The authors thank Grant Calder for technical assistance with the microscope, Matt Bush for comments on the protocol, and the John Innes Centre for purchase of the Zeiss widefield microscope. This work was funded by BBSRC grant BB/I002197/1 (to M.J.B), by BBSRC Institute Strategic Programme Grant BB/J004561/1 to the John Innes Centre, by Swedish Research Council grant 621-2010-4463 (to K.F.), and by a Leopoldina Postdoctoral Fellowship (to S.S.).

1. ניתוק של טרי S. נבגי venezuelae ואת הכנת בינוני תרבות שהות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 30 מ&quot;ל מלטוז-שמרים-מאלט חלץ חלץ (MYM) בינוני, בתוספת 60 μl פתרון אלמנט עקבות R2 (TE), עם 10 נבגים μl של SV60 זן [pSS209 :: BT1 φ attB (divIVA P - divIVA-mCherry P ftsZ -ftsZ-ypet)]. לצמיחה עקבית נביגה של התאים, להשתמש בבקבוק מבולבל או בקבוקון המכיל באביב כדי לאפשר אוורור מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאים עבור 35-40 שעות ב 30 מעלות צלזיוס, 250 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את התאים על ידי מיקרוסקופיה נוזלי רכוב שלב ניגודיות. בשלב זה שברים ונבגי mycelial יהיו גלויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 1 מ&quot;ל תאים בצנטריפוגה בטבלה העליונה ב 400 XG דקות 1 עד גלולה תפטיר ושברי תאים גדולים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כ 300 שיתוף supernatant μlntaining השעיה של נבגים לצינור 1.5 מיליליטר חדש ולשמור על קרח. שמור את מדיום התרבות הנותרת עבור צעד 1.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל נבגים 01:20 ב MYM-TE (ריכוז סופי: 0.5-5 x 10 7 נבגים / מ&quot;ל) ולשמור על הקרח עד הצורך (ראה שלב 2.3). הערה: למרות התנאים המדויקים המפעילים נביגה ב Streptomyces אינם מובנים, באמצעות מדיום MYM-TE בילו, לרבות כל אותות תאיים ידועים מתרבה sporulating, מגרה נביגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן לעקר 10 מ&quot;ל של מדיום תרבות הנותרים כדי להשיג בילה MYM-TE כי הוא חופשי של נבגים ושברי mycelial. שימוש במסנן 0.22 מיקרומטר מזרק סטרילי ולהעביר בילה MYM-TE לצינור 15 מ&quot;ל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את מוכן בילה MYM-TE במשך כמה ימים על 4 מעלות צלזיוס אם ניסויים נוספים באמצעות תנאי הגידול דומים הם להתנהל. </li></ol> 2. הכנת המכשיר microfluidic הערה: כל PLA microfluidicte מאפשר עד ארבעה ניסויים בלתי תלויים להתבצע. כדי למנוע זיהום של תאי זרימה בשימוש, השתמש פתרונות סטרילי ותנאי עבודה בעת הגדרת ניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון משלוח מהצלחת microfluidic ולשטוף את הבארות עם MYM-TE סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 μl MYM-TE כדי מפרצון גם 1 ו 300 μl בילה MYM-TE לבארות 2 עד 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 40 טענו μl מדולל נבגים משלבים 1.6 טעינת תא היטב 8 של השביל &quot;A&quot; ו לאטום את הסעפת לצלחת פי הוראות מייצרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תוכנת בקרת מיקרופלואידיקה, לבחור את סוג הצלחת המתאים ולהקים תכנית זרימת ממשלת ערוץ הזרימה הקאמרית תרבות ידי בינוני זורם מבארות כניסה 1 עד 5 בשעה 6 psi במשך 2 דקות לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת תוכנות שליטת מיקרופלואידיקה, ליצור פרוטוקול זרימה לניסוי: זורם MYM-TE מבאר כניסה 1 עבור 6 שעות, כדי לאפשר נביטה וצמיחה וגטטיבי של התאים. מֶתֶגאז כדי טפטוף של בילה MYM-TE מבארים 2 עד 5 בפעם הנותרת של הניסוי. במהלך הניסוי לשמור קבוע בלחץ הזרימה 6 psi (המקביל ל כ 9 μl בינוני / hr). התחל תוכנית תזרים לאחר שלב 3.5. </li></ol> 3. הגדר של מיקרוסקופ פרוטוקול זמן לשגות הערה: שיטה זו יושמה על מיקרוסקופ widefield הפוך ממונעת האוטומטי לחלוטין מצוידת במצלמת sCMOS, מנורת מתכת הליד, פוקוס אוטומטי חומרה, בעל קרקע צלחות 96-היטב בתא סביבתי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לחמם את החדר הסביבתי עד 30 מעלות צלזיוס מראש על מנת למנוע בעיות עם הפוקוס האוטומטי לאחר תחילת הניסוי. הזמן הדרוש תלוי בתא הסביבתי בשימוש, המיקרוסקופ ומערכת החימום. התחל כדי לחמם את המערכת בלילה שלפני הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את Softwa מיקרוסקופ ואוטומציה מיקרוסקופיה ובקרהמִחָדָשׁ. השתמש צמצם מספרי גבוהת טבילה אובייקטיבי שמן (NA) לאיסוף אותות אופטימלי ברזולוציה מרחבית, כגון 100X, 1.46 אובייקטיבי NA שמן דסק&quot;ש. בחר מסננים מתאימים ומראות dichromatic לרכוש התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) תמונות ותמונות של תערובות חלבון צהוב-ניאון אדום ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח טיפת שמן טבילה על המטרה ולהוסיף נוזל טבילה לתחתית חלון ההדמיה על צלחת microfluidic לשפר פוקוס תא במהלך רכישת תמונה. בזהירות הר מכשיר microfluidic האטום (שלב 2.5) על הבמה של מיקרוסקופ ההפוכה. ודא כי הצלחת מונחת היטב בעל הבמה אינו עוברת במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על חלון ההדמיה של תא תרבות microfluidic אל מוקד באמצעות סמני עמדה המוטבעות להתמצאות. פוקוס על החלק השמאלי ביותר של תא הזרימה הראשונה (שכותרתו &quot;A&quot;) עם הגודל מהלכודה 5, המקבילה לגובה מלכודת של 0.7 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנת מיקרופלואידיקה, תאי עומס מן המפרצון גם 8 ב 4 psi במשך 15 שניות. בדוק את צפיפות התאים בתא התרבות ידי הזזת הבמה על חלון ההדמיה. אם לא נבגים נלכדו, לחזור על שלב טעינת תא או לחלופין להגביר את לחץ הטעינה ו / או זמן עד צפיפות התאים הרצויה מושגת (1-10 נבגים לכל חלון הדמיה עם 2,048 x 2,048 פיקסלים). הימנע להעמיס את חדר התרבות. הערה: בדרך כלל אנחנו משתמשים מלכודת גודל 5 הדמית Streptomyces, אבל אנחנו גם השגנו תוצאות טובות עם מלכודת בגדלי 4 ו -3, עיינו במדריך למשתמש של הספק לקבלת הצעות נוספות על אופטימיזציה של תהליך טעינת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעילו את תוכנית הזרימה תוכנות שליטה משלב 2.5 ולאפשר הצלחת microfluidic לחום-לאזן במשך שעה 1 בשלב מיקרוסקופ לפני תחילת רכישת התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת תוכנות שליטת מיקרוסקופ, להקים רכישה רבה ממדים לקחת muתמונות רובים של בעמדות במה מרובות לאורך זמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור שמירה אוטומטית: לציין ספרייה עבור שמירה אוטומטית של קבצי תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת הגדרות תאורה, לקבוע הגדרות תאורה אופטימלית עבור כל מבנה ספציפי מראש. לצורך הניסוי המתואר, השתמש פעמי החשיפה הבאות: דסק&quot;ש 150 msec, YFP 250 msec, RFP 100 msec. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זמן-סדרה: להגדיר סדרה עתית לרכוש תמונות בנקודות הזמן הרצוי ברצף. הדמית מחזור החיים של ס venezuelae, לבחור מרווח זמן 40 דקות במשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למשרות במת פוקוס אוטומטית: לסרוק את חדר התרבות על ידי הזזת עמדות במת חנות במה לכל תפקיד הדמיה של עניין. ודא כי עמדות חד-שלבי ממוקמים מספיק מזה כדי למזער photobleaching ו phototoxicity.Typically להשתמש עד 12 עמדות. שגרת פוקוס אוטומטית מפעיל עבור כל נקודת זמן לתקן מוקדי סחף האט. אם אפשרות זו זמינה תוכנות שליטה מיקרוסקופ, אסטרטגית פוקוס אוטומטית מוגדר &quot;עדכון שטח מקומי על ידי פוקוס אוטומטי חומרה&quot;. לאחר Z-הקואורדינטות של עמדות הבמה שנבחרו מאומתות, להפעיל את הפוקוס אוטומטי חומרה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הניסוי זמן לשגות של תוכנות שליטה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק שכל העמדות הבמה עדיין בפוקוס בנקודות מאוחר יותר. בניסויי זמן לשגות פועלים במשך כמה שעות, מעת לעת אנו מבחינים להיסחף הבמה גם בעת שימוש פוקוס אוטומטי. אם עמדות במה צריכות להיות refocused, להפסיק את הניסוי בכל נקודת זמן מתאימה, לשנות את הפוקוס ולהפעיל מחדש את הניסוי בתוך פרק הזמן המוגדר הדמיה (שלב 3.7.3). ראה שלב 4.3 עבור איך לשרשר סדרת הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור רכישת תמונה לאחר 24-30 שעות או כאשר העובש באזור של עניין יש בדיל לתוך נבגים (ראה סדרת תמונת DIC). לעצור את תוכנית תזרים בתוכנה לפרק את המכשיר microfluidic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן צלחת microfluidic משומש STO לטווח קצרזַעַם. הסר הנותרים MYM-TE ובילה MYM-TE מבאר 1 עד 6, גם בזבוז ריק 7 וטעינה התא היטב 8. בתנאים סטריליים, למלא מחדש בשימוש בארות של השביל &quot;A&quot; ובארות של נתיבים שאינם בשימוש ( &quot;B&quot; כדי &quot;D&quot;) על צלחת עם בופר פוספט סטרילית (PBS). חותם את הצלחת עם parafilm כדי למנוע ממנו להתייבש ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 4. דור של זמן לשגות סרטים שימוש פיג&#39;י תוכנה הערה: יש לציין כי חבילות תוכנה מסחרית וחופשית שונות זמינות כדי לעבד תמונות מיקרוסקופיה זמן לשגות כולל ZenBlue, Metamorph, קפוא, ImagePro או ImageJ. כאן נתמקד פיג&#39;י, אשר הנה תכנית עיבוד תמונת קוד פתוח מבוססת על ImageJ, ואשר כבר מספק מספר התוספים המותקנים מראש שימושיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני הדמיה העברת מניסוי זמן לשגות למחשב אשר פיג&#39;י מותקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השקת התוכנית ולייבא את הקובץ הדמיה באמצעות &amp;# 34; קובץ&gt; יבוא&gt; ביו-פורמטים &quot;. או פשוט על ידי גרירת קובץ ההדמיה לתוך פיג&#39;י ב&quot; אפשרויות היבוא ביו-הפורמטים &quot;, סמן את התיבה&quot; ערוצים לפצל &quot;כדי לקבל ערימת תמונה נפרדת עבור כל ערוץ תאורה (DIC , RFP, YFP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: כדי למזג זמן-סדרות נפרדות נובעות הפסקה ברכישת התמונה בשל refocusing (שלב 3.9), פתח ערימות תמונת בהתאמה וברח &quot;תמונה&gt; סטאקס&gt; כלים&gt; לשרשר&quot; לכל ערוץ (DIC, RFP, YFP ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את איכות נתוני הזמן לשגות ידי גלילת ערימות תמונה. חפש עובש כי נשאר בפוקוס לאורך זמן, צמיחת mycelial מופע ובסופו של דבר ליצור נבגים (מחסנית DIC). בדוק את לוקליזציה subcellular הצפויה DivIVA-mCherry על קצות hyphal (מחסנית RFP) ו FtsZ-YPet להרכיב טבעות יחידות או מבנים רבים, כמו-סולם וגטטיבי או עובש sporogenic (מחסנית YFP), בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד אזור של אינטרס עבור processi במורד הזרםng של תמונות. זמן לשגות מיקרוסקופ לעתים קרובות מייצרת קבצים גדולים והדבר עשוי להאט עיבוד על ידי פיג&#39;י. לכן מומלץ לזהות ולבודד אזור של העניין (ROI) ולבצע צעדי עיבוד תמונה נוספים על גרסה קטנה יותר זה של מחסנית התמונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;הבחירה מלבנית&quot; בתפריט וצייר ROI מלבני בערימת תמונת DIC בצורה כזאת כי העובש בפיתוח מוקף על ידי ROI במהלך סדרת התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכפל ROI מחסנית עם &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש על הבר שם ערימת תמונת YFP ובחר &quot;ערוך&gt; בחירה&gt; שחזר בחירה&quot; בתפריט כדי לשחזר את הבחירה מלבני הקודמת של דסק&quot;ש המקורי מחסנית לאותה ההופעה במיקום בערימת YFP לשכפל את ההחזר על ההשקעה עם &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך זה עבור מחסנית RFP. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את התמונות בתמונה השלוש ערימות to להסיר מרחף במה במישור xy לאורך זמן. גלול אל המסגרת האחרונה במחסנית דסק&quot;ש ובחר &quot;Plugin&gt; הרשמה&gt; StackReg&gt; RigedBody&quot; מהתפריט. חזור על שלב זה עבור RFP ואת מחסנית תמונת YFP. במידת הצורך, לחתוך את ההחזר על ההשקעה על ידי חזרה על צעד 4.5.1-4.5.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: כוונון הבהירות והניגודיות באופן ידני עבור כל ערימה התמונה עם &quot;כוונון הבהירות והניגודיות כלי&quot; ( &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;C&quot;) או בחר &quot;תהליך&gt; שפר ניגודיות&quot; מהתפריט ולהחיל את &quot;לנרמל&quot; פקודה לכל התמונות בערימה. יצוין כי הפקודה האחרונה תשנה ערכי הפיקסלים ולכן עשוי להשפיע ניתוח התמונה במורד הזרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: שלב ערימות פרט (מרה לפורמט קובץ RGB, ראה 4.11) אופקי או אנכי באמצעות התוסף &quot;תמונה&gt; סטאקס&gt; כלים&gt; שלב&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת סרגל קנה מידה ( &quot;נתח&gt; כלים&gt; בר סולם&quot;) ואת חתם זמן (&amp;# 34; תמונה&gt; סטאקס&gt; זמן סטמפר &quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור ערימות תמונה שונות כרצף תמונה בפורמט &quot;.tiff&quot;. כדי להפיק סרט, שמירה בשם &quot;.אבי&quot;. לחלופין, סדרת תמונת יצוא בפורמט QuickTime באמצעות התוסף &quot;ביו-פורמטים&gt; ביו-פורמטי יצואן&quot; ובחר את סוג הקובץ &quot;.mov&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג תמונות מסגרות יחידות, בחר במסגרת של הריבית לשכפל את התמונה &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot;. שינוי סוג של התמונה המתקבלת כדי &quot;RGB&quot; או &quot;8-bit&quot; תחת &quot;תמונה&gt; סוג&gt; צבע RGB או 8 סיביות&quot; ולשמור את התמונה בשם &quot;.tiff&quot;. הערה: פיג&#39;י מציעה מספר פונקציות נוספות בהמשך ויסמנו או תהליך הסדרת הזמן לשגות. עבור אל תמיכה מקוונת פיג&#39;י לקבלת מידע מפורט (http://fiji.sc/Fiji). </li></ol>

<ol>
	<li>Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Fl&#228;rdh, K., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-di-GMP+signalling+and+the+regulation+of+developmental+transitions+in+streptomycetes.">c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in streptomycetes.</a> Nat. Rev. Microbiol. 13, 749-760 (2015).</li><li>Jakimowicz, D., van Wezel, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division+and+DNA+segregation+in+Streptomyces.:+how+to+build+a+septum+in+the+middle+of+nowhere?.">Cell division and DNA segregation in Streptomyces.: how to build a septum in the middle of nowhere?.</a> Mol. Microbiol. 85, 393-404 (2012).</li><li>McCormick, J. R., Fl&#228;rdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+regulators+that+govern+Streptomyces+development.">Signals and regulators that govern Streptomyces development.</a> FEMS Microbiol. Rev. 36, 206-231 (2012).</li><li>Fl&#228;rdh, K., Richards, D. M., Hempel, A. M., Howard, M., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+apical+growth+and+hyphal+branching+in+Streptomyces.">Regulation of apical growth and hyphal branching in Streptomyces.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 737-743 (2012).</li><li>Hempel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ser/Thr+protein+kinase+AfsK+regulates+polar+growth+and+hyphal+branching+in+the+filamentous+bacteria+Streptomyces.">The Ser/Thr protein kinase AfsK regulates polar growth and hyphal branching in the filamentous bacteria Streptomyces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 109, E2371-E2379 (2012).</li><li>Fuchino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+gradients+of+an+intermediate+filament-like+cytoskeleton+are+recruited+by+a+polarity+landmark+during+apical+growth.">Dynamic gradients of an intermediate filament-like cytoskeleton are recruited by a polarity landmark during apical growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E1889-E1897 (2013).</li><li>Holmes, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coiled-coil+protein+Scy+is+a+key+component+of+a+multiprotein+assembly+controlling+polarized+growth+in+Streptomyces.">Coiled-coil protein Scy is a key component of a multiprotein assembly controlling polarized growth in Streptomyces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E397-E406 (2013).</li><li>McCormick, J. R., Su, E. P., Driks, A., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+viability+of+Streptomyces+coelicolor.+mutant+for+the+cell+division+gene+ftsZ.">Growth and viability of Streptomyces coelicolor. mutant for the cell division gene ftsZ.</a> Mol. Microbiol. 14, 243-254 (1994).</li><li>Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+and+the+division+of+prokaryotic+cells+and+organelles.">FtsZ and the division of prokaryotic cells and organelles.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 862-871 (2005).</li><li>Grantcharova, N., Lustig, U., Fl&#228;rdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+FtsZ+assembly+during+sporulation+in+Streptomyces+coelicolor+A3(2).">Dynamics of FtsZ assembly during sporulation in Streptomyces coelicolor A3(2).</a> J. Bacteriol. 187, 3227-3237 (2005).</li><li>Richards, D. M., Hempel, A. M., Fl&#228;rdh, K., Buttner, M. J., Howard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+basis+of+branch-site+selection+in+filamentous+bacteria.">Mechanistic basis of branch-site selection in filamentous bacteria.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002423 (2012).</li><li>Hempel, A. M., Wang, S. B., Letek, M., Gil, J. A., Fl&#228;rdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assemblies+of+DivIVA+mark+sites+for+hyphal+branching+and+can+establish+new+zones+of+cell+wall+growth+in+Streptomyces+coelicolor.">Assemblies of DivIVA mark sites for hyphal branching and can establish new zones of cell wall growth in Streptomyces coelicolor.</a> J. Bacteriol. 190, 7579-7583 (2008).</li><li>Wolanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replisome+trafficking+in+growing+vegetative+hyphae+of+Streptomyces+coelicolor+A3(2).">Replisome trafficking in growing vegetative hyphae of Streptomyces coelicolor A3(2).</a> J. Bacteriol. 193, 1273-1275 (2011).</li><li>Jyothikumar, V., Tilley, E. J., Wali, R., Herron, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+microscopy+of+Streptomyces+coelicolor.growth+and+sporulation.">Time-lapse microscopy of Streptomyces coelicolor.growth and sporulation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 6774-6781 (2008).</li><li>Willemse, J., Borst, J. W., de Waal, E., Bisseling, T., van Wezel, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+control+of+cell+division:+FtsZ+is+recruited+by+SsgB+during+sporulation+of+Streptomyces.">Positive control of cell division: FtsZ is recruited by SsgB during sporulation of Streptomyces.</a> Genes. Dev. 25, 89-99 (2011).</li><li>Glazebrook, M. A., Doull, J. L., Stuttard, C., Vining, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+of+Streptomyces+venezuelae.+in+submerged+cultures.">Sporulation of Streptomyces venezuelae. in submerged cultures.</a> J. Gen. Microbiol. 136, 581-588 (1990).</li><li>Bibb, M. J., Domonkos, A., Chandra, G., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+chaplin+and+rodlin+hydrophobic+sheath+proteins+in+Streptomyces+venezuelae.is+controlled+by+sigma(BldN)+and+a+cognate+anti-sigma+factor,+RsbN.">Expression of the chaplin and rodlin hydrophobic sheath proteins in Streptomyces venezuelae.is controlled by sigma(BldN) and a cognate anti-sigma factor, RsbN.</a> Mol. Microbiol. 84, 1033-1049 (2012).</li><li>Al-Bassam, M. M., Bibb, M. J., Bush, M. J., Chandra, G., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+regulator+heterodimer+formation+controls+a+key+stage+in+Streptomyces+development.">Response regulator heterodimer formation controls a key stage in Streptomyces development.</a> PLoS Genet. 10, e1004554 (2014).</li><li>Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+aerial+growth,+cell+division,+and+chromosome+segregation+are+targets+of+WhiA+before+sporulation+in+Streptomyces+venezuelae.">Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae.</a> MBio. 4, e00684-e00613 (2013).</li><li>Tschowri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrameric+c-di-GMP+mediates+effective+transcription+factor+dimerization+to+control+Streptomyces+development.">Tetrameric c-di-GMP mediates effective transcription factor dimerization to control Streptomyces development.</a> Cell. 158, 1136-1147 (2014).</li><li>Mirouze, N., Ferret, C., Yao, Z., Chastanet, A., Carballido-L&#242;pez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MreB-Dependent+Inhibition+of+Cell+Elongation+during+the+Escape+from+Competence+in+Bacillus+subtilis.">MreB-Dependent Inhibition of Cell Elongation during the Escape from Competence in Bacillus subtilis.</a> PLoS Genet. 11, e1005299 (2015).</li><li>Zopf, C. J., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquiring+fluorescence+time-lapse+movies+of+budding+yeast+and+analyzing+single-cell+dynamics+using+GRAFTS.">Acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using GRAFTS.</a> J. Vis. Exp. (e50456), (2013).</li><li>Meniche, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpolar+addition+of+new+cell+wall+is+directed+by+DivIVA+in+mycobacteria.">Subpolar addition of new cell wall is directed by DivIVA in mycobacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, E3243-E3251 (2014).</li><li>Donovan, C., Schauss, A., Kramer, R., Bramkamp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+impacts+on+cell+growth+and+division+site+selection+in+Corynebacterium+glutamicum.">Chromosome segregation impacts on cell growth and division site selection in Corynebacterium glutamicum.</a> PLoS One. 8, e55078 (2013).</li><li>Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Escherichia+coli.+growth+rate+to+osmotic+shock.">Response of Escherichia coli. growth rate to osmotic shock.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, 7807-7812 (2014).</li><li>Fl&#228;rdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+DivIVA+in+polar+growth+and+morphogenesis+in+Streptomyces+coelicolor+A3(2).">Essential role of DivIVA in polar growth and morphogenesis in Streptomyces coelicolor A3(2).</a> Mol. Microbiol. 49, 1523-1536 (2003).</li><li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics.">High-throughput subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Mol. Microbiol. 80, 612-627 (2011).</li><li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy.">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nat. Protoc. 7, 80-88 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+fluorescent+D-amino+acids+and+their+use+for+probing+peptidoglycan+synthesis+and+bacterial+growth+in+situ.">Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ.</a> Nat. Protoc. 10, 33-52 (2015).</li><li>Szafran, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+I+(TopA)+is+recruited+to+ParB+complexes+and+is+required+for+proper+chromosome+organization+during+Streptomyces+coelicolor.+sporulation.">Topoisomerase I (TopA) is recruited to ParB complexes and is required for proper chromosome organization during Streptomyces coelicolor. sporulation.</a> J. Bacteriol. 195, 4445-4455 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

זמן לשגות מיקרוסקופית של מחזור החיים Streptomyces כבר מאתגר מבחינה טכנית בעבר. כאן אנו מציגים פרוטוקול חזק כדי לבצע דימות תאי חיים של מחזור החיים המלא באמצעות התכת חלבון פלואורסצנטי אל DivIVA סמן הקוטבי בתא וחטיבת חלבון תא FtsZ לעזור לחזות להתחקות התקדמות באמצעות תכנית התפתחותית (איור 2). מרכזי לשיטה זו היא הטיפוח של ס venezuelae במכשיר microfluidic המאפשר זלוף בינוני קבוע ואת חילופי מדיום הגידול רגיל (MYM-TE) עם המדיום בילה (בילה MYM-TE). השינוי של מצב ההתרבות חשוב בפרוטוקול תאר כי downshift התזונתי כמו גם בארות עדיין שום אותות תאיים לא מזוהים (למשל מניין אותות חישה) במדיום תרבות בילו, לקדם נביגה, ואילו אספקה ​​רציפה של מדיום תזונתי עשירה מגרה growt וגטטיבישעות עם היווצרות כמעט נבג (מידע לא מוצג). לפיכך, culturing תאים במערכת microfluidic זו עדיף על תאי culturing על agarose כי הוא מציע גמישות ניסיון יותר ומאפשר ניטור ארוך טווח של שינויי התפתחות חיידקים בתגובה לשינויים בתנאי תרבות. למרות צלחות microfluidic מיועדות לשימוש יחיד בלבד, לזרום ערוצים שלא היה מחוסן עם תאים יכול לשמש בניסויים הבאים. אנו ממליצים להשתמש בכל ערוצי צלחת microfluidic תוך שבוע, כפי שחווינו בעיות איטום סעפת צלחות שנפתחו לזמנים ארוכים יותר. בעת הגדרת ניסוי, מצאנו כי נבגים מוכנים טרי מונבטים בתוך שתי שעות של נטען לתוך תא הזרימה, ואילו נבגים נגזרו מנית גליצרול קפוא נדרשים לפחות 6 שעות לפני צינורות ניבטו יצאו (מידע לא מוצג). עיכוב זה בלבלוב משתרע לכל אורכה של הניסוי יכול להפריעזמינות הציוד תנאי הניסוי. כמו כן, חשוב להתחיל את הניסוי עם טפטוף של MYM-TE לפחות 3 שעות כדי לספק חומרים מזינים מספיק לפיתוח תולדה של צינורות נבט. זלוף עם MYM-TE יכול להתארך מעבר hr הראשונית 3 אם הניסוי נועד ללמוד הצמיחה וגטטיבי. בעוד נבגים לספק הבחירה המועדפת של חומר המוצא, שברי hyphal קצר יכול גם להיות טעון לתוך צלחת microfluidic. עם זאת, את יעילות הטעינה בעת שימוש תפטיר טעון היא משמעותית נמוכה ולעתים קרובות דורשת מספר ריצות טעינה אשר עשוי להציג מגבלה כאשר בוחנים מוטנטים שאינם sporulating. ללא קשר לסוג של בידוד המשמש, חשוב לא להעמיס על חדר התרבות עם נבגים או שברי hyphal כמו זה יוביל צפיפות מהירה שיכול להפריע דיפוזיה תקשורת לסבך ניתוח תמונה. חשוב לתכנן את בניית חלבוני כתב carefully לשימוש הדמיה זמן לשגות הקרינה Streptomyces. אורך לינקר בין חלבון המטרה ואת כתב הניאון והבחירה של N- או בשילובי C- מסוף יכול להיות קריטי. יתר על כן, תנאי ניסוי אופטימליים, כוללים תדירות הדמיה וזמן חשיפה, צריכים להיקבע מראש עבור כל חלבון fluorescently- מתויג. ס פלואורסצנציה אוטומט תערוכת עובש venezuelae בערוץ הירוק / צהוב שעשויות להיות בעייתיים כאשר הדמית חלבון שכותרתו fluorescently כי מתבטא ברמות נמוכות. בנוסף, יש לציין כי, במהלך הנביטה ואת שלב הצמיחה וגטטיבי הראשונית, S. venezuelae הוא רגיש במיוחד אור באורך גל קצר (למשל בעת שימוש בשילובי חלבון CFP). למרות ההתקדמות המתמשכת בטכניקות הדמיה ומערכות כתב ניאון עבור הדמיה לחיות תאים של חיידקים, ברוב חבילות התוכנה (למשל MicrobeTracker, Schnitzelcאמות, CellProfiler) לעיבוד האוטומטי הבא של אלו סוגים של ערכות נתונים אינן תומכות הניתוח של תמונות נגזרות חיידקים פילמנטיות עם סגנון חיים רב-תאיים 27-29. לפיכך, יש צורך לפתח אלגוריתם מתאים לניתוח תפוקה גבוהה כמותי של נתונים הדמיה מ- Streptomyces וחיידקים filamentous אחרים. לסיכום, העבודה המתוארת כאן ממחישה את הפוטנציאל העצום של ס venezuelae כמערכת התפתחותית מודל חדשה מהמין, בגלל יכולתה sporulate בנוזל. מכשיר culturing microfluidic הוא פשוט לשימוש גם עבור משתמשים לא מנוסים. הוא מספק פלטפורמה מצוינת ללמוד תהליכים ביולוגיים תא מרכזיים מחזור חי Streptomyces, כולל לוקליזציה חלבון דינמית, צמיחה מקוטבת, ואת הבידול מורפולוגיים של תפטיר רב-תאי לתוך רשתות של נבגי unigenomic. בנוסף זה הניסיון להגדיר up גם מספק נקודת מוצא מפתה כדי לחקור את האירועים בפיתוח שדורשים לסירוגין התנאים תרבות, או את השימוש של צבעי ניאון כגון חומצות -amino D ניאון כדי לפקח סינתזה פפטידוגליקן או יודיד propidium ו 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כדי לחזות כרומוזום ארגון 30,31.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/53863/fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle" target="_blank">Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device</a>
The author&#39;s name was updated from:
Mark Buttner
to:
Mark J. Buttner

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/53863/fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle" target="_blank">Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device</a>
The middle initial J. has been added to author Mark Buttner.

Erratum: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomycetes הם חיידקי אדמת שוכני המאופיינות מחזור התפתחותית מורכב המעורב בידול מורפולוגיים מ תפטיר רב-תאי, הדחה-מזין רדום, נבגי unigenomic 1-3. תחת תנאי גידול נוחים שנבג Streptomyces הטיפוסי מתחיל לנבוט ידי לשיחול צינורות ניבטים אחד או שניים (איור 1). צינורות אלה להאריך ובהרחבת טיפ ולגדול לרשת hyphal קנים המכונית התפטיר וגטטיבי. צמיחת פולאר הסתעפות hyphal מופנה על ידי DivIVA החלבון החיוני. חלבון מפותל, סליל זהו חלק ממכלול ציטופלסמית גדול שנקרא polarisome, שהוא חיוני עבור החדרת חומר מעטפה הסלולרית החדש בקצה הארכת 4-7. במהלך צמיחה של צמח, חוטי hyphal להיות ממודרים כתוצאה מהיווצרותם הנדירה של מה שנקרא חוצת קירות 8. ההיווצרות של קירות הצולבים אלה מחדש<html> quires FtsZ, החלבון cytoskeletal דמוי טובולין כי הוא חיוני עבור חלוקת התא רוב החיידקים 9. בשנת Streptomyces, לעומת זאת, קירות צלב וגטטיבי אלה אינם להוביל לפרידת התכווצות תאי תאים ולכן מסת mycelial נשארה כרשה של תאי סינסיציאלי מחובר יתר. בתגובת הגבלת מזין ואיתות אחרים שאינם מובנים היטב, עובש אוויר מיוחד להתנתק התפטיר וגטטיבי ולגדול לאוויר 3. הקמת המבנים אלה יוזמת את שלב הרבייה של פיתוח, שבמהלכו עובש האוויר רב-גנומי הארוך להיות מחולק עשרות תאי prespore unigenomic השווה בגודלן. אירוע חלוקת תא מסיבי זה הוא מונע על ידי ההתכווצות סינכרוני של טבעות FtsZ מרובות בתוך 2,10 עובש sporogenic היחיד. בידול מורפולוגי הושלם על ידי השחרור של רדומים, בעובי דופן, נבגים פיגמנט. t &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig1.jpg" /> איור 1:. Streptomyces מחזור החיים על תקשורת מוצקה זהו מודל של מחזור החיים מבוסס על מחקרים קלסיים של ס coelicolor גדל על צלחות אגר. פיתוח הסלולר של נבג מתחיל עם ההיווצרות של צינורות ניבטים אחד או שניים, אשר גדלים באמצעות רחבת טיפ ליצירת רשת של הסתעפות עובש. הצמיחה פולאר הסתעפות של העובש וגטטיבי היא נוהלה על ידי DivIVA (אדום). ההיווצרות של חוצת קירות וגטטיבי דורשת FtsZ (ירוק). בתגובה להגבלות מזין אותות אחרים, עובש אווירי מוקמים. מעצר של צמיחה אווירית מרוכז באופן הדוק עם ההרכבה של סולם של FtsZ-טבעות, אשר מעוררות את septa נביגה כי למדר את עובש sporogenic לתאי prespore דמוי קופסא. תאים אלה להרכיב קיר נבג עבה והם בסופו של דבר released נבגים פיגמנט מבוגרים. האירועים התפתחותי החשובים של מחזור חי Streptomyces הם גם מאופיינים 1,3. עם זאת, מה הוא עדיין נדיר מחקרי תא ביולוגי מעסיקות הקרינה מיקרוסקופיה זמן לשגות לספק תובנה תהליכי subcellular שבבסיס בידול, כגון דינמיקת לוקליזציה חלבון, תנועת כרומוזום חלוקת תא מבחינת התפתחותית מבוקרת. Live- תא הדמיה של פיתוח Streptomyces כבר מאתגר בגלל המורכבות של מחזור החיים ואת המאפיינים הפיזיולוגיים של האורגניזם. מחקרים קודמים על צמיחת צמח ו בשלבים הראשונים של septation נביגה יש מועסקים לתאי הדמיה חדיר-חמצן, או הצמיחה נתמכת agarose של coelicolor Streptomyces על במת מיקרוסקופ 11-15. שיטות אלה, עם זאת, מוגבלים על ידי מספר גורמים. חלק מהמערכות רק לאפשר הדמיה לטווח קצר של צמיחה הסלולרחלבוני ניאון ד לפני תאים סובלים אספקת חמצן מספיקה או לצמוח מתוך המטוס מוקד בשל דפוס תלת ממדי של פיתוח hyphal. במקרים בם הדמיה לטווח ארוך אפשרית, טיפוח תאים על גבולות רפידות agarose גמישות ניסיון, כי התאים לא יכולים להיחשף תנאי גידול או מתח חלופיים, ואת קרינת הרקע מהמדיום של רפידות agarose מגבילה מאוד את היכולת לנטר ניאון חלש אותות. כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור דימות תאים חיים של מחזור החיים Streptomyces להשלים עם דיוק ורגישות מעולה. על ידי הגדלה Streptomyces במכשיר microfluidic מחובר מיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield (איור 2), אנו יכולים כעת לעקוב אחר נביטה, צמיחה צמח ו נביגה septation על פני פרק זמן של עד 30 שעות. זה קל מאוד על ידי השימוש של Streptomyces אורגניזם המודל החדש </em&gt; venezuelae כי זה sporulates להשלמה ליד בתרבות השקועה ובכך מתגבר על המגבלה של מיני מודל הקלסיים ס coelicolor, אשר sporulates רק על תקשורת מוצקה 16-20. כדי לעזור לחזות צמיחה צמח ו נביגה, אנו שיתוף-Express fluorescently מתויג גרסאות של DivIVA סמן הקוטביות בתא ואת החלבון חלוקת התא מפתח FtsZ. אנחנו משתמשים במכשיר microfluidic זמינים מסחרית כי הועסק בהצלחה עבור mycobacteria, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, subtilis Bacillus ושמרים 21-25. מערכת מלכודות תאי מטוס בודד מוקדי ומאפשרת שליטת זלוף הרציפה של מדיום תרבות ממאגרים שונים. בפרוטוקול המפורט ננצל בתכונה זו כדי לחשוף ס venezuelae תפטיר וגטטיבי על downshift תזונתי לקדם נביגה. הדה הפרוטוקולscribed הוא עבור דימות תאים חיים של מחזור החיים Streptomyces כולו, אבל התנאים תקשורת אלטרנטיבית או הגדרות מיקרוסקופ ניתן לבחור אם בשלבים התפתחותיים ספציפיים הם בעלי עניין מיוחד. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig2.jpg" /> איור 2: סכמטי המתאר את זרימת העבודה הניסויית. שלושת הצעדים העיקריים המתוארים בפרוטוקול מוצגים. ראשית, נבגים ובינוניים בילו ערוכים מתרבות נייחת פאזיים. שנית, נבגים טריים נטענים לתוך מערכת microfluidic וס venezuelae הוא צלם לאורך כל מחזור החיים ההתפתחותיים שלו באמצעות מיקרוסקופ הפוכה אוטומטית לחלוטין עם תא דגירה לשמור על טמפרטורה לצמיחה אופטימלית. שלישית, סדרת הזמן לשגות שהתקבלה מנותחת ומעובד באמצעות תוכנת הקוד הפתוח פיג&#39;י.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B04A CellAsic ONIX plate for bacteria cells</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>B04A-03-5PK</td>
			<td>Microfluidic culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellAsic ONIX Microfluidic Perfusion System and ONIX FG (version 5.0.2)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>EV-262</td>
			<td>The latest ONIX vesion (July 2015) and instructions on how to use the programme can be found here: http://www.merckmillipore.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer.Z1 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>431007-9902-000</td>
			<td>Fully automated and motorized inverted widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator XL multi S1 with Temperature Module S1 and Heating unit XL S2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>411857-9061-000</td>
			<td>Environmental chamber surrounding the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420792-9800-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocra FLASH 4 V2</td>
			<td>Hamamatsu Photonics K.K.</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator HXP 120V</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>423013-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FL Filter Set 46 HE YFP shift free</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>489046-9901-000</td>
			<td>Fluorescent filter set, excitation 500/25 nm, emission 535/30 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FL Filter Set 63 HE RFP shift free</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>489063-0000-000</td>
			<td>Fluorescent filter set, excitation 572/25 nm, emission 629/30 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting frame K-M for multiwell plates</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1272-644</td>
			<td>Stage holder for microfluidic plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN pro 2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>410135-1002-120</td>
			<td>Microscope control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Time Lapse</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>410136-1031-110</td>
			<td>Software module to set up time-lapse microscopy experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Tiles/Positions</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>410136-1025-110</td>
			<td>Software module to save specific stage positions (xzy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>open-source software package</td>
			<td>http://fiji.sc/Fiji</td>
			<td>Generation of time-lapse movies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM) 
			4 g Maltose 
			4 g Yeast extract 
			10 g Malt extract 
			add 1 L H2O using 50 % tap water and 50 % reverse osmosis water and supplement with 200 ml of R2 trace element solution per 100 ml after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sporulation medium used to culture S. venezuelae SV60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R2 Trace element solution (TE) 
			8 mg ZnCl2 
			40 mg FeCl3-6H2O 
			2 mg CuCl2-2H2O 
			2 mg MnCl2-4H2O 
			2 mg Na2B4O7-10H2O 
			2 mg (NH4)6Mo7O24-4H2O 
			add 200 ml H2O 
			Autoclave and store at 4 oC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 0.002 volumes to MYM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>Used to refill inlet wells of unused lanes in B04A plates in order to prepare plate for short-term storage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Satorius stedim</td>
			<td>16532-K</td>
			<td>Preparation of spent MYM-TE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV60</td>
			<td>John Innes Centre strain collection</td>
			<td></td>
			<td>S. venezuelae strain expressing divIVA-mcherry and ftsZ-ypet</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence time-lapse imaging of the complete s. venezuelae life cycle using a microfluidic device

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties. 
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.

ההדמיה לחיות התאים המוצלחת של ס כולו מחזור החיים venezuelae מניב זמן-סדרה רצופה כולל שלבי ההתפתחות העיקריים של נביטה, צמיחה צמח ו נביגה (איור 3, סרט 1). ויזואליזציה של ההתקדמות דרך מחזור החיים משופרת נוספת על ידי לוקליזציה subcellular הברורה של DivIVA-mCherry ו FtsZ-YPet. במהלך נביטה וצמיחה וגטטיבי, DivIVA-mCherry מצטבר בלעדי בקצות hyphal גדלו או סימני טביעה חדש נקודות סניף (איור 4 א). תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם מיצוב subcellular שדווח בעבר של 12,26 DivIVA. לעומת זאת, FtsZ-YPet יוצר יחיד מבנים דמויי טבעת במרווחים לא סדירים של תפטיר גדל (איור 4B). מבנים אלה מספקים את הפיגום לסינתזה של קירות צלב וגטטיבי שאינם מגבילים, המוביל להיווצרות של interconnמדורי hyphal ected 8. בידול הסלולר של גדל עובש לתוך עובש sporogenic הופך לגלוי על ידי היעלמות מוקדי קוטב DivIVA-mCherry, מעצרו של צמיחת קוטב והעלייה במקבילה של קרינת FtsZ-YPet (האיור 4C). בשנת sporulating העובש, דפוס לוקליזציה של FtsZ-YPet משתנה באופן דרמטי; חוטי סליל FtsZ-YPet הראשונים מתגלגלים לאורך hypha ולאחר מכן, אירוע סינכרוני פתאומי, כמעט, סלילים אלה להתגבש סולם צלצולי YPet FtsZ פזור. תחת תנאי הניסוי המתואר כאן, מופץ באופן שווה אלה סולמות FtsZ-YPet להימשך כ -2 שעות. לבסוף, מחיצה נביגה להיות ניכר הניגוד התערבות ההפרש (DIC) תמונות (איור 4D) ולבסוף נבגים חדשים מתפרסמים. הפרוטוקול הבא המתאר את עיבוד התמונה באמצעות תוכנת פיג&#39;י קובעה<html> TEP-אחר-צעד הסבר כיצד להפיק סרט לפרסום מהסדרת הזמן לשגות רכש (סרט 1). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig3.jpg" /> איור 3: תמונות Snapshot מתוך סדרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות נציג ס venezuelae הפיק שכותרתו fluorescently FtsZ (ירוק) DivIVA (אדום) מוצגים הם מסגרות נבחרות תמונות ממוזגות (פנל עליון: RFP-YFP-DIC, פנל תחתון: DIC). לדמיין את מחזור חי Streptomyces כולל נביטה, צמיחת צמח ו נביגה. תמונות נלקחו סרט 1. זמן נמצא hr: דקות. ברי סולם = 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ד / 53,863 / 53863fig4.jpg &quot;/&gt; איור 4: נציג תוצאות עבור סדרה הזמן לשגות מוצלחת של מחזור חי Streptomyces (א) לוקליזציה של DivIVA-mCherry.. מוצגים הם תמונות של שתי נקודות בפעם הבאות מסרט 1 עם תמונות ממוזגות של RFP וערוצי דסק&quot;ש. DivIVA-mCherry מסמן אתרי סניף hyphal חדשים (ראש חץ מלא) ו localizes בקצה hyphal לכוון צמיחה קוטבית (ראש חץ פתוח). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר (ב) לוקליזציה FtsZ-YPet במהלך הצמיחה וגטטיבי (ראש חץ). FtsZ-YPet יוצר יחיד מבנים דמוי טבעת (פנל עליון) כי לא להצר (DIC, פנל תחתון). (C) FtsZ-YPet (ירוק) לוקליזציה במהלך septation נביגה. מוקדי DivIVA-mCherry מוצגים באדום, עם זמן שחלף המתואר להלן (HR: דקות). סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. (ד) מקביל תמונות דסק&quot;ש של עובש sporulating מ (C) מראה את הטופסation של תאי prespore עם septa נביגה הגלוי (בתמונה משמאל), אשר בסופו של דבר להבשיל לכדי שרשרת של נבגים (בתמונה מימין). זמן הוא hr: דקות. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="מסגרת מסרט 1" src="/files/ftp_upload/53863/53863mov1.jpg" /> סרט 1: סדרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות של Streptomyces venezuelae מחזור החיים הסרט מורכב תמונות RFP-YFP הממוזגת (משמאל) ואת התערבות ההפרש לעומת המקביל (DIC) תמונות (מימין).. DivIVA-mCherry מוצג YPet-FtsZ האדום בירוק. מרווח הזמן בין יחיד מסגרות הוא 40 דקות. בר סולם = 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/movie1.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה תי</a>סרט של.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device at JoVE.com

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

זמן לשגות הדמיה הקרינה של השלם<em&gt; S. venezuelae</em&gt; מחזור החיים באמצעות מכשיר microfluidic

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

13.7K Views.  John Innes Centre, Norwich Research Park. Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

Video: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

בידוד ואנליזה של הגנום virions יחיד באמצעות &#39;נומיקס וירוס אחד &quot;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

נדידת תאים דנדריטים ניטור באמצעות<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H דימות תהודה מגנטית

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA טיהור מן intracellularly Grown<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; בתאי Macrophage

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo fluorescence optical imaging (OI), in two different mouse models of inflammation: a rheumatoid arthritis (RA) and a contact hypersensitivity reaction (CHR) model. Light with a wavelength in the near infrared (NIR) window (650 - 950 nm) allows a deeper tissue penetration and minimal signal absorption compared to wavelengths below 650 nm. The major advantages using fluorescence OI is that it is cheap, fast and easy to implement in different animal models.
Activatable fluorescent probes are optically silent in their inactivated states, but become highly fluorescent when activated by a protease. Activated MMPs lead to tissue destruction and play an important role for disease progression in delayed-type hypersensitivity reactions (DTHRs) such as RA and CHR. Furthermore, MMPs are the key proteases for cartilage and bone degradation and are induced by macrophages, fibroblasts and chondrocytes in response to pro-inflammatory cytokines. Here we use a probe that is activated by the key MMPs like MMP-2, -3, -9 and -13 and describe an imaging protocol for near infrared fluorescence OI of MMP activity in RA and control mice 6 days after disease induction as well as in mice with acute (1x challenge) and chronic (5x challenge) CHR on the right ear compared to healthy ears.

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper explains the application of fluorescent imaging using an activatable optical imaging probe to visualize the in vivo activity of key matrix metalloproteinases in two different experimental models of inflammation.

לא פולשני<em&gt; בויבו</em&gt; פלואורסצנטי הדמיה אופטית של פעילות MMP דלקתית באמצעות Activatable פלואורסצנטי סוכן הדמיה

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...