This work was funded in part by NIH R01 #DE021475 to CTM and an NSF Graduate Research Fellowship to NAE. Thanks to Miles Johnson for assistance with imaging and Priscilla Erickson for critical reading of the manuscript.

כל העבודה דגים אושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש מאוניברסיטת קליפורניה-ברקלי (מספר פרוטוקול R330). המתת חסד בוצעה באמצעות טבילה 0.025% Tricaine-S שנאגרו עם 0.1% נתרן ביקרבונט 39. כל השלבים מבוצעים בטמפרטורת החדר. 1. הכנה הערה: בצע את פעולות 1.1-1.5 צינורות חרוטים או צלוחיות נצנץ שיכול לאטום בחוזקה להיות מונח אופקי. דגים לא צריכים להיות מזועזע כל הזמן, אבל מנסה לערבב הפתרון לעתים קרובות ככל האפשר על ידי היפוך בעדינות או טלטול מתלה של צינורות או צלוחיות לחשוף את כל הצדדים של הדג לפתרון מכתים ולאפשר כתם לחדור לרקמה שווה. אל תניחו קבוצה גדולה של דגים על שייקר פלטפורמה, כמו המשקל הכבד של הנוזל ישבור שייקר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן או דג טרי מורדם או דגים מאוחסן אתנול עם 10% Neutral שנאגר פורמלין (NBF) הלילה. לחלופין, להשתמש 4% paraformאלדהיד בתמיסה 1x PBS במקום 10% NBF. הערה: אם להפיק ממנה DNA, קליפ חלק קטן של סנפירי זנב או חזה לפני הקיבוע ולאחסן באתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך לתקן כראוי במנדף כימי ולהחליף עם מי ברז (כלומר ~ pH 7.0) עבור 2 שעות. הימנע משימוש במי דה מיונן כפי שקרה לעתים קרובות יכול להיות חומצי יכול decalcify עצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר מים ודגי כתם עם 0.008% Alizarin האדום S ב 1% KOH במים למשך 24 שעות. עבור דגים פחות מ -20 מ&quot;מ אורך סטנדרטי, השתמש 0.004% Alizarin האדום ס (ערוך 100x (פתרון מניות 0.8%) של Alizarin האדום S אז מה שיכול להיות מדולל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כתם (הצבת מיכל פסולת המתאים במנדף) ודגים המקום במי ברז למשך מספר שעות. שינוי מים לפי הצורך עד לשטוף במים הוא בעיקר ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור דגי מים ומקום לתוך 50% גליצרול, 0.25% KOH לסליקה עדינה לנתיחה שלאחר מכן. הערה: פרוטוקול מכתים זה שונה מן השיטות שתוארו קודם לכן 40,41. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Dissection הערה: ראה איור 1 עבור סקירה של מורפולוגיה שלד ראש רלוונטי. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig1.jpg" /> איור 1:. קוצן ראש מורפולוגיה שלד Alizarin האדום מוכתם ראש קוצן threespine צלם עם קרינה תחת סט מסנן rhodamine B. מורפולוגיה שימושיים מתויג: אופ = opercle, Subop = subopercle, BSRs = branchiostegal קרני, Preop = preopercle, Infraorb 1-3 = 1-3 infraorbital (circumorbitals המכונה גם או suborbitals), דנט = dentary, Premax = premaxilla, מקס = maxilla נאס, = אף, לאט. ethm = לרוחב כִּברָתִי, Psph = parasphenoid, Fron = העצם הפרונטלית. לתיאור מפורט יותר של השלד ראש קוצן, לראות אנקר (1974) 31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של</a>נתון זה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הדג השטוח (איור 2 א) וכנס המלקחיים של השען # 5 חד לתוך הצד של העין בזווית של 45 מעלות ~ לנקב את הקרום המכסה את העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקלף את הקרום הרחק מן העין, דומה לקליפת מכסת יוגורט (איור 2 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מלקחיים פתוחים מאחורי העין, לאחוז את עצב הראייה מאחורי העין, ולהסיר את העין (איור 2 ג). אין לנקב את העין כפי שהוא ידלוף מלנין. אם ניקב, מלנין ניתן נשטף במהלך השלבים מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על צד שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל האחורי, למקום להב מספריים לנתח קטן אחד תחת כנף opercle, להב מספריים גרור dorsally מעל opercle, ואז לחתוך רקמות רכות ועד ארובת העין (איור 2 ד). חותכים הגבו עד עצם opercle. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את העצם הפרונטלית (גב אל ארובת העין) (איור 2E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את העצם parasphenoid קו האמצע סביב tהוא המרכז של ארובת העין (איור 2F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך opercle חוזר על הצד שכנגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מלקחיים תחת opercle ולאט לאט לקלף את הפנים מהגוף, זמירה כל רקמות רכות עדיין מחוברות (2G איור - H). שים לב שלא לשבש את השורה הראשונה של rakers זימים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים, לנתק את ceratohyals משני הצדדים מן basihyal קו האמצע תוך קילוף והסרה של שלד craniofacial קדמית (הלסת כולה כולל dentary, premaxilla, ו maxilla; השלד hyoid כולו כולל opercle עורי החיצוני, preopercle, subopercle, ו קרן branchiostegal ואת הגב שבבסיס ואלמנטי endochondral גחון; והחלק הקדמי של הגולגולת כולל האף, כִּברָתִי לרוחב, ועצמות infraorbital, ראה איורים 1 ו 2I). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוצי אגן יכולים להיות מקופלים החוצה מהגוף, ויכולים לשמש כידית עבור מלקחיים לאחוז of כאשר ההווה. שדרות ננעלו במקומו. כדי לבטל את הנעילה, משוך בעדינות את עמוד שדרה עם מלקחיים ישירות מגוף דגים, אז בעדינות לכופף בדיעבד ללחוץ עמוד שדרה שטוחה נגד דגים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכניסו נסגר מלקחיים אחוריים גחון לשלד branchial (ממש מתחת צינור מעיים) ו מלקחיים גרורים קדמי, מתגרים לגזרים את השרירים ורצועות הנותרים המקובעים לשלד branchial (האיור 2J - K). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קצות מלקחיים סגורים, לגרד ממנו את שרירי הצמדת השלד הגבה branchial אל braincase הגחון בתוך אחורי לכיוון קדמי (האיור 2L). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 2.9 ו 2.10 על הצד שכנגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחוז בבסיס צינור המעיים ולמשוך anteriorly להסיר את הצינור שלד ובמעיים branchial (איור 2M - N). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את צינור המעיים על ידי יצירת האחורי חתך בניצב סוף ceratobranchial החמישי (איור 2 טו </strong&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת כל שברי עצמות שנותרו מן braincase בצד הגבי של שלד branchial, הכנס מספריים לתוך סל branchial לעשות חתך הגבה (חיתוך קדמי אל אחורי) בין הסטים הבילטרליים של צלחות שן הגבה (איור 3 א - ד). ודא לחתוך מרוכז כדי למנוע נזק לוחות השן הגבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות שני חתכים לרוחב רדודים לומן המעי גומי בקצה האחורי של השלד branchial (הקצה הקדמי של צינור המעיים) כדי לסייע עם פתיחת שלד branchial (איור 3E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח דגים וכל פיסות הרקמה לתוך צנצנת והניח שלד branchial לתוך צינור microcentrifuge עם גליצרול 50%, 0.25% KOH להמשיך סליקה עדינה, או גליצרול 100% אם לא סליקה נוספת נדרשת. צנצנות וצינורות תווית עם מזהה ייחודי, כך שניתן יהיה לעקוב. סכום סליקה הנדרש הוא בעיקר פונקציה של הגודל של הדגים, דגים בוגרים גדולים (מעל 40 מ &#39;מ &#39;אורך סטנדרטי) בדרך כלל לחייב סליקה נוספת. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig2.jpg" /> איור 2:. לנתיחת שלד branchial קוצן Alizarin האדום מוכתם דגי קוצן threespine מוכנים לנתיחה. עין depigmented מ סליקה נרחבת. חצים כחולים מציינים את כיוון התנועה. (א) להציג לרוחב של ראש קוצן, הקדמי הוא בצד ימין. (ב) הסרת קרום המכסה את העין. (ג) הסרת העין. (ד) הגבה לחתוך מעל opercle. (E) לחתוך עצם פרונטאלית. (F) Parasphenoid לחתוך. (G - אני) הסרת שלד הפנים. (J) הסרת חיבורי רקמות רכות שלד branchial גחון. (K - L) הסרת חיבורי שלד הגבה branchial. (&lt;strong&gt; M - N) הסרת שלד branchial. (O) הפרד את צינור המעיים מן השלד branchial. עיין בשלבים 2.1 דרך 2.16 לפרטים נוספים. סרגל קנה מידה = 5 מ&quot;מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 3. שלד branchial מחדש מכתים (במידת הצורך) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכתים את כהה שלד branchial או רקמות ברורות יותר, להסיר גליצרול 50%, פתרון KOH 0.25% ולשטוף עם 1% KOH פעמים (לשטוף אחד חמש דקות ואחריו לשטוף את שני 24 שעות תוך רעד אופקי על שייקר פלטפורמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר 1% KOH מחדש כתם עם 0.008% Alizarin האדום S ב KOH 1% למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כתם ולהחליף עם KOH 1% למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון KOH ולהחליף עם 50% גליצרול, 0.25% KOH. </li></ol> 4. הרכבת branchial שלד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שלד branchialמ גליצרול 50%, 0.25% KOH או 100% גליצרול מקום קרוב לתחתית של תלוש כיסוי זכוכית 22 מ&quot;מ x 60 מ&quot;מ עם הצד הגבי פונה כלפי מעלה (איור 3F). הוסף כמה טיפות של גליצרול 50%, 0.25% KOH או 100% גליצרול על גבי שלד branchial. אם מעבר מ 50% גליצרול, 0.25% KOH ל -100% גליצרול, פתרון שינוי בצינור microcentrifuge ולנער עבור&gt; 5 דקות לפני הרכבה לאזן רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרדדי שני כדורים קטנים של פלסטלינה ומניח על קצוות של להחליק את המכסה לפעול כמו מפרידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רופף במקום coverslip שני על גבי בלחץ חזק מספיק כדי לשטח את שלד branchial הקדמי (האיור 3G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיל לפתוח את דש הגבי עזב כולל צלחות שן מגבות, לרדד, וחלק בין coverslips (האיור 3H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טכניקה חזור עם דש הגבי תקין ולדחוף השלד כולו branchial מהקצה של coverslip (איור 3I). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנותבאופן מקורי, להחזיק דשי הגבי של חלל פתוח עם מלקחיים ובזהירות מקום coverslip על, משטח את שלד branchial בתנועה אחת חלקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, הר השלד branchial הפוך על תלוש לכסות אחד, מפשק אותן למעלה ולמטה בכל צד הגב החוצה רוחבית כך כוח המשיכה אינו מאפשר השלד branchial לסגור לגבות. ואז לכסות עם תלוש כיסוי הזכוכית שני 22 מ&quot;מ x 60 מ&quot;מ ו להפוך הכנה. הערה: טכניקות הרכבה שונות נוהגות לעבוד טוב יותר או גרוע יותר עבור כל אדם. נסה כל ולראות מה מרגיש הכי נוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ קל על coverslip העליון לשטח כדורי חימר מספיק כדי לשמור על שלד branchial הרכוב שטוח, אך היזהרו שלא למחוץ את הדגימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תהליך ההרכבה, ceratobranchials יכול לסובב לטשטש שורה של rakers. תרופה זו על ידי הזזה מלקחיים בין coverslips מחדש המכוונת את ceratobranchials או שלד branchial כולו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות preps שטוחה במגשי שקופית roטמפרטורת אום. רכוב גליצרול 100%, ניתן לאחסן preps בין coverslips לגשר במשך עשור לפחות. מלקחיים ומספריים נקיים עם isopropanol או אתנול וטיפי כיסוי. </li></ol><img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig3.jpg" /> איור 3:. שטוח הרכבת שלד branchial המניפולציה ואת ההרכבה של שלד branchial מוצג. חצים כחולים מציינים את כיוון התנועה. (א) branchial הגבה שלד למעלה בצד. (B - D) סיבוב חתך בין לוחות שן הגבה. (E), קיצוץ רוחבי ברקמות רכות להמשיך לפתוח את הבסיס של צינור הבטן. (F) שלד branchial ממוקם בחלק התחתון של coverslip מוכן גובר. (G) coverslip השנייה מונחת על החצי הקדמי של שלד branchial (מעל צלחות שן מגבות). (H - I)הרכבה שטוחה של שלד branchial ידי דשי צלחת שן הגבה פתיחת זזה בין שני תלושים לכסות. עיין בשלבים 4.1 עד 4.6 לפרטים נוספים. סרגל קנה מידה = 5 מ&quot;מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<ol>
	<li>Cooper, W. J., Westneat, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form+and+function+of+damselfish+skulls:+rapid+and+repeated+evolution+into+a+limited+number+of+trophic+niches.">Form and function of damselfish skulls: rapid and repeated evolution into a limited number of trophic niches.</a> BMC Evol. Biol. 9 (24), (2009).</li><li>Albertson, R. C., Kocher, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+developmental+basis+of+cichlid+trophic+diversity.">Genetic and developmental basis of cichlid trophic diversity.</a> Heredity. 97 (3), 211-221 (2006).</li><li>Martin, C. H., Wainwright, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+novelty+is+linked+to+exceptional+rates+of+morphological+diversification+in+two+adaptive+radiations+of+cyprinodon+pupfish.">Trophic novelty is linked to exceptional rates of morphological diversification in two adaptive radiations of cyprinodon pupfish.</a> Evolution. 65 (8), 2197-2212 (2011).</li><li>Wainwright, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+pharyngognathy:+A+phylogenetic+and+functional+appraisal+of+the+pharyngeal+jaw+key+innovation+in+labroid+fishes+and+beyond.">The evolution of pharyngognathy: A phylogenetic and functional appraisal of the pharyngeal jaw key innovation in labroid fishes and beyond.</a> Syst. Biol. 61 (6), 1001-1027 (2012).</li><li>Sibbing, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+capture+and+oral+processing.">Food capture and oral processing.</a> Cyprinid Fishes. , 377-412 (1991).</li><li>Bell, M., Foster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , (1994).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+development+of+facial+bone+morphology+in+threespine+sticklebacks.">Evolution and development of facial bone morphology in threespine sticklebacks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (16), 5791-5796 (2005).</li><li>Mcgee, M. D., Wainwright, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+as+a+generator+of+phenotypic+diversity+in+threespine+stickleback.">Convergent evolution as a generator of phenotypic diversity in threespine stickleback.</a> Evolution. 67 (4), 1204-1208 (2013).</li><li>McGee, M. D., Schluter, D., Wainwright, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+basis+of+ecological+divergence+in+sympatric+stickleback.">Functional basis of ecological divergence in sympatric stickleback.</a> BMC Evol. Biol. 13, 277 (2013).</li><li>McGuigan, K., Nishimura, N., Currey, M., Hurwit, D., Cresko, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+genetic+variation+in+static+allometry+in+the+threespine+stickleback.">Quantitative genetic variation in static allometry in the threespine stickleback.</a> Integr. Comp. Biol. 50 (6), 1067-1080 (2010).</li><li>Caldecutt, W. J., Bell, M. A., Buckland-Nicks, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+and+geographic+variation+in+dentition+of+threespine+stickleback,+Gasterosteus+aculeatus.">Sexual dimorphism and geographic variation in dentition of threespine stickleback, Gasterosteus aculeatus.</a> Copeia. 2001 (4), 936-944 (2001).</li><li>Berner, D., Moser, D., Roesti, M., Buescher, H., Salzburger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+architecture+of+skeletal+evolution+in+european+lake+and+stream+stickleback.">Genetic architecture of skeletal evolution in european lake and stream stickleback.</a> Evolution. 68 (6), 1792-1805 (2014).</li><li>Jamniczky, H. a., Barry, T. N., Rogers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eco-evo-devo+in+the+study+of+adaptive+divergence:+examples+from+threespine+stickleback+(Gasterosteus+aculeatus).">Eco-evo-devo in the study of adaptive divergence: examples from threespine stickleback (Gasterosteus aculeatus).</a> Integr. Comp. Biol. 55 (1), 166-178 (2015).</li><li>Magnuson, J., Heitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gill+raker+apparatus+and+food+selectivity+among+mackerels,+tunas,+and+dolphins.">Gill raker apparatus and food selectivity among mackerels, tunas, and dolphins.</a> Fish. Bull. 69 (2), 361-370 (1971).</li><li>Kahilainen, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+gill+raker+number+variability+in+adaptive+radiation+of+coregonid+fish.">The role of gill raker number variability in adaptive radiation of coregonid fish.</a> Evol. Ecol. 25 (3), 573-588 (2011).</li><li>Arnegard, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+ecological+divergence+during+speciation.">Genetics of ecological divergence during speciation.</a> Nature. 511 (7509), 307-311 (2014).</li><li>Gross, H. P., Anderson, J. M., Gross, H. P., Anderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+variation+in+the+gillrakers+and+diet+of+European+threespine+sticklebacks,+Gasterosteus+aculeatus.">Geographic variation in the gillrakers and diet of European threespine sticklebacks, Gasterosteus aculeatus.</a> Copeia. 1984 (1), 87-97 (1984).</li><li>Hagen, D., Gilbertson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+variation+and+environmental+selection+in+Gasterosteus+aculeatus+L+in+the+Pacific+Northwest,+America.">Geographic variation and environmental selection in Gasterosteus aculeatus L in the Pacific Northwest, America.</a> Evolution. 26 (1), 32-51 (1972).</li><li>McPhail, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecology+and+evolution+of+sympatric+sticklebacks+(Gasterosteus):+morphological+and+genetic+evidence+for+a+species+pair+in+Enos+Lake,+British+Columbia.">Ecology and evolution of sympatric sticklebacks (Gasterosteus): morphological and genetic evidence for a species pair in Enos Lake, British Columbia.</a> Can. J. Zool. 62 (7), 1402-1408 (1984).</li><li>Schluter, D., McPhail, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+character+displacement+and+speciation+in+sticklebacks.">Ecological character displacement and speciation in sticklebacks.</a> Am. Nat. 140 (1), 85-108 (1992).</li><li>Robinson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trade+offs+in+Habitat-specific+foraging+efficiency+and+the+nascent+adaptive+divergence+of+sticklebacks+in+lakes.">Trade offs in Habitat-specific foraging efficiency and the nascent adaptive divergence of sticklebacks in lakes.</a> Behaviour. 137 (7), 865-888 (2000).</li><li>Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+developmental+genetic+features+underlie+stickleback+gill+raker+evolution.">Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution.</a> Evodevo. 5 (1), (2014).</li><li>Miller, C. T., Glazer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+skeletal+evolution+in+sticklebacks+is+controlled+by+additive+and+clustered+quantitative+trait+loci.">Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait loci.</a> Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).</li><li>Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+assembly+improvement+and+mapping+convergently+evolved+skeletal+traits+in+sticklebacks+with+Genotyping-by-Sequencing.">Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing.</a> G3. 5, 1463-1472 (2015).</li><li>Wainwright, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+pharyngeal+jaw+apparatus.">Functional morphology of the pharyngeal jaw apparatus.</a> Fish Physiol. Fish Biomech. , 77-102 (2006).</li><li>Hulsey, C. D., Fraser, G. J., Streelman, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+development+of+complex+biomechanical+systems:+300+million+years+of+fish+jaws.">Evolution and development of complex biomechanical systems: 300 million years of fish jaws.</a> Zebrafish. 2 (4), 243-257 (2005).</li><li>Lauder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+design+and+evolution+of+the+pharyngeal+jaw+apparatus+in+euteleostean+fishes.">Functional design and evolution of the pharyngeal jaw apparatus in euteleostean fishes.</a> Zool. J. Linn. Soc. 77, 1-38 (1983).</li><li>Fraser, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancient+gene+network+is+co-opted+for+teeth+on+old+and+new+jaws.">An ancient gene network is co-opted for teeth on old and new jaws.</a> PLoS Biol. 7 (2), e1000031 (2009).</li><li>Stock, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+dentition+in+comparative+context.">Zebrafish dentition in comparative context.</a> J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 523-549 (2007).</li><li>Liem, K., Greenwood, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+approach+to+the+phylogeny+of+the+pharyngognath+teleosts.">A functional approach to the phylogeny of the pharyngognath teleosts.</a> Am. Zool. 21 (1), 83-101 (1981).</li><li>Anker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+kinetics+of+the+head+of+the+stickleback,+Gasterosteus+aculeatus.">Morphology and kinetics of the head of the stickleback, Gasterosteus aculeatus.</a> Trans. Zool. Soc. London. 32 (5), 311-416 (1974).</li><li>Meyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometrics+and+allometry+in+the+trophically+polymorphic+cichlid+fish,+Cichlusomu+citrinelfum:+Alternative+adaptations+and+ontogenetic+changes+in+shape.">Morphometrics and allometry in the trophically polymorphic cichlid fish, Cichlusomu citrinelfum: Alternative adaptations and ontogenetic changes in shape.</a> J. Zool., Lond. 221, 237-260 (1990).</li><li>Huysseune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+plasticity+in+the+lower+pharyngeal+jaw+dentition+of+Astatoreochromis+alluaudi+(Teleostei:+Cichlidae).">Phenotypic plasticity in the lower pharyngeal jaw dentition of Astatoreochromis alluaudi (Teleostei: Cichlidae).</a> Arch. Oral Biol. 40 (11), 1005-1014 (1995).</li><li>Muschick, M., Indermaur, A., Salzburger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+Evolution+within+an+adaptive+radiation+of+cichlid+fishes.">Convergent Evolution within an adaptive radiation of cichlid fishes.</a> Curr. Biol. 22 (24), 2362-2368 (2012).</li><li>Cleves, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolved+tooth+gain+in+sticklebacks+is+associated+with+a+cis-regulatory+allele+of+Bmp6.">Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).</li><li>Ellis, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+developmental+and+genetic+mechanisms+underlie+convergently+evolved+tooth+gain+in+sticklebacks.">Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks.</a> Development. (142), 2442-2451 (2015).</li><li>Tucker, A. S., Fraser, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+developmental+diversity+of+tooth+regeneration.">Evolution and developmental diversity of tooth regeneration.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 25-26, 71-80 (2014).</li><li>Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+developmentally+temporal+quantitative+trait+loci+underlie+convergent+evolution+of+increased+branchial+bone+length+in+sticklebacks.">Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks.</a> Proc. R. Soc. B. 281, (2014).</li><li>Leary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , (2013).</li><li>Bell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+phenetics+and+genetics.">Evolutionary phenetics and genetics.</a> Evol. Genet. Fishes. , 431-528 (1984).</li><li>Taylor, W. R., Van Dyke, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+procedures+for+staining+and+clearing+small+fishes+and+other+vertebrates+for+bone+and+cartilage+study.">Revised procedures for staining and clearing small fishes and other vertebrates for bone and cartilage study.</a> Cybium. 9 (2), 107-119 (1985).</li><li>Erickson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+190+base+pair,+TGF-&#946;+responsive+tooth+and+fin+enhancer+is+required+for+stickleback+Bmp6+expression.">A 190 base pair, TGF-&#946; responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression.</a> Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).</li><li>Miller, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis-Regulatory+changes+in+Kit+ligand+expression+and+parallel+evolution+of+pigmentation+in+sticklebacks+and+humans.">cis-Regulatory changes in Kit ligand expression and parallel evolution of pigmentation in sticklebacks and humans.</a> Cell. 131 (6), 1179-1189 (2007).</li><li>Aigler, S. R., Jandzik, D., Hatta, K., Uesugi, K., Stock, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+constraint+underlie+irreversibility+of+tooth+loss+in+cypriniform+fishes.">Selection and constraint underlie irreversibility of tooth loss in cypriniform fishes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (21), 7707-7712 (2014).</li><li>Pasco-Viel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+trends+of+the+pharyngeal+dentition+in+Cypriniformes+(Actinopterygii+Ostariophysi).">Evolutionary trends of the pharyngeal dentition in Cypriniformes (Actinopterygii Ostariophysi).</a> PLoS One. 5 (6), e11293 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

The branchial skeleton is a complex set of bones in the throat of a fish that manipulates, filters, and masticates food items on their way to the esophagus. Many interesting trophic traits including the patterning of gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones vary across and within species. The majority of these traits are difficult to near impossible to accurately measure with the branchial skeleton in situ (e.g., gill raker length, branchial bone length). This flat-mounting protocol places all...

סכום מדהים של מגוון קיים בשלד הראש בין חוליות, במיוחד בקרב דגים. במקרים רבים המגוון הזה הופך לפשוט אסטרטגיות האכלה שונות 1 - 4, והוא יכול לכלול שינויים משמעותיים הוא דפוסי craniofacial חיצוניים ופנימיים. שלד branchial ממוקם באופן פנימי בגרון של דג והמקיף ביותר של חלל buccal. שלד branchial מורכב 5 מקטעים הומולוגיים סדר, הקדמיים וארבעת מהם לתמוך הזימים. יחד חמישה קטעים אלה כממשק בין דגים ופירות שלהם 5. וריאצית שפע של תכונות כולל rakers זימים, שיני בלוע, ועצמות branchial לתרום ליקוט יעיל על סוגים שונים של מזון. הקוצנים עברו קרינה אדפטיבית לאחר צורות אושיאניק האבות יישבו אגמי מים מתוקים ונחלים ברחבי חצי הכדור הצפוני. המעבר בתזונהמ זואופלנקטון קטן באוקיינוס ​​כדי טרף גדול במים מתוקים הביא וריאציה trophic דרמטית תכונות כמה craniofacial 6. בעוד מחקרים רבים התמקדו על הבדלי craniofacial חיצוניים הקוצנים 7 - 13, שינויי craniofacial חשובים להתפתח שוב ושוב בשלד branchial הפנימי. היכולת ליצור כלאיים פורים בין אוכלוסיות קוצן ברורות מורפולוגית מספקת הזדמנות מצוינת כדי למפות את הבסיס הגנטי של שינויים התפתחו עד שלד branchial. תכונה אחת trophic של משמעות אקולוגית היא הדפוסים של rakers זימים, עצמות עורי תקופתיות המרפדות את פניהם הקדמיים וגם אחוריים של עצמות branchial ומשמשים לסנן פריטים טרפים. דגים כי בדרך כלל ניזונים טרף קטנים נוטים להיות יותר ויותר בצפיפות הזימים במרווחים rakers לעומת דגים הניזונים טרף גדול יותר 14,15. וריאציה rakers הזימים דווחה הן within ובין מיני 14-19, והיבטים של דפוסי מגרפות זימים לתרום נישות trophic וכושר 16. עשרות שנים של מחקר תיעדו בהרחבה מספר זיז הזים וריאציה בהרחבה הקוצנים threespine 17 - 21; עם זאת, מחקרים אלה מתמקדים בדרך כלל בשורה הראשונה של rakers זימים. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח מודולריות בבקרה הגנטית של מספר מגרפות זימים פני שלד branchial 22,23 ועל פני שורה אחת מגרפות זימים ריווח 23 ואורך 24 המדגיש את החשיבות של לימוד יותר משורה אחת או מגרפות זימים אחת להבין את בסיס גנטי ההתפתחותי של הפחתת מגרפות זימים. אחת מתכונותיהן trophic שניות של שניהם המשמעות האקולוגית ביו הן הדפוסים של שיניים בלועות. שיני דגים יכולות להיות ממוקמות בשני הלסת האוראלית בשלד branchial, המכונות שיני בלוע. שיני Oral משמשות בעיקר עמ &#39;rey ללכוד בשיניים בלוע משמשים מניפולציה לעיסה וטרף 25 - 27. שתי הסדרות יוצרים באמצעות מנגנונים התפתחותיים משותף ונחשבים מבחינה התפתחותית הומולוגיים 28. מודולריות מעניין מתרחש תוך שלחלק מינים, כגון דג זברה, שיני בלוע פה ועל גב חוסר 29 בעוד מינים אחרים ceratobranchials מספר שיניים, pharyngobranchials, ולפעמים שיני basihyal ו hypobranchials 30. בשנת הקוצנים, שיניים בלוע נמצאים ventrally על ceratobranchial ו dorsally החמישי על הקדמי וגם האחורי pharyngobranchials 31. קינמטיקה על האכלת קוצן להראות הלסת האוראלית משמשת בעיקר עבור לכידת טרף והקלת האכלת יניקת 9 עוזב לעיסה ללסת הבלוע. בשנת ציקלידים, מורפולוגיה הלסת בלוע התחתון משתנה באופן דרמטי 32,33 ו הוכח להיות אדפטיבית בקורלציה עם נישה trophic 34. רַבאוכלוסיות קוצן מים מתוקים ple התפתחו מגדילה דרמטית במספר שן בלוע גחון 23,35,36. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי הבסיס הגנטי ההתפתחותי של רווח השן התפתח זה הנו ייחודי, בעיקר בשתי אוכלוסיות נגזרות עצמאי של הקוצנים מים מתוקים 36. בניגוד שיניים יונקים, דגים להתחדש שיניהם ברציפות לאורך החיים הבוגרים 37. שתי אוכלוסיות מים מתוקות שיניים גבוהות שתוארו לעיל אלה התפתחו בקצב החלפת שן מואץ, ובכך יוצרים מערכת החולייתנים נדירה לחקר הבסיס הגנטי של התחדשות 36. אחת מתכונותיהן trophic שלישי התפתח שוב ושוב הקוצנים מים מתוקים ארוכה עצמות epibranchial ו ceratobranchial, את homologs קשת המגזרי branchial של הלסת העליונה והתחתונה, בהתאמה 38. עצמות branchial ארוכות להעניק חלל buccal גדול וסבירות הם אדפטיבית על שאפשרו פריטי טרף גדולים להיות גonsumed. יתר על כן, בדגים אחרים, עצמות epibranchial חשובות לדיכאון של צלחות שן בלוע הגבה 25. כמו זיז זים ושיני בלוע, עצמות branchial הן פנימיות ולכן, קשה לדמיין או לכמת בקלות. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לנתח שטוח הר שלד branchial, המאפשרים הדמיה קלה וכימות של מגוון תכונות craniofacial חשובים. בעוד פרוטוקול זה מתאר לנתיחת קוצן, באותה שיטה זו פועלת על מגוון רחב של דגים אחרים.

<table><tbody><tr><td>Potassium Hydroxide (KOH)</td><td>EMD</td><td>PX1480-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893-4L</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin (NBF)</td><td>Azer Scientific</td><td>NBF-4-G</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Red S</td><td>EMD</td><td>AX0485-3</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glasses 22 mm x 60 mm</td><td>VWR</td><td>16004-350</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 10 mm Glass Petri Dish</td><td>Kimble Chase</td><td>23064-10010</td><td>To dissect samples on</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>Can be poured into glass or plastic Petri dishes to make dissecting plates</td></tr><tr><td>Modeling Clay</td><td>Sargent Art</td><td>22-4000</td><td>1 lb cream</td></tr><tr><td>Scintillation Vials (case of 500)</td><td>Wheaton</td><td>986586</td><td>Borosilicate Glass with Screw Cap</td></tr><tr><td>Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip)</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td>Dumostars are an alternative</td></tr><tr><td>Dissecting Scissors&amp;nbsp;</td><td>FST</td><td>15003-08</td><td>Alternate sizes are available depending on size of sample</td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Leica</td><td>S6E with KL300 LED</td><td>Many other models work nicely, having a flat base helps</td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes 1.7 ml</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Cardboard slide tray</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and flat-mounting of the threespine stickleback branchial skeleton

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species' diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.

<html> תוצאות פרוטוקול זה שלד branchial רכוב גזור ושטוח (איור 4) שבו מגוון של תכונות תזונתיות חשובות ניתן לכמת. מתוך תפיסת גב, כל השורות של rakers זימים, כל צלחות השן בלועה, וכמעט כל עצמות branchial ניתן מדמיינים בקלות לכמת 22 - 24,35,36,38,42. Alizarin ?...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton at JoVE.com

Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton

The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.

Dissection ו-הרכבה שטוחה של שלד Threespine קוצן branchial

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology ...

dissection-flat-mounting-threespine-stickleback-branchial

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Views.  University of California, Berkeley. The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species. 

Video: Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here the robust and efficient expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of Branchiostoma lanceolatum. The development of the microinjection technique in this basal chordate will pave the way for far-reaching technical innovations in this emerging model system, including in vivo imaging and gene-specific manipulations.

ביטוי של חלבונים ניאון ב<em&gt; Lanceolatum מיתרני הראש</em&gt; על ידי הזרקת mRNA לביציות מופרה

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Developmental Biology

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller 'finite elements', FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a 'heat map' showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.

Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.

בניית מודלים אלמנטים סופיים לחקור ביומכניקה לסת דג הזברה

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Characterization Of Multi-layered Fish Scales (Atractosteus spatula) Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

The hierarchical architecture of protective biological materials such as mineralized fish scales, gastropod shells, ram&#8217;s horn, antlers, and turtle shells provides unique design principles with potentials for guiding the design of protective materials and systems in the future. Understanding the structure-property relationships for these material systems at the microscale and nanoscale where failure initiates is essential. Currently, experimental techniques such as nanoindentation, X-ray CT, and SEM provide researchers with a way to correlate the mechanical behavior with hierarchical microstructures of these material systems1-6. However, a well-defined standard procedure for specimen preparation of mineralized biomaterials is not currently available. In this study, the methods for probing spatially correlated chemical, structural, and mechanical properties of the multilayered scale of A. spatula using nanoindentation, FTIR, SEM, with energy-dispersive X-ray (EDX) microanalysis, and X-ray CT are presented.

Characterization Of Multi-layered Fish Scales Atractosteus spatula Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

This paper presents the methods used for probing spatially correlated chemical, structural, and mechanical properties of the multilayered scale of Atractosteus spatula (A. spatula) using nanoindentation, Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, scanning electron microscopy (SEM), and X-ray computed tomography (X-ray CT). The experimental results have been used to investigate the design principles of protective biological materials.

אפיון של קשקשים דגים שכבתיים Multi-(<em&gt; מרית Atractosteus</em&gt;) באמצעות Nanoindentation, רנטגן CT, FTIR, וSEM

The hierarchical architecture of protective biological materials such as mineralized fish scales, gastropod shells, ram&#8217;s horn, antlers, and turtle ...

Bioengineering

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

תמונה רציפה-הלבנה להתוות תאי שווא יחידים בצומת Neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Neuroscience

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

A 3-D Tail Explant Culture to Study Vertebrate Segmentation in Zebrafish

Vertebrate embryos pattern their major body axis as repetitive somites, the precursors of vertebrae, muscle, and skin. Somites progressively segment from the presomitic mesoderm (PSM) as the tail end of the embryo elongates posteriorly. Somites form with regular periodicity and scale in size. Zebrafish is a popular model organism as it is genetically tractable and has transparent embryos that allow for live imaging. Nevertheless, during somitogenesis, fish embryos are wrapped around a large, rounding yolk. This geometry limits live imaging of PSM tissue in zebrafish embryos, particularly at higher resolutions that require a close objective working distance. Here, we present a flattened 3-D tissue culture method for live imaging of zebrafish tail explants. Tail explants mimic intact embryos by displaying a proportional slowdown of axis elongation and shortening of rostrocaudal somite lengths. We are further able to stall axis elongation speed through explant culture. This, for the first time, enables us to untangle the chemical input of signaling gradients from the mechanistic input of axial elongation. In future studies, this method can be combined with a microfluidic setup to allow time-controlled pharmaceutical perturbations or screening of vertebrate segmentation without any drug penetration concerns.

Here, we present the protocol for 3-D tissue culture of the zebrafish posterior body axis, enabling live study of vertebrate segmentation. This explant model provides control over axis elongation, alteration of morphogen sources, and subcellular resolution tissue-level live imaging.

תרבות הסבר זנב תלת-ממדית לחקר פילוח בעלי חוליות בזברהפיש

Vertebrate embryos pattern their major body axis as repetitive somites, the precursors of vertebrae, muscle, and skin. Somites progressively segment from ...

Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a wide range of techniques encompassing ex vivo and in vitro approaches. However, most studies still rely on the analysis of two-dimensional (2D) imaging data, which limits proper evaluation of a developmental process like axial extension and somitogenesis involving highly dynamic interactions in a complex 3D space. Here we describe techniques that allow mouse live imaging acquisition, dataset processing, visualization and analysis in 3D and 4D to study the cells (e.g., neuromesodermal progenitors) involved in these developmental processes. We also provide a step-by-step protocol for optical projection tomography and whole-mount immunofluorescence microscopy in mouse embryos (from sample preparation to image acquisition) and show a pipeline that we developed to process and visualize 3D image data. We extend the use of some of these techniques and highlight specific features of different available software (e.g., Fiji/ImageJ, Drishti, Amira and Imaris) that can be used to improve our current understanding of axial extension and somite formation (e.g., 3D reconstructions). Altogether, the techniques here described emphasize the importance of 3D data visualization and analysis in developmental biology, and might help other researchers to better address 3D and 4D image data in the context of vertebrate axial extension and segmentation. Finally, the work also employs novel tools to facilitate teaching vertebrate embryonic development.

Here, we describe computational tools and methods that allow visualization and analysis of three and four-dimensional image data of mouse embryos in the context of axial elongation and segmentation, obtained by in toto optical projection tomography, and by live imaging and whole-mount immunofluorescence staining using multiphoton microscopy.

גישות הדמיה וניתוח תלת-ממדיות וארבעה מימדים לחקר התארכות צירית וסגמנטציה צירית של בעלי חוליות

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury model was developed in the adult optic tectum of zebrafish and medaka and comparative histological and molecular analyses were performed to elucidate the molecular mechanisms regulating the high regenerative capacity of this tissue across these fish species. Here a stab wound injury model is presented for the adult optic tectum using a needle and histological analyses for proliferation and differentiation of the neural stem cells (NSCs). A needle was manually inserted into the central region of the optic tectum, and then the fish were intracardially perfused, and their brains were dissected. These tissues were then cryosectioned and evaluated using immunostaining against the appropriate NSC proliferation and differentiation markers. This tectum injury model provides robust and reproducible results in both zebrafish and medaka, allowing for comparing NSC responses after injury. This method is available for small teleosts, including zebrafish, medaka, and African killifish, and enables us to compare their regenerative capacity and investigate unique molecular mechanisms.

A mechanical brain injury model in the adult zebrafish is described to investigate the molecular mechanisms regulating their high regenerative capacity. The method explains to create a stab wound injury in the optic tectum of multiple species of small fish to evaluate the regenerative responses using fluorescent immunostaining.

מודל פציעת פצע דקירה של הטקטום האופטי הבוגר באמצעות דגי זברה ומדאקה לניתוח השוואתי של יכולת התחדשות

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Dissection ו-הרכבה שטוחה של שלד Threespine קוצן branchial

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ביטוי של חלבונים ניאון ב