The authors have no acknowledgements.

全ての動物実験は、国立衛生研究所のガイドラインに従って実行し、トレドの大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されています。 pIL1-DsRedをマウスの1表現型注：子孫は、野生型（WT）C57BL6マウスとヘテロ接合pIL1-DsRedのマウスを交配することによって生成されます。 3〜4週齢の仔は、表現型の準備と考えられています。マウスの顎下出血は、わずかな修正23で確立されたプロトコルに準拠しています。 <ol><li> マウス子犬の全血からの白血球の分離 <ol><li>各1.5ミリリットルマイクロチューブにヘパリン20μlのを追加します。 </li><li>ケージから1子犬を取得します。子犬の識別タグを記録します。顎下静脈から採血する前に子犬を麻酔するために必要とされていません。 </li><li>首の首筋によって子犬を持ち、目に顎下静脈を貫通5ミリメートルのランセットを使用して電子の頬袋。血の滴が浸透の点から発散するように、小さな穿刺を作成するために十分な力を適用します。各子犬のための新しい針を使用してください。 </li><li>ヘパリン含有マイクロチューブに子犬あたりの血液の5滴 - 3を収集します。穿刺部位をきれいにし、止血を容易にするための圧力を適用します。 </li><li>新しいケージに子犬を入れて、動物施設にケージを返す前に30分間観察します。 </li><li>正および負の対照として知られている表現型の成体マウスから血液を採取します。 </li><li>各チューブ、ボルテックスチューブに赤血球溶解緩衝液500μlを追加し、5インキュベート - 氷の上で10分。 </li><li>各管中の細胞懸濁液の下にウシ胎児血清（FBS）を500μl - ゆっくりと400を追加します。明確なインターフェースは、上位層の細胞懸濁液及びFBSの下位層との間に観察することができます。 </li><li> 5分間1500×gでキャップチューブと遠心分離機サンプル。 </li><li>毛皮に1.1.9 - を繰り返して、1.1.7の手順THER赤血球を除去。溶解が初めて十分であれば繰り返さないでください。ペレットを遠心分離した後に識別することは困難であるべきです。 </li></ol></li><li> リポポリサッカライド（LPS）刺激と文化 <ol><li>完全なロズウェルパーク記念研究所（RPMI）1640培地200μlで細胞を再懸濁し。 </li><li>フローサイトメトリーチューブに細胞懸濁液を転送します。 </li><li>完全RPMI 1640培地の990μlのLPSストック溶液10μl（1mg / ml）を混合して使用液をLPSを行います。 </li><li>細胞懸濁液の200μlに作業溶液を10μg/ mlのLPSの20μLを加えます。 </li><li>キャップチューブを緩くし、5％CO 2で37℃で4時間サンプルをインキュベートします。 </li></ol></li><li> フローサイトメトリー分析 <ol><li>フローサイトメトリーのためのデータ取得プログラムを開きます。前サンプル取得に取得テンプレートを設定します。 </li><li>ツールパレットのドットプロットツールをクリックします。 FOを描きます側方散乱（SSC）プロット対rward散乱（FSC）。リニアスケールにFSCとSSCの電圧パラメータを設定します。 </li><li>サイトメーターによって許可されたFSCとSSCの最低のしきい値を選択します。それぞれ、FSCとSSCのしきい値200と50を適用します。 </li><li> SSCプロット対FSC内、破片、赤血球およびリンパ球、単球、顆粒球、および樹状細胞を含み、かつ除外ゲートG1を描きます。 </li><li>ツールパレットのヒストグラムツールをクリックします。 FL2（赤色蛍光チャネル）ヒストグラムを描画します。すべてのDsRed陽性事象を含めるようにゲートを描画するFL2信号のベースラインと陽性対照サンプルを設定するには、陰性対照試料を使用してください。 </li><li>サイトメーターの流体工学コントロールパネルで、「HI」（約60マイクロリットル/分）に「RUN」への流体モードと流量を設定します。各サンプルについて10,000事象を獲得します。 </li><li> G1のゲートからのDsRed陽性細胞の割合を測定することにより、子犬の表現型を決定します。 </li></ol></li></ol><pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 2。 pIL1-DsRedをマウスにおける皮膚の炎症の誘導<ol><li> 100mg / kgのケタミン、10mg / kgのキシラジン、および1mg / kgのアセプロマジンを含む麻酔薬カクテルの腹腔内（ip）注射によりマウスを麻酔。適切に麻酔したマウスは、つま先のピンチに後足の撤退を示しません。 </li><li>マウスの両耳の背側表面に脱毛クリームを適用します。 1分30秒を待ちます。水湿らせたコットンで耳の表面を拭き、風乾させます。 </li><li>マイクロメーターを使用して、耳の厚さを測定し、別々のケージにマウスを交換します。 （ - 30分〜15）麻酔から回復するまで観察します。脱毛製品によって誘発される皮膚の炎症を解決するために、さらなる実験が行われる前に、マウスは3日間休むことができます。 </li><li> 1ミリリットルのアセトンにOXの16.7ミリグラムを溶解し、オリーブオイル250μlのOX /アセトン溶液750μLを混合することにより、1.25％（w / v）のOXを準備します。 250とアセトンの750μLを混合することにより、車両のソリューションを準備＃181;オリーブオイルのリットル。 </li><li>麻酔薬カクテル（2.1）の腹腔内注射による再麻酔マウス。以前のように耳の厚さを測定します。 </li><li>右耳の各側に1.25％OXの12.5μLを適用します。左耳のそれぞれの側にアセトン/オリーブオイルビヒクル溶液12.5μlのを適用します。 </li><li>完全に元のケージにマウスを交換し、動物飼育施設に戻り、その後、他のマウスがその耳に侮辱を防ぐために回復するまでマウスをケージメイトとは別に保管してください。 注：脱毛は、耳の厚さの変化により、以下の軽微な皮膚の炎症を引き起こすことがあります。このマイナーな炎症は3日後に、通常の耳の厚さによって確認解決されます。 24時間局所適用した後、OX-処理された耳は有意な（P &lt;0.01）と比較ビヒクル溶液のみで処理した耳膨潤を示します。 </li></ol> pIL1-DsRedをマウスにおける好中球の3ラベリング注：低用量Fで好中球のin vivo標識luorescence共役好中球特異的mAbは、最近開発されたプロトコル19に従います。眼窩後注射は、いくつかの変更24で確立されたプロトコルに従って行われます。 <ol><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の90μlの0.5 mg / mlでアレクサフルオロ647結合抗Ly6Gモノクローナル抗体（クローン1A8）の10μLを希釈することにより抗Ly6G mAbのワーキング溶液を調製します。 </li><li> 28ゲージの針を持つU-100インスリン注射器に抗Ly6G mAbのワーキング溶液（50μg/ mlの）の100μlのを転送します。 </li><li>先に説明した麻酔薬カクテル（2.1）の腹腔内注射により大人pIL1-DsRedをマウスを麻酔。クリーンな作業ボードに麻酔マウスの腹部を下に置きます。 </li><li>部分的にソケットから眼球突出する1つのマウスの眼に優しい下方皮膚背に圧力と腹を適用します。 </li><li>慎重に眼窩後に内側眼角で約30°の角度で、ダウンベベル、針を置きます洞。 注：オペレータが洞に針を挿入一度圧力、浸透とホッと抵抗を感じることができます。 </li><li>ゆっくりとスムーズマウスに抗Ly6G mAbの100μlのワーキング溶液（5μgのモノクローナル抗体/マウス/注射）を注入します。すぐに針を外します。出血少量の成功した注入を示唆しています。 </li><li>すぐに右と左のマウスの耳の上に1.25％OXと車両のソリューションを適用します。 </li><li> 8時間後、同じマウスに眼窩後部注射を介して新たに調製した抗Ly6G mAbのワーキング溶液（5μgのモノクローナル抗体/マウス/注射）の100μLを管理します。 </li><li>血管を可視化するために、すぐに撮影する前に、30 mg / mlでフルオレセインイソチオシアネート（FITC）の管理100μlを眼窩後部注射によってデキストラン（150kDaのを）抱合しました。 </li></ol> pIL-1-DsRedをマウスにおける好中球プライミングの4生体内イメージング<ol><li>麻酔薬カクテル（2.1）の腹腔内注射でマウスを麻酔。0;しばらくイメージングのための麻酔下で乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医の軟膏を適用します。 <ol><li>等量のPBSで元の麻酔薬カクテル500μlの希釈して1ミリリットル半用量の麻酔薬カクテルを準備します。 </li><li>蝶27ゲージの針で1ミリリットル注射器に半用量の麻酔薬カクテルを転送します。 </li><li>腹腔内にマウスの腹部に蝶の針を挿入し、テーピングによって腹部に蝶の羽を修正。 </li></ol></li><li>撮影台の中心にカバーガラスを置きます。所定の位置に保持するためにカバースリップの端をテープで固定します。 </li><li>マウスの耳の腹側表面上だけでなく、カバースリップ上でPBSのドロップを置きます。 </li><li>位置は、カバーガラスの上に、その耳で、マウスを麻酔しました。また、テープを介して、所定の位置に保持カバーガラスとスライドガラスとの間に耳を挟むことによって、ダウン耳の先端、背側をマウントします。 </li><li>マルチレーザ蛍光共焦点顕微鏡および関連するすべての電子をオンにしますquipment。周囲光の露出を最小限にするために部屋の照明をオフにします。 </li><li>画像取得ソフトウェアを開きます。色素一覧メニューの蛍光色素の検出のためのレーザー・チャネルを選択します。 </li><li>接眼レンズを通してのDsRed +細胞から血管や赤の信号から緑色の信号を観測することによって炎症を起こした耳皮膚にフォーカスを調整します。 </li><li>スキャン2マイクロ秒/ピクセルの速度と512×512ピクセルの解像度で高速スキャンを実行します。ライブビューメニューの各チャンネルの擬似カラーを選択します。最後に設定し、スキャンの場所を開始するために、フォーカスノブを調整します。 </li><li> 8マイクロ秒/ピクセルと800×800または1024×1024ピクセルの解像度 - スキャン4の速度でゆっくりとスキャンを実行します。高電圧を調整し、ゲイン、及び彩度（赤ピクセル）を回避しながら、信号の強度を最大化するために各チャンネルのオフセット。各チャンネルで唯一の少数の赤色画素があるはずです。 </li><li>目をスキャンすることによって三次元画像セットを作成電子の耳皮膚、635ミクロン×635ミクロン×30ミクロン（20X対物レンズ）、または1270ミクロン×を角質層に表面的に始まり、X、Y、317ミクロン×30ミクロン（対物レンズ40倍）×317ミクロンのZボリューム下方に進んで2ミクロンのzの手順で1270ミクロン×50ミクロン（10×対物レンズ）。 注：角質層は、表皮の最も外側の層であり、容易にその強い自家蛍光信号に基づいてローカライズすることができます。 </li><li>タイムラプスイメージング実験では、レコードの3次元画像を最大8時間ごとに2または4分。 </li><li>蝶の針を介して半用量の麻酔カクテル10μlの - マウスが麻酔から回復し始めると断続的に、5を管理し、けいれんウィスカーの観察に基づいて指摘しました。 注：麻酔用量の注意が必要 - 過剰摂取がマウスの死を引き起こす可能性があります。また、瓶内吸入麻酔は、短期的な麻酔およびAのマウスに適用することができますノーズコーンは、長期的画像化のために使用することができます。 </li><li>イメージングが完了した段階から麻酔マウスを削除します。テープを外し、マウスの腹部から翼状針を取り除きます。動物飼育施設内の別々のケージにマウスを返します。 注： - 3時間の短期イメージング（&lt;1時間）のために、マウスは完全に1に迅速に麻酔から回復します。 16時間 - 長期イメージング（〜8時間）のために、マウスは、12の一般的な回復期間で、ゆっくりと回復します。したがって、経口水投与は重度の脱水症を防ぐために、回復期間中に少なくとも数回をお勧めします。 </li><li>処理画像データセットは、個々の細胞を追跡遊走経路を生成し、画像解析ソフトウェア25を使用して細胞移動の方向と速度を算出します。 </li></ol>

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Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window.">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung.">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).</li></ol>

The authors have no financial conflicts of interest.

本研究の目的は、まだ現在利用可能な技術によって満たされていない生きている動物における好中球のプライミングのプロセスを監視するための技術を開発することです。この目標を達成するために、3つの確立された方法が実行される：IL-1βプロモーター駆動のDsRedレポーターマウスの皮膚炎症の1）誘導プライミングの尺度として、蛍光結合抗Ly6Gの低用量での好中球の2）in vivo標識モノクローナル抗体、3）生体内共焦点顕微鏡画像。これらの3つの方法の組み合わせは、炎症性皮膚病変におけるプライミングされた好中球（DsRedを+ / Ly6G +）の運動性活動の可視化を可能にします。下塗りされた好中球の移動方向と速度がさらに回遊経路追跡を経由して定量化されます。タイムラプスビデオのシリーズを記録することにより、下塗りされた好中球の出現のリアルタイムの動態は、iで炎症部位とのDsRed発現の買収で監視されていますndividual好中球はまた、血管外空間に観察されます。このように、好中球のプライミングの動的なプロセスが正常にここで紹介する技術を使用して初めて生きている動物で可視化されています。 この技術は、いくつかの重要なステップで使用されます。まず、皮膚組織は、生体内画像化のための最も便利な体の部分です。マウスの耳にOXの局所適用は、共焦点顕微鏡下で炎症を起こしている皮膚における免疫細胞の挙動の直接可視化を可能にします。第二に、マウスは麻酔薬の反復注射を必要と撮像中に常に鎮静剤を投与されなければなりません。しかし、過鎮静は、マウスが撮影中に死亡の原因となります。過剰摂取を避けるために、麻酔薬（半二重または全用量の第三）の低用量は、長期的なイメージングのために推奨されています。第三に、蛍光共役好中球特異的mAbが原因で、マウス好中球（8-10時間30の半減期）の短い寿命に断続的に注入する必要があります。最後に、フォーカスDRIFTは、温度変化、マウス本体の動き、時間の経過とともに耳の腫脹、および計測器31の動作に起因する振動を含む複数の要因が原因で発生することがタイムラプスイメージング、中に大きな問題です。いくつかの方法が鎮静さに酸素と暖かさを提供するために、環境室を設置、ステージ上でその上にスライドガラスをテーピングすることにより所定の位置にマウスの耳を固定し、このような撮像時の鎮静の一定用量の投与として、ドリフトを防ぐために開発されてきました手動で再フォーカス範囲、必要なときに32,33によって生物と同様に。 このプロトコルの制限を述べることも同様に重要です。まず、低速のマウス・リカバリ（12から16時間）の長さの撮像期間8​​時間は、このプロトコルは、このような長時間の実験に適していないかもしれないことを示すによる連続鎮静に観察された後。別のアプローチは、Uではなく撮像期間にわたって配列にいくつかのマウスを使用することです一つだけを歌います。第二循環FITCデキストランの段階的な漏れは、おそらく炎症状態34 ​​における皮膚血管透過性の増大に起因する経時的画像化の間に観察されます。従って、血管の視覚化は、著しく画像化の後の段階での循環における減少した蛍光を与え損なわれる。あるいは、これらは、血管内皮細胞35に付着するように血管をマークするために、このようなイソレクチンB4として蛍光共役レクチンを使用してもよいです。 皮膚の炎症性病変における好中球のプライミングのプロセスの視覚化に加えて、ここに記載の技術は、多くの他の実験設定で適用することができます。最近開発された撮像ウインドウとの組み合わせでは、プライミングされた好中球の挙動を描写する生体顕微鏡は、脳、乳腺、肺、腹部臓器36-39を含む深部組織や器官で評価することができました。プリムのまた、可視化単球およびマクロファージのような他の細胞型のING /活性化を介してin vivo標識と共にpIL1-DsRedのマウスを使用して達成することができる蛍光結合目的の細胞型に特異的mAb。まとめると、この技術は、生きた動物中の好中球のプライミング工程の生体内イメージングのための基本的な枠組みを提供するが、それはまた、異なる組織で展開種々の炎症状態にある他の免疫細胞の挙動と機能を研究するための新しいアプローチを発表だけではありません。

好中球は、循環中で最も豊富で短命白血球です。彼らは急速に彼らは抗菌ペプチドおよびプロテアーゼ1を含有する顆粒と一緒に活性酸素の放出および窒素中間体を介してプロの食細胞として機能し、感染または損傷の部位に動員されます。彼らの募集時には、好中球は炎症2の部位での到着時に顕著に強化された食細胞の機能で、その結果、微生物製品、化学誘引物質、および炎症性サイトカインを含む種々の薬剤によって「プライミングされた&quot;されています。好中球のプライミングのメカニズムが広く試験管 3,4 に研究されています。しかしながら、 インビボでのプロセスの動的監視は、これまで不可能でした。 近年、生体内イメージングは​​、生体内の生物学的プロセスの細胞動態を可視化し、定量化するための重要な技術となっています。 Intraviタル画像は、従来の一光子励起顕微鏡（ 例えば、共焦点）を介して行うことができ、または多顕微鏡5に近づきます。時間が経つにつれて、かなりの改善が増加画像解像度、改善されたイメージング深さを可能にするこの技術で達成された、組織の光損傷、および強化された防振6,7を減少させました 。時間をかけて細胞移動および相互作用の動的可視化を可能にする独自の能力を考えると、生体顕微鏡は広く免疫学8に研究の多様な分野に適用されています。生体内イメージングは​​、よりよい生きている動物モデルの両方の細胞および分子レベルでの免疫応答を理解し、文脈する免疫学者を可能にします。 最近のトランスジェニックの進歩だけでなく、ノックインレポーターマウスは、生​​きている動物に好中球の動的挙動を監視するための有用なツールを提供してきました。リゾチームMプロモーター駆動強化緑色蛍光タンパク質ノックインマウスは広く溢出、細菌感染、および無菌性炎症9-15を含む種々の炎症性プロセスの間、好中球、単球、およびマクロファージの運動性を特徴づけるために使用されています。さらに、細胞質の蛍光共鳴エネルギー転移のバイオセンサーを発現するトランスジェニックマウスは、炎症性腸16内の好中球細胞外調節さマイトジェンキナーゼおよびプロテインキナーゼAの ​​活性を研究に使用されています。好中球における蛍光発現のための高い特異性を有するマウスモデルは、それ自体がリンパ球抗原6G（Ly6G）17の発現に結合された蛍光タンパク質tdTomato、ならびにCreリコンビナーゼを生成キャッチアップノックインマウス、です。このモデルを介したLy6G欠損好中球の可視化は、これらの細胞が生体内の炎症のコンテキストでの滅菌または感染の様々な通常の機能を発揮することが実証されています。 DsRedの蛍光​​Pを発現するトランスジェニックマウス好中球、炎症性単球、および活性化マクロファージを含むと考え - - （IL-1β）プロモーター（pIL1-DsRedの）はIL-1β産生細胞の運動性挙動を可視化するために利用されているinterleuikin-1βマウスの制御下に遺伝子をrotein新興炎症を起こした皮膚の18インチ in vivoでの標識は、炎症を起こした組織中の好中球の細胞および分子の挙動を追跡するための代替的なアプローチとして機能することができます。蛍光標識した抗GR-1モノクローナル抗体（mAb）の低用量の静脈内注射した後、GR-1 +好中球の動員カスケードは、 黄色ブドウ球菌 19を感染させたマウスの皮膚病変で可視化されてきた。ストレプトアビジンを含む結合体のインビボ投与コンジュゲートさ705 nmの量子ドットおよびビオチン化抗Ly6G mAbが特異的に循環好中球20にラベルを付けます。 neutrophへのそのようなコンジュゲートのまた、エンドサイトーシスIL小胞間質への移行の好中球で高速小胞輸送の追跡を可能にする。P-セレクチン糖タンパク質リガンド-1（PSGL-1）、L-セレクチン（CD62L）に対する蛍光標識抗体とのin vivo標識、インテグリンαM（CD11bのTNFα誘導性炎症モデルにおける）およびケモカイン（CXCモチーフ）受容体2（CXCR2）は、初期の炎症の21時に遊んで調節機構を解明しました。偏好中球は、CD11bおよびCXCR2の再分配が生じ、活性化血小板上のCD62Lの存在と対話するためのPSGL-1に富んだuropods、好中球遊走を駆動し、炎症を開始する受容体を突出しています。 IL-1βは、下塗りされた好中球22に上昇しているシグネチャー遺伝子の一つです。 pIL1-DsRedのレポーターマウスにおいて、DsRedの蛍光シグナル（ すなわち 、IL-1βプロモーターの活性化）正にIL-1βmRNAの発現及びIL-1βタンパク質産生と相関します。&lt;SUP&gt; 18は、好中球のプライミングのプロセスを監視するには、生体顕微鏡法は、蛍光結合抗Ly6G mAbによる好中球のin vivo標識次pIL1-DsRedのマウスモデルにおけるオキサゾロン（OX）で皮膚の炎症の誘導を伴う開発されました。このモデルを介して、様々な疾患および障害の動物モデルにおいて好中球プライミングの動作及び機能を研究することが可能です。

<table>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:165px;">APP Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:139px;">NDC 63323-540-31</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:165px;">Lonza</td>
			<td style="width:139px;">10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:165px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Lipopolysaccharides</td>
			<td style="width:165px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">L4391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:165px;">Hospira</td>
			<td style="width:139px;">NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine</td>
			<td style="width:165px;">LLOYD Laboratory</td>
			<td style="width:139px;">NADA #139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acepromazine</td>
			<td style="width:165px;">Boehringer Ingelheim</td>
			<td style="width:139px;">ANADA 200-361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hair-removal cream</td>
			<td style="width:165px;">Church &#38; Dwight</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">A16P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxazolone</td>
			<td style="width:165px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">E0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:196px;">Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td style="width:139px;">127610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:196px;">U-100 insulin syringe with 28 G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">FITC-CM-Dextran, 150 Kda</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">74817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">Butterfly infusion set (27 G needle)</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:139px;">387312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSCalibur cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellQuest Pro software</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metamorph Software</td>
			<td>Universal Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital imaging of neutrophil priming using il-1&#946; promoter-driven dsred reporter mice

好中球は人間の血液循環中で最も豊富な白血球であるとすぐに炎症部位に補充されます。プライミングは、好中球の貪食機能を強化し、重要なイベントです。広範な研究は、感染や傷害の間に好中球のプライミングの存在と重要性を発表しているが、 生体内でこのプロセスを可視化する手段が使用できなくなっています。蛍光結合抗リンパ球抗原の注入によって達成- 2）in vivoでの好中球の標識をプライミングの尺度として使用- 1）のDsRedレポーターシグナル：提供されたプロトコールは、3の方法論を組み合わせることにより、生きている動物にプライミング好中球のダイナミックなプロセスの監視が可能6G（Ly6G）モノクローナル抗体（mAb）、3）生体内共焦点画像化。いくつかの重要なステップは、このプロトコルに関与している：オキサゾロン誘発性マウス耳皮膚の炎症、動物の適切な鎮静、抗Ly6G mAbの反復注射、および前へ撮影時の焦点ドリフトのention。いくつかの制限は、1つのマウスでの連続撮影時間（〜8時間）の限界とフルオレセインイソチオシアネート - デキストラン炎症状態の血管からの漏出として、観察されているが、このプロトコルは、生体内イメージングのための基本的なフレームワークを提供します簡単にマウス炎症モデルにおける他の免疫細胞の検査に拡大することができる下塗りされた好中球の挙動と機能、。

pIL1-DsRedのマウスのスクリーニングを、フローサイトメトリーを使用して、末梢血白血球によって産生される表現型のDsRed蛍光シグナルに基づいて行われます。 LPS刺激は、好中球、単球、および樹状細胞を26〜28を含む骨髄細胞におけるIL-1βの産生を誘導することが知られています。したがって、単離された白血球は、フローサイトメトリー分析の前に4時間、LPSとインキュベートします。次に、ゲートは、このゲート制御集団で測定される細胞サイズ（FSC）および内部の複雑さ（SSC）（ 図1A）29、およびDsRedの信号に基づいて、骨髄細胞を循環させるために設定されています。 pIL1-DsRedをマウスからの同じ細胞が識別可能なDsRedの信号（ 図1B）を発現しながら、WTマウスからの循環骨髄細胞は、最小限、DsRedを発現します。この表現型の方法によって同定さpIL1-DsRedのマウスは、その後の実験に使用されています。完全な表現型のプロセスはわずか数を要することに留意すべきです時間 - 組織の収穫、酵素消化、DNAの単離、PCRおよび電気泳動を含む伝統的な遺伝子型決定法よりもはるかに短いです。 IL-1βプロモーターの活性化は、最近22をプライミング好中球のマーカーとして同定されています。したがって、好中球のプライミングの動的プロセスはpIL1-DsRedのマウスを用いた動物の生体内で可視化評価することができます。皮膚の炎症を誘発するために、皮膚感作のOXは、局所pIL1-DsRedをマウスの右耳に塗布し、ビヒクル単独を、同じ動物の左耳に塗布します。生きた動物での好中球を標識するために、最近開発されたプロトコルは、直前に蛍光標識された抗Ly6G mAbの少量を投与することによって行われ、OX適用後8時間です。血管を見つけるには、FITCデキストランは、撮影の直前に注入されます。 OX適用後24時間、Aに大型のDsRed + / Ly6G +細胞の数は、血管外の空間（ 図2A）に見られ、プライミングされた好中球を表しています。少数のDsRed / Ly6G +細胞はまた、最も可能性の高い休んで好中球を表す、発見されました。また、のDsRed + / Ly6Gの小集団-細胞は観察され、炎症性単球および活性化マクロファージを含むことができます。 40分タイムラプスビデオでは、炎症性皮膚病変内に新興Ly6G +好中球は、典型的なアメーバ状のクロールの動き（ 補足ムービー1）を示します。 / Ly6G +好中球集団（ 図2B） -細胞の遊走パスはDsRedを+ / Ly6G +とのDsRedの運動性挙動を比較するために追跡されます。トラックのプロットは、細胞外空間が（ 図2C）に入力された後、両方の好中球集団は「ランダム」の移行を表示することを明らかにした分析します。興味深いことに、/ Ly6G +対応（ 図2D） - DsRedを+ / Ly6G +好中球は、彼らのDsRedと比較して有意に高い速度を示します。これは、炎症性病変における好中球のプライミングと加速運動性との関連を示唆しています。 好中球のプライミングのタイミングを監視するには、タイムラプスビデオのシリーズは、OX処理（ - 4補足作品2）以下の異なる時間に始まる記録しました。 DsRedを- / Ly6G +細胞、休止好中球は、早ければ8と血管外空間での検出可能になる- OX適用後12時間とその数は（4、図2E、補足作品3）その後、比較的低いままです。 OX適用後16時間-逆に、のDsRed + / Ly6G +細胞の数は、プライミングされた好中球は、14で始まり、後の時点で徐々に増加します。いくつかのDsRed <sアップ&gt; - / Ly6G +細胞が徐々にこの期間（ 図2F、補足ムービー5）の間に血管外空間への動員後のDsRed信号を取得します。 16時- 20時間、血管外Ly6G +好中球の大半は、それらのDsRed発現に基づいて「プライミングされた」とみなされます。これらの観​​察は、生きた動物における炎症性病変で発生する好中球のプライミングの大きさ、テンポ、および場所を明らかにしました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54070/54070fig1.jpg" /> 図1：pIL1-DsRedをマウスの表現型 （A）フローサイトメトリーは、FSCとSSCのパラメータに基づいて、骨髄細胞（G1）を循環の人口を実証分析します。 （B）FL2チャネルにおいてヒストグラムがのpIL-DsRedのマウス（赤）またはWTマウス（青）からの細胞のG1ゲート内のDsRed +細胞の割合を示します。データがleでの代表的なものです3つの独立した実験AST。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54070/54070fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54070/54070fig2.jpg" /> 図2： 炎症性皮膚病変中 のDsRed + / Ly6G + 好中球 の運動性活動の可視化 （A）静的共焦点顕微鏡画像は、OX処理ショーの後血管外空間での3白血球集団、 すなわち 24時間を記録し、DsRedを+ / Ly6G +細胞。 （アスタリスク）、DsRedを- / Ly6G +細胞（三角形）、およびDsRedを+ / Ly6G -細胞（矢印）。バー=20μmです。 DsRedを+ / Ly6G +細胞（赤）とのDsRed - / Ly6G +細胞（青）migratoについて比較しますOXアプリケーション（ 補足ムービー1）24時間後に開始する共焦点顕微鏡によって記録された40分のタイムラプスムービーからRYパス（B）、トラックプロット（C）、および速度（D）。 （D）バーは、平均速度の値を示しています。 *** P &lt;0.001。 （E）のDsRed + / Ly6G +細胞との数のDsRed - / Ly6G +細胞はOXアプリケーション（ 補足作品2〜4）後の異なる時点で記録されたタイムラプスムービーの一連からカウントされます。示したデータは、3連続した画像から算出した細胞数/ mm 2の（平均±SD）です。 （F）静的画像はOX塗装（ 補足ムービー5）後11〜14.5時間から記録タイムラプスムービーから作成されます。矢印は、観察期間中に血管外空間内のDsRedの発現を取得Ly6G +細胞を示しています。バー=50μmです。画像は許可（著作権2015免疫学者のアメリカの協会）と、基準22から再生されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54070/54070fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 。 補足ムービー1： - / Ly6G +細胞（青）中（OX塗装後24時間での）炎症性皮膚病変中 のDsRed + 好中球 の運動性挙動は、共焦点顕微鏡画像はDsRedを+ / Ly6G +細胞（ピンク）とのDsRedの運動性を示します血管外空間。血管は緑色に見えます。バー=20μmです。ビデオが許可（著作権2015免疫学者のアメリカ協会、Inc.）を参照22から再生されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54070/54070video1.mov" target="_blank">をクリアしてください</a>このビデオを見るにはこちらICK。 補足ムービー2： 炎症性皮膚病変中 のDsRed + 好中球 の運動性挙動 （OXの塗装後4時間で）共焦点顕微鏡画像はDsRedを+ / Ly6G +細胞（ピンク）とDsRedの表示-血管外空間に/ Ly6G +細胞（青色）。 。血管は緑色に見えます。自己蛍光が存在し、毛包に関連しています。バー=100μmです。ビデオが許可（著作権2015免疫学者のアメリカの協会）と、基準22から再生される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54070/54070video2.mov" target="_blank">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。</a> 補足ムービー3：INF に DsRedを + 好中球 の運動性挙動（OXの塗装後8時間で）lammatory皮膚病変共焦点顕微鏡画像はDsRedを+ / Ly6G +細胞（ピンク）とDsRedを示す- 。血管外空間に/ Ly6G +細胞（青色）。血管は緑色に見えます。自己蛍光が存在し、毛包に関連しています。バー=100μmです。ビデオが許可（著作権2015免疫学者のアメリカの協会）と、基準22から再生される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54070/54070video3.mov" target="_blank">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。</a> 補足ムービー4： 運動性 炎症性皮膚病変中 のDsRed + 好中球 の挙動 （11時- OXの塗装後19時間）共焦点顕微鏡画像は（ピンク）のDsRed + / Ly6G +細胞を示すとのDsRed -中/ Ly6G +細胞（青）。 extravascularスペース。血管は緑色に見えます。自己蛍光が存在し、毛包に関連しています。バー=100μmです。ビデオが許可（著作権2015免疫学者のアメリカの協会）と、基準22から再生される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54070/54070video4.mov" target="_blank">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。</a> 補足ムービー5：Ly6G + 好中球 によってDsRedの信号の取得 、この高倍率のビデオは（矢印で示す）Ly6G +細胞が血管外でのDsRed発現を獲得する過程を示して補足ビデオ4に示すタイムラプスムービーから。観察期間（OX塗装後の11から14.5時間）の間にスペース。バー=50μmです。ビデオは許可（著作権2015年イムのアメリカの協会と参照22から再生されますmunologists社）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54070/54070video5.mov" target="_blank">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。</a>

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Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

IL-1βプロモーター駆動のDsRedレポーターマウスを用いた好中球プライミングの生体内イメージング

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

intravital-imaging-neutrophil-priming-using-il-1-promoter-driven

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.5K ビュー.  University of Toledo College of Medicine and Life Sciences. This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals. 

ビデオ: Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

生体内ビデオ顕微鏡による組織内好中球腔内クロールを追跡、経内皮移動と走

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

免疫・感染学

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

マウス膝窩リンパ節の生体内イメージング

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

胚中心の高解像度生体内ストライプ照明顕微鏡

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

CXCR6.Gfpレポーターマウスを使用して、健康で罹患肝臓における免疫細胞の長期生体内多光子顕微鏡イメージング

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

レポーターマウスを用いたIL-22を発現するリンパ球の可視化

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular compartment where the killing and digestion of engulfed particles take place, is the main arena for neutrophil pathogen killing that requires tight regulation. Phagosomal pH is one aspect that is carefully controlled, in turn regulating antimicrobial protease activity. Many fluorescent pH-sensitive dyes have been used to visualize the phagosomal environment. S-1 has several advantages over other pH-sensitive dyes, including its dual emission spectra, its resistance to photo-bleaching, and its high pKa. Using this method, we have demonstrated that the neutrophil phagosome is unusually alkaline in comparison to other phagocytes. By using different biochemical conjugations of the dye, the phagosome can be delineated from the cytoplasm so that changes in the size and shape of the phagosome can be assessed. This allows for further monitoring of ionic movement.

This manuscript describes a simple method to measure the phagosomal pH and area as well as the cytoplasmic pH of human and mouse neutrophils using the ratiometric indicator seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, or S-1. This is achieved using live-cell confocal fluorescence microscopy and image analysis.

レシオメトリックpH指示薬を使用して好中球ファゴソームと細胞質のイメージング

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

レポーター酵素蛍光を用いたマウスにおける結核菌をイメージング

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

イメージング 2 光子生体顕微鏡を用いたインフルエンザ ウイルス感染症の中に気管粘膜の細胞相互作用

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...