מחוסן עם תאים יכול לשמש בניסויים הבאים. אנו ממליצים להשתמש בכל ערוצי צלחת microfluidic תוך שבוע, כפי שחווינו בעיות איטום סעפת צלחות שנפתחו לזמנים ארוכים יותר. בעת הגדרת ניסוי, מצאנו כי נבגים מוכנים טרי מונבטים בתוך שתי שעות של נטען לתוך תא הזרימה, ואילו נבגים נגזרו מנית גליצרול קפוא נדרשים לפחות 6 שעות לפני צינורות ניבטו יצאו (מידע לא מוצג). עיכוב זה בלבלוב משתרע לכל אורכה של הניסוי יכול להפריעזמינות הציוד תנאי הניסוי. כמו כן, חשוב להתחיל את הניסוי עם טפטוף של MYM-TE לפחות 3 שעות כדי לספק חומרים מזינים מספיק לפיתוח תולדה של צינורות נבט. זלוף עם MYM-TE יכול להתארך מעבר hr הראשונית 3 אם הניסוי נועד ללמוד הצמיחה וגטטיבי. בעוד נבגים לספק הבחירה המועדפת של חומר המוצא, שברי hyphal קצר יכול גם להיות טעון לתוך צלחת microfluidic. עם זאת, את יעילות הטעינה בעת שימוש תפטיר טעון היא משמעותית נמוכה ולעתים קרובות דורשת מספר ריצות טעינה אשר עשוי להציג מגבלה כאשר בוחנים מוטנטים שאינם sporulating. ללא קשר לסוג של בידוד המשמש, חשוב לא להעמיס על חדר התרבות עם נבגים או שברי hyphal כמו זה יוביל צפיפות מהירה שיכול להפריע דיפוזיה תקשורת לסבך ניתוח תמונה. חשוב לתכנן את בניית חלבוני כתב carefully לשימוש הדמיה זמן לשגות הקרינה Streptomyces. אורך לינקר בין חלבון המטרה ואת כתב הניאון והבחירה של N- או בשילובי C- מסוף יכול להיות קריטי. יתר על כן, תנאי ניסוי אופטימליים, כוללים תדירות הדמיה וזמן חשיפה, צריכים להיקבע מראש עבור כל חלבון fluorescently- מתויג. ס פלואורסצנציה אוטומט תערוכת עובש venezuelae בערוץ הירוק / צהוב שעשויות להיות בעייתיים כאשר הדמית חלבון שכותרתו fluorescently כי מתבטא ברמות נמוכות. בנוסף, יש לציין כי, במהלך הנביטה ואת שלב הצמיחה וגטטיבי הראשונית, S. venezuelae הוא רגיש במיוחד אור באורך גל קצר (למשל בעת שימוש בשילובי חלבון CFP). למרות ההתקדמות המתמשכת בטכניקות הדמיה ומערכות כתב ניאון עבור הדמיה לחיות תאים של חיידקים, ברוב חבילות התוכנה (למשל MicrobeTracker, Schnitzelcאמות, CellProfiler) לעיבוד האוטומטי הבא של אלו סוגים של ערכות נתונים אינן תומכות הניתוח של תמונות נגזרות חיידקים פילמנטיות עם סגנון חיים רב-תאיים 27-29. לפיכך, יש צורך לפתח אלגוריתם מתאים לניתוח תפוקה גבוהה כמותי של נתונים הדמיה מ- Streptomyces וחיידקים filamentous אחרים. לסיכום, העבודה המתוארת כאן ממחישה את הפוטנציאל העצום של ס venezuelae כמערכת התפתחותית מודל חדשה מהמין, בגלל יכולתה sporulate בנוזל. מכשיר culturing microfluidic הוא פשוט לשימוש גם עבור משתמשים לא מנוסים. הוא מספק פלטפורמה מצוינת ללמוד תהליכים ביולוגיים תא מרכזיים מחזור חי Streptomyces, כולל לוקליזציה חלבון דינמית, צמיחה מקוטבת, ואת הבידול מורפולוגיים של תפטיר רב-תאי לתוך רשתות של נבגי unigenomic. בנוסף זה הניסיון להגדיר up גם מספק נקודת מוצא מפתה כדי לחקור את האירועים בפיתוח שדורשים לסירוגין התנאים תרבות, או את השימוש של צבעי ניאון כגון חומצות -amino D ניאון כדי לפקח סינתזה פפטידוגליקן או יודיד propidium ו 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כדי לחזות כרומוזום ארגון 30,31.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/53863/fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle" target="_blank">Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device</a>
The author&#39;s name was updated from:
Mark Buttner
to:
Mark J. Buttner

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/53863/fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle" target="_blank">Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device</a>
The middle initial J. has been added to author Mark Buttner.

Erratum: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomycetes הם חיידקי אדמת שוכני המאופיינות מחזור התפתחותית מורכב המעורב בידול מורפולוגיים מ תפטיר רב-תאי, הדחה-מזין רדום, נבגי unigenomic 1-3. תחת תנאי גידול נוחים שנבג Streptomyces הטיפוסי מתחיל לנבוט ידי לשיחול צינורות ניבטים אחד או שניים (איור 1). צינורות אלה להאריך ובהרחבת טיפ ולגדול לרשת hyphal קנים המכונית התפטיר וגטטיבי. צמיחת פולאר הסתעפות hyphal מופנה על ידי DivIVA החלבון החיוני. חלבון מפותל, סליל זהו חלק ממכלול ציטופלסמית גדול שנקרא polarisome, שהוא חיוני עבור החדרת חומר מעטפה הסלולרית החדש בקצה הארכת 4-7. במהלך צמיחה של צמח, חוטי hyphal להיות ממודרים כתוצאה מהיווצרותם הנדירה של מה שנקרא חוצת קירות 8. ההיווצרות של קירות הצולבים אלה מחדש<html> quires FtsZ, החלבון cytoskeletal דמוי טובולין כי הוא חיוני עבור חלוקת התא רוב החיידקים 9. בשנת Streptomyces, לעומת זאת, קירות צלב וגטטיבי אלה אינם להוביל לפרידת התכווצות תאי תאים ולכן מסת mycelial נשארה כרשה של תאי סינסיציאלי מחובר יתר. בתגובת הגבלת מזין ואיתות אחרים שאינם מובנים היטב, עובש אוויר מיוחד להתנתק התפטיר וגטטיבי ולגדול לאוויר 3. הקמת המבנים אלה יוזמת את שלב הרבייה של פיתוח, שבמהלכו עובש האוויר רב-גנומי הארוך להיות מחולק עשרות תאי prespore unigenomic השווה בגודלן. אירוע חלוקת תא מסיבי זה הוא מונע על ידי ההתכווצות סינכרוני של טבעות FtsZ מרובות בתוך 2,10 עובש sporogenic היחיד. בידול מורפולוגי הושלם על ידי השחרור של רדומים, בעובי דופן, נבגים פיגמנט. t &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig1.jpg" /> איור 1:. Streptomyces מחזור החיים על תקשורת מוצקה זהו מודל של מחזור החיים מבוסס על מחקרים קלסיים של ס coelicolor גדל על צלחות אגר. פיתוח הסלולר של נבג מתחיל עם ההיווצרות של צינורות ניבטים אחד או שניים, אשר גדלים באמצעות רחבת טיפ ליצירת רשת של הסתעפות עובש. הצמיחה פולאר הסתעפות של העובש וגטטיבי היא נוהלה על ידי DivIVA (אדום). ההיווצרות של חוצת קירות וגטטיבי דורשת FtsZ (ירוק). בתגובה להגבלות מזין אותות אחרים, עובש אווירי מוקמים. מעצר של צמיחה אווירית מרוכז באופן הדוק עם ההרכבה של סולם של FtsZ-טבעות, אשר מעוררות את septa נביגה כי למדר את עובש sporogenic לתאי prespore דמוי קופסא. תאים אלה להרכיב קיר נבג עבה והם בסופו של דבר released נבגים פיגמנט מבוגרים. האירועים התפתחותי החשובים של מחזור חי Streptomyces הם גם מאופיינים 1,3. עם זאת, מה הוא עדיין נדיר מחקרי תא ביולוגי מעסיקות הקרינה מיקרוסקופיה זמן לשגות לספק תובנה תהליכי subcellular שבבסיס בידול, כגון דינמיקת לוקליזציה חלבון, תנועת כרומוזום חלוקת תא מבחינת התפתחותית מבוקרת. Live- תא הדמיה של פיתוח Streptomyces כבר מאתגר בגלל המורכבות של מחזור החיים ואת המאפיינים הפיזיולוגיים של האורגניזם. מחקרים קודמים על צמיחת צמח ו בשלבים הראשונים של septation נביגה יש מועסקים לתאי הדמיה חדיר-חמצן, או הצמיחה נתמכת agarose של coelicolor Streptomyces על במת מיקרוסקופ 11-15. שיטות אלה, עם זאת, מוגבלים על ידי מספר גורמים. חלק מהמערכות רק לאפשר הדמיה לטווח קצר של צמיחה הסלולרחלבוני ניאון ד לפני תאים סובלים אספקת חמצן מספיקה או לצמוח מתוך המטוס מוקד בשל דפוס תלת ממדי של פיתוח hyphal. במקרים בם הדמיה לטווח ארוך אפשרית, טיפוח תאים על גבולות רפידות agarose גמישות ניסיון, כי התאים לא יכולים להיחשף תנאי גידול או מתח חלופיים, ואת קרינת הרקע מהמדיום של רפידות agarose מגבילה מאוד את היכולת לנטר ניאון חלש אותות. כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור דימות תאים חיים של מחזור החיים Streptomyces להשלים עם דיוק ורגישות מעולה. על ידי הגדלה Streptomyces במכשיר microfluidic מחובר מיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield (איור 2), אנו יכולים כעת לעקוב אחר נביטה, צמיחה צמח ו נביגה septation על פני פרק זמן של עד 30 שעות. זה קל מאוד על ידי השימוש של Streptomyces אורגניזם המודל החדש </em&gt; venezuelae כי זה sporulates להשלמה ליד בתרבות השקועה ובכך מתגבר על המגבלה של מיני מודל הקלסיים ס coelicolor, אשר sporulates רק על תקשורת מוצקה 16-20. כדי לעזור לחזות צמיחה צמח ו נביגה, אנו שיתוף-Express fluorescently מתויג גרסאות של DivIVA סמן הקוטביות בתא ואת החלבון חלוקת התא מפתח FtsZ. אנחנו משתמשים במכשיר microfluidic זמינים מסחרית כי הועסק בהצלחה עבור mycobacteria, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, subtilis Bacillus ושמרים 21-25. מערכת מלכודות תאי מטוס בודד מוקדי ומאפשרת שליטת זלוף הרציפה של מדיום תרבות ממאגרים שונים. בפרוטוקול המפורט ננצל בתכונה זו כדי לחשוף ס venezuelae תפטיר וגטטיבי על downshift תזונתי לקדם נביגה. הדה הפרוטוקולscribed הוא עבור דימות תאים חיים של מחזור החיים Streptomyces כולו, אבל התנאים תקשורת אלטרנטיבית או הגדרות מיקרוסקופ ניתן לבחור אם בשלבים התפתחותיים ספציפיים הם בעלי עניין מיוחד. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig2.jpg" /> איור 2: סכמטי המתאר את זרימת העבודה הניסויית. שלושת הצעדים העיקריים המתוארים בפרוטוקול מוצגים. ראשית, נבגים ובינוניים בילו ערוכים מתרבות נייחת פאזיים. שנית, נבגים טריים נטענים לתוך מערכת microfluidic וס venezuelae הוא צלם לאורך כל מחזור החיים ההתפתחותיים שלו באמצעות מיקרוסקופ הפוכה אוטומטית לחלוטין עם תא דגירה לשמור על טמפרטורה לצמיחה אופטימלית. שלישית, סדרת הזמן לשגות שהתקבלה מנותחת ומעובד באמצעות תוכנת הקוד הפתוח פיג&#39;י.

<table><tbody><tr><td>B04A CellAsic ONIX plate for bacteria cells</td><td>Merck-Millipore</td><td>B04A-03-5PK</td><td>Microfluidic culture plates</td></tr><tr><td>CellAsic ONIX Microfluidic Perfusion System and ONIX FG (version 5.0.2)</td><td>Merck-Millipore</td><td>EV-262</td><td>The latest ONIX vesion (July 2015) and instructions on how to use the programme can be found here: http://www.merckmillipore.com</td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 Microscope</td><td>Zeiss</td><td>431007-9902-000</td><td>Fully automated and motorized inverted widefield microscope</td></tr><tr><td>Incubator XL multi S1 with Temperature Module S1 and Heating unit XL S2</td><td>Zeiss</td><td>411857-9061-000</td><td>Environmental chamber surrounding the microscope</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC objective</td><td>Zeiss</td><td>420792-9800-000</td><td></td></tr><tr><td>Ocra FLASH 4 V2</td><td>Hamamatsu Photonics K.K.</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Illuminator HXP 120V</td><td>Zeiss</td><td>423013-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>FL Filter Set 46 HE YFP shift free</td><td>Zeiss</td><td>489046-9901-000</td><td>Fluorescent filter set, excitation 500/25 nm, emission 535/30 nm</td></tr><tr><td>FL Filter Set 63 HE RFP shift free</td><td>Zeiss</td><td>489063-0000-000</td><td>Fluorescent filter set, excitation 572/25 nm, emission 629/30 nm</td></tr><tr><td>Mounting frame K-M for multiwell plates</td><td>Zeiss</td><td>000000-1272-644</td><td>Stage holder for microfluidic plate</td></tr><tr><td>ZEN pro 2012</td><td>Zeiss</td><td>410135-1002-120</td><td>Microscope control software</td></tr><tr><td>ZEN Module Time Lapse</td><td>Zeiss</td><td>410136-1031-110</td><td>Software module to set up time-lapse microscopy experiments</td></tr><tr><td>ZEN Module Tiles/Positions</td><td>Zeiss</td><td>410136-1025-110</td><td>Software module to save specific stage positions (xzy)</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>open-source software package</td><td>&lt;u&gt;http://fiji.sc/Fiji&lt;/u&gt;</td><td>Generation of time-lapse movies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 4 g Maltose&lt;br/&gt; 4 g Yeast extract&lt;br/&gt; 10 g Malt extract&lt;br/&gt; add 1 L H2O using 50 % tap water and 50 % reverse osmosis water and supplement with 200 ml of R2 trace element solution per 100 ml after autoclaving</td><td></td><td></td><td>Sporulation medium used to culture &lt;em&gt;S. venezuelae&lt;/em&gt; SV60</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;R2 Trace element solution (TE)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 8 mg ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 40 mg FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;-6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg CuCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;B&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;-10H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;Mo&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;24&lt;/sub&gt;-4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; add 200 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; Autoclave and store at 4 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td><td></td><td></td><td>Add 0.002 volumes to MYM</td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffered saline)</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>Used to refill inlet wells of unused lanes in B04A plates in order to prepare plate for short-term storage.</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m syringe filters</td><td>Satorius stedim</td><td>16532-K</td><td>Preparation of spent MYM-TE</td></tr><tr><td>SV60</td><td>John Innes Centre strain collection</td><td></td><td>&lt;em&gt;S. venezuelae&lt;/em&gt; strain expressing &lt;em&gt;divIVA-mcherry&lt;/em&gt; and &lt;em&gt;ftsZ-ypet&lt;/em&gt;</td></tr></tbody></table>

fluorescence time-lapse imaging of the complete s. venezuelae life cycle using a microfluidic device

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties. 
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.

ההדמיה לחיות התאים המוצלחת של ס כולו מחזור החיים venezuelae מניב זמן-סדרה רצופה כולל שלבי ההתפתחות העיקריים של נביטה, צמיחה צמח ו נביגה (איור 3, סרט 1). ויזואליזציה של ההתקדמות דרך מחזור החיים משופרת נוספת על ידי לוקליזציה subcellular הברורה של DivIVA-mCherry ו FtsZ-YPet. במהלך נביטה וצמיחה וגטטיבי, DivIVA-mCherry מצטבר בלעדי בקצות hyphal גדלו או סימני טביעה חדש נקודות סניף (איור 4 א). תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם מיצוב subcellular שדווח בעבר של 12,26 DivIVA. לעומת זאת, FtsZ-YPet יוצר יחיד מבנים דמויי טבעת במרווחים לא סדירים של תפטיר גדל (איור 4B). מבנים אלה מספקים את הפיגום לסינתזה של קירות צלב וגטטיבי שאינם מגבילים, המוביל להיווצרות של interconnמדורי hyphal ected 8. בידול הסלולר של גדל עובש לתוך עובש sporogenic הופך לגלוי על ידי היעלמות מוקדי קוטב DivIVA-mCherry, מעצרו של צמיחת קוטב והעלייה במקבילה של קרינת FtsZ-YPet (האיור 4C). בשנת sporulating העובש, דפוס לוקליזציה של FtsZ-YPet משתנה באופן דרמטי; חוטי סליל FtsZ-YPet הראשונים מתגלגלים לאורך hypha ולאחר מכן, אירוע סינכרוני פתאומי, כמעט, סלילים אלה להתגבש סולם צלצולי YPet FtsZ פזור. תחת תנאי הניסוי המתואר כאן, מופץ באופן שווה אלה סולמות FtsZ-YPet להימשך כ -2 שעות. לבסוף, מחיצה נביגה להיות ניכר הניגוד התערבות ההפרש (DIC) תמונות (איור 4D) ולבסוף נבגים חדשים מתפרסמים. הפרוטוקול הבא המתאר את עיבוד התמונה באמצעות תוכנת פיג&#39;י קובעה<html> TEP-אחר-צעד הסבר כיצד להפיק סרט לפרסום מהסדרת הזמן לשגות רכש (סרט 1). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig3.jpg" /> איור 3: תמונות Snapshot מתוך סדרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות נציג ס venezuelae הפיק שכותרתו fluorescently FtsZ (ירוק) DivIVA (אדום) מוצגים הם מסגרות נבחרות תמונות ממוזגות (פנל עליון: RFP-YFP-DIC, פנל תחתון: DIC). לדמיין את מחזור חי Streptomyces כולל נביטה, צמיחת צמח ו נביגה. תמונות נלקחו סרט 1. זמן נמצא hr: דקות. ברי סולם = 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ד / 53,863 / 53863fig4.jpg &quot;/&gt; איור 4: נציג תוצאות עבור סדרה הזמן לשגות מוצלחת של מחזור חי Streptomyces (א) לוקליזציה של DivIVA-mCherry.. מוצגים הם תמונות של שתי נקודות בפעם הבאות מסרט 1 עם תמונות ממוזגות של RFP וערוצי דסק&quot;ש. DivIVA-mCherry מסמן אתרי סניף hyphal חדשים (ראש חץ מלא) ו localizes בקצה hyphal לכוון צמיחה קוטבית (ראש חץ פתוח). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר (ב) לוקליזציה FtsZ-YPet במהלך הצמיחה וגטטיבי (ראש חץ). FtsZ-YPet יוצר יחיד מבנים דמוי טבעת (פנל עליון) כי לא להצר (DIC, פנל תחתון). (C) FtsZ-YPet (ירוק) לוקליזציה במהלך septation נביגה. מוקדי DivIVA-mCherry מוצגים באדום, עם זמן שחלף המתואר להלן (HR: דקות). סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. (ד) מקביל תמונות דסק&quot;ש של עובש sporulating מ (C) מראה את הטופסation של תאי prespore עם septa נביגה הגלוי (בתמונה משמאל), אשר בסופו של דבר להבשיל לכדי שרשרת של נבגים (בתמונה מימין). זמן הוא hr: דקות. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="מסגרת מסרט 1" src="/files/ftp_upload/53863/53863mov1.jpg" /> סרט 1: סדרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות של Streptomyces venezuelae מחזור החיים הסרט מורכב תמונות RFP-YFP הממוזגת (משמאל) ואת התערבות ההפרש לעומת המקביל (DIC) תמונות (מימין).. DivIVA-mCherry מוצג YPet-FtsZ האדום בירוק. מרווח הזמן בין יחיד מסגרות הוא 40 דקות. בר סולם = 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/movie1.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה תי</a>סרט של.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device at JoVE.com

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

זמן לשגות הדמיה הקרינה של השלם<em&gt; S. venezuelae</em&gt; מחזור החיים באמצעות מכשיר microfluidic

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

13.8K Views.  John Innes Centre, Norwich Research Park. Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

Video: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

התקני microfluidic פשוטים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt;,<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ודג זברה

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Bioengineering

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes underlying central cell cycle events. However, imaging of these molecules in slow-growing bacteria represents a challenge due to photobleaching of fluorophores and phototoxicity during image acquisition. Here, we describe a simple protocol to circumvent these limitations in the case of Myxococcus xanthus (which has a generation time of 4 - 6 h). To this end, M. xanthus cells are grown on a thick nutrient-containing agar pad in a temperature-controlled humid environment. Under these conditions, we determine the doubling time of individual cells by following the growth of single cells. Moreover, key cellular processes such as chromosome segregation and cell division can be imaged by fluorescence live-cell imaging of cells containing relevant fluorescently labeled marker proteins such as ParB-YFP, FtsZ-GFP, and mCherry-PomX over multiple cell cycles. Subsequently, the acquired images are processed to generate montages and/or movies.

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Bacterial cells are spatially highly organized. To follow this organization over time in slow growing Myxococcus xanthus cells, a set-up for fluorescence live-cell imaging with high spatiotemporal resolution over several generations was developed. Using this method, spatiotemporal dynamics of important proteins for chromosome segregation and cell division could be determined.

קרינה פלואורסצנטית Live-תא הדמיה של שלמה וגטטיבי תא מחזור של חיידק חברתית גידול איטי Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

Biochemistry

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; עובר

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Developmental Biology

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

הקמתה של הזחל דג זברה כמודל חיה כדי Investigate Trypanosoma cruzi תנועתיות Vivo ב

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Biology

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

שימוש בהתקן מיקרופלואידיקה גירוי מכני, רזולוציה גבוהה הדמיה של C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

Neuroscience

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

היווצרות ספרואידים רב-תאיים לניתוח מטבולי והיפוקסיה מבוסס FLIM

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

מחבר זרקור: סטנדרטיזציה של שיטות היווצרות כדוריד לניתוח מטבולי וחמצון באמצעות מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

ייצור ומיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של תאים חיים מרובי פרמטרים (FLIM) של ספרואידים רב-תאיים

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

זמן לשגות הדמיה הקרינה של השלם

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

התקני microfluidic פשוטים עבור

קרינה פלואורסצנטית Live-תא הדמיה של שלמה וגטטיבי תא מחזור של חיידק חברתית גידול איטי Myxococcus xanthus

גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת

הקמתה של הזחל דג זברה כמודל חיה כדי Investigate Trypanosoma cruzi תנועתיות Vivo ב

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית

שימוש בהתקן מיקרופלואידיקה גירוי מכני, רזולוציה גבוהה הדמיה של C. elegans

שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans

ייצור ומיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של תאים חיים מרובי פרמטרים (FLIM) של ספרואידים רב-תאיים

ייצור ומיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של תאים חיים מרובי פרמטרים (FLIM) של ספרואידים רב-תאיים