The authors have no acknowledgements.

כל הניסויים בבעלי החיים מבוצעים בהתאם המכונים הלאומיים הנחיות בריאות ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש מאונ&#39; טולדו. 1. phenotyping של עכברים pIL1-DsRed הערה: Offspring מופקים על ידי גידול עכברים הטרוזיגוטיים pIL1-DsRed עם wild-type (WT) עכברים C57BL6. שלושה עד ארבעה שבוע גורים ישנים נחשבים מוכנים phenotyping. דימום submandibular של עכברים כדלקמן פרוטוקול הוקם עם שינויים קלים 23. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של תאי דם לבנים מן הדם המלא של גורי עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של הפרין לכל צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכש גור אחד מהכלוב. רשום את תג הזיהוי של הגור. אין הוא הכרחי כדי להרדים גורים לפני איסוף הדם מהעורק submandibular. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק גור בעורפו צוואר לנקב את וריד submandibular ב הדואר כיס לחי באמצעות אזמל 5 מ&quot;מ. להפעיל כוח מספיק כדי ליצור לנקב קטן, כך טיפות דם להפריש מנקודת החדירה. שימוש במחט חדשה עבור כל גור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף 3 - 5 טיפות של דם לכל גור בתוך שפופרת microcentrifuge המכיל הפרין. נקה את האתר לנקב ולהפעיל לחץ כדי להקל המוסטאסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שם גור בכלוב חדש ולבחון למשך 30 דקות לפני ההחזרה לכלוב למתקן החיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם מעכברים בוגרים של פנוטיפ המכונה בקרות חיוביות ושליליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של חיץ lysing של כדוריות דם אדומות על צינור אחד, צינורות מערבולת, דגירה במשך 5 - 10 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוסיף 400 - 500 μl של בסרום שור העוברי (FBS) מתחת השעיות התא בצינור אחד. ממשק ברור ניתן להבחין בין השעית התא העליונה שכבה ו השכבה התחתונה של FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות שווים דגימות צנטריפוגות ב 1500 גרם × למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.1.7 - 1.1.9 לפרווהיס להסיר תאי דם אדומים. אל תחזור אם תמוגה מספיק בפעם הראשונה. הגלולה צריכה להיות קשה להבחין לאחר צנטריפוגה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lipopolysaccharide (LPS) גירוי והתרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 200 μl של מכון הזיכרון רוזוול פארק שלם (RPMI) בינוני 1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא זרימה cytometry צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך LPS הפתרון עובד על ידי ערבוב 10 μl של פתרון המניות LPS (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) עם 990 μl של המדיום RPMI להשלים 1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​LPS הפתרון עובד 200 μl של השעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות שווי רופפים דגירת דגימות במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנית רכישת נתונים עבור cytometry הזרימה. הגדרת תבנית רכישה לפני לדגום רכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כלי Dot-מגרש בלוח הכלי. צייר FO<html> פיזור rward (FSC) לעומת פיזור צד (SSC) העלילה. הגדר את הפרמטרים מתח FSC ו SSC כדי בקנה מידה ליניארי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את ספי הנמוך ביותר של FSC ו SSC הדבר נתמך על ידי cytometer. החל ספי 200 ו -50 עבור FSC ו SSC, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך FSC לעומת העלילה SSC, לצייר G1 השער הכולל מונוציטים, גרנולוציטים, ותאים דנדריטיים, ולא כולל פסולת, תאי דם אדומים לימפוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכלי היסטוגרמה בפלטת הכלי. צייר היסטוגרמה FL2 (ערוץ הקרינה אדום). השתמש מדגם ביקורת שלילי להגדיר את הבסיס של אותות FL2 ומדגם בקרה חיובי לצייר שער כולל את כל אירועי DsRed החיוביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוח הבקרה fluidics של cytometer, להגדיר את מצב הנוזלים כדי &quot;להפעיל&quot; ואת קצב הזרימה &quot;HI&quot; (כ 60 μl / min). רוכשת 10,000 אירועים עבור כל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע פנוטיפ גור על ידי מדידת אחוז התאים חיוביים DsRed משער G1. </li></ol></li></ol>class = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. אינדוקציה של דלקת עור של עכברים pIL1-DsRed <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים העכבר על ידי הזרקה (IP) הזרקה של קוקטייל הרדמה המכיל 100 מ&quot;ג / ק&quot;ג קטמין, 10 מ&quot;ג / xylazine ק&quot;ג, ו 1 מ&quot;ג / ק&quot;ג acepromazine. עכברים הרדימו כראוי לא מראים אחורית נסיגה כפה קמצוץ בוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל קרם להסרת שיער על פני השטח הגבי של שתי האוזניים של העכבר. מתן 30 שניות עד 1 דקות. נגב פני אוזן עם צמר גפן במים רטוב ולאפשר אוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את עובי האוזן באמצעות מיקרומטר ולהחליף עכבר בכלוב נפרד. שימו לב עד ההתאוששות מן ההרדמה (~ 15 - 30 דקות). כדי לפתור דלקת עור הנגרמת על ידי מוצר הסרת השיער, לאפשר עכבר כדי לנוח במשך 3 ימים לפני ניסויים נוספים מתבצעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1.25% (w / v) OX ידי המסת 16.7 מ&quot;ג של OX ב 1 מ&quot;ל אצטון ערבוב 750 μl של פתרון OX / אצטון עם 250 μl של שמן זית. כן פתרון רכב על ידי ערבוב 750 μl של אצטון עם 250 &amp;# 181; l של שמן זית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להרדים עכבר באמצעות זריקת ip של קוקטייל הרדמה (2.1). מדוד את עובי האוזן כמו קודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 12.5 μl של OX 1.25% על כל צד של האוזן הימנית. החל 12.5 μl של פתרון הרכב שמן אצטון / זית על כל צד של האוזן השמאלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור עכבר להיפרד-חבריהם לכלוב עד התאושש לחלוטין כדי למנוע עלבון אוזניו ידי עכברים אחרים, ואז להחליף את העכבר בכלוב המקורי ולחזור מתקן דיור בעלי חיים. הערה: הסרת השיער עלולה לגרום דלקת עור קלה הבאה על ידי שינוי של עובי אוזן. דלקת קטין זה תיפתר לאחר-מכן 3 ימים אושר על ידי עובי אוזן נורמלי. לאחר יישום מקומי למשך 24 שעות, אוזניים שטופלו OX להראות משמעותי (p &lt;0.01) נפיחות פתרון הרכב לעומת האוזניים לבד שטופלו. </li></ol> 3. תיוג של נויטרופילים עכברים pIL1-DsRed הערה: תיוג vivo של נויטרופילים ידי f במינון נמוךluorescence מצומדות מב ספציפי נויטרופילים כדלקמן פרוטוקול שפותח לאחרונה 19. זריקות רטרו-מסלולית מבוצעות על פי פרוטוקול הוקם עם כמה שינויים 24. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עובד מב אנטי Ly6G ידי דילול 10 μl של 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​Alexa פלואוריד 647 מצומדות אנטי Ly6G מב (שיבוט 1A8) ב 90 μl של בופר פוספט (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μl של פתרון העבודה נגד Ly6G מב (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לתוך מזרק אינסולין U-100 עם 28 מחט מד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר מבוגר pIL1-DsRed על ידי זריקה ip של קוקטייל הרדמה שתואר לעיל (2.1). מניחים את הבטן העכבר הרדים למטה על לוח עבודה נקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לחץ כלפי מטה עדין על גב עור גחון בעין אחת עכבר כדי לבלוט את גלגל העין באופן חלקי מהשקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום מחט, שפוע למטה, בזווית של כ -30 מעלות על canthus המדיאלי לתוך רטרו מסלוליתסִינוּס. הערה: מפעיל הרשת הסלולרית יכול להרגיש את הלחץ, חדירה והתנגדות הקלה פעם מחדיר מחט לתוך הסינוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט חלקה להזריק 100 μl של מב אנטי Ly6G פתרון עובדים (5 מיקרוגרם מב / עכבר / הזרקה) לתוך העכבר. הסר את המחט במהירות. כמות קטנה של דימום מצביעה על זריקה מוצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להחיל 1.25% OX פתרון רכב על ימין ועל אוזני עכבר שמאליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 8 שעות, לנהל 100 μl של פתרון העבודה נגד Ly6G מוכן טרי מב (5 מיקרוגרם מב / עכבר / הזרקה) באמצעות הזרקת רטרו מסלולית לאותו עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את כלי הדם, מיד לפני הדמיה, לנהל 100 μl של 30 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​והעמסת isothiocyanate (FITC) מצומדות dextran (150 KDA) באמצעות הזרקת רטרו מסלולית. </li></ol> 4. הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים PIL-1-DsRed עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר עם זריקת ip של קוקטייל הרדמה (2.1).0; החל משחת וטרינרים לעיני עכבר כדי למנוע יובש לאחר הרדמה של הדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 1 מיליליטר חצי מנת קוקטייל הרדמה על ידי דילול 500 μl של קוקטייל הרדמה מקורי עם נפח שווה של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר חצי מנה קוקטייל ההרדמה כדי מזרק 1 מ&quot;ל עם מחט מד פרפר 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט של פרפר לתוך בטן עכבר intraperitoneally ולתקן את כנף הפרפר אל הבטן על ידי מקליטה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip זכוכית במרכז הבמה הדמיה. קלטת את הקצוות של coverslip כדי להחזיקו במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה של PBS על פני השטח הגחון של האוזן העכבר כמו גם על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמדה הרדימה עכבר עם האוזן שלה על coverslip. הר קצה האוזן, צד הגב למטה, על ידי הרבדה לאוזן בין coverslip ו זכוכית שקופית, גם מוחזק במקום באמצעות קלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מיקרוסקופ confocal קרינה רב-ליזר וכל הדואר הקשורquipment. לכבות את האורות בחדר כדי למזער את החשיפה אור הסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת רכישת התמונה. בחר את ערוצי ליזר לגילוי של צבעי ניאון בתפריט הרשימה דיי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המיקוד על עור האוזן הדלקתי על ידי תצפית של אותות ירוקים מכלי דם האותות אדומים מתאי DsRed + דרך עיני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע סריקה מהירה עם מהירות סריקה של 2 מיקרו-שניות / פיקסלים ורזולוציה של 512 × 512 פיקסלים. בחר pseudocolor לכל ערוץ בתפריט התצוגה החי. התאם את הידית להתמקד להגדיר סוף ולהתחיל מיקום של סריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע סריקות איטיות עם מהירות סריקה של 4 - 8 μsec / פיקסלים ורזולוציה של 800 × 800 או 1,024 × 1,024 פיקסלים. התאם את המתח הגבוה, לזכות, וכן לקזז על כל ערוץ פרט למקסם את עוצמת האותות תוך הימנעות רוויה (פיקסלים אדומים). לא צריך להיות רק כמה פיקסלים אדומים בכל ערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת קבוצות תמונה תלת-ממדיות על ידי סריקת הדואר העור האוזן מתחיל באופן שטחי את השכבה הקרנית ועל התקדמותם כלפי מטה עם x, y, כרכים z של 317 מיקרומטר × 317 מיקרומטר × 30 מיקרומטר (אובייקטיבי 40X), 635 מיקרומטר × 635 מיקרומטר × 30 מיקרומטר (אובייקטיבי 20X), או 1,270 מיקרומטר × 1,270 מיקרומטר × 50 מיקרומטר (אובייקטיבי 10X) בשעה 2 מיקרומטר Z- צעדים. הערה: השכבה הקרנית היא השכבה החיצונית ביותר של האפידרמיס ולהיות יכולה מקומי מבוססת בקלות על אות autofluorescence החזקה שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים הדמיה זמן לשגות, שיא תלת ממדי תמונות כל 2 דקות או 4 עד 8 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסירוגין, כמו העכבר מתחיל להתאושש מההרדמה, ציין מבוסס על תצפיות של שפם מתעוות, לנהל 5 - 10 μl של קוקטייל הרדמה חצי מנה דרך מחט פרפר. הערה: היי זהירה של מינון ההרדמה - מנת יתר עלול לגרום למות עכבר. לחלופין, הרדמת משאיפת בצנצנת יכולה להיות מיושמת על העכבר עבור הרדמה לטווח קצר לביןחרטומו יוכל לשמש עבור הדמיה לטווח ארוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העכבר הרדים מהבמה כאשר ההדמיה תושלם. ניתוק הקלטת ולהסיר מחט פרפר מן בטן העכבר. החזר את העכבר בכלוב נפרד במתקן דיור בעלי חיים. הערה: עבור הדמיה לטווח קצר (&lt;1 שעה), עכברים להחלים לחלוטין מן ההרדמה במהירות 1 - 3 שעות. עבור הדמיה לטווח ארוכה (~ 8 שעות), עכברים להתאושש לאט, עם תקופת החלמה טיפוסית של 12 - 16 שעות. לפיכך, ממשל מים אוראלי מומלץ לפחות מספר פעמים במהלך תקופת ההחלמה על מנת למנוע התייבשות חמורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכי נתוני הדמית תהליך, לעקוב אחר תאים בודדים, ליצור נתיבי נדידה, ולחשב את הכיווניות ומהירויות של נדידת תאים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה ב -25. </li></ol>

<ol>
	<li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+at+work.">Neutrophils at work.</a> Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).</li><li>Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+the+innate+immune+response.">Neutrophils in the innate immune response.</a> Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).</li><li>Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+priming:+pathophysiological+consequences+and+underlying+mechanisms.">Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms.</a> Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).</li><li>El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+of+the+neutrophil+NADPH+oxidase+activation:+role+of+p47phox+phosphorylation+and+NOX2+mobilization+to+the+plasma+membrane.">Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane.</a> Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).</li><li>Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+imaging+in+rheumatic+diseases.">Cellular imaging in rheumatic diseases.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).</li><li>Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+microbial+immunity+in+living+tissues.">Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues.</a> Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).</li><li>Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immunoimaging--deeper,+bigger,+more+precise,+and+definitively+more+colorful.">The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful.</a> Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).</li><li>Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+biology+in+live+animals:+ready+for+prime+time.">Imaging cell biology in live animals: ready for prime time.</a> J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).</li><li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+neutrophil+response+to+sterile+tissue+injury+in+mouse+dermis+reveals+a+three-phase+cascade+of+events.">Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events.</a> J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+recruited+by+chemoattractants+in+vivo+induce+microvascular+plasma+protein+leakage+through+secretion+of+TNF.">Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF.</a> J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).</li><li>Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptolysin+S+inhibits+neutrophil+recruitment+during+the+early+stages+of+Streptococcus+pyogenes+infection.">Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection.</a> Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).</li><li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain.">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multi-modal+imaging+of+experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+transgenic+reporter+mice+reveals+the+dynamic+nature+of+inflammatory+changes+during+disease+progression.">In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression.</a> J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).</li><li>Slaba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+Dynamic+Platelet-Neutrophil+Response+in+Sterile+Liver+Injury+and+Repair+in+Mice.">Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice.</a> Hepatology. , (2015).</li><li>Mizuno, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+PKA+regulation+of+ERK+activity+during+neutrophil+recruitment+to+inflamed+intestines.">In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines.</a> J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).</li><li>Hasenberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catchup:+a+mouse+model+for+imaging-based+tracking+and+modulation+of+neutrophil+granulocytes.">Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes.</a> Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).</li><li>Matsushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+IL-1beta+production+in+skin.">Intravital imaging of IL-1beta production in skin.</a> J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).</li><li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+against+neutrophil+LY6G+do+not+inhibit+leukocyte+recruitment+in+mice+in+vivo.">Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo.</a> Blood. 121 (1), 241-242 (2013).</li><li>Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+imaging+for+the+in+vivo+tracking+of+high-speed+vesicle+transport+in+mouse+neutrophils.">A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils.</a> Sci. Rep. 3, (1913).</li><li>Sreeramkumar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+scan+for+activated+platelets+to+initiate+inflammation.">Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation.</a> Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+priming+occurs+in+a+sequential+manner+and+can+be+visualized+in+living+animals+by+monitoring+IL-1beta+promoter+activation.">Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation.</a> J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).</li><li>Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+simple,+and+humane+method+for+submandibular+bleeding+of+mice+using+a+lancet.">A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet.</a> Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice).">Retro-orbital injections in mice).</a> Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Fotos, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+time-lapse+microscopy+and+high-resolution+tracking+of+cell+migration).">Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration).</a> Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).</li><li>Mizumoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+immunostimulants+by+dendritic-cell-based+functional+screening.">Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening.</a> Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).</li><li>Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+proteins:+selling+cytokines+by+the+pound.">Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound.</a> Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).</li><li>Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+ATP-+and+LPS-induced+IL-1beta+release+in+human+monocytes.">Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).</li><li>Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+effects+of+domoic+acid+differ+between+in+vivo+and+in+vitro+exposure+in+mice.">Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice.</a> Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).</li><li>Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+role+of+G-CSF+in+the+production,+survival,+and+release+of+neutrophils+from+bone+marrow+into+circulation.">Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation.</a> Blood. 100 (3), 854-861 (2002).</li><li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging.">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).</li><li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+assessment+of+confocal+microscopy+slide-based+systems:+instability.">Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability.</a> Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).</li><li>Hogan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focusing+on+the+experiment.">Focusing on the experiment.</a> Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).</li><li>Kabashima, K., Egawa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+multiphoton+imaging+of+cutaneous+immune+responses.">Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses.</a> J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).</li><li>Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+epidermal+keratinocytes+and+dermal+vasculatures+using+two-photon+microscopy.">Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy.</a> J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).</li><li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window.">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window.">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung.">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).</li></ol>

The authors have no financial conflicts of interest.

מטרת מחקר זה היא לפתח טכנולוגיה לניטור התהליך יחול נויטרופילים בעלי חי חיים, אשר טרם התקיימו על ידי הטכניקות זמינות כרגע. כדי להשיג מטרה זו, שלוש מתודולוגיות הוקמה מבוצעת: 1) אינדוקציה של דלקת עור IL-1β עכברי כתב DsRed מונחה אמרגן כאמצעי של הטרמה, 2) in vivo תיוג של נויטרופ...

נויטרופילים הם לויקוציטים בשפע קצרים מועד ביותר במחזור. הם מגויסים במהירות לאתרים של זיהום או פציעה, שבו הם משרתים פגוציטים כפי מקצועיים באמצעות שחרור ביניים חמצן וחנקן תגובתי יחד עם גרגירים המכילים פפטידים מיקרוביאלית פרוטאזות 1. במהלך גיוסם, נויטרופילים הם &quot;דרוכים&quot; על ידי סוכנים שונים כולל מוצרי חיידקים, chemoattractants, וציטוקינים דלקתיים, וכתוצאה מכך פונקציונלית תָא בַּלעָן משופרת במידה ניכרת עם הגיעם אתר של דלקת 2. המנגנונים של הטרמה נויטרופילים נחקרו רבות במבחנה 3,4; עם זאת, ניטור דינמי של התהליך in vivo מצטער לא יכל להסיג עד כה. לאחרונה, הדמית intravital הפכה טכניקה חשובה הדמיה לכימות הדינמיקה הסלולר של תהליכים ביולוגיים באורגניזמים חיים. Intraviהדמית טל יכולה להתבצע באמצעות מיקרוסקופ עירור אחד פוטונים קונבנציונליים (למשל, confocal) או מיקרוסקופיה multiphoton מתקרבת 5. במשך הזמן, שיפורים משמעותיים הושגו טכניקה זו מאפשרת רזולוציית תמונה מוגברת, עומק הדמיה משופרת, ירד נזקי רקמות, 6,7 ייצוב תמונה משופרת. בהינתן היכולת הייחודית שלה כדי לאפשר הדמיה דינמית של הגירה ואינטראקציה הסלולר לאורך זמן, מיקרוסקופיה intravital יושמה בהרחבה בתחומים מגוונים של מחקר באימונולוגיה 8. הדמית Intravital מאפשרת אימונולוגים כדי להבין טובים יותר את הקשר התגובה חיסונית ברמה התאית ומולקולרית הם חיים במודלים של בעלי חיים. התקדמות המהונדסת וכן עקומים בעכברי כתב ספקה כלים שימושיים לניטור ההתנהגויות הדינמיות של נויטרופילים ב בעלי חיים. אמרגן מונחה M ליזוזים חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת עקומהעכברים שימשו רחב לאפיין תנועתיות של נויטרופילים, מונוציטים, מקרופאגים במהלך תהליכים דלקתיים שונים כולל extravasation, זיהום חיידקי, ודלקת סטרילית 9-15. יתר על כן, העכברים הטרנסגניים המבטא biosensor העברת אנרגיה תהודה הקרינה cytoplasmic הועסק בחקר פעילות קינאז mitogen ו- A קינאז חלבון תאי-מוסדר נויטרופילים במעי מודלק 16. מודל Murine עם סגוליות גבוהות עבור ביטוי קרינת נויטרופילים הוא עכבר הקטשופ העקום, מייצר recombinase Cre וכן tdTomato חלבון פלואורסצנטי, שבעצמה מצמידה את הביטוי של 6G אנטיגן לימפוציטים (Ly6G) 17. ויזואליזציה של נויטרופילים Ly6G המחסרים באמצעות מודל זה הוכיחה כי התאים האלה להפעיל פונקציונליות נורמלית במגוון הקשרים דלקתיים סטרילי או זיהומיות in vivo. עכברים טרנסגניים המבטאים את p ניאון DsRedrotein גן בשליטת העכבר interleuikin-1β (IL-1β) אמרגן (pIL1-DsRed) כבר נוצל כדי להמחיש את התנהגויות ניע של תאים מייצרים IL-1β - האמין לכלול נויטרופילים, מונוציטים דלקתיים, מקרופאגים הופעל - המתעורר בעור מודלק 18. בשנת vivo תיוג יכול לשמש גישה חלופית לאיתור התנהגויות תאית ומולקולרית של נויטרופילים ברקמות דלקתיות. לאחר הזרקה תוך ורידית של מינונים נמוכים של שכותרתו fluorescently אנטי-GR-1 נוגדן חד-שבטי (מב), מפל גיוס של Gr-1 + נויטרופילים כבר דמיינו בנגעים בעור העכבר נגוע Staphylococcus aureus 19. בשנת vivo הממשל של conjugates המכיל streptavidin- מצומדות 705 נקודות קוונטיות ננומטר מב אנטי Ly6G biotinylated תווית במיוחד נויטרופילים במחזור 20. יתר על כן, אנדוציטוזה של conjugates כזה לתוך neutrophשלפוחית ​​il מאפשר מעקב התחבורה שלפוחית ​​במהירות גבוהה ב נויטרופילים נודדות אל interstitium. בשנת vivo תיוג עם נוגדנים הקרינה מצומדות נגד P-selectin גליקופרוטאין ליגנד-1 (PSGL-1), L-selectin (CD62L), integrin αM (CD11b chemokine ו) (מוטיב CXC) קולטן 2 (CXCR2) במודל של דלקת הנגרמת TNFα יש הבהיר את מנגנוני ויסות בבית לשחק במהלך מוקדם דלקת 21. נויטרופילים Polarized לבלוט PSGL-1 מועשר uropods לקיים אינטראקציה עם ההווה CD62L על טסיות מופעל, וכתוצאה מכך חלוקה מחדש של CD11b ו CXCR2, קולטנים שמניעים הגירה נויטרופילים וליזום את הדלקת. IL-1β הוא אחד הגנים החתים כי הוא מוגבה ב נויטרופילים דרוכים 22. בעכברים הכתב pIL1-DsRed, אותות הקרינה DsRed (כלומר., הפעלה של האמרגן IL-1β) לתאם באופן חיובי עם IL-1β ביטוי mRNA וייצור חלבון IL-1β. &lt;sup&gt; 18 כדי לפקח על תהליך של הטרמה נויטרופילים, שיטה מיקרוסקופית intravital פותחה מעורבים אינדוקציה של דלקת עור עם oxazolone (שור) במודל העכבר pIL1-DsRed הבאים in vivo תיוג של נויטרופילים עם מב הקרינה מצומדות אנטי Ly6G. Via מודל זה, ניתן ללמוד את ההתנהגות ותפקוד של נויטרופילים דרוכים במודלים של בעלי חיים של מחלות והפרעות שונות.

<table>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:165px;">APP Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:139px;">NDC 63323-540-31</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:165px;">Lonza</td>
			<td style="width:139px;">10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:165px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Lipopolysaccharides</td>
			<td style="width:165px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">L4391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:165px;">Hospira</td>
			<td style="width:139px;">NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine</td>
			<td style="width:165px;">LLOYD Laboratory</td>
			<td style="width:139px;">NADA #139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acepromazine</td>
			<td style="width:165px;">Boehringer Ingelheim</td>
			<td style="width:139px;">ANADA 200-361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hair-removal cream</td>
			<td style="width:165px;">Church &#38; Dwight</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">A16P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxazolone</td>
			<td style="width:165px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">E0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:196px;">Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td style="width:139px;">127610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:196px;">U-100 insulin syringe with 28 G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">FITC-CM-Dextran, 150 Kda</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">74817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">Butterfly infusion set (27 G needle)</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:139px;">387312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSCalibur cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellQuest Pro software</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metamorph Software</td>
			<td>Universal Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital imaging of neutrophil priming using il-1&#946; promoter-driven dsred reporter mice

נויטרופילים הם לויקוציטים הנפוצים ביותר במחזור דם אנושי מגויסים במהירות לאתרים דלקתיים. לקרקע הוא אירוע קטלני זה משפר את הפונקציונליות phagocytic של נויטרופילים. למרות מחקרים מקיפים חשפו את קיומה וחשיבותה של הטרמה נויטרופילים במהלך זיהום ופגיע, פירושו של ביטוי חזותי תהליך זה in vivo לא היה בהישג ידי. הפרוטוקול ספק מאפשר ניטור של התהליך הדינמי של נויטרופילים יחולו בחיות חיים על ידי שילוב שלוש מתודולוגיות: 1) אות כתב DsRed - משמש כמדד יחול 2) תיוג נויטרופילים vivo - מתקבל על ידי הזרקה של אנטיגן נגד לימפוציטים קרינה מצומדות 6G (Ly6G) נוגדן חד-שבטי (מב) ו -3) הדמיה confocal intravital. שלבים קריטיים כמה מעורבים בפרוטוקול זה: דלקת עור אוזן עכבר נגרם oxazolone, הרגעה מתאימה של חיות, זריקות חוזרות ונשנות של מב אנטי Ly6G, ו קודםention של סחיפה המוקד במהלך ההדמיה. למרות מספר מגבלות נצפו, כגון הגבלת זמן הדמיה הרציפה (~ 8 שעות) ב שמאלי ואת הדליפה של isothiocyanate-dextran והעמסה מכלי דם במדינה הדלקתית, פרוטוקול זה מספק מסגרת יסוד הדמית intravital של התנהגות ותפקוד נויטרופילים דרוכים, אשר ניתן להרחיב בקלות הבדיקה של תאי חיסון אחרים במודלי דלקת עכבר.

הקרנת עכברי pIL1-DsRed מתבצעת על פי איתות קרינת DsRed פנוטיפי המיוצרת על ידי לויקוציטים הדם ההיקפיים שלהם באמצעות cytometry זרימה. גירוי LPS ידוע לגרום ייצור IL-1β בתאים מיאלואידית כולל נויטרופילים, מונוציטים, ותאים דנדריטיים 26-28. לפיכך, לויקוציטים מבודד מו?...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1ÃŽÂ² Promoter-driven DsRed Reporter Mice at JoVE.com

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים שימוש IL-1β מונחה יזם עכברים Reporter DsRed

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

intravital-imaging-neutrophil-priming-using-il-1-promoter-driven

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.5K Views.  University of Toledo College of Medicine and Life Sciences. This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals. 

Video: Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

מעקב זחילה Intraluminal נויטרופילים, הגירה Chemotaxis Transendothelial ועל רקמות על ידי מיקרוסקופית וידאו Intravital

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Intravital הדמיה של בלוטות לימפה popliteal עכבר

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז&#39;רמינל

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

לטווח ארוך Intravital multiphoton מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיסוני בבריאים וחולה כבד באמצעות עכברים CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

ויזואליזציה של לימפוציטים-22-להביע IL באמצעות עכברים Reporter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular compartment where the killing and digestion of engulfed particles take place, is the main arena for neutrophil pathogen killing that requires tight regulation. Phagosomal pH is one aspect that is carefully controlled, in turn regulating antimicrobial protease activity. Many fluorescent pH-sensitive dyes have been used to visualize the phagosomal environment. S-1 has several advantages over other pH-sensitive dyes, including its dual emission spectra, its resistance to photo-bleaching, and its high pKa. Using this method, we have demonstrated that the neutrophil phagosome is unusually alkaline in comparison to other phagocytes. By using different biochemical conjugations of the dye, the phagosome can be delineated from the cytoplasm so that changes in the size and shape of the phagosome can be assessed. This allows for further monitoring of ionic movement.

This manuscript describes a simple method to measure the phagosomal pH and area as well as the cytoplasmic pH of human and mouse neutrophils using the ratiometric indicator seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, or S-1. This is achieved using live-cell confocal fluorescence microscopy and image analysis.

הדמיה נויטרופילים Phagosome ו הציטופלסמה באמצעות אינדיקטור pH ratiometric

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

אינטראקציה תא הדמיה ב רירית והכו אותי במהלך זיהום בנגיף שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים Intravital

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...