Name: isolating hair follicle stem cells and epidermal keratinocytes from dorsal mouse skin
Uploaded: 2016-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin at JoVE.com

This work was supported in part by NIH grant RO1GM60124 (to H.S.). H.S. is an Investigator with the Howard Hughes Medical Institute. Y.F. is supported by the Deloro Career Advancement Chair and The German Israeli Foundation (I-2381-412.13/2015). D.S. is supported by the Coleman-Cohen post-doctoral fellowship.

מחקר זה בוצע בהתאם קפדנית עם המלצות שהותוו מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של משרד הבריאות הישראלי. כל החיות טופלו על פי פרוטוקול טיפול בבעלי חיים מוסדי המאושר IL-02302-2015 של הטכניון טכנולוגי. 1. הכנה ניסויית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין בסרום שור העוברי chelated הערה: תאי אפיתל רגישים מאוד סידן ולכן חשוב לשלוט על החשיפה של תאים אלה סידן. על מנת להבטיח כי התאים אינם חשופים סידן במהלך קלאציה תהליך הבידוד משמש כדי להסיר כל סידן שיורית מן בסרום שור עוברית המשמש להכנת חיץ מכתים 29. הפרוטוקול הבא מכין כ 1 ליטר של החופשי סידן עוברי שור סרום הנדרש למאגר מכתים הכנת FACS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 400 גרם של חומר chelating יבש, למשל., Chelex, לתוך מבחנה 4 L ולהוסיף מזוקקים H 2 O ל בהיקף כולל 4 ל כיסוי ומתמשך מוקפצים באמצעות בוחש מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ל- pH 7.4 באמצעות 10 N פתרון HCl תוך ערבוב. המשך ערבוב במשך 20 דקות מחדש ולהתאים את ה- pH לפי הצורך עד pH נשאר יציב במשך יותר מ -20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת כוס לני 4 ° C. כדי לאפשר את חומר chelating לגבש גלולה קומפקטית. בזהירות לשאוב H 2 O ולהוסיף מזוקקים טריים H 2 O ל בהיקף כולל של 4 ל &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התאמת pH כמו בשלב 1.1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הכוס על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. כדי לאפשר את חומר chelating לגבש גלולה קומפקטית. בזהירות לשאוב H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט מוסיפים שתי 500 מ&quot;ל בקבוקי בסרום שור העובר לחומר chelating. מערבבים לאט על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. להבטיח כי הגדרת המהירות אינה מייצרת בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכוס על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. כדי לאפשר את החומר chelating להקים חינמוןלפעול גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את הנוזל לתוך בקבוק 1 ליטר זכוכית לסנן אותה דרך פילטר עליון בקבוק בתנאים סטריליים. אחסן את בסרום chelated ב -20 ° C או להשתמש מיד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מאגר מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100 מ&quot;ל של 3% chelated FBS ב PBS ללא Ca 2 + ו Mg 2+ ולשמור על הקרח. </li></ol></li></ol> בידוד 2. של זקיקי השיער למבוגרים אפידרמיס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים באמצעות isoflurane 5% באמצעות תיבת אינדוקציה. הפרוטוקול המתואר כאן היה מותאם באמצעות עכברים ישנים 50-80 יום נמצאים בשלב telogen של מחזור HF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על פי נהלי מעבדה סטנדרטיים. הנה, להרדים עכברים באמצעות מנת יתר CO 2 בתא המתת חסד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את כל השיער מן העור הגבה באמצעות קוצץ חשמלי. הימנע ראש וגפיים. שמור את הקוצץ קרוב ככל האפשר לעור. למנוע נזק לעור השכבה התת עורית. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל השיער מוסר, להשתמש 70% אתנול כדי להסיר שאריות שיער כדי לחטא את עור הגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על כרית לנתח, מלקחיים באמצעות להרים את העור ליד הזנב ולעשות ניק קטן בעזרת מספריים. חותך את עור הגב כולו בכיוון אחורי-קדמי על ידי חיתוך בזהירות את העור ומפריד בינה לבין fascia. למנוע נזק השכבה התת עורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העור על מחצלת לנתח, בצד השיער כלפי מטה, להצמיד שני הקצוות הסמוכים של העור לתקן במקום. בעדינות לגרד את השומן, באמצעות אזמל בוטה עד הדרמיס ברור ומסודר. הערה: כאשר מגרדים את השומן, להשתמש במלקחיים מעוקל כדי להפעיל לחץ עדין על העור. החל לחץ על העור באמצעות הצד המעוגל של מלקחיים. פעולה זו תמנע את העור מקריעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העור, הדרמיס בצד למטה, ב 100 מ&quot;מ צלחת תרבות סטרילי, ויישר את העור על מנת להבטיח כי אין קפלים. הוסף 10 מ&quot;ל של PBS ללא Ca 2 + </sup&gt; ו Mg 2+ (PBS -) כדי בצלחת תרבות וליישר את העור במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS ולהוסיף 10 מ&quot;ל של טריפסין 0.25%. ודא כי העור הוא פרש והוא צף בחופשיות. דגירה פיסת עור אחד לכל 10 מ&quot;ל של טריפסין 0.25%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת דגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30-120 דקות או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol> 3. הכנת תרחיף תא בודד מ&#39;שיער&#39; זקיקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרד את כל השיער מעל העור באמצעות מלקחיים מעוקלים אזמל, ב קדמי לכיוון אחורי. מתחי את העור במקום באמצעות צדו הקמור של מלקחיים ולהשתמש אזמל כדי לגרד את השיער. הערה: אל תגרד את השיער לתוך התמיסה טריפסין הוסיף בשלב 2.8. התחל הזנב ופעל בכיוון צמיחת השיער. מגרדים נגד כיוון צמיחת שיער יגרום לאובדן משמעותי של HFS ו ירידה בתשואת תא. HFS נוטה לדבוק זה יחד ויוצר גושים קטנים; על מנת לצמצם הגודל דואר של גושי HF לנסות לגרד שטח קטן בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העור ללא שיער כדי בצלחת תרבות חדשה ולהוסיף 10 מ&quot;ל של PBS - כדי למנוע התייבשות. בדוק את העור לגרד כל שיער נותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את HFS באמצעות אזמל מלקחיים עד השעית HF יחידה מתקבלת. במרץ triturate השעית HF באמצעות פיפטה 10 מיליליטר במשך כמה דקות כדי לשבור את כל גושי השיער. הערה: בצע את כל השלבים הבאים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה HF בצינור 50 מ&quot;ל מראש שכותרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS - מן העור ולהשתמש בו כדי לשטוף את צלחת תרבית תאים שהכילה השעית HF; להעביר את הצינור 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כְּבָסִים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה על ידי עובר דרך מסננת תא 70 מיקרומטר מצויד על צינור 50 מ&quot;ל. שטפו את שפופרת 50 מ&quot;ל הראשונית ואת מסננת עם 10 מ&quot;ל של חיץ מכתים (PBS - עם 3% chelated FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה על ידי העברהתא מסנן דרך 40 מיקרומטר מצויד על צינור 50 מיליליטר. לשטוף את הצינור עם 5-10 מ&quot;ל של חיץ מכתים על מנת להבטיח כי כל התאים הועברו אל צינור חדש. שמור את ההשעיה על הקרח עד שכל החיות עובדו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 300 XG ב 4 מעלות צלזיוס. supernatant לשאוב בזהירות מבלי להפריע גלולה ו resuspend גלולה ב 5 מ&quot;ל של חיץ מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 5 דקות XG 300 ב 4 מעלות צלזיוס. בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 800 μl של חיץ מכתים. הערה: הכרכים המפורטים לעיל מספיק תאים מכתימים נגזרים משני עכברים בוגרים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיה העביר לתוך צינורות FACS שכותרתו קדם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור צינורות שולטים, לקחת 25-50 μl של השעית תא (או כל שמאל שיורית מן השעית התא) ולעשות עד בהיקף כולל של 300 μl עם חיץ מכתים. הערה: הכין צינורות מלאים (μl נפח הכולל 300) עבור בלא כתם (לא נוגדןואין DAPI); DAPI בלבד; Integrin β1; Integrin α6; SCA-1; CD34. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את הנוגדנים הראשוניים DAPI (ראה טבלת חומרי דילולים מתאימים) בריכוזים הרצויים אל הצינור המתאים. בעדינות קפיצית את הצינורות כדי לערבב את השעית התא. חזור על קרח מכסים ברדיד אלומיניום כדי להגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 30 דקות על קרח בעדינות קפיץ הצינורות כל 10 דקות כדי להבטיח תאים נשמרים השעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים על ידי מילוי כל צינור FACS עם חיץ מכתים (כ 4 מ&quot;ל לכל צינור); צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 XG ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 800 μl של חיץ מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את השעית תא לתוך צינור FACS עם כובעים מסננים תא כדי להבטיח השעית תא בודדת. </li></ol> 4. ניתוח cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך מיון תאים באמצעות מיד cytometer זרימה עם מסננים מתאימים עבור סיגנהאיתור l. השתמש 405 סגול ננומטר (למדידות DAPI), 488 ננומטר כחול (למדידות FSC, SSC, PE, PE-Cy7 ו FITC) ו 633 לייזרים אדומים ננומטר (עירור של APC) הערה: ודא כי מכשיר הקלטה מ גלאי עבור כל שלושת ערוצי הניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שערי קרינה מוגדרת על סמך דגימות בלא כתם ופיצוי עבור חפיפה ספקטרלית באמצעות פקדים מוכתמים יחידים. הערה: השתמש בפקדים צבעוניים אחת להתאמת הפיצוי בין ערוצים על מנת לחסל כל חפיפת אותות הניאון. התאמת התגמול יהיה תלוי סדרן FACS בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת שערים העיקרי מבוסס על DAPI להוציא תאים מתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את עלילת הפיזור (SSC-A vs-A FSC) כדי לבחור לאירועי גופייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת FSC וגובה SSC ופרמטרים רוחב לחסל עבור כפילויות ולהפלות לאירועים גופיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי שער עם α6 גבוה והבעה β1 ומתוך אוכלוסייה זו תאי שער גם עם CD34 ביטוי גבוה או ביטוי גבוה Sca1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מיין לתוך צינור FACS מראש שכותרתו. הערה: שתי אוכלוסיות של תאים יכול להיות מבודד; α6 + / β1 + / CD34 + / SCA-1 - ו α6 + / β1 + / SCA-1 + / CD34 -. תאים ממוינים צריכים להישמר על קרח בכל העת עד שהם משמשים ביישומים במורד כגון תרבית תאים או בידוד RNA </li></ol>

<ol>
	<li>Wagers, A. J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+adult+stem+cells.">Plasticity of adult stem cells.</a> Cell. 116, 639-648 (2004).</li><li>Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal,+multipotency,+and+the+existence+of+two+cell+populations+within+an+epithelial+stem+cell+niche.">Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche.</a> Cell. 118, 635-648 (2004).</li><li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scratching+the+surface+of+skin+development.">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445, 834-842 (2007).</li><li>Hsu, Y. C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+business:+stem+cell+progeny+join+the+niche+to+regulate+homeostasis.">A family business: stem cell progeny join the niche to regulate homeostasis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 103-114 (2012).</li><li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+homeostasis:+a+balancing+act+of+stem+cells+in+the+skin.">Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 207-217 (2009).</li><li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hair+cycle.">The hair cycle.</a> J Cell Sci. 119, 391-393 (2006).</li><li>Muller-Rover, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+guide+for+the+accurate+classification+of+murine+hair+follicles+in+distinct+hair+cycle+stages.">A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages.</a> J Invest Dermatol. 117, 3-15 (2001).</li><li>Zhang, Y. V., Cheong, J., Ciapurin, N., McDermitt, D. J., Tumbar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+self-renewal+and+differentiation+phases+in+the+niche+of+infrequently+dividing+hair+follicle+stem+cells.">Distinct self-renewal and differentiation phases in the niche of infrequently dividing hair follicle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 267-278 (2009).</li><li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+hair+follicle+bulge+contribute+to+wound+repair+but+not+to+homeostasis+of+the+epidermis.">Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis.</a> Nat Med. 11, 1351-1354 (2005).</li><li>Hsu, Y. C., Pasolli, H. A., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+between+stem+cells,+niche,+and+progeny+in+the+hair+follicle.">Dynamics between stem cells, niche, and progeny in the hair follicle.</a> Cell. 144, 92-105 (2011).</li><li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tortoise+and+the+hair:+slow-cycling+cells+in+the+stem+cell+race.">The tortoise and the hair: slow-cycling cells in the stem cell race.</a> Cell. 137, 811-819 (2009).</li><li>Plikus, M. V., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+hair+cycle+domain+patterns+and+regenerative+hair+waves+in+living+rodents.">Complex hair cycle domain patterns and regenerative hair waves in living rodents.</a> J Invest Dermatol. 128, 1071-1080 (2008).</li><li>Ito, M., Kizawa, K., Hamada, K., Cotsarelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+follicle+stem+cells+in+the+lower+bulge+form+the+secondary+germ,+a+biochemically+distinct+but+functionally+equivalent+progenitor+cell+population,+at+the+termination+of+catagen.">Hair follicle stem cells in the lower bulge form the secondary germ, a biochemically distinct but functionally equivalent progenitor cell population, at the termination of catagen.</a> Differentiation. 72, 548-557 (2004).</li><li>Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-retaining+cells+reside+in+the+bulge+area+of+pilosebaceous+unit:+implications+for+follicular+stem+cells,+hair+cycle,+and+skin+carcinogenesis.">Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis.</a> Cell. 61, 1329-1337 (1990).</li><li>Cotsarelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+stem+cells:+a+folliculocentric+view.">Epithelial stem cells: a folliculocentric view.</a> J Invest Dermatol. 126, 1459-1468 (2006).</li><li>Trempus, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+for+living+murine+keratinocytes+from+the+hair+follicle+bulge+with+the+cell+surface+marker+CD34.">Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34.</a> J Invest Dermatol. 120, 501-511 (2003).</li><li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+and+profiling+adult+hair+follicle+stem+cells.">Capturing and profiling adult hair follicle stem cells.</a> Nat Biotechnol. 22, 411-417 (2004).</li><li>Lyle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C8/144B+monoclonal+antibody+recognizes+cytokeratin+15+and+defines+the+location+of+human+hair+follicle+stem+cells.">The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells.</a> J Cell Sci. 111 (Pt 21), 3179-3188 (1998).</li><li>Liu, Y., Lyle, S., Yang, Z., Cotsarelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratin+15+promoter+targets+putative+epithelial+stem+cells+in+the+hair+follicle+bulge.">Keratin 15 promoter targets putative epithelial stem cells in the hair follicle bulge.</a> J Invest Dermatol. 121, 963-968 (2003).</li><li>Vidal, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9+is+essential+for+outer+root+sheath+differentiation+and+the+formation+of+the+hair+stem+cell+compartment.">Sox9 is essential for outer root sheath differentiation and the formation of the hair stem cell compartment.</a> Curr Biol. 15, 1340-1351 (2005).</li><li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr6+marks+stem+cells+in+the+hair+follicle+that+generate+all+cell+lineages+of+the+skin.">Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin.</a> Science. 327, 1385-1389 (2010).</li><li>Nijhof, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-surface+marker+MTS24+identifies+a+novel+population+of+follicular+keratinocytes+with+characteristics+of+progenitor+cells.">The cell-surface marker MTS24 identifies a novel population of follicular keratinocytes with characteristics of progenitor cells.</a> Development. 133, 3027-3037 (2006).</li><li>Jensen, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+population+of+clonogenic+and+multipotent+murine+follicular+keratinocytes+residing+in+the+upper+isthmus.">A distinct population of clonogenic and multipotent murine follicular keratinocytes residing in the upper isthmus.</a> J Cell Sci. 121, 609-617 (2008).</li><li>Jensen, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lrig1+expression+defines+a+distinct+multipotent+stem+cell+population+in+mammalian+epidermis.">Lrig1 expression defines a distinct multipotent stem cell population in mammalian epidermis.</a> Cell Stem Cell. 4, 427-439 (2009).</li><li>Jaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+marks+cycling,+yet+long-lived,+hair+follicle+stem+cells.">Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells.</a> Nat Genet. 40, 1291-1299 (2008).</li><li>Horsley, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blimp1+defines+a+progenitor+population+that+governs+cellular+input+to+the+sebaceous+gland.">Blimp1 defines a progenitor population that governs cellular input to the sebaceous gland.</a> Cell. 126, 597-609 (2006).</li><li>Goldstein, J., Horsley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Home+sweet+home:+skin+stem+cell+niches.">Home sweet home: skin stem cell niches.</a> Cell Mol Life Sci. 69, 2573-2582 (2012).</li><li>Fuchs, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sept4/ARTS+regulates+stem+cell+apoptosis+and+skin+regeneration.">Sept4/ARTS regulates stem cell apoptosis and skin regeneration.</a> Science. 341, 286-289 (2013).</li><li>Nowak, J. A., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+epithelial+stem+cells.">Isolation and culture of epithelial stem cells.</a> Methods Mol Biol. 482, 215-232 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to declare

הפרוטוקול המתואר כאן הוא מבוסס היטב לבידוד HFSCs מהעור הגבי של עכברים בוגרים אבל יכול להיות מיושם באופן שווה לבידוד של אוכלוסיות אחרות בתוך מבנה HF, בהתבסס על הבחירה של סמנים 2,16,23,28,29. שיטה זו היא יתרון במיוחד על פני שיטות אחרות של בידוד תא, כגון דיסוציאציה רקמות, בכ?...

תאי גזע בוגרים (גיל) הם חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס רקמות על ידי החלפת תאים מתים ותיקון רקמות שנפגעו על פציעה. גיל אלה מוגדרים על ידי היכולת שלהם לעבור התחדשות עצמית מתמדת להתמיין שושלות תאים שונות 1-3. המערכות למדו הטוב ביותר, אשר תלוי גיל מבוגר עבור החידוש שלהם, כוללות את מערכת hematopoietic, במעי 1,2,4 העור. במהלך עובר, העור מתחיל כמו שכבה אחת של תאי אפידרמיס. המורפוגנזה של זקיק השיער (HF) מתחילה כאשר תאי mesenchymal לאכלס את העור ומהווה הדרמיס collagenous בסיסי 5. מתמחה תאים mesenchymal, כי מאוחר יותר מהווים את עורי פטמית (העקורים), לארגן ישירות מתחת לשכבת האפידרמיס וממריץ האפיתל כדי ליצור placodes השיער מתחיל לצמוח כלפי מטה 6. מאוד מתרבים תאי מטריקס, ממוקם בחלק התחתון של HF,מעטפת תאי mesenchymal אלה ויוצרים את השיער הנורה, בעוד השכבה הפנימית מתחילה להתמיין גלילים קונצנטריים לגבש השערה (HS) ואת נדן השורש הפנימי שמסביב (IRS) 2,3. לאחר הינקות האפידרמיס בעור מורכב משלושה תאים: האפידרמיס interfollicular (IFE), בלוטת החלב (SG) ואת HF. בניגוד IFE ו SG אשר נמצא במצב מתמיד של הומאוסטזיס, את HF הוא איבר מיני דינמי אשר עובר מחזורים רצופים של צמיחה (anagen), הרס (קטגן) ומנוחה (telogen) 4,7. תאי גזע זקיק שיער (HFSCs) דלק כי במחזוריות בלתי פוסקת זו, הנמצאים ליד גומחה בתוך HF המכונית הבליטה 4. במהלך Anagen HFSCs לצאת הבליטה, העוקבים אחר איתות הפעלה מן העקורים, להתחיל מתרבה ויורד כלפי מטה ובכך ליצור שובל ליניארי ארוך של תאים המכונים נדן השורש החיצוני (ORS) 8-10. תאי מטריקס, כימקיפים את העקורים בבסיס של HF, מחזור במהירות ולהעביר שעברו התמיינות מסוף כלפי מעלה ובכך יצירת HS ואת 10 IRS (איור 1). משך anagen קובע את אורך השיער תלויה יכולת שגשוג והתמיינות של תאי מטריקס 6. כאשר HF נכנס קטגן, התאים מטריקס הגברה במעבר בהפסקת הנורה להתרבות, עוברים אפופטוזיס ו לסגת לחלוטין תוך משיכת העקורים כלפי מעלה עד שהוא מגיע אל החלק הלא-אופניים של 8,11 HF. במהלך הכחשה זו HF יוצרת מבנה זמני הידוע כאפיק אפיתל, אופייני קטגן, ומכילה הרבה תאים אפופטוטיים. בעכברים, קטגן נמשך בין 3-4 ימים, והוא מסונכרן מאוד במחזור השיער הראשון. כאשר HF מגיע telogen כל HFSCs להיות שקט. השלבים ברורים של מחזור HF גם מאופיינים שינויים בצבע העור העכבר של בשל מייצור elanin. השינויים העור משחור במהלך anagen כדי אפור כהה במהלך קטגן לוורוד במהלך telogen 6,7,12,13. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53931/53931fig1.jpg" /> איור 1: מחזור זקיק השיער. HF מורכב בחלקו העליון קבע וחלק שיפוץ נמוך כל הזמן, רכיבה על אופניים, אשר עוברת מחזורים רצוף של צמיחה מהירה (anagen), הרס (קטגן) ושלב קפאון קרוב משפחה או שאר (telogen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53931/53931fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גדול גרסה של נתון זה.</a> ה- SCS שמירה על HF זוהה בתחילה באמצעות ניסויי מרדף, עם thymidine tritiated, שחשפו אוכלוסייה של תאי שומרי תווית רכיבה איטית (LRC) ששכנו באזור הקבע של HF ממש מתחת SG 14. התקדמות HFSCאפיון חשף מספר קטן של סמנים כי ניתן להשתמש כדי לזהות ולבודד גיל ספציפי מן הנישה HF 15. אולי הסמן הטוב ביותר להעשרת HFSCs הוא CD34, סמן פני התא מזוהה גם כסמן SC hematopoietic בבני אדם 16. בתוך CD34 זה + אוכלוסיות שתי אוכלוסיות נפרדות גם בודדו מבוסס על integrin α6 ביטוי 2. סמן נוסף הוא קרטין 15 (K15) אשר מבוטא בכמות גבוהה באזור הבליטה, שיתוף לוקליזציה עם ביטוי CD34 ו אמרגן K15 משמש למיקוד ולבודד HFSCs בחיות מהונדסות 15,17-19. בעשור האחרון מספר אוכלוסיות נפרדות אחרות של HFSCs ו ובתאים גם דווחו להתגורר בתוך HF 17,20-27. תכונה מרגשת נוספת של HFSCs תרומתם תיקון עור. בתנאים רגילים HFSCs לחדש את HF ואינו לוקח חלק הומאוסטזיס IFE. HoweVer, בתגובה פציעה, תאים אלה לצאת נישה SC שלהם וסיוע repopulating IFE 9. אנחנו הוכחנו לאחרונה כי עכברים שנמחקו עבור תצוגת הגן הפר-אפופטוטיים Sept4 / ARTS למספר גדל והולך של CD34, K15 ו Sox9 + HFSCs, מה שמראה על התנגדות אפופטוזיס. HFSCs בודד Sept4 / ARTS - / - עורות מגבים ניצול התא מופעל קרינת מיון (FACS) והיה יותר שני גידול של פי מספר CD34 + ו- K15 + HFSCs. ARTS Sept4 / אלה - / - HFSCs הורחב במבחנה ולא הוליד רק מושב יותר אבל היו גם מסוגל לעמוד בתנאים קשים בהשוואה לקבוצת ביקורת 28. כתוצאה מכך שיש מספר גדל של HFSCs, Sept4 / ARTS - / - עכברים נרפאו מהר יותר באופן משמעותי בתגובת פציעות כריתת עור. באופן מפתיע, Sept4 / ARTS - / - עכברים displayeדה מספר רב של HFS מחדש ממיטת הפצע, וצלקות קטנות באופן משמעותי. יתר על כן, העכברים שנמחקו עבור XIAP (X-linked מעכב אפופטוזיס), ליעד ביוכימיים של ARTS, הפגינו ריפוי לקוי 28. תוצאות העבודה שלנו בצעה במעבדות אחרות הראו כי HFSCs לשמש מודל אידיאלי עבור מחקר על הביולוגיה והתפקוד של גיל מבוגר. כאן אנו מתארים את המתודולוגיה של העשרה ובידוד של HFSCs ו קרטינוציטים אפידרמיס מבוסס על הביטוי של ארבעה סמנים: α6 integrin; β1 integrin; SCA-1 (סמן קרטינוציטים אפידרמיס) ו CD34. בידוד דומה K15 + HFSCs יכול גם להתבצע באמצעות עכבר כתב K15-GFP 19.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane&amp;nbsp;</td><td>Primal Critical Care</td><td>&amp;nbsp;66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>Carbon dioxide</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Electro Shaver</td><td>Oster&amp;nbsp;</td><td>Golden A5</td><td>Shaver from any other company could be used</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Gadot Lab</td><td>830000051</td><td>96% ehtanol diluted with distilled water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dissection mat</td><td></td><td></td><td>Dissection tools from any provider can be used</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>11251-10</td><td>Foreceps from any other company could be used</td></tr><tr><td>Scissors&amp;nbsp;</td><td>Dumont</td><td>14094-11</td><td>Scissors from any other company could be used</td></tr><tr><td>Needles/Pins</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Albion</td><td>10</td><td>Ensure that the scalpel has a blunt end</td></tr><tr><td>Tissue culture dish 60 mm x 15 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430166</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>-</td><td></td><td>In house PBS without Calcium and Magnesium</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-050-1A</td><td>Trypsin obtained from a different company might have a different activity and duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly</td></tr><tr><td>Pipettes 10 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning, 4488</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>50 ml sterile centrifuge tubes</td><td>Minplast Ein-shemer</td><td>35050-43</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m Cell strainer</td><td>Fisher</td><td>22362548</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m Cell strainer</td><td>Fisher</td><td>22362549</td><td></td></tr><tr><td>Staining buffer</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf 5804 R</td><td>5805 000.017</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes with Cell strainer caps&amp;nbsp;</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes&amp;nbsp;</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Integrin &amp;beta;1</td><td>eBioscience</td><td>25-0291</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Integrin &amp;alpha;6</td><td>eBioscience</td><td>15-0495</td><td>1:600</td></tr><tr><td>Sca I</td><td>eBioscience</td><td>11-5981</td><td>1:200</td></tr><tr><td>CD34</td><td>eBioscience</td><td>9011-0349</td><td>1:300</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>Dry Chelex</td><td>BioRad</td><td>142-2842</td><td></td></tr><tr><td>Beaker&amp;nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Stir bar</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>NHCl</td><td>BioLab</td><td>1903059</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Beit Haemek Biological Industries</td><td>400718</td><td>FBS obtained from a different company can be used</td></tr><tr><td>1 L glass bottle</td><td>Ilmabor</td><td>Boro 3.3</td><td></td></tr><tr><td>Bottle top filter</td><td>Autofil</td><td>1102-RLS</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating hair follicle stem cells and epidermal keratinocytes from dorsal mouse skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את ההעשרה ובידוד של שני סוגים של אוכלוסיות:. בליטת SCS ו קרטינוציטים אפידרמיס איור 2 מדגימים את השלבים העיקריים של הפרוטוקול. ניצול העור הוסר הגבי האחורי של עכברים בן 8 שבוע, אנו מועשרים גיל בליטה באמצעות סמן CD34, אשר באה...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin at JoVE.com

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

בידוד תאי גזע זקיק שיער עוריות קרטינוציטים מן עור עכבר הגבה

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

isolating-hair-follicle-stem-cells-epidermal-keratinocytes-from

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

20.9K Views.  Technion Israel Institute of Technology. An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

Video: Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast physiology and pathology underlie a spectrum of clinical entities, including fibroses in multiple organs, hypertrophic scarring following burns, loss of cardiac function following ischemia, and the formation of cancer stroma. However, fibroblasts remain a poorly characterized type of cell, largely due to their inherent heterogeneity. Existing methods for the isolation of fibroblasts require time in cell culture that profoundly influences cell phenotype and behavior. Consequently, many studies investigating fibroblast biology rely upon in vitro manipulation and do not accurately capture fibroblast behavior in vivo. To overcome this problem, we developed a FACS-based protocol for the isolation of fibroblasts from the dorsal skin of adult mice that does not require cell culture, thereby preserving the physiologic transcriptional and proteomic profile of each cell. Our strategy allows for exclusion of non-mesenchymal lineages via a lineage negative gate (Lin-) rather than a positive selection strategy to avoid pre-selection or enrichment of a subpopulation of fibroblasts expressing specific surface markers and be as inclusive as possible across this heterogeneous cell type.

Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.

עכברי Dermal פיברובלסטים בידוד על ידי FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

עכבר עוריות עצבית קרסט לתאי גזע (EPI-NCSC) תרבויות

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Biology

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

בידוד וכתמים של העור העכבר Keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

בידוד, תרבית ואפיון של תאי שוואן ראשוניים, קרטינוציטים ופיברובלסטים מעורלה אנושית

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Neuroscience

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

בידוד של העכבר Keratinocytes באפידרמיס ושלהם בתרבות הclonogenic של מבחנה

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

בידוד ותרבות של קרטינוציטים אוראליים ראשוניים מחך העכבר למבוגרים

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...